眼病的治疗的制作方法
【专利说明】眼病的治疗
[0001] 本申请是申请日为2005年8月23日、申请号为201210342530. 5、题为"眼病的治 疗"的分案申请。其中申请号为201210342530. 5的发明申请是申请号为200580036349.X 的分案申请。本申请是依据专利局对申请号为201210342530. 5的发明申请发出的驳回决 定中指出的单一性问题所作出的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于眼病治疗的方法和组合物；特别然而并非专门涉及青光眼的治 疗。在优选实施方案中，本发明涉及RNAi技术的使用以下调眼房水（aqueousformation) 形成基因和眼房水流出（aqueousoutflow)基因。也提供了治疗眼病的方法和组合物。
[0003] 发明背景
[0004]RNAi作为下调基因表达的工具
[0005] 通过同源重组的基因寻靶通常用于确定哺乳动物中的基因功能，但是这是消耗成 本和时间的方法。备选地，在用核酶或反义技术的mRNA抑制以后可以确定许多基因的功 能。虽然在有些情况中是成功的，但是这些技术难以普遍应用。siRNA-定向的"击倒"的出 现在体细胞遗传学中激起了革命，允许哺乳动物中的基因功能的廉价并快速的分析。
[0006] 建立在mRNA水平敲除基因表达的方便并可靠的方法是过去15年在分子生物学 中周期性的题目。在产生细胞或生物功能损失的努力中，已经试验了多种分子，所述分子 包括，例如，反义序列、核酶、和嵌合寡核苷酸，但是这样分子的设计是基于反复试验，取决 于目标基因的性质。而且，难以预知期望的效果，并且经常仅实现弱抑制（BraaschCorey， 2002)〇
[0007] 在1990年代初该现象在植物中发现以后，1998年AndyFire和CraigMeilo首次 用线虫（Caenorhabditiselegans)虫表明dsRNA(双链RNA)可以以非常有效的方式特异 并选择性抑制基因表达（Fire等，1998)。在他们的实验中，第一条链（称为有义RNA)的序 列与目标信使RNA(mRNA)的相应区域的序列符合。第二条链（反义RNA)对于该mRNA是互 补的。得到的dsRNA结果是远比相应的单链RNA分子（特别是，反义RNA)更有效（数个数 量级）。Fire等，1998对RNA干涉命名为现象RNAi。这个有效的基因沉默机理已经显示在 大多数系统发育的门之中的数个种类中起作用。
[0008] 当叫作DICER的酶遇到dsRNA，并且将其切割成叫作小干扰RNAs或siRNAs的片 段时，RNAi开始。这种蛋白属于RNaseIII核酸酶家族。当蛋白复合物聚集这些RNA残余 物，并且将它们的密码用作寻找和破坏细胞中具有匹配序列的任何RNAs诸如目标mRNA的 向导（综述参见Bosher&Labouesse，2〇00)〇
[0009]RNAi现象（Akashi等，2001)可以总结如下：
[0010] ?步骤1 :dsRNA识别和扫描过程。
[0011] ?步骤2:通过RNAseIII活性分解dsRNA，并且产生siRNAs。
[0012] ?步骤3 :siRNAs和RISC复合体中缔合因子的缔合。
[0013] ?步骤4:识别互补的目标mRNA。
[0014] ?步骤5:在与siRNA互补区域中心分解目标mRNA。
[0015] ?步骤6:降解目标mRNA，并且再生RISC复合体。
[0016] 在将RNAi现象用作基因击倒技术的尝试中，很快意识到，哺乳动物细胞已经发展 了针对病毒感染的各种保护现象，这些保护线性可以妨碍这种方法的应用。实际上，极低水 平的病毒dsRNA的存在引发了干扰素应答，这导致翻译的全面非特异性抑制，其又引发了 程序性细胞死亡（Williams，1997,Gil&Esteban，2000)〇
[0017] 在2000年，使用dsRNA的第一次尝试导致小鼠卵母细胞和早期胚胎中的3种基因 的特异性抑制（MmGFP受控于延伸因子la、E-f丐黏着蛋白和c-mos)。翻译被抑制，因此，当 所述胚胎继续发育时，没有观察到PKR应答（Wianny&Zernicka-Goetz，2000)。一年后，关 于RibopharmaAG(Kulmbach，Germany)的研究首次证明了RNAi在哺乳动物细胞中的功能 性。使用短的（20-24碱基对）dsRNAs-其叫作SIRPLEX?-它们甚至在人细胞中特异性地关 闭基因，而不起始急性期反应。后来其它的研究小组进行的类似实验（Elbashir等，2001; Caplen等·，2001)进一步证明了这些结果。
