用于皮肤护理的组合物及其医药组合与其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种用于皮肤护理的组合物的制备方法，尤指一种由厮带组织培养而 获得含有特定组份的组合物的制备方法；本发明亦关于一种用于皮肤护理的组合物，其具 有刺激皮肤胶原蛋白增生的效果。
【背景技术】
[0002] 现有技术中，是藉由培养上皮细胞和间质干细胞等方式W获得干细胞因子（stem cell factor, SCF)、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)、表 皮生长因子（epidermal growth facto;r，EGF)及类膜岛素生长因子（insulin-l;Lke growth factor, IG巧等生长因子，其缺点在于一般冷冻需渐进降溫，相当耗时，且在后续培养过程 中，培养基所含的盐类会造成对皮肤毛发的刺激性。
【发明内容】
[0003] 鉴于现有技术未使用冻融循环方式而导致产量较低、且无同时进行浓缩与去盐类 的步骤W及整体步骤较为繁复耗时等缺点，本发明提供一种用于皮肤护理的组合物的制备 方法，该方法是通过液态氮冷冻解冻循环方式破坏细胞并收集细胞裂解液（cell lysate)， W获得更多的多肤混合物（polyp巧tide or protein cocktail),并经由浓缩去盐W获得 特定分子量的组合物。
[0004] 为达上述目的，本发明提供一种用于皮肤护理的组合物的制备方法，其包含：提供 猪厮带（umbilical cord)组织；W冲洗液冲洗该猪厮带组织，使血球细胞和体液从该猪厮 带组织中移除；由该猪厮带组织分离细胞并进行继代培养W获得细胞激素；将该细胞及该 细胞激素进行冻融循环至少2次，W获得多肤混合物；将该多肤混合物浓缩去盐，W获得组 合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿（dalton，化）。 阳0化]依据本发明，"冲洗液"如此处所述是指对于猪厮带组织为等张的溶液；优选的所 述冲洗液是90%氯化钢溶液或憐酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution, PB巧。
[0006] 依据本发明，"分离细胞"如此处所述是指将猪厮带切成非常小的碎片W形成厮带 碎片，并将4块至6块厮带碎片放置培养皿中，其培养皿中包括10毫升（ml)的生长培养基 (含有a -MEM W及10 %胎牛血清（fetal bovine serum, FB巧），置于恒溫容器培养10天 后去除厮带碎片，且每周加两次3ml培养基，其中恒溫容器是指二氧化碳（C〇2)培养箱（含 有5% C〇2)，从而获得细胞。
[0007] 依据本发明，"继代培养"如此处所述是指当细胞生长至高密度时，即进行收集细 胞，并经稀释后分殖至新的培养皿中，W降低细胞密度并维持细胞生长，其稀释比例依细胞 种类而异。
[0008] 依据本发明，"冻融循环"如此处所述是指将细胞及其细胞激素放置于液态氮中冷 冻，然后再将细胞取出至室溫中融化，反复多次而达到破坏细胞膜的效果。如本案所例示， 将含有细胞的冷冻管直接浸置于液态氮中，再将含有细胞的冷冻管由液态氮中取出并置于 37°C水浴解冻，重复W上步骤循环至少2次，并将破裂的细胞于1000 G离屯、15分钟至20分 钟。
[0009] 依据本发明，"浓缩去盐"如此处所述是指将多肤混合物放置于过滤装置中，并经 由离屯、及去除上清液，使多肤混合物达到浓缩并去除盐类的效果。如本案所例示，将多肤混 合物置于超滤装置或离屯、设备，W减少多肤混合物的体积、增加浓度W及去除杂质（如盐 类），W获得一组合物，该组合物的分子量大于3000道尔顿（dalton，化）。
[0010] 优选的，所述组合物包含一种或多种选自由碱性成纤维细胞生长因子化asic fibroblast growth factor, bFGF)、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF)、转化生长因子 0-1 (transforming growth factor beta-l，TGF-0 I)及其 组合所组成的组。
[0011] 优选的，在所述的由猪厮带组织分离细胞W进行继代培养并获得细胞激素的步骤 中，是将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3天至18天，W获得细胞激素。
