可断裂peg载阿霉素脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药品技术领域，尤其涉及一种载阿霉素脂质体的制备方法。
【背景技术】
[0002]将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过SephadexG50凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。理想的肿瘤靶向给药系统，需要同时具有高效的肿瘤蓄积能力和强入胞作用。在脂质体表面修饰聚乙二醇，可显著延长脂质体的循环时间，通过EPR效应使肿瘤蓄积增加，但PEG的存在同时也阻碍了脂质体与肿瘤细胞的相互作用，使药物无法有效的被递送到肿瘤细胞内发挥抗癌活性。为克服这一弊端，近年来开发出一系列可断裂PEG技术，包括:pH敏感型,酶敏感型,还原敏感型等，对于还原敏感型可断裂PEG构建的脂质体，主要通过二硫键作为桥接分子连接PEG和脂质材料，当脂质体在肿瘤部位高度蓄积后，通过外源性给予还原剂如半胱氨酸等，就可使PEG从脂质体表面断裂开来，还原敏感型可断裂PEG策略具有材料合成简单，断裂易于控制等优越性。TAT肽作为一种强效的细胞穿膜肽被修饰于脂质体后可以促进脂质体高效入胞，但TAT的非选择特异性导致其肿瘤蓄积较低。
【发明内容】
[0003]本发明就是针对上述问题，提供一种提高肿瘤蓄积以及进入肿瘤细胞的效率的一种可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0005]可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法，包括下步骤。
[0006](1)将处方量的 SPC，Cho, DSPE-PEG-TAT, DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋转蒸发成膜，于真空干燥器中过夜，加入2.5mlPBS缓冲液，于空气浴摇床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超声5min脱膜，探头超声制备得到TAT和遮挡PEG共修饰的脂质体(脂质浓度2.068ymol/ml);其中，制备Rh-ΡΕ标记的脂质体时，需在脂质材料中加入荧光标记的磷脂，用量为每份脂质体20 μ go
[0007](2)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过SephadexG50凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。
[0008](3)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。
[0009]作为一种优选方案，采用的仪器包括，ZHWY-100H型恒温空气摇床；RE_200B型旋转蒸发仪；恒温水浴锅；SB-5200D超声波清洗仪；AL204-1C电子天平；超声细胞粉碎机；RF-5301荧光分光光度计；SizerNanoZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪；细胞培养板；C02培养箱；SkanIt生物发光仪；SW_CJ-ZFD水平流净化工作台；XD_RFL倒置荧光显微镜；凝胶分离检测系统。
[0010]本发明有益效果。
[0011]本发明细胞穿膜肽和可断裂PEG共修饰的脂质体系统进行了进一步的优化，体外细胞当以10%的可断裂PEG5000修饰脂质体时，可断裂PEG对TAT的屏蔽率达到最大值94%，因此脂质体稳定性好，从而提高药物的抗肿瘤效率。以该处方的脂质体系统对阿霉素进行包载，以粒径，电位及包封率为指标筛选载药脂质体的制备工艺，所制备的载D0X的共修饰脂质体粒径均匀在90nm左右，PDK0.2分散性良好，zeta电位接近电中性，包封率>95%。成功的实现了对载阿霉素共修饰脂质体的制备和优化，所制备的脂质体稳定性好，载药量高，这也是该载药系统能够最终实现有效的抗肿瘤作用的必备条件。
【具体实施方式】
[0012]可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法，包括下步骤。
[0013](1)将处方量的 SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋转蒸发成膜，于真空干燥器中过夜，加入2.5mlPBS缓冲液，于空气浴摇床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超声5min脱膜，探头超声制备得到TAT和遮挡PEG共修饰的脂质体(脂质浓度2.068ymol/ml);其中，制备Rh-ΡΕ标记的脂质体时，需在脂质材料中加入荧光标记的磷脂，用量为每份脂质体20 μ go
[0014](2)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过SephadexG50凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。
[0015](3)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。
[0016]作为一种优选方案，采用的仪器包括，ZHWY-100H型恒温空气摇床；RE_200B型旋转蒸发仪；恒温水浴锅；SB-5200D超声波清洗仪；AL204-1C电子天平；超声细胞粉碎机；RF-5301荧光分光光度计；SizerNanoZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪；细胞培养板；C02培养箱；SkanIt生物发光仪；SW_CJ-ZFD水平流净化工作台；XD_RFL倒置荧光显微镜；凝胶分离检测系统。
[0017]不同总磷脂与胆固醇的比例下制备的脂质体包封率，粒径电位无显著差异，包封率均在90%以上，由于我们脂质体处方中PEG5000含量较高，将使脂质体膜稳定性下降，考虑到胆固醇在维持脂质体膜稳定性中的“膜缓冲剂”作用。
[0018]选择300mM硫酸铵缓冲液为水化溶剂，载药前脂质浓度2.585 μ mol/mL;，以PBS(pH=7.4)为洗脱溶剂替换外水相的硫酸铵，载药温度为45°C，载药时间为15min，药脂比为1:10ο
【主权项】
1.可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法，包括下步骤； (1)将处方量的SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 置 50ml 茄形瓶中，氯仿溶解后旋转蒸发成膜，于真空干燥器中过夜，加入2.5mlPBS缓冲液，于空气浴摇床中，35°C，150rpm, 28min水化，水浴超声5min脱膜，探头超声制备得到TAT和遮挡PEG共修饰的脂质体(脂质浓度2.068 μ mol/ml);其中，制备Rh_PE标记的脂质体时，需在脂质材料中加入荧光标记的磷脂，用量为每份脂质体20 μ g ; (2)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体；将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过S印hadexG50凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体； (3)将脂质材料抽干成膜后，加入lmL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体；将该lmL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过凝胶柱替换外水相，收集脂质体组分于2mL容量瓶中，用外水相缓冲液定容后，加入适量盐酸阿霉素水溶液，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。2.根据权利要求1所述可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，采用的仪器包括，ZHWY-100H型恒温空气摇床；RE-200B型旋转蒸发仪；恒温水浴锅；SB-5200D超声波清洗仪；AL204-1C电子天平；超声细胞粉碎机；RF_5301荧光分光光度计；SizerNanoZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪；细胞培养板；C02培养箱；SkanIt生物发光仪；SW-CJ-ZFD水平流净化工作台；XD-RFL倒置荧光显微镜；凝胶分离检测系统。
【专利摘要】可断裂PEG载阿霉素脂质体的制备方法属于药品技术领域，尤其涉及一种载阿霉素脂质体的制备方法。本发明提供一种提高肿瘤蓄积以及进入肿瘤细胞的效率的一种载阿霉素脂质体的制备方法。含糖聚合物修饰纳米粒的制备方法，包括下步骤。（1）将处方量的SPC，Cho，DSPE-PEG-TAT，DSPE-PEG-OMe置50ml茄形瓶中，氯仿溶解后旋转蒸发成膜，于真空干燥器中过夜，加入2.5mlPBS缓冲液。（2）将脂质材料抽干成膜后，加入1mL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。（3）将脂质材料抽干成膜后，加入1mL硫酸铵缓冲液，水化超声制备出均匀的小单室脂质体。将该1mL脂质体以一定的缓冲液洗脱通过凝胶柱替换外水相，一定温度下孵育即得阿霉素脂质体。
【IPC分类】A61K47/10, A61K9/127, A61K31/704, A61P35/00, A61K47/42
【公开号】CN105310983
【申请号】CN201410376265
【发明人】孙仁
【申请人】孙仁
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年8月3日