75] 从图中还可看出，当骨水泥液固比增大时，凝结时间逐渐变大；当骨水泥固体粉末 中TTCP/DCPA的量增加时，凝结时间减小；与用固化液A相比，当用固化液B时，骨水泥凝结 时间稍微增大；但在一定的范围内，骨水泥的液固比、两种固相粉末的比例以及两种不同固 化液对骨水泥的凝结时间影响不大。
[0076] 2、抗压强度测试方法如下：
[0077] 待骨水泥样品在模具中固化成型后放入37°C，100%湿度培养箱内孵育，分别在 1、3、5、7、14天时取出，将两端用细砂纸磨至水平，然后用万能试验机测量固化体的抗压强 度，施加载荷速度为lmm/min，最大压力2000N，每组数据由5个平行实验得到。
[0078] 结果如图2-5所示，由图2-5可以看出，制备的12种骨水泥中，随着固化时间的延 长，抗压强度均逐渐增大。除了样品4,其他骨水泥孵育两周后抗压强度均在30MPa以上， 尤其是样品2孵育两周时的强度为43MPa，比样品4的抗压强度高很多，这可能是因为柠檬 酸钙颗粒变小后，与固化液的接触面积变大，骨水泥水化反应充分，并且柠檬酸钙与HA或 TTCP/DCPA的颗粒粒度相匹配，晶体接触点多，达到紧密的堆积，减小了孔径和孔隙率，故抗 压强度高。而过粗的粉体不利于材料形成细密的结构。
[0079] 从图2-5还可以看出，用固化液A要比固化液B制备的骨水泥强度高一些，这可 能是因为使用两种固化液时，复合骨水泥的固化机理不同。从图3可以看出，当液固比在 0. 7-1. 2ml/g范围内时，抗压强度随着液固比的增加先增大后减小；从图4可以看出，由柠 檬酸钙与TTCP/DCPA复合的骨水泥，在一定范围内，随着TTCP/DCPA比例的增加，复合骨水 泥强度逐渐增大；从图5可以看出，使用固化液B时，与柠檬酸钙ATTCP/DCPA)复合骨水泥 相比，柠檬酸钙/HA复合骨水泥的早期强度相对较低，随着孵育时间的延长，两种骨水泥的 抗压强度都是先迅速增大，后趋于平稳，而柠檬酸钙/HA复合骨水泥在两周时的强度相对 较高。
[0080] 实施样品1和样品10的X射线衍射分析：
[0081] 分别将固化1天和7天时的骨水泥用研钵磨成细粉，通过X射线衍射仪对样品进 行分析，研究两种骨水泥的固化机理，X射线衍射仪的工作条件：CuKa，管电压40KV，管电流 25mA〇
[0082] 样品1固化ld、7d时的XRD衍射图谱见图6,可以看出，图a、b中各峰的位置和 PDF:28-2003的标准卡片【Ca3(C6H507) 2 · 4H20】和09-0432的标准卡片【Ca5(P04) 3 (0H)】很 相似，这是因为骨水泥的主要成分是柠檬酸钙和羟基磷灰石。对比图a，图b中柠檬酸钙的 特征峰有所宽化，而羟基磷灰石的特征峰更尖锐一些，这说明随着骨水泥固化时间的延长， 骨水泥中的固相与液相发生水化反应，生成少量的羟基磷灰石。
[0083] 样品10固化ld、7d时的XRD衍射图谱见图7,可以看出，图a、b中各峰的位置和 PDF:28-2003 的标准卡片【Ca3(C6H507) 2 ·4Η20】、25-1137 的标准卡片【Ca4(P04)20】和 09-0080 的标准卡片（CaHP04)很相似，这是因为骨水泥的主要成分就是柠檬酸钙、磷酸四钙和磷酸 氢钙，对比图a，图b中最明显的变化是柠檬酸钙在5. 8°、12.Γ和17°的特征峰都减弱， 而在32°时出现了很明显的羟基磷灰石的特征峰，这说明随着骨水泥固化时间的延长，骨 水泥中的固相与液相发生水化反应，生成少量的羟基磷灰石。
[0084] 样品1和10的X射线衍射分析结果表明，两种复合骨水泥水化反应的最终产物都 是羟基磷灰石，这说明两种骨水泥都具有良好的生物相容性和骨引导性。
[0085] 效果实施样品10细胞生物相容性实验：
[0086] 将纳米级片状柠檬酸钙与TTCP/DCPA按质量比2:1混合均匀，加入固化液A，液固 比为0.8:1，调和搅拌后将所得膏状物置入模具，脱模后将其切片为cp7.Smmxlmm圆片作 为实验组；以纳米级片状柠檬酸钙为骨水泥固相，加入固化液A，液固比为1: 1，调和搅拌后 将所得膏状物置入模具，脱模后将其切片为(P7.5mmx1mm圆片，作为对照组。
[0087] 将两种样品用超声清洗ld，环氧乙烷灭菌2h后烘干备用。在无菌条件下，将样品 放于24孔板底部，加入MG63细胞悬浮液（2X104个/孔），以90 %F12+10 %小牛血清作为 培养基，将样品置于37°C，100%湿度，5% 0)2浓度的恒温孵箱中培养，每两天换一次培养基 (每组5个平行样）。
[0088] 将MG63细胞与样品材料共培养Id和4d时，弃去培养板孔内的培养基，加入 0·lmol/L，pH7. 2-7. 4 的PBS(无Ca2+、Mg2+)，清洗样品 2 次，各lmin。在 2. 5%戊二醛/PBS 溶液中固定2h。用梯度乙醇溶液脱水：30 %，50 %，75 %，80 %各lOmin，100 %乙醇3次，每 次lOmin。醋酸异戊酯替换30min，临界点干燥，喷金后于扫描电镜下观察细胞在样品表面 的形貌及粘附和铺展情况。