[0018] -年后，Paddison等（Paddison等，2002)尝试应用折叠成发夹结构的小RNAs来 抑制特异的基因的功能。这一工作受到早先的研究的启发，早先的研究表明，线虫中的一些 基因通过编码发夹结构的RNAs的RNAs而天然地调控其它基因。在各种正常的和癌症的人 和小鼠细胞系中检测，短的发夹RNAs(shRNAs)能够如同它们的siRNA副本那样有效地沉默 基因。此外，shRNA在体内展现出比等价双链体更少的再缔合动力学。甚至更重要的，这些 作者制备了转基因细胞系，这些转基因细胞系被加工以合成在细胞分裂过程中表现出持续 长久的抑制作用的shRNAs(Eurogentec)。最近，表明另一组小RNAs(也包括在21-25nt范 围内）介导基因表达的下调。已经在线虫中描述了这些叫作小的瞬时调控RNAs(stRNAs) 的RNAs，在线虫中，它们调控发育过程中基因表达时间。应该注意到，尽管有明显的相似性， 但是stRNAs和siRNAs通过不同的作用模式发生（综述参见Banerjee&Slack，2002)。与 siRNAs相反，22nt长的stRNAs在翻译起始后下调目标mRNA的表达，而不影响mRNA的完整 性。最近的研究表明，最初在线虫类中描述的两种stRNAs是线虫类中存在的具有上百种其 它微-RNAs(miRNAs)的大家族中的成员（Grosshans&Slack，2002)。
[0019] 科学家开始将RNAi用在一些系统中，包括线虫、果蝇、锥虫和各种其它的无脊椎 动物。并且，应用这种方法，一些小组最近描述了在不同的哺乳动物细胞系-特别是在Hela 细胞中-的蛋白生物合成的特异性抑制，这表明RNAi是在体外用于基因沉默的广泛适用的 方法。基于这些结果，RNAi已经迅速地成为确定（鉴定和分配）基因功能的公认工具。并 且，应用短dsRNA寡聚核苷酸的RNA干扰将允许解释只被部分测序的基因的功能。因此，在 诸如下列各项的研究中，RNAi将是不可避免的：
[0020] ?在真核细胞中在转录后水平上抑制基因表达。在这一内容中，RNAi是快速评估 基因功能和揭示无效表型的直接工具。
[0021] ?研发RNAi技术用于移植后的胚胎。
[0022] ·RNA干扰主要的经济显著性由其作为治疗原理的应用而建立。由于此，RNAi可 以产生治疗人类疾病的基于RNA的药物。
[0023] 青光眼
[0024] 青光眼是盲的主要原因之一。世界范围内接近15%的盲的情况由青光眼产生。最 普通的类型，原发性开角型青光眼，在超过40岁的一般人群中具有1/200的发病率。
[0025] 已经将青光眼简单限定为由眼内压力（Ι0Ρ)持续升高超过其正常生理极限的所 引起视觉组织破坏的过程。
[0026] 越来越清楚，许多形式的青光眼具有遗传成分，并且更多的当前研究集中在识别 染色体区域和促进青光眼的基因。可能是0AG的病因学是多因素的，由超过一种基因中的 突变的组合和至今未经确认的环境因素产生。关于青少年和成年人发作的0AG，已经识别了 数个基因座。然而，仅已知一种基因，即染色体Iq21-q31上的GLC1A基因座处的肌纤蛋白/ TIGR(小梁网可诱导的糖皮质激素反应）基因。在全世界的人种学多样的人群中已经识别 了超过三十种该基因的突变。研究显示了它仅导致了总0AG的大约5% (见WirtzSamples， 2003，和Khaw等，2004a中的评论）。
[0027] 发病机制
[0028] 虽然升高的水平可能不同，但是大多数的青光眼的特征在于升高的Ι0Ρ。在那些青 光眼中，其中所述升高最初是低的（即，开角型青光眼、黑色素细胞青光眼）并且一些继发 性青光眼、视网膜神经节细胞和视神经损害发展缓慢。在闭角型青光眼中Ι0Ρ的突然高度 升高经常致使眼盲，无疑主要由于在筛板水平的轴浆流中止。
[0029] 在人的研究中，已经广泛地接受，组织坏死在青光眼发生的视神经盘损害的引发 或进行中起作用。视网膜神经节细胞退化可以是坏死，但是由I0P的升高触发细胞凋亡的 可能性是似乎合理的，并且认为一氧化氮和谷氨酸的各自作用在所述疾病的进行期间是相 关的（对于这个问题上最近的综述见Osborne等，2003)。
