一种评价中药防治骨质疏松症的实验方法
【专利摘要】本发明公开了一种评价中药防治骨质疏松症的实验方法，包括以下步骤：动物给药，动物体内荧光标记,测定骨相关评价指标，动物给药阶段通过构建大鼠骨质疏松模型，通过设定多组对照实验，从而有效的评价中药防治骨质疏松症的疗效，便于进一步提升中药的内在质量。
【专利说明】
一种评价中药防治骨质疏松症的实验方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种模式评价中药疗效的实验方法，具体为一种评价中药防治骨质疏 松症的实验方法。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正 常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。
[0003] 骨质疏松症好发于老年人或停经后妇女，目前危害全球约1/3的50岁以上女性和 1/5的50岁以上男性，其发病率在世界常见慢性病中已跃居第7位，成为中老年妇女骨痛骨 折及骨折致残、致死的主要原因之一。
[0004] 虽然，目前临床所采用的中药显示了良好的治疗效果，但由于没有客观有效的中 药药效学评价方法，故不能评价所用药物处方是否是最佳的，影响了进一步的药物开发研 究。中医药现代化，是中医学走向世界的重大课题，中医药学必须依赖方法学的突破和思路 的创新，重视以国际评估标准进行科研设计的评价方法并在实践中规范应用，才能使研究 成果被国际学术界接受。因此急需为评价中医药疗效提供可靠的方法学指导，才能进一步 促进中医药现代化。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种评价中药防治骨质疏松症的实验方法，以有效的评价 中药防治骨质疏松症的疗效。
[0006] 为实现上述目的，本发明的实验方法，包括以下步骤。
[0007] ⑴动物给药，采用雌性SD大鼠分为如下组别给药：基础组，蒸馏水5ml/kg/d灌 胃；阴性对照组，做假手术，蒸馏水5ml/kg/d灌胃，实验30~180天；模型组，手术去除大 鼠双侧卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模型，以蒸馈水5ml/kg/d灌胃，实验30~180天；服药 组，手术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模型，中药粉〇. 342g/kg/d灌胃，实验 30~180天；实验过程中，每周称重一次，称重前一天禁食不禁水，第二天给药前称重，然后 调整给药剂量并进行给药。
[0008] (2)动物体内荧光标记，所有雌性大鼠处死前13、14两天和3、4两天分别皮下注 射0.7%钙黄绿素1 ml/kg各一次，两荧光标记间隔10天，每周称量一次体重，自由饮水给 食，实验结束后，用3%，1. 5ml/kg的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死。
[0009] (3)测定骨相关评价指标。
[0010] 其中，所述的骨相关评价指标为：骨转化的血生化指标，骨组织形态计量学测定， 骨密度检测，骨生物力学检测。
[0011] 优选地，动物给药阶段还包括双膦酸盐组，即手术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大 鼠骨质疏松模型，以阿仑磷酸钠 lmg/kg/d灌胃，实验90天。
[0012] 优选地，动物给药阶段还包括综合给药组，即手术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大 鼠骨质疏松模型，阿仑磷酸钠 lmg/kg/d加中药粉0. 342g/kg/d灌胃，实验90天。
[0013] 其中，所述的SD大鼠采用3月龄未交配SPF级雌性SD大鼠，在SPF级环境饲养至 6月龄，饲养温度为20~26°C，湿度为40~70%，采用10h :14h昼夜间断照明。
[0014] 其中，所述的0. 7%钙黄绿素的制备方法为：在闭光环境中用2% NaHC03生理盐水 l〇〇ml，磁力搅拌，同时缓慢加入钙黄绿素粉末0. 7g，待完全溶解后用微孔过滤器过滤，置于 4 °C冰箱避光保存。
