靶向经修饰的tnf家族成员的制作方法

靶向经修饰的tnf家族成员的制作方法
【专利说明】祀向经修饰的TNF家族成员
[0001] 本发明设及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子， 其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至祀细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF 超家族的成员的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对 受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至祀细胞。祀向通过使TNF超家族 的经修饰的细胞因子融合于祀向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步设 及TNF超家族的所述祀向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
[0002] TNF超家族由通过调控细胞死亡、增殖和分化而在免疫系统中具有至关重要功能 的促炎性细胞因子组成。此外，所述家族的成员被描述为对骨代谢、神经系统、新血管系统 和癌发生施加作用。它含有W自我装配性非共价结合的同=聚体形式具有生物活性的19种 配体，即n型(细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白。尽管大多数TNF超家族配体W膜结合 的蛋白质形式合成，但可通过蛋白水解裂解来产生可溶性形式。它们全都通过它们的C末端 TNF同源性结构域来结合一种或多种来自TNF受体超家族的分子，所述结构域在家族成员之 间展现约20-30%序列同源性。迄今为止，已在人中鉴定了 29种TNF超家族受体。运些主要是 在配体结合细胞外结构域中具有富含半脫胺酸的基序的I型(细胞外N末端、细胞内C末端） 跨膜糖蛋白。然而，存在一些例外，如通过共价连接的C末端糖脂连接于膜的TRAIL-R3。可溶 性受体可通过蛋白水解裂解(例如TNF-Rl和TNF-R2)或通过选择性剪接编码跨膜结构域的 外显子来产生。运个超家族的受体可基于它们的信号传导性质而被划分在3个组中：诱导调 亡的具有细胞质死亡结构域的受体;诱导如^-邮、1服、938、6服和？131(的若干信号传导路 径的具有TRAF相互作用基序的受体;和缺乏细胞内信号传导结构域的诱巧受体。TNF通过与 TNF-Rl (p55)相互作用来诱导调亡，而与TNF-R2(p75，主要在免疫细胞上表达)结合会促进 增殖。TRAIL信号传导更复杂，因为它可结合两种死亡受体（TRA化-RUDR4)和TRA^-R2 (0尺5))、两种诱巧受体（了1^化-1?3(0〔1?1)和了1?4化-1?4(0〔1?2))^及可溶性骨保护素 (OSteoprotegerin) (OPG)。与后S种受体中的一种结合抑制TRAIL介导的调亡，因为运栓系 TRAIL而远离死亡受体（Gaul"和Aggerwal, 2003; Hehlgan巧日Pfeffer, 2005; Huang和化eiWi, 2007)O
[0003] 死亡诱导性TNF超家族成员TNF、CD9化(FasL)和TRAIL是针对表达它们的相应受体 TNF-Rl、〔095^1?4比-1?巧町1?4比-1?2的癌症的潜在治疗剂。实际上^^最初在超过25年前被 发现为一种通过在体内导致某些肿瘤的出血性坏死而具有卓越抗肿瘤活性的因子。稍后， 变得明确的是归因于TNF的对肿瘤新血管系统的选择性损害也确定它的抗肿瘤潜力 化e jeune等，2006; van化rssen等，2006)。不幸的是，在癌症治疗中全身性使用TNF仍然受 阻于它的休克诱发性质。它当前在临床上仅与化学疗法组合用于隔离肢体灌注的环境中来 治疗软组织肉瘤和处于转变中的黑素瘤(Robeds等，2011)。此外，CD%L在全身性施用时是 有毒的，因为它导致归因于大量肝细胞调亡的致死性肝细胞毒性(Galle等，1995)。然而，已 显示TRAIL会诱导癌细胞的调亡，针对非转化细胞具有少许或不具有细胞毒性，并且在各种 晚期癌症中进行的临床试验报道在许多情况下疾病稳定。然而，为获得足够总体治疗活性， 需要组合治疗，此暗示归因于正常细胞对TRAIL诱导的调亡敏感的可能的副作用 (Ashkenaz巧日Herbst ,2008;hlschlehner等，2009)。已进行不同方法来使全身性施用死亡 诱导性TNF超家族成员后的毒性减至最小，如具有较低毒性和较高效率的突变TNF化i等， 2012)，通过肿瘤特异性部分来递送通常呈单链构建体形式的TNF或TRAIUde Bruyn等， 2013 ;Gregorc等，2009;Liu等，2006; Siegemund等，2012;Wang等，2006)，嵌合可溶性CD95L (Daburon等，2013)或激动性TRAIkRl、TRAIkR2或CD95特异性抗体（Johnstone等，2008; Ogasawara等，1993;化X等，2010)。它们中的一些可增加治疗指数，但从未达到它显著改进 临床结果的程度。