[0089]结果如图8所示，由图8可以看出，共培养1天时（图a、b)，细胞在材料表面以细 胞突起伸入到材料表面颗粒之间，牢固地黏附于材料表面，此时细胞外基质较少，细胞分布 分散，呈单个生长，细胞间界线很清楚。与对照组相比，实验组细胞铺展较好，部分可见相互 之间通过伪足连接，而对照组细胞很多还呈球状，没有铺展开。共培养4天时（图c、d)，材 料表面细胞分裂增殖，细胞数量增多，细胞排列致密连成片，形状多样化，含有多角星形细 胞并伴有更多的丝样伪足，胞外基质也很多，细胞外基质中有丝状纤维链接。与对照组相 比，实验组细胞排列更为致密，并呈现多层细胞分布的现象，这说明柠檬酸钙与TTCP/DCPA 的复合骨水泥更有利于细胞的增殖分化，具有更加优异的细胞活性。
【主权项】
1. 含柠檬酸钙的骨水泥，所述骨水泥由固相部分和液相部分组成，其特征在于，固相部 分由柠檬酸钙和磷酸钙盐复合而成，柠檬酸钙和磷酸钙盐的质量比为2~5 : 1;并且，液 固比为0. 5~1. 5 : 1。2. 根据权利要求1所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述磷酸钙盐为磷酸四钙、 磷酸氢钙、羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙或二水磷酸二钙中的至少一种；优选的，所 述磷酸钙盐为磷酸四钙、磷酸氢钙或羟基磷灰石中的至少一种。3. 根据权利要求2所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述磷酸钙盐为磷酸四钙 和磷酸氢钙的混合物，磷酸四钙与磷酸氢钙的摩尔比为1 : 1;或所述磷酸钙盐为羟基磷灰 石。4. 根据权利要求3所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述含柠檬酸钙的骨水泥 中， 所述磷酸钙盐为磷酸四钙和磷酸氢钙的复合物时，柠檬酸钙与磷酸钙盐的质量比为 2 : 1 ;或： 所述磷酸钙盐为羟基磷灰石时，柠檬酸钙与磷酸钙盐的质量比为3 : 1。5. 根据权利要求1~4所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述柠檬酸钙为四水柠 檬酸钙、二水柠檬酸钙、无水柠檬酸钙或微米级球状柠檬酸钙、纳米级片状柠檬酸钙、纳米 级纤维状柠檬酸钙。6. 根据权利要求1~5任一项所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述骨水泥中， 液相部分为：腿#04和Κ2ΗΡ04水溶液的混合液，ΚΗ孑04和Κ2ΗΡ04的摩尔比为1 : 1 ;或液相 部分为：梓檬酸和梓檬酸钾水溶液的混合液，朽1檬酸和梓檬酸钾的质量比为5 : 1。7. 根据权利要求6所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述液相部分中，KH2P0JP Κ2ΗΡ04的浓度均为0. 2~lmol/L;进一步，KH2P〇dPΚ2ΗΡ04水溶液的混合液中还含有海藻酸 钠、壳聚糖或明胶中的至少一种。8. 根据权利要求6所述含柠檬酸钙的骨水泥，其特征在于，所述液相部分中，柠檬酸和 柠檬酸钾水溶液的混合液由质量分数为25%的柠檬酸、5%的柠檬酸钾和质量分数为70% 的去离子水组成。9. 权利要求1~8任一项所述含柠檬酸钙的骨水泥的制备方法，其特征在于，将柠檬 酸钙和磷酸钙盐按质量比2~5 : 1均匀混合形成固相复合物，再按液固比0.5~1.5 : 1 将骨水泥用固化液与固相复合物搅拌混匀形成骨水泥膏体，然后将膏体在室温条件下自然 固化成型得到含柠檬酸钙的骨水泥。10. 根据权利要求9所述含柠檬酸钙的骨水泥的制备方法，其特征在于，所述固化液为 腿孑04和K2HP047K溶液的混合液，KH孑04和Κ2ΗΡ04的摩尔比为1 : 1 ;或： 所述固化液为梓檬酸和梓檬酸钾水溶液的混合液，朽1檬酸和梓檬酸钾的质量比为5 : 1〇
【专利摘要】本发明属于骨损伤修复医用材料领域，具体涉及一种含柠檬酸钙的骨水泥的制备方法与应用。本发明提供一种含柠檬酸钙的骨水泥，所述骨水泥由固相部分和液相部分组成，其中，固相部分由柠檬酸钙和磷酸钙盐复合而成，柠檬酸钙和磷酸钙盐的质量比为2～5︰1；并且，液固比为0.5～1.5︰1。本发明所提供得含柠檬酸钙的骨水泥具有良好的可塑性、骨引导性、骨诱导活性、细胞活性和较好的降解率的综合生物医学性能，适用于骨科、脑外科和颅颌面整形修复。
【IPC分类】A61L27/50, A61L27/12
【公开号】CN105396175
【申请号】CN201511008235
【发明人】李峻峰, 刘雨晴, 高阳, 赵瑞兰, 邹琴, 曹文强, 钟良兆, 赖雪飞
【申请人】成都理工大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月29日