供批号：20140818419;新生牛血清由四季青生物 科技有限责任公司提供，批号：111107;01^由办(：1〇116公司提供，批号:1熟0215 ;0130(二甲 基亚砜）由Amresco公司提供，批号：020120307354; roS(磷酸盐缓冲液）由索莱宝科技有限 公司提供，批号:721H026;青链霉素混合液Gibco公司提供，批号：1491907。
[0032] 4.细胞培养HSC-T6细胞用含重量含量1%青链霉素、10%新生牛血清的DMEM培养基 在37°C，5%C02条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0033] 5.仪器311型C02培养箱（美国ThermoForma公司）；DMIRB型倒置显微镜（德国徕 卡）;BioTek型酶标仪(美国）；TB-215型丹佛精密天平(德国赛多利斯公司）;HVE-50型自动 高压灭菌器（日本HIRAYAMA公司）；DLE560型超净工作台（荷兰Clean Air公司）；明澈-D 24 UV超纯水仪(法国默克密理博公司）;G3型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司）。
[0034] 方法 1.狗蚁草总生物碱用完全培养液溶解，使药物终浓度分别为100μg/ml、80μg/ml、60yg/ ml、40μg/ml、20μg/ml，配好后用0 · 22μηι微孔滤膜过滤。
[0035] 2.取对数生长期的HSC-T6细胞，调整细胞浓度为3 Χ104个/ml，接种于96孔板，每 孔100μ1，共设六个组，每组设3个复孔，分别为对照组、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40yg/ ml、20μg/ml药物组，在37°C，5%C02培养箱中培养24h待细胞贴壁后对照组加入100μ1完全培 养液，其余各组加入相应浓度的含药培养液1〇〇μ1，使药物终浓度分别为l〇〇μg/ml、8〇yg/ ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml。继续培养 48h 后每孔加入 0 · 5μg/ml 的 MTT 继续培养 4h，4h 后 吸去上层液，每孔加入150ylDMS0振荡10min，在490nm处用酶标仪测0D值，重复三次取平均 值。
[0036] 3.药物对HSC-T6细胞生长的抑制率计算方法 生长抑制率=(对照组平均0D值-实验组平均0D值)/对照组平均0D值X 100%。
[0037] 4.半数抑制浓度IC5Q的计算采用寇氏法计算IC5Q。药物IC 5Q值的公式为：IC5Q=lg^ 1
[Xm -?(Σ p- 0.5)]。式中Xm:设计的最大浓度的对数值;i:相邻两组浓度对数值之差；Σ P:各组生长抑制率之和;0.5:经验常数。
[0038] 结果 狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的抑制结果如表1所示，各剂量组与对照组比较P均 小于0.01，差异具有非常显著性，表明狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞的增殖具有明显抑制 作用。图1显示，随着药物浓度的增高，药物对细胞增殖的抑制作用明显增强。
[0039] 表1狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞生长的影响i ±1)
注：与对照组比较，** Ρ<〇.〇1 从图2中可观察到对照组HSC-T6细胞密集生长，呈梭形且紧密排列。胞体近中央处可见 圆形或椭圆形的胞核（图2A) ; 20μg/ml浓度组，HSC-T6细胞数量较对照组明显减少，且有部 分细胞缩小、变圆、死亡（图2B) ; 40μg/ml组，HSC-T6细胞数量较对照组减少明显，大部分细 胞缩小变圆、聚集，只有部分贴壁生长的成纤维样细胞，可见多数漂浮的细胞碎片（图2C); 60μg/ml组，HSC-T6细胞数量较对照组减少更明显，大部分细胞缩小变圆、聚集，只有部分贴 壁生长的成纤维样细胞，可见多数漂浮的细胞碎片（图2D);80μg/ml组，HSC-T6细胞无明显 的正常细胞，细胞全部缩小变圆、聚集，可见多数漂浮的细胞碎片（图2E);100μg/ml浓度组， HSC-T6细胞未见明显的正常细胞，绝大部分细胞仅剩小的细胞核（图2F)。
[0040] 实验结论 肝脏疾病是危害人体健康的重要疾病，全世界每年死于慢性肝病转变为肝纤维化和肝 癌的人数多达140万，多种慢性肝脏疾病的恶化都会经历肝纤维的过程，而肝纤维化的逆转 是阻止病情恶化的关键，HSC-T6细胞的过度活化是肝纤维化的中心环节，阻止HSC-T6细胞 的过度增殖成为治疗肝纤维化的关键，本次实验采用MTT法检测出狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的抑制作用，通过数据和细胞形态学观察表明狗蚁草中总生物碱有抗肝纤维化 的作用。
【主权项】