[0004]惊人地，我们发现有可能制备包含TNF超家族的细胞因子的构建体，其中所述细胞 因子被修饰W降低对受体的亲和力，其中所述细胞因子被连接于祀向部分，并且其中所述 构建体具有强烈降低的全身性毒性，并且仅对由祀向部分祀向的细胞显示显著生物活性。 [000引本发明的第一方面是一种构建体，其包含（i)TNF超家族的细胞因子链的S个拷 贝，其中所得细胞因子被修饰(被称为"经修饰的细胞因子"）W使对它的受体的亲和力降 低，（ii)连接子序列和(iii)祀向部分，其中所述连接子序列使细胞因子拷贝连接于所述祀 向部分。如此处所用的构建体可为本领域技术人员已知的任何蛋白质构建体，包括但不限 于经化学修饰的蛋白质、蛋白质复合物和融合蛋白。在一个优选实施方案中，使用个别自我 =聚化细胞因子链，其中一个或多个链可被连接于祀向部分。在另一优选实施方案中，=个 拷贝呈现为单链细胞因子;在一优选实施方案中，拷贝由连接子序列分隔W有助于W=聚 形式呈现细胞因子。对于本领域技术人员明确的是具有一个游离细胞因子链和两个彼此连 接的细胞因子拷贝的混合形式也是可能的。所得=聚细胞因子携带相较于野生型细胞因子 使它的生物活性降低的修饰。所述修饰可为降低正常野生型细胞因子的活性的修饰，或它 可为增加同源性、非内源性TNF家族细胞因子(如但不限于另一物种的不结合人TNF家族细 胞因子受体的TNF家族细胞因子)的活性的修饰。修饰可为本领域技术人员已知的降低或增 加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或酶修饰，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它 蛋白质W及突变。在细胞因子的两个或更多个拷贝被呈现为单链的情况下，可使连接子的 长度适合于扰乱正常=聚结构，从而导致对受体的活性较低。或者，可将特殊氨基酸并入连 接子中W修饰结构;所述氨基酸可进一步被修饰。作为一非限制性实例，可将赖氨酸并入连 接子中W允许达成聚乙二醇化。优选地，所述修饰是突变，甚至更优选地，它是降低细胞因 子对它的受体的亲和力的突变。如此处所用的降低的亲和力和随之发生的降低的生物活性 意指相较于正常结合受体的野生型细胞因子，经修饰的细胞因子具有的生物活性小于野生 型细胞因子的生物活性的70%，甚至更优选小于野生型细胞因子的生物活性的60%，更优 选小于野生型细胞因子的生物活性的50%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的 40%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的30%，更优选小于野生型细胞因子的生物 活性的20%，最优选小于野生型细胞因子的生物活性的10%。优选地，TNF超家族的经修饰 的细胞因子是TNF超家族的野生型细胞因子的突变体，并且将活性与TNF超家族的野生型细 胞因子进行比较。可通过为本领域技术人员所知的任何方法测量亲和力和/或活性。可通过 Scatchard作图分析和计算机拟合结合数据（例如Scatchard, 1949)，或通过如由Rrecht等 (1993)所述在流通条件下进行反射干设光谱法来测量相较于野生型TNF对受体的亲和力的 突变TNF对受体的亲和力。
[0006]优选地，所述细胞因子选自由FasUTRAIU TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、 T 肥AKL、LTa、L邱、LIGHT、CD2 化、41B化、G 口化、APRIL、EDA、VEG 巧邮AFF组成的组。优选地，所 述细胞因子呈现为单链，其中各链由连接子序列连接。
[0007] 使经修饰的细胞因子连接于祀向部分。如此处所用的"连接"可通过共价结合达 成，或它可通过亲和力结合达成。在一非限制性实例中，所述祀向部分可为对于一种特异性 来说针对祀细胞上的结合位点，W及对于另一特异性来说针对经修饰的细胞因子或融合于 所述细胞因子的标签的双特异性抗体。在另一非限制性实例中，祀向部分可被W化学方式 连接于经修饰的细胞因子，或它可为重组融合蛋白。优选地，所述祀向构建体是重组融合蛋 白。优选地，所述祀向部分使细胞因子祀向肿瘤环境，特别是祀向肿瘤血管系统(例如祀向 肿瘤的内皮细胞，通常是新内皮细胞）。甚至更优选地，祀向部分是可通过结合位点与结合 分子之间的特异性相互作用将融合蛋白向表达TNF超家族的细胞因子的受体，优选是能够 与经修饰的细胞因子相互作用的受体的细胞上的结合位点引导的结合分子。