狗蚁草总生物碱的制备方法以及抗肝纤维化的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种狗蚁草总生物碱的制备方法以及抗肝纤维化的用途。
【背景技术】
[0002] 狗蚁草为豆科植物链荚豆Alysicarpys Vaginalis(L. )DC.的全草，别名链荚豆、 山土豆、假花生、大叶青等。性凉，味甘、苦，具活血通络、清热化湿、接骨消肿、去腐生肌功 效。治慢性肝炎时取根45g猪蹄、酒炖服，为广西地区常用药，具有浓郁的民族特色。对于狗 蚁草的化学成分及药理作用鲜有报道，化学成分而言只有广西中医药大学的郭兴杰等发现 其中含有胡萝卜苷、谷留醇和水杨酸并将它们作为狗蚁草药材质量控制的指标。
[0003] 广西中医药大学2014年11月20日申请了一种狗蚁草乙酸乙酯提取物的制备方法 的中国专利，申请号201410667241.1，发明人郑作文、唐云刚、黄刚贞；该发明公开了一种 狗蚁草乙酸乙酯提取物的制备方法，先将狗蚁草用95%乙醇浸泡后，进行回流提取，保持微 沸2h，过滤，得第一次提取液，药材冷却后，再加12倍量95%乙醇，保持微沸1.5小时，得第二 次滤液。药材稍稍冷却，加入12倍量95%乙醇，保持微沸1小时，得第三次滤液，合并3次提取 液，旋转蒸发仪浓缩，先制得95%乙醇浸膏；干燥后用水溶解，然后依次用石油醚、乙酸乙酯 进行萃取，经浓缩、挥发溶剂和真空干燥后得到狗蚁草的乙酸乙酯提取物。该发明还公开了 狗蚁草乙酸乙酯提取物在制备治疗慢性肝炎方面药物的应用。
[0004] 但是除了上述研究筛选出狗蚁草制备治疗慢性肝炎药物的最优活性部位为乙酸 乙酯部位外尚未发现有其它相关报道。故有必要对狗蚁草化学组成及成分的药理作用做进 一步的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种狗蚁草总生物碱的制备方法以及研究其抗肝纤维化的 用途。
[0006] 所述的总生物碱制备方法如下： (1) 将狗蚁草打成粉，药材用体积浓度为95%，80%，50%的乙醇分三次回流提取，第一次 提取加入体积浓度95%的乙醇至药材10-15倍量，进行回流提取;保持微沸2h，过滤，得第一 次提取液;药材冷却后，第二次加8-10倍量体积浓度80%的乙醇，保持微沸1小时，得第二次 滤液;药材冷却后，第三次加入5倍量体积浓度50%的乙醇，保持微沸1小时，得第三次滤液； (2) 合并3次提取液，回收溶剂，得总浸膏； (3) 用重量含量0.5~1%的硫酸溶解浸膏，过滤； (4) 滤液加重量含量1%的NaOH溶液，调pH至9-10; (5) 用8-10倍量体积乙酸乙酯分2~3次萃取(4)的溶液，合并萃取液，回收乙酸乙酯得总 生物碱。
[0007] 所述狗蚁草总生物碱抗肝纤维化的用途主要表现在狗蚁草总生物碱对HSC-T6细 胞增殖的影响。其研究方法包括以下步骤： (1)狗蚁草总生物碱用完全培养液溶解，使药物终浓度分别为1〇〇μ8/π!?、80μ8/π?1、60μ g/ml、40μg/ml、20μg/ml，配好后用0·22μπι微孔滤膜过滤。
[0008] (2)取对数生长期的HSC-T6细胞，调整细胞浓度为3Χ104个/ml，接种于96孔板，每 孔 100μ1，每组设3个复孔，分别为对照、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，总 共六组，在37°C，体积浓度5%C0 2培养箱中培养24h待细胞贴壁后对照组加入100μΙ完全培 养液，其余各组加入相应浓度的含药培养液1〇〇μ1，使药物终浓度分别为l〇〇μg/ml、8〇yg/ ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml。继续培养 48h 后每孔加入 0 · 5μg/ml 的 MTT 继续培养 4h，4h 后 吸去上层液，每孔加入150ylDMS0振荡lOmin，在490nm处用酶标仪测0D值，重复三次取平均 值。
[0009] 所述培养液为DMEM完全培养液，其中包含DMEM培养基、重量含量1%青链霉素、10% 新生牛血清。所述DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基 础上研制的。
[0010] MEM培养基的配制方法如下： (1)配置前准备:配置培养基新制备的milli water。调节pH值的酸碱溶液也应该使用 这种水配置。制备培养基的器皿清洗干净，并用mi 11 i water润洗两次； (2 )溶解培养基:取5%终体积的mi 11 i water，加入到1L玻璃杯中，将干粉培养基倒入烧 杯，水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，磁力搅拌助溶； (3) 补加试剂：根据包装袋说明加入似!1〇)32.28，册1^3 2.3838、非必需氨基酸0-10ml ； (4) 加抗生素:一般抗生素终浓度--青霉素 lOOM/ml，链霉素 lOOM/mhlL加入10m储 备液； (5) 调pH值:加水到1000ml，然后用HC1或者NaOH调节pH到7 · 2; (6) 过滤除菌:采用0.22μπι滤膜。过滤后分装于100或200ml小瓶中。过滤后pH值一般上 升0.1-0.3; (7) 加小牛血清:根据培养基配置的量将小牛血清分装，冷冻保存-20°C。临用前将加入 小牛血清10%。