1. 一种狗蚁草总生物碱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将狗蚁草打成粉，药材用体积浓度为95%，80%，50%的乙醇分三次回流提取，第一次 提取加入体积浓度95%的乙醇至药材10-15倍量，进行回流提取;保持微沸2h，过滤，得第一 次提取液;药材冷却后，第二次加8-10倍量体积浓度80%的乙醇，保持微沸1小时，得第二次 滤液;药材冷却后，第三次加入5倍量体积浓度50%的乙醇，保持微沸1小时，得第三次滤液； (2) 合并3次提取液，回收溶剂，得总浸膏； (3) 用重量含量0.5~1%的硫酸溶解浸膏，过滤； (4) 滤液加重量含量1%的NaOH溶液，调pH至9-10; (5) 用8-10倍量体积乙酸乙酯分2~3次萃取(4)的溶液，合并萃取液，回收乙酸乙酯得总 生物碱。2. 狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:狗蚁草总生物碱用于 抑制HSC-T6细胞增殖，包括以下步骤： (1) 总生物碱用培养液溶解，使药物终浓度分别为l〇〇μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40yg/ ml、20μg/ml，配好后用0.22μηι微孔滤膜过滤； (2) 取对数生长期的HSC-T6细胞，调整细胞浓度为3 Χ104个/ml，接种于96孔板，每孔100 μL，每组设3个复孔，分别为对照、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，总共六 组，在37°C，体积浓度5%C0 2培养箱中培养24h待细胞贴壁后对照组加入100μΙ完全培养液， 其余各组加入相应浓度的含药培养液1〇〇μ1，使药物终浓度分别为100μg/ml、80μg/ml、60y g/ml、40μg/ml、20μg/ml，继续培养48h后每孔加入0 · 5μg/ml的MTT继续培养4h，4h后吸去上 层液，每孔加入150ylDMS0振荡10min，在490nm处用酶标仪测0D值，重复三次取平均值。3. 如权利要求2所述的狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:所 述培养液为DMEM完全培养液，其中包含DMEM培养基、重量含量1%青链霉素、10%新生牛血清； 所述DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。4. 如权利要求3所述的狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:所 述MEM培养基的配制方法如下： (1) 配置前准备:配置培养基新制备的mi 11 i water; 调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配置，制备培养基的器皿清洗干净，并用milli water润洗两次； (2) 溶解培养基:取5%终体积的mi 11 i water，加入到1L玻璃杯中，将干粉培养基倒入烧 杯，水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，磁力搅拌助溶； (3) 补加试剂:根据包装袋说明加入NaHC03 2.2g，HEPES 2.383g、非必需氨基酸0-10ml; (4) 加抗生素:一般抗生素终浓度--青霉素 lOOM/ml，链霉素 ΙΟΟΜ/ml; 1L加入10m储 备液； (5) 调pH值:加水到1000ml，然后用HC1或者NaOH调节pH到7 · 2; (6) 过滤除菌:采用0.22μπι滤膜;过滤后分装于100或200ml小瓶中；过滤后pH值一般上 升0.1-0.3; (7) 加小牛血清:根据培养基配置的量将小牛血清分装，冷冻保存-20°C ; 临用前将加入小牛血清10%。5. 如权利要求2所述的狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:所 述对数生长期的HSC-T6细胞的培养方法为:将HSC-T6细胞用含重量含量1%青链霉素、10%新 生牛血清的DMEM培养基在37°C，体积浓度5%C02条件下培养。6. 如权利要求2所述的狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:药 物对HSC-T6细胞生长的抑制率计算方法； 生长抑制率=(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/对照组平均OD值X 100%。7. 如权利要求2所述的狗蚁草总生物碱在制备抗肝纤维化药物的用途，其特征在于:半 数抑制浓度IC5Q的计算采用寇氏法计算；药物IC 5Q值的公式为：IC5Q=lg〃[Xm -?(Σ p- 0.5)]； 式中Xm:设计的最大浓度的对数值；i:相邻两组浓度对数值之差；Σ ρ:各组生长抑制 率之和;0.5:经验常数。
【专利摘要】本发明公开了豆科链荚豆植物狗蚁草总生物碱的制备方法以及抗肝纤维化的用途。制备方法是将将狗蚁草打成粉，用体积浓度为95%，80%，50%乙醇分三次回流提取，合并3次提取液，回收溶剂，得总浸膏。用重量含量0.5~1%硫酸溶解浸膏，过滤，滤液加重量含量1%NaOH溶液，调pH至9-10，用同体积乙酸乙酯分2~3次萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯得总生物碱。本发明还公开了狗蚁草总生物碱抗肝纤维化的用途，狗蚁草总生物碱抑制肝星状细胞（HSC-T6）细胞增殖的方法，通过数据和形态学观察表明狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞的生长有明显的抑制作用，从而起到抗肝纤维化的作用。
【IPC分类】A61K36/48, A61P1/16
【公开号】CN105582045
【申请号】CN201610068356
【发明人】郑作文, 吴先昊, 唐云丽, 杨小梁, 张瑜, 吴霜
【申请人】广西中医药大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年2月1日