在一个优选实 施方案中，所述结合分子是特异性结合位于细胞的外部上的分子的小化合物。在另一优选 实施方案中，所述结合分子是针对在细胞壁上表达的凝集素（lectin)样分子的糖结构。在 另一优选实施方案中，所述结合分子是祀向肿瘤环境，优选祀向肿瘤血管系统的肤。所述肤 为本领域技术人员所知，并且包括但不限于NGR(祀向在肿瘤血管中表达的CD13亚型）和RGD 肤(化ng等，2011;W02005054293)。优选地，所述肤是祀向Qv抗整联蛋白（integrin)的RGD-4C 肤(Arap等，1998)。在另一优选实施方案中，所述结合分子是包含结合结构域的蛋白质。结 合结构域为本领域技术人员所知。所述结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合结构 域(C抓）（Blake等，2006)、重链抗体化cAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(Tramontane)等， 1994)、骆驼科重链抗体的可变结构域（VHH)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)、亲和体 (Nygren等，2008)、a体(alphabody) (W02010066740)、设计的错蛋白（ankyrin)重复结构域 (DARPin) (Stumpp等，2008)、抗运载蛋白（antical in) (Skerra等，2008)、打结素化nott in) 化0Imar等，2008)和工程改造的CH2结构域(纳米抗体;Dimitrov，2009)。优选地，所述祀向 部分是纳米抗体。
[0008] 在一优选实施方案中，在重组融合蛋白中，使祀向部分连接于经修饰的细胞因子。 可使祀向部分直接融合于突变细胞因子，或它可借助于连接子片段进行融合。优选地，所述 连接子是GGS连接子。甚至更优选地，所述连接子由至少5个GGS重复，更优选至少10个GGS重 复，更优选至少15个GGS重复组成，更优选地，所述连接子是由17-23个GGS重复组成的连接 子，最优选地，所述连接子由20个GGS重复组成。祀向部分可被融合在突变细胞因子的氨基 末端或簇基末端;优选地，所述祀向部分被融合在突变细胞因子分子的氨基末端。除突变细 胞因子和祀向部分之外，构建体可进一步包含其它结构域，如但不限于标签序列、信号序 列、另一细胞因子或抗体。
[0009] 优选地，祀向部分针对选自由W下组成的组的祀标:CD20、CD33、CD47、CD70、PSCA、 PSMA、Her2、c-Met、EGFR、Axl、腫生蛋白C、av03整联蛋白、纤连蛋白（f ibronectirOEDA末端 EDB结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)、腫生蛋白-C和CD13及其肿瘤细胞特异性剪 接变体。当祀向部分祀向肿瘤血管系统时，具体来说，设想的祀标包括但不限于CD13、av抗整 联蛋白、纤连蛋白邸A末端邸B结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)和腫生蛋白-C。根 据替代性特定实施方案，所述祀向部分针对CD20。特别设想的是祀向部分是抗体(或纳米抗 体），因为针对运些祀标的抗体可易于获得和/或可易于产生。
[0010] 细胞因子链中的突变可为本领域技术人员已知的任何突变，如缺失、插入或点突 变。至少一个链具有至少一种突变;然而，若干种突变可被组合在一个链中。=个链可携带 相同突变或不同突变。优选地，所述突变使细胞因子对它的受体或它的一种受体的亲和力 降低。优选地，所述突变是点突变。
[0011] 在一个优选实施方案中，细胞因子是TNF，并且使构建体祀向在TNFRl和/或TNFR2 表达细胞上表达的标志物。在另一优选实施方案中，所述标志物是组织特异性标志物，甚至 更优选地，所述标志物是新血管系统组织或癌组织特异性标志物。最优选地，所述标志物选 自由〔020、化^、(3-]\161、66尸1?、腫生蛋白(：、曰麻整联蛋白和〔013组成的组。
[0012] 优选地，经修饰的细胞因子是突变TNF，其中突变选自由在位置R32、N34、Q67、H73、 1^75^77、586、￥87、￥91、197、1'105、口106、4109、口113、￥115、6127、化37、0143、4145上的突变 组成的组。甚至更优选地，所述突变选自由TNF R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、 T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、 P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T组成的组。甚至更优选地，所述突 变选自由Y87X、I97X和Y115X组成的组。