[0015] 采用本发明方法，通过去除大鼠双侧卵巢，建立大鼠骨质疏松模型，通过多个对照 组对照，并引入治疗骨质疏松症的西药双膦酸盐组的对照实验，可以获得中药在治疗骨质 疏松症上的统计学对比数据，及中西药的疗效对比，从而较好的评价其整体疗效，便于进一 步提升中药的内在质量。
【附图说明】
[0016] 图1为给药期间芪骨胶囊组A (30天）体重随时间的变化。
[0017] 图2为给药期间芪骨胶囊组B (90天）体重随时间的变化。
[0018] 图3为给药期间芪骨胶囊组C (180天）体重随时间的变化。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。
[0020] 芪骨胶囊是由多种中药组成的复方制剂，临床对骨质疏松症有效。实施例采用芪 骨胶囊作为实验对象，通过本发明方法评价芪骨胶囊防治骨质疏松症的疗效。
[0021] 一.动物给药 实验动物采用6月龄SD大鼠。3月龄未交配SPF级雌性SD大鼠140只，在SPF级环境 饲养至6月龄后，随机分为12组，其中基础组在实验第一天即取材做对照，阴性对照组进行 假手术后随机分为阴性对照A组（30天)，阴性对照B组（90天）和阴性对照C组（180天)。 其余大鼠均行双侧卵巢切除术后，随机分为模型组、服药组(芪骨胶囊组)、双膦酸盐组、综 合给药组，具体实验给药方法和分组见表1。
[0022] 表1动物分组及实验方法
本实施例采用的阿仑磷酸钠：杭州默沙东制药有限公司生产，70mg/片(成人用量为每 周1次，一次1片70mg或每天1次，一次1片10mg)。按大鼠灌胃量为5ml/kg/d，折算剂量 为lmg/kg/d，用蒸馏水配成0. 02%。芪骨胶囊：厦门中药厂有限公司生产，按大鼠灌胃量为 5ml/kg/d，折算剂量：芪骨胶囊粉0. 342g/kg/d，用蒸馏水配成6. 83%。
[0023] 所有实验动物由广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证编号： 0108467。大鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号： SYXK (粵)2008-0002。动物饲养条件：饲养期间5只/大箱，给药期间2只/中箱，群养，饲 养温度与湿度：20~26°C，40~70%，采用10h :14h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持 稳定，以保证试验结果的可靠性。自由进食饮水，饲料、饮用水为广东省医学实验动物中心 提供。对购入SD大鼠检疫3d。期间每日检查动物一次，未发现不健康的动物，全部大鼠纳 入实验。
[0024] 实验过程中，每周称重一次，称重前一天禁食不禁水，第二天给药前称重，数据录 入电脑，然后调整给药剂量并进行给药。
[0025] 二.动物体内荧光标记 所有雌性大鼠处死前13、14两天和3、4两天分别皮下注射0. 7%钙黄绿素7mg/kg (1 ml/kg)各一次，两荧光标记间隔10天。每周称量一次体重，自由饮水给食。实验结束后， 用3%戊巴比妥钠（1. 5ml/kg)行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死。本实施例中钙黄绿 素（calcein):粉剂，Sigma Chemical Co.，USA产品。在闭光环境用2% NaHC03生理盐水 l〇〇ml，磁力搅拌，同时缓慢加入calcein粉末0. 7g，待完全溶解后用微孔过滤器过滤，即为 0.7% calcein溶液，置4°C冰箱避光保存备用。予大鼠颈部皮下注射，用量为1 ml/kg。
[0026] 三.饲养期间各组大鼠一般情况和体重变化 去卵巢手术第二天死亡5只动物（因非单笼饲养，考虑为动物间挤压及因疼痛撕咬所 致)。实验第57天发现芪骨胶囊组B 2 #动物右臂下皮肤有约l*lcm伤口，伤口处脱毛， 皮肤粉红色，疑为动物打架咬伤所致皮肤感染，每天涂抹碘伏消毒伤口，涂抹红霉素软膏消 炎，约18天后伤口完全愈合。实验期间现芪骨胶囊组C和芪骨+双膦酸盐组各有1只动 物死亡，死亡解剖后发现死亡原因与灌胃有关，与药物无关。其余动物试验期间未见明显异 常。
[0027] 由表2, 3,4, 5,6和图1，图2及图3可见，去卵巢诱导的骨质疏松模型大鼠动物体 重增长迅速，芪骨胶囊和双膦酸盐灌胃给药可降低骨质疏松大鼠的体重。
