刻度线，分装到试剂瓶后在12rC下高压灭菌30min，冷却后放4°C冰箱保 存。
[0054] 酵母浸膏一蛋白腺一葡萄糖琼脂培养基:葡萄糖lOg，蛋白腺lOg，酵母膏5g，琼脂 粉lOg，加水溶解在SOOmL锥形瓶中，充分揽拌均匀后12rC灭菌30min，冷却后4°C冰箱保存 备用。
[0化日]RPMI 1640液体培养液:取RPMI 1640(含心谷氨酷胺，不含碳酸氨钢)粉末2. OSg， 加入10%葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2% )及MOPS粉6.906g，加蒸馈水至约为200血，混合 均匀后在22 °C用Imo 1 /L的化0田容液调抑约为7.0 ± 0.1，临用前用0.22皿混合纤维膜过滤灭 困。
[0化6] 1.2仪器 AB204-N电子天平 梅特勒-巧利（上海）公司
[0化7] SVE-4A1超肆工作會 新加坡啟CQ公司 INCUCELL 55恒温培养箱 德国MMM公司 VENTICELL 55干热灭菌箱德国MMM公司 HS-9041高温高压采菌器 韩国HAHSHIN公司 不诱辆过滤器(2000ml) 江苏天和仪器厂 96化璋养扳 秦圍COSTA反么哥
[0化引 可调式移液器 Thermo Electron ( h海)公司 SC-329常溫冰箱 中国海尔公司 -2(TC低溫冰柜 中国海尔公司 G-560E满旋混合器 美国Si公司 M地iscan.MKJ酶疏後 美国前却敞)虹hsys'tems.公司.
[0化9] 1.3实验菌株
[0060]质控菌株：白色念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；
[0061 ]实验菌株:千佛山医院临床分离的白色念珠菌；
[0062] 菌株鉴定:实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35°C下培养48小时，菌落呈绿 色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中屯、微生物研究室W标准微生物学方法 鉴定为白色念珠菌。
[0063] 菌液制备:-20°C下保存的白色念珠菌室溫下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基 上，35°C培养2地，取发育良好的单一菌落再次接种，35°C培养24h，W保证菌株处于生长期。 选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经满旋器振荡均匀后W中国细菌浊度标准管比 浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为IX IO6CFlVmL,系列稀释 即得到工作菌液，并W活菌计数进行浓度验证。
[0064] 2.内容与方法
[0065] 2.1盐酸氨漠索与氣康挫联合抗耐药白色念珠菌作用测定
[0066] 根据化SI M27-A3方案的棋盘法，WRPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍 工作浓度，筛选ABH与化C联合应用的浓度范围，即ABH终浓度为256~化g/mL，FLC的终浓度 为64~0.12扣g/mL。按浓度从低到高的顺序分别吸取化C药液50化，分别加入96孔平板的第 2~11列，按浓度从低到高的顺序吸取ABH药液50化，分别加入各96孔平板的第G~A行，除第 12列外各孔再分别加100化菌液，其余不足20化L的孔用RPMI-1640培养液补足。其中化为生 长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据化SI M27-A3方案的要求，将加药的96孔平板置35 °C恒溫培养箱中培养2地后，分别用XTT负载化 后W酶标仪测定OD并记录结果。所有实验重复S次。
[0067] 2.2评价方法与结果判定
[0068] 2.2. ILoewe additivity理论
[0069] Loewe additivity (LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用， 因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓 度指数法(fractional inhibitory concentration index，FICI)，表述女曰下：
[0070] X FIC=FI Ca+F I Cb = Ca/M I Ca+Cb/MI Cb
[0071] MICa和MICb分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，Ca与Cb为两药联用时达到相 同药效时各自的浓度。FICIM为括抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI < 0.5定义为协同作用。
[0072] 2.2.2Bliss independence理论
[0073] Blissindependence(BI)理论是WAE(药物各浓度下真菌生长百分率的理论值 与实验值之差)为数据分析模型。AE模型表述如下：
[0074] AE = EAXEB-Ecomb