[0011] 所述的肝星状细胞(HSC-T6)购买于上海博蕴有限公司由广西中医药大学药理教 研室保存。
[0012] 所述对数生长期细胞的培养方法为:将HSC-T6细胞用含重量含量1%青链霉素、10% 新生牛血清的DMEM培养基在37°C，5%C0 2条件下培养。
[0013] 药物对HSC-T6细胞生长的抑制率计算方法。生长抑制率=(对照组平均0D值-实验 组平均0D值)/对照组平均0D值X 100%。
[00M]半数抑制浓度IC5Q的计算采用寇氏法计算。药物IC5Q值的公式为：IC5Q=lg- KXm -i (Σ p- 0.5)]。式中Xm:设计的最大浓度的对数值;i:相邻两组浓度对数值之差；Σ p:各组 生长抑制率之和;〇. 5:经验常数。
[0015]本发明的优点在于： 1.本发明提供了一种提取狗蚁草中总生物碱的制备方法，对中国专利申请号 201410667241.1的方法进行了改进，此方法操作简单，使用试剂易得。
[0016] 2.本发明将狗蚁草总生物碱应用于抗肝纤维化，可有效抑制HSC-T6的增值，本发 明对慢性肝病的治疗做出了突出贡献。
【附图说明】
[0017]图1为狗蚁草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的抑制结果。
[0018] 图2A为HSC-T6细胞在10 X 20显微镜下的形态学观察中的对照组。
[0019] 图2B为HSC-T6细胞在10X20显微镜下的形态学观察中的20μg/ml药物组。
[0020]图2C为HSC-T6细胞在10X20显微镜下的形态学观察中的40μg/ml药物组。
[0021 ] 图2D为HSC-T6细胞在10X20显微镜下的形态学观察中的60μg/ml药物组。
[0022] 图2E为HSC-T6细胞在10X20显微镜下的形态学观察中的80μg/ml药物组。
[0023] 图2F为HSC-T6细胞在10X20显微镜下的形态学观察中的100μg/ml药物组。
[0024]
【具体实施方式】
[0025] 实验材料 狗蚁草全草采自广西壮族自治区武鸣县，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为豆科链 荚豆属链荚豆(Alysicarpys vaginalis(L. )DC.)的全草。实验所用试剂均为分析纯。
[0026] 实验方法与结果 实施例1 狗蚁草总生物碱的制备方法： (1)将狗蚁草打成粉，药材用含量为体积浓度95%，80%，50%的乙醇分三次回流提取，第 一次提取加入95%乙醇(v/v)至药材10-15倍量，进行回流提取;保持微沸2h，过滤，得第一次 提取液;药材冷却后，第二次加8-10倍量80%乙醇(v/v)，保持微沸1小时，得第二次滤液;药 材冷却后，第三次加入5倍50%乙醇(v/v)，保持微沸1小时，得第三次滤液。
[0027] (2)合并3次提取液，回收溶剂，得总浸膏； (3) 用0.5~1%硫酸溶解浸膏，过滤； (4) 滤液加 l%NaOH溶液，调PH至9-10; (5) 用同体积乙酸乙酯分2~3次萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯得总生物碱。
[0028] 实施例2 细胞实验材料与仪器 1.培养液DMEM完全培养液含DMEM培养基、重量含量1%青链霉素、10%新生牛血清。其中 DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。 [0029] MEM培养基的配制方法如下： (1)配置前准备:配置培养基新制备的milli water。调节pH值的酸碱溶液也应该使用 这种水配置。制备培养基的器皿清洗干净，并用mi 11 i water润洗两次； (2 )溶解培养基:取5%终体积的mi 11 i water，加入到1L玻璃杯中，将干粉培养基倒入烧 杯，水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，磁力搅拌助溶； (3) 补加试剂:根据包装袋说明加入NaHC032.2g，HEPES2.383g、非必需氨基酸10ml; (4) 加抗生素:一般抗生素终浓度--青霉素 lOOM/ml，链霉素 lOOM/mhlL加入10m储 备液； (5) 调pH值:加水到1000ml，然后用HC1或者NaOH调节pH到7 · 2; (6) 过滤除菌:采用0.22μηι滤膜。过滤后分装于100ml小瓶中。过滤后pH值一般上升0.1- 0.3； (7) 加小牛血清:根据培养基配置的量将小牛血清分装，冷冻保存-20°C。临用前将加入 小牛血清10%。
[0030] 2.细胞株肝星状细胞(HSC-T6)购买于上海博蕴有限公司由广西中医药大学药理 教研室保存。
[0031 ] 3.试剂乙酸乙酯（天津富宇精细化工有限公司，批号，20150922);以上均为分析 纯。MTT(四甲基唑蓝），美国Amresco公司提