[0028] 与阴性对照组A比较，模型组A在D8~D29体重增长，差异有统计学意义（K0. 01); 芪骨胶囊组A在D15~D29体重增长，差异有统计学意义（代0. 01)。与模型组A比较，芪骨 胶囊组A在D8、D29体重下降，差异有统计学意义（K0. 05)，从图1可见，芪骨胶囊组A在 D8~D29,体重与模型组A比较有下降的趋势。
[0029] 与阴性对照组B比较，模型组B、芪骨胶囊组B、双膦酸盐组、芪骨胶囊+双膦酸盐 组在D15~D85体重均增长，差异有统计学意义（代0. 01);与模型组B比较，芪骨胶囊组B、双 膦酸盐组、芪骨胶囊+双膦酸盐组在各测定时间点均无统计学差异（P>〇. 05)，从图2可见， 芪骨胶囊组B、双膦酸盐组、芪骨胶囊+双膦酸盐组在D36~D85体重与模型组B比较有下降 的趋势。
[0030] 四.骨转化的血生化指标测定 检测试剂： 血钙、骨钙素、骨碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、I型胶原N末端肽均购自南京建成 (L〇P#R20130710/20130910)。
[0031] 检测方法如下： 梯度稀释标准品，在96T酶标板中标准孔每孔加入标准品50 μ 1，链霉素-HRP50 μ 1， 待测样品孔每孔加入样品40 μ 1，然后各加入抗体10 μ 1，链酶亲和素-HRP50 μ 1 (空白对 照孔不加样品，生物素标记的抗体，链酶亲和素-HRP)，盖上封板膜，轻轻震荡均匀，37°C温 育60min后揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次， 拍干，然后每孔先加入显色剂A50 μ 1，再加入显色剂B50 μ 1，轻轻震荡均匀，37°C避光显色 lOmin，每孔加入终止液50 μ 1终止反应，用酶标仪在450nm波长下检测其吸光值。根据标 准品的浓度及对应的0D值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的0D值在回归方 程上计算出对应的样品浓度。
[0032] I 型胶原 C 端肽购自 CUSABIO 公司（批号：C031029123/C1220140102)。
[0033] 检测方法如下： 取出酶标版，设一个空白对照孔、不加任何液体，每个标准点一次设两个孔，每孔加入 相应标准品50 μ 1，其余每个检测孔直接加入待测样品50 μ 1，每孔加入酶结合物50 μ 1 (空 白对照孔除外)，再按同样的顺序加入抗体50 μ 1，充分混匀，盖上封板膜，置37°C温育2小 时，温育后揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置10S后甩干，如此重复3次 后拍干，每孔先加入显色剂A50 μ 1，再加入显色剂B50 μ 1，轻轻震荡均匀，37°C避光显色 15min，每孔加入终止液50 μ 1终止反应，用酶标仪在450nm波长下检测其吸光值。根据标 准品的浓度及对应的0D值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的0D值在回归方 程上计算出对应的样品浓度。
[0034] 实验结果如下：
从表7可见，与基础组相比，阴性对照组A骨碱性磷酸酶下降（尸〈0. 05)，其余生化指 标无明显变化（尸>0.05)。
[0035] 从表8可见，与阴性对照组A相比，模型组A骨碱性磷酸酶下降（尸〈0. 05)。与模 型组A相比，受试药物组A各项血清生化指标均无明显变化（尸>0.05)。
[0036] 从表9可见，与阴性对照组B相比，模型组B的NTX下降（Ρ〈0. 01)，其它生化指标 均无明显变化（P>〇. 05)。与模型组B相比，芪骨胶囊组B、双膦酸盐组、联合用药组各项生 化指标均无明显变化（P>〇. 05)。
[0037] 从表10可见，与阴性对照组C相比，模型组C的血钙、CTX含量升高（K0. 01)，而 TRAP含量下降（代0. 01)。与模型组C相比，受试药物组C的CTX含量下降（代0. 01)，其它 生化指标均无明显变化（乃〇. 05)。