[0012] 优选的，所述的由猪厮带组织分离细胞W进行继代培养并获得细胞激素的步骤 中，是将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养12天，W获得细胞激素。
[0013] 依据本发明，"猪厮带组织"如此处所述是指来自无特定病原（specific pathogen free, SP巧猪。
[0014] 本发明又提供一种W前述制备方法所获得的的组合物，该组合物具有刺激皮肤胶 原蛋白增生的效果。
[0015] 依据本发明，"刺激皮肤胶原蛋白增生"如此处所述是指如本发明实施例所例示， 该组合物使胶原蛋白相较于控制组增生0. 5倍至3. 5倍。
[0016] 本发明再提供一种医药组合物，其包含有效剂量的前述组合物W及其医药可接受 的溶剂及/或赋形剂。
[0017] 优选的，所述的有效剂量的组合物是每毫升0. 05纳克（ng/ml)至20ng/ml。
[0018] 依据本发明，"医药可接受的溶剂及/或赋形剂"如此处所述是指任意可做为人类 或动物内服或外用的溶剂，例如酒精-水共溶剂、水、生理食盐水；更佳的，所述的医药可接 受的溶剂及/或赋形剂是水或生理食盐水；其中溶剂加入的量，W能维持组合物的有效剂 量为原则。
[0019] 本发明所述的制备方法是藉由不含血清的培养基培养细胞特定天数W获得细胞 激素，并经由液态氮重复冻融W破坏细胞，W获得更多的多肤混合物，再经由浓缩去盐W获 得特定分子量的组合物，其中该组合物具有刺激皮肤胶原蛋白增生的效果。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明的组合物用于细胞增殖实验的柱状图。
[0021] 图2为本发明的组合物用于MTS实验的柱状图。
[0022] 图3为本发明的组合物用于伤口愈合实验的细胞图，其中图3 (a)中的DO表示实 验的第0天，即于含有细胞的培养盘中划一条线；图3化）中的D3表示实验的第3天，SFM 为不含血清的培养基（serum化ee medium);图3(c)及图3(d)分别表示W本发明的组合 物（浓度分别为0. 55ng/ml及0. llng/ml)加入培养基后培养3天。
[0023] 图4为本发明的组合物用于促进胶原蛋白生成实验的柱状图，其中W bFGF作为横 坐标并作为稀释测试的依据。
【具体实施方式】
[0024] 本发明将由下列的实施例做为进一步说明，运些实施例并不限制本发明前面所掲 示的内容。本领域技术人员可W做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。
[0025] 制备例1由猪厮带分离细胞
[00%] 提供猪厮带，并将猪厮带W 75 %乙醇清洗20秒至30秒，然后W憐酸盐缓冲溶液 (phosphate buffered saline, PB巧清洗，再将厮带切成3至4等份置于已灭菌的培养盘 中。W手术刀或綴子沿厮带静脉将厮带打开，并将厮带W两綴子将厮带拉开，小屯、将动脉移 除W避免任何血液泼瓣至华通氏胶（Wharton's jelly,即厮带内的胶状结缔组织），同时将 静脉一并移除。将华通氏胶块从线羊膜（cord amnion)移除并置于新鲜且含有a-MEM的 培养皿中W保持其润湿。接着W外科剪刀将厮带切成非常小的碎片W形成厮带碎片，并将 4-6块厮带碎片放置培养盘中，其培养盘中包括10毫升（ml)的生长培养基（含有Q-MEM W及10 %胎牛血清（fetal bovine serum, FB巧），并置于C〇2培养箱（含有5 % CO 2)。每周 加两次3ml培养基。10天后将厮带碎片移除，并W PBS洗涂后加入新鲜的培养基，使细胞培 养至80 %至90 %满，并进行继代培养W增殖细胞。
[0027] 制备例2继代培养细胞
[0028] 藉由真空抽吸器吸除培养基，并W 5ml PBS清洗培养盘中的细胞。再次移除PBS， 并将3ml且浓度为0. 25%的膜蛋白酶（trypsin)-EDTA加到各培养盘中；将培养盘放置在 37°C、5分钟后。将分离的细胞收集于15ml离屯、管中，W 400G离屯、5分钟后，去除上清液并 加入2ml培养基。藉由移液管将细胞重新悬浮，并吸取10微升（y 1)细胞与10 y 1刚果蓝 (trypan blue)混合，且W自动细胞计数器进行细胞计数。
[00巧]制备例3制备细胞激素（巧tokines)
[0030] 为产生细胞激素，首先将制备例2所得的细胞接种