一种治疗大肠癌的药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种药物，尤其设及一种治疗大肠癌的药物。
【背景技术】
[0002] 大肠癌是一种形势严峻的全球性疾病。2012年，近70万人死于大肠癌，新增病例 140万。化疗是晚期大肠癌的主要治疗方法。传统化疗药物的细胞毒作用常引起不同程度的 毒副反应及组织脏器的损伤，严重影响病人的生存质量。祀向治疗是在细胞分子水平上，针 对已经明确的致癌位点（肿瘤细胞内的蛋白分子或基因片段)设计相应的治疗药物，药物进 入体内会特异地结合致癌位点，使肿瘤细胞特异性死亡，而不波及正常组织细胞，代表了肿 瘤治疗的新方向。但是，由于肿瘤基因组的复杂性和高概率的基因突变，导致包括大肠癌在 内的大部分肿瘤对单一祀点的祀向治疗耐药，因此推出新的系统疗法变得十分迫切。
[0003] p38MAPK(p38丝裂原活化蛋白激酶）和mTOR(雷帕霉素祀体蛋白）被作为肿瘤祀向 治疗的祀点而广为研究。P38MAPK是细胞对热、紫外福射、炎症因子等压力刺激作出反应的 关键调控因子。P38MAPK蛋白有p38a、p380、p38 丫和p3如四个亚基，p38a亚基相对其它S种 更普遍存在。P38MAPK憐酸化包括转录因子和激酶在内的大量底物，运些底物在炎症反应、 细胞分化、细胞周期和调亡中发挥重要作用。越来越多的证据显示P38MAPK在许多（包括癌 症在内的）其它疾病中同样扮演重要角色。大肠癌、乳腺癌、滤泡性淋己瘤、神经胶质瘤、头 颈部鱗癌、肺癌、甲状腺癌中都显示p38a表达明显升高。临床前研究显示:在部分大肠癌中， p38a和p380对肿瘤细胞的存活和增殖至关重要，祀向抑制p38a和p3地能够增加大肠癌对5-氣尿喀晚和伊立替康的敏感性。但是在部分对P38MAPK激酶抑制剂耐药的大肠癌，P38MAPK 激酶抑制剂并不能抑制肿瘤生长。
[0004] mTOR是调控细胞生长的核屯、分子，它直接参与两个激酶复合物mTORCl和mT0RC2的 形成。mTORCl控制细胞生长和代谢过程，mT0RC2调节细胞存活。临床前研究显示:部分大肠 癌对mTOR激酶抑制剂敏感，mTOR激酶抑制剂单药可明显抑制肿瘤生长。但是在部分耐药大 肠癌，mTOR激酶抑制剂对肿瘤生长没有抑制作用。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种治疗大肠癌的药物，对P38MAPK 激酶抑制剂和mTOR激酶抑制剂耐药的大肠癌均具有良好治疗效果。本发明解决上述技术问 题所采取的技术方案为：
[0006] 一种治疗大肠癌的药物，T0R38,由P38MAPK激酶抑制剂、mTOR激酶抑制剂和辅助剂 组成;其中，P38MAPK激酶抑制剂为SB202190，mT0R激酶抑制剂为0SI027。
[0007] 为了优化上述的技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[000引优选地，SB202190与0SI027的质量比为1:2~1:3。
[0009] 优选药物为注射剂。
[0010] 优选地，上述药物为液体注射剂或注射用粉剂。
[0011] 优选地，上述辅助剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液包括水和有机组分。
[0012] 优选地，上述有机组分选自注射用大豆油、乙醇、丙二醇、聚乙二醇，吐溫-80、司 盘-85、普流罗尼F-68、簇甲基纤维素、海藻酸钢、聚乙締化咯烧酬、明胶、甘露醇、山梨醇、 单硬脂酸侣或硅油的一种或几种，水为注射用水。
[0013] 优选地，上述药物的还可W为口服的片剂或颗粒胶囊。
[0014] 另一方面，本发明还提供上述的药物在制备治疗大肠癌的药物中的应用。
[0015] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:本发明的治疗大 肠癌的药物，针对P38MPK激酶抑制剂和mTOR激酶抑制剂耐药的大肠癌均具有治疗效果，治 疗效果相较传统药物疗效稳定，为大肠癌的化疗提供了一种新的药物和治疗思路。
【附图说明】
[0016] 图1为横酷罗丹明B(SRB)比色法测定的不同药物抑制大肠癌细胞生长的结果。冲< 0.0 lvs. SB202190 ；★?<0.0 lvs. 0SI027〇
[0017] 图2为平板克隆形成实验中测定不同药物抑制大肠癌细胞克隆形成的结果(大肠 癌细胞分别用58202190,051027，1'01? 38干预。柱状图为平板克隆形成结果的定量，*口< 0.Olvs.SB202190;^p(O-Oivs-OSIOST)C
[0018] 图3为软琼脂集落形成实验中测定不同药物抑制大肠癌细胞软琼脂集落形成的结 果（大肠癌细胞分别用SB202190,0SI027，T0R 38干预。柱状图为软琼脂集落形成结果的定 量，冲<0.0 lvs. SB202190 ;★?<0.0 lvs.0SI027)。