[0038] 五.骨组织形态计量学测定 骨组织形态计量学测定采用OsteoMeasure 0M系统（OsteoMeasure，USA)。松质骨骨组 织形态计量学采用左侧胫骨上段和第四腰椎不脱钙骨切片骨片用甲苯胺蓝染色，测 量静态参数；骨片脱塑后不染色直接封片，测量动态参数动。本实验所有参数采用国际 通用标准骨组织形态计量学术语命名。通过国际通用的公式对直接测得的参数计算并用于 分析。
[0039] 本实施例仅列举大鼠腰椎松质骨形态计量学结果。
[0040] 从表11可见，与阴性对照组A相比，模型组A静态参数％Tb. Ar下降（P〈0. 05)，而 Tb. Sp增加（P〈0. 05)。与模型组A相比，芪骨胶囊组A各项参数均无明显变化（P>0. 05)。
[0041] 从表12可见，与阴性对照组A相比，模型组A动态参数％0b. S. Pm增加（K0. 05)。 与模型组A相比，芪骨胶囊组A各项参数均无明显变化（乃0. 05)。
[0042] 从表13可见，与阴性对照组B比较，模型组B静态参数％Tb. Ar、Tb. Th、Tb. N均下降 (代0.05&代0.01)，而113.5?明显升高（代0.01)。与模型组8比较，芪骨胶囊组8各项参数 均无明显变化（/?). 05)，双膦酸盐组和联合用药组％Tb. Ar、Tb. N均增加（K0. 05&K0. 01)， 而Tb. Sp均降低（K0.0 1)。与芪骨胶囊组B比较，双膦酸盐组和联合用药组Tb.N均 升高（K0. 05&代0· 01)，而Tb. Sp均降低（K0. 05&代0· 01)，联合用药组％Tb. Ar也增加 (K0. 05)。与双膦酸盐组比较，联合用药组腰椎静态参数均无明显变化（/?). 05)。
[0043] 从表14可见，与阴性对照组B相比，模型组B腰椎动态参数BFR/TV下降（K0. 05)， 而％013. S. Pm升高（K0. 01)，其它参数未见明显变化（/?). 05)。与模型组B比较，芪骨胶囊 组B各项参数均无明显变化（乃0. 05)，双膦酸盐组和联合用药组MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/ TV、％Ob. S. Pm 均降低（Κ0· 05&K0. 01)，而双膦酸盐组 Oc. N/mm、％Oc. S. Pm 升高（Κ0· 05)。 与芪骨胶囊组Β比较，双膦酸盐组MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均降低（ΚΟ. 05)，而Oc. Ν/ mm、％0c. S. Pm升高（ΚΟ. 05)。而联合用药组各项参数与芪骨胶囊组Β及双膦酸盐组比较均 无明显变化（乃〇. 05)。
[0044] 从表15可见，与阴性对照组C比较，模型组C静态参数％Tb. Ar、Tb. Th、Tb. Ν均下 降（P〈0. 05&P〈0. 01)，而Tb. Sp明显升高（P〈0. 01)。与模型组C比较，芪骨胶囊组C各项参 数均无明显变化（P >0. 05)。
[0045] 从表16可见，与阴性对照组C相比，模型组C腰椎动态参数Oc. N/mm、％Oc. S. Pm、％Ob. S. Pm均升高（K0.0 5)。与模型组C比较，芪骨胶囊组C各项参数均无明显变化 {P>Q. 05) 〇
[0046] 五.骨密度检测 扫描左侧股骨全段、第4腰椎全段，测量其骨矿物质密度（BMD)。
[0047] 从表17可见，与阴性对照组A相比，模型组A的股骨远端BMD下降（代0· 05)，与 模型组A比较，芪骨胶囊组A的股骨和腰椎的骨密度均无明显变化（/M). 05)。
[0048] 从表18可见，与阴性对照组B比较，模型组B的股骨和腰椎BMD均下降 (代0.05&代0.01)。与模型组B比较，芪骨胶囊组B的股骨和腰椎BMD均无明显变 化（/?). 05)，双膦酸盐组和联合用药组股骨近端BMD、股骨远端BMD、股骨BMD均增加 (K0.0 5&K0. 01)。与芪骨胶囊组B比较，双膦酸盐组和联合用药组股骨近端BMD、股骨远端 BMD、股骨BMD均增加（K0.0 5&K0. 01)。与双膦酸盐组比较，联合用药组股骨近端BMD增加 (K0. 05)，但股骨远端BMD、股骨BMD无明显变化（乃0. 05)。
[0049] 从表19可见，与阴性对照组C比较，模型组C的股骨和腰椎BMD均下降（K0. 01)。 与模型组C比较，芪骨胶囊组C的股骨