厚朴酚在杀灭鱼类寄生原虫中的应用及其制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及厚朴酚(c18h18o2)的用途，尤其涉及厚朴酚在杀灭鱼类体表寄生虫药物 中的用途。
【背景技术】
[0002] 目前渔业生产中，鱼类病害是实现水产养殖业高产高效的主要障碍之一，其中鱼 类寄生虫病是发病率最高，危害最严重的一类鱼类疾病。据全国水产总站统计数据表明，在 鱼类118种生物源性疾病中寄生虫疾病占24.58%，其中鱼类寄生原虫病是流行普遍、危害 最严重的一类。鱼类寄生原生动物包括肉足鞭毛门（Sarcomastigophora)、复顶门 (Apicomplexa)、微抱子门（Microspora)、囊抱子门（Ascetospora)、黏抱子门（Myxozoa)和 纤毛门（Ciliophora)六大门类。其中车轮虫、多子小瓜虫（简称小瓜虫）以及黏孢子虫是对 鱼类危害比较大的种类，全国各地乃至世界范围内均有报道。目前，小瓜虫病、车轮虫病等 寄生原生动物病的流行尚未得到有效控制。有资料显示，在我国的一些省份几乎每年都有 这些疾病的发生，引起鱼的死亡并造成大量的经济损失;此外，这些疾病还严重影响了观赏 养殖渔业的发展。因此，预防控制和治疗寄生原虫病具有重要的社会意义和经济价值。
[0003] 当前，我国常用的临床杀原虫渔药主要是硫酸锌、硫酸铜、盐酸氯苯胍、地克珠利 等，而日益突出的耐药性、食品安全和环境安全问题已经成为制约寄生原虫疾病控制的瓶 颈。天然产物易降解、对非靶标生物毒性低，因此从中发现杀虫活性分子是有效创制无公害 渔药的一条重要途径。
[0004] 厚朴酸是从木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis)的干燥干皮、根皮及枝皮中 提取分离的一种化合物，其结构式为：
[0006] 厚朴酚的分子式为C18H1802，分子量为266.32，呈无色针状结晶，在氯仿、丙酮、乙醚 等有机溶剂中易溶，微溶于水，熔点为102 °C。厚朴酚已知具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗溃疡 等多种药理作用。目前，尚无厚朴酚在杀灭鱼类寄生原虫的研究与应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供厚朴酚在制备用于杀灭鱼类寄生原虫多子小瓜虫的 药物中的应用。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供一种杀灭鱼类寄生原虫的防治剂，该防治剂按重量 百分比计量由下列原料组成:6~12%的厚朴酸、3~6 %的乙醇、1~3%的表面活性剂、1~ 4%的透皮剂，余量为菜籽油，上述原料的总和为100% ;所述表面活性剂选自吐温-20;所述 透皮剂选自水溶性氮酮。
[0009] 本发明的最后一个目的在于提供上述杀灭鱼类寄生原虫的防治剂的制备方法，包 括以下步骤：
[0010] 1)按计量称取厚朴酚、表面活性剂、透皮剂、乙醇以及菜籽油，备用；
[0011] 2)将厚朴酚、乙醇和菜籽油混合搅拌至厚朴酚完全溶解，得混合溶液；
[0012] 3)将表面活性剂以及透皮剂加入步骤2)所得的混合溶液中后搅拌均匀，即得杀灭 鱼类寄生原虫的防治剂。
[0013] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0014] 1)本发明对已知化合物厚朴酚发掘了新的用途，开拓了新的应用领域。
[0015] 2)厚朴酚是一种无公害绿色新型渔药有效成分，对鱼类毒性较低、不易产生耐药 性，能有效杀灭离体和在体多子小瓜虫，效果显著。
[0016] 3)本发明所述防治剂制备、使用方法简单。
【具体实施方式】
[0017] 为了更好的理解本发明的实质，以下将用厚朴酚对鱼类急性毒性实验、防治剂的 药理试验及结果来说明其在杀灭鱼类寄生原虫药物中的用途。
[0018] 试验例1厚朴酚对斑马鱼急性毒性试验
[0019] 1材料与方法
[0020] 1 · 1材料
[0021] 1.1.1供试样品
[0022]试验所用厚朴酚纯度为98.0 %，购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。精确 称取l.〇g厚朴酚，用二甲基亚砜(DMS0,购自西安化学试剂厂）充分溶解，定容于100mL容量 瓶中，配成浓度为10mg/mL的厚朴酚母液，4°C冰箱保存备用。
[0023] 1.1.2试验动物
[0024] 试验所用斑马鱼购于陕西省朱雀路花鸟市场，要求体质健壮，规格一致，平均体重 〇.47g。购回后在实验室水簇箱中暂养10d，每天投喂2次，投入的斑马鱼专用饲料(购于陕西 省朱雀路花鸟市场)在l〇min内吃完为限。待适应实验室环境条件后再进行毒性试验。
[0025] 1.1.3试验仪器
[0026] ALC-1100百分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;KQ-500E型超声波 清洗器;5~10yL，20~200yL移液器:VoluMate，Made in Germany;自动控温加热棒，浙江舟 山市渔具厂生产;塑料盆(容积为8L)等。
[0027] 1.2试验方法
[0028] 1.2.1试验条件
[0029]采用静水式试验法，每盆加充分曝气的自来水5L，pH 7.2，控制水温为23 ± 1°C，先 加入厚朴酚母液充分混匀形成一定浓度的厚朴酚药液后再加入斑马鱼，每盆放养10尾。整 个试验中要求保持水中溶氧在5mg/L以上。