[0019] 图4为通过叮晚澄染色分析药物处理大肠癌细胞72小时后的调亡情况(大肠癌细 胞分别用SB202 190 ,OS I 027 ,TOR38处理72h，然后进行日丫晚澄染色并计数。*P< 0.Olvs.SB202190;^p(O-Oivs-OSIOST)C
[0020] 图5为通过PARP剪切实验分析药物处理大肠癌细胞72小时后的调亡情况(大肠癌 细胞分别用58202190,051027，1'01? 38处理7211，然后收集细胞并抽提细胞总蛋白，进行 western blot检测）。
[0021] 图6为免疫组化分析动物实验中分别用不同药物处理后大肠癌移植瘤的P-S6和 Ki67表达情况。（P-S6代表mTOR信号通路活性，Ki67代表肿瘤细胞增殖能力）。
[0022] 图7为Western blot分析动物实验中分别用不同药物处理后大肠癌移植瘤的mTOR 信号通路活性和P38MAPK信号通路活性。（P-S6K、P-AKT代表mTOR信号通路活性，P-MK2、P-HSP27代表P38MAPK信号通路活性）。
[0023] 图8为用TU肥L染色分析动物实验中不同药物处理后大肠癌移植瘤的细胞调亡情 况。柱状图为大肠癌移植瘤细胞调亡结果的定量。数据代表均值±标准差（n = 10)，巧< 0.0 lvs. SB202190 ；★?<0.0 lvs. 0SI027〇
[0024] 图9为动物实验中不同药物处理后大肠癌移植瘤的体积(肿瘤体积数据代表均值 ± 标准差(n = 10)，冲 <0.0 lvs. SB202190，★?<0.0 lvs. 0SI027)。
【具体实施方式】
[002引本发明提供了一种治疗大肠癌的药物，由P38MAPK激酶抑制剂、mTOR激酶抑制剂和 辅助剂组成;其中，P38MAPK激酶抑制剂为SB202190，mT0R激酶抑制剂为0SI027。
[0026] 下面通过具体实施例(实验)对本发明进行详细和具体的介绍，W使更好的理解本 发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。如无特殊说明，实施例中各个体外验证实验的 大肠癌细胞系肥Tl 16、SWl 116、SW620均购自ATCC，按照ATCC说明培养。S种细胞系均设置对 照组、SB202190作用组、0SI027作用组W及TOR 38作用组【SB202190+0SI027联合作用组（即本 申请的药物)】。体内验证实验设置对照组、SB202190作用组、0SI027作用组W及TOR 38作用组 【SB202190+0SI027联合作用组（即本申请的药物)】。
[0027] 实施例一横酷罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法
[002引实验采用S种大肠癌细胞系HCTl 16、SWl 116、SW620, S种细胞系均设置对照组、 SB202190作用组、0SI027作用组W及TOR38作用组【SB202190+0SI027联合作用组（即本申请 的药物)】。具体的实验方法为：
[0029] (1)取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，膜蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均 匀，取两滴细胞悬液台吩蓝染色，于显微镜下计数活细胞数目（死细胞数目不得超过5% )， 用完全培养液调整细胞数目至1 X 105个细胞/毫升。
[0030] (2)于96孔细胞培养板中每孔加入1 OOiil细胞悬液，将培养板置于C02培养箱中培 养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品的完全培养液，每个浓度设3个 平行孔，另设A行细胞加入不含药完全培养液作正常对照孔(C)。
[0031 ] (3)加药完成后，吸出空白孔中培养液，去离子水洗5遍。培养板于微孔板振荡器上 振荡混匀，置于C02培养箱中继续培养48小时。
[0032] (4)取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50山预冷的50%的S氯醋酸(TCA)固 定，静置5分钟后，再将培养板移至4°C放置1小时。
[0033] (5)倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入10化1 SRB液， 在室溫放置10分钟，未与蛋白质结合的SRB用1 %醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用15化1 lOmmol/L非缓冲化is碱液(P化