[0030] 治疗
[0031] 虽然数种病因学涉及青光眼综合征，但是疗法选择中绝对的决定因素是虹膜角膜 角之内压力的原发性和/或诱导的改变量。
[0032] 虽然升高的Ι0Ρ导致青光眼中神经元损害的病理生理的机理是未知的，但是当前 的治疗包括针对降低这种压力的药物治疗或外科手术。
[0033] 可以利用四种类型的药物尝试医药抑制升高的Ι0Ρ:眼房水形成抑制剂（在它们 之中有碳酸酐酶抑制剂、β-肾上腺素能阻滞剂、或α2-肾上腺素能受体激动剂）；缩瞳剂 (即拟副交感神经药-胆碱功能药物_、或抗胆碱酯酶抑制剂）；眼色素层巩膜流出增强剂； 和高渗试剂（穿过睫状体上皮之内的血液/水屏蔽产生渗透压梯度）。将全部四种用于青 光眼的治疗中，前三种通常作为急诊治疗和长期的控制，而所述高渗试剂作为急诊和手术 前治疗是宝贵的。第五类药物，神经保护试剂，正在开始出现为对于医药治疗的重要的可能 添加物。实际上，N0S和谷氨酸水平在青光眼中升高并且它们涉及视网膜神经节细胞坏死或 细胞凋亡的观察增加了神经保护治疗和甚至是神经再生的可能性。因而氨基酸激发拮抗剂 N0S抑制剂、谷氨酸受体拮抗体、细胞凋亡抑制剂和钙通道封阻剂是将来青光眼治疗的发展 中的全部潜在的选择物。所述钙通道可以减少微循环对视神经头部的削弱效果，同时在小 梁细胞水平潜在增加流出的可能性。
[0034] 在参考文献中给出了多种眼病和它们的治疗的评论，特别是在Bunce(2005)、 Costagliola(1995,2000)、Cullinane(2002)、Sakaguchi(2002)、Shah(2000)、和 Wang(2005)中。
[0035]目前我们的现有治疗肯定达不到目的并且与流出可能性的评价、治疗的精确监控 和外科技术的复杂性有关的实际困难全部组合而困扰预后；全部青光眼中占优势的因素是 视网膜神经节细胞的退化，因而通过有效的低眼压的神经保护是我们使用的任何治疗的基 本需要（对于在这个问题上的最近综述，见Khaw等2004b)。
[0036] 发明概述
[0037] 在本发明中发明人描述了用于治疗眼病症的方法，特征在于改变动物包括人中的 Ι0Ρ。特别是，眼病症可以包括青光眼、葡萄膜炎、和炎症。所述方法基于基因表达的下调， 所述基因涉及眼中的眼房水（aqueous)形成或眼房水流出。可以通过双链核酸部分的使用 影响下调，命名为siNA或小干涉的NA，其定向于干涉多种候选基因的mRNA表达。尽管修饰 的核酸或类似的化学合成的实体也包括在本发明的范围内，但是所述siNA优选是siRNA。
[0038] 本发明的优选实施方案涉及siNA的局部施用。本发明的实施方案也提供了供治 疗眼病症用的药物组合物。本发明可以使用在局部眼治疗、涉及青光眼发病机制的目标基 因、还有化学合成的实体治疗动物（包括人）疾病的用途的领域内。
[0039] 除青光眼的治疗之外，本方法也适于治疗所述眼的前房的其它疾病。特别是，所述 方法可以应用于疾病的治疗，其特征在于改变眼中的眼房水形成或流出。可以治疗的病症 实例包括局部病症诸如感染或炎症，和一般病症诸如葡萄膜炎或全身疾病的表现。另外，本 发明的某些实施方案提供用于糖尿病性视网膜病的治疗。
[0040] 发明详述
[0041] 目标基因
[0042] 本发明中，本发明发明人限定一系列目标基因，其表达水平可以改变Ι0Ρ。这些基 因可以属于涉及眼房水形成的基因的组或者涉及眼房水流出的基因的组。这里是我们的目 标基因系列：
[0043] ?碳酸酐酶II、IV和XII
[0044] 鲁肾上腺素能药受体：β1和2以及αIA、IB和ID
[0045] ?乙酰胆碱酯酶
[0046] ?环加氧酶1和2
[0047] ?腺苷三磷酸酶：α1、α2、α3、β1、β2
[0048] ?内皮性白细胞粘着分子I(ELAM-1)
[0049] ?血管紧张素系统：血管紧张素II、血管紧张素II转化酶类（ACEI和ACEII)、 血管紧张素II受体（ATR1和ATR2)和肾素
[0050] ·Cochlin
[0051] siNA的设计
[0052] 尽管RNAi的机制尚未已知，但是产生特异性的dsRNA寡核苷酸所需的步骤是清楚 的。已经表明，长度为21-26个核苷酸的dsRNA双链体链在产生RNA干扰中最有效。选择 基因内部正确的同源区域也是重要的。当考虑产生用于RNAi的dsRNA时，诸如距