[0075] 其中，Ea为A药单用时真菌的生长率，扣为8药单用时真菌的生长率，Ewmb为A药和B 药联用时真菌的生长率。结果分析时，通过S SYN与XANT，即96孔板中所有正值A E和负值 A E的加和为指标来判断两种药物的相互作用。当AE的绝对值<100%时，表示为弱协同或 弱括抗作用；当A E的绝对值介于100%与200%之间时，表示为中等协同或括抗作用，当A E 的绝对值大于200%时，表示为为强协同或括抗作用。
[0076] 3.结果
[0077] 3.1盐酸氨漠索与氣康挫联合抗耐药白色念珠菌作用结果
[0078] 3.1.1盐酸氨漠索与氣康挫联合的最低有效抑菌浓度
[0079] 各孔中真菌生长百分数的计算方法为：
[0080] 真菌生长百分数=(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值
[0081] 按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80%的最低联 用药物浓度为判读终点。
[0082] ABH与化C联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，但对白色念珠 菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用。现把耐药株CAlO和CA16在加药96孔板中的生 长百分数实验结果列表如下(表1-3)所示。
[0083] 表.1.用棋盘表示Affl与化C的联合用药抗耐药白色念珠菌CAlO生长百分率（W FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出）。
[0085] 表.2.用棋盘表示Affl与化C的联合用药抗耐药白色念珠菌CA16生长百分率（W FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出）。
[0087] 3.1.2FICI模型和A E模型评价ABH与FLC联用的协同作用
[008引FICI模型的评价指标为FICI值，FICI <0.5则定义为协同作用。由表3可W看出，各 组合的FICI值均小于0.5,表现为较强的协同作用。
[0089] A E模型的评价指标为X SYN与XANT，由表3可W看出，各组I： SYN和SANT的总和 均远远大于200%，表现为强烈的协同作用，ABH与化C联用对抗CAlO和CA16的S维图如图1 和图2。从图中可W直观的看出不同药物组合均具有强烈的协同作用。图片与上述数值分析 具有一致性。
[0090] 表.3. WFICI模型和A E模型评价盐酸氨漠素和氣康挫联合用药抗真菌作用
[0092] 注解:FLC:氣康挫;ABH:盐酸氨漠索;MIC:最低抑菌浓度;MICa:药物单用时氣康挫 的最低抑菌浓度;Ca:药物联用时氣康挫的最低抑菌浓度;MICb:药物单用时盐酸氨漠索的最 低抑菌浓度;Cb :药物联用时盐酸氨漠索的最低抑菌浓度;FICI:分数抑菌浓度指数；X SYN: 96孔板中所有正值A E之和；X ANT: 96孔板中所有负值A E之和。
[0093] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 一种盐酸氨溴索联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征是:所述产品为药物。3. 如权利要求1所述的应用，其特征是:所述真菌为白色念珠菌。4. 如权利要求1所述的应用，其特征是:所述盐酸氨溴索与氟康唑联合应用时的有效浓 度配比：氟康唑:盐酸氨溴索=1:64。5. 如权利要求1所述的应用，其特征是:所述应用时盐酸氨溴索的最低抑菌浓度为：128 yg/mL〇6. 如权利要求1所述的应用，其特征是:所述应用时氟康唑的最低抑菌浓度为:2yg/mL。7. -种抗真菌产品，其特征是：以盐酸氨溴索和氟康唑为主要活性成分。8. 如权利要求7所述的抗真菌产品，其特征是，所述盐酸氨溴索与氟康唑的有效浓度配 比为氟康唑:盐酸氨溴索= 1:64。9. 如权利要求7所述的抗真菌产品，其特征是，所述盐酸氨溴索的最低浓度为：128yg/ mL〇10. 如权利要求7所述的抗真菌产品，其特征是，所述氟康挫的最低浓度为:2yg/mL。
【专利摘要】本发明公开了盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用，属于医药技术领域，本发明以多种方法研究氟康唑和盐酸氨溴索联用对耐药白色念珠菌的静态与动态联合抗真菌作用。盐酸氨溴索与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：盐酸氨溴索＝1:64(μg/mL)，最低抑菌浓度分别为：128μg/mL与2μg/mL。盐酸氨溴索联合氟康唑时，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。
【IPC分类】A61K31/137, A61P31/10, A61K31/4196
【公开号】CN105663126
【申请号】CN201610186067
【发明人】孙淑娟, 李秀云, 张才擎, 韩毅, 崔学艳
【申请人】山东省千佛山医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月29日