[0030] 1.2.2试验药物浓度的设定
[0031 ]首先，通过预试验确定正式试验药液中厚朴酸浓度的大致范围，即斑马鱼在24h内 全部死亡的药物浓度（l〇.〇mg/L)和96h内不发生死亡的药物浓度(3.0mg/L)。然后在预试验 基础上，在药物浓度3.0~10.0mg/L范围内按浓度等差(公差d = l)插入3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0、10.0 mg/L八个浓度试验组，进行正式试验，观察各浓度下斑马鱼的中毒死亡 情况。
[0032]在试验期间随时观察记录斑马鱼的死亡情况，如发现鱼死亡，应即时捞出，以免影 响水质，影响试验结果。判断鱼死亡的方法是当鱼停止呼吸后（鳃盖运动停止）用玻璃棒或 镊子轻击鱼的尾柄部，如果在3min之内鱼体不产生任何应激反应，即可判断死亡。
[0033]试验期间统计在12h、24h、48h和96h四个时间段内各药物浓度下斑马鱼的死亡情 况。试验期间应保持安静，尽可能避免对斑马鱼的任何干扰。当空白对照组(无药物组）的死 亡率小于5%，各时间段内斑马鱼的死亡率可不予校正;若空白对照组的死亡率大于5%，则 应予校正，校正公式采用Abbott公式；如果空白对照组死亡率达20 %以上，则在查找原因 后，重新进行毒性试验。
[0034] Abbott公式:p = p'-C/1-C
[0035] P:校正死亡率，即纯属药物引起的死亡率
[0036] K :试验组死亡率，即自然因素和药物引起的死亡率 [0037] C:对照组死亡率，即自然因素引起的死亡率
[0038] 1.2.3厚朴酚最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC50)
[0039] 观察和记录斑马鱼在第12h、24h、48h和96h内的死亡情况，并计算死亡率，再利用 SPSS 20.0软件中的Probit计算模块得出各个时间段的回归方程及半数致死浓度(95%的 可信限）。
[0040] 1.2.4厚朴酚安全浓度的计算
[0041] 根据Turbell公式计算安全浓度：
，.其中48h LC50 为48小时的半数致死浓度，24h LC5Q表示24小时的半数致死浓度。
[0042] 2结果与分析
[0043] 2.1不同浓度的厚朴酚在不同时间内对斑马鱼的致毒情况
[0044] 各试验药物浓度在第1211、2411、4811、9611内的斑马鱼死亡情况见表1。在药物浓度为 10.0mg/L的高浓度试验组，试验用鱼中毒反应非常明显，用药后2h左右出现异常表现，斑马 鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而 死。在浓度为3.0mg/L的低浓度试验组中，斑马鱼表现较安静，对外界反应灵敏，活动正常。
[0045]表1不同浓度的厚朴酚在不同时间对斑马鱼的中毒死亡结果
[0047] 2.2最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC50)
[0048] 由表2可知各时间段的回归方程、半数致死浓度(LC5Q)和其LC5Q的95%可信限。其 中第24h的LC 5〇 = 5 · 96mg/L，95 % 的可信限为5 · 63~6 · 30mg/L;第48h的LC5〇 = 5 · 30mg/L， 95%的可信限为4.62~5.9411^/1。
[0049]表2各时间段的直线回归方程、LC5Q及其95%的可信限
[0051 ] 2.3安全浓度
[0052]根据Turbell公式计算出厚朴酸对斑马鱼的安全浓度。
[0054]从结果显示，厚朴酚对斑马鱼的安全浓度不是很高。但是，实际中，浓度在3. Omg/L 的情况下，96h没有出现鱼死亡的发生，厚朴酚作为杀虫渔药药效成分仍然具有很好的推广 价值。
[0055]试验例2厚朴酚对小瓜虫杀灭效果 [0056] 1材料与方法
[0057] 1.1试验动物
[0058] 试验动物为金鱼(Carassius auratus)，体重均小于5.0g，来源于陕西省咸阳市长 兴金鱼养殖场。
[0059] 1.2寄生虫
[0060] 小瓜虫是从陕西省朱雀路花鸟市场的患病金鱼分离得到，其传代方式:将金鱼置 于若干40L温度为22.0±2.0°C的水箱中，用充氧栗进行增氧和虹吸法吸污，隔天换水1/3。 收集小瓜虫的方法:首先将若干严重寄生小瓜虫的金鱼置于装有300mL过滤水的烧杯30分 钟。由于金鱼不停的游动，成熟的小瓜虫从金鱼体表脱落，用吸管收集脱落的小瓜虫包囊。 然后将收集到的包囊在23.5±0.5°C温度中培养18~20h得到小瓜虫幼虫。小瓜虫计数方 法：用移液器移取2yL的幼虫悬液置载玻片上，并在解剖镜下计数，重复十次取平均值作为 小瓜虫幼虫悬液浓度，再据此浓度计数小瓜虫。
[0061 ] 1.3试验药物
[0062]试验所用厚朴酚纯度为98.0 %，购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。精确 称取l.〇g厚朴酚，用二甲基亚砜(DMS0,购自西安化学试剂厂）充分溶解，定容于100mL容量 瓶中，配成浓度为10mg/mL的厚朴酚母液，4°C冰箱保存备用。
[0063] 1.4厚朴酚杀灭小瓜虫幼虫的效果
[0064]测定厚朴酚杀灭小瓜虫幼虫的效果采用固定法。在96孔板的每一孔中放入300个 幼虫。再依次放入厚朴酚母液使厚朴酚的最终浓度分别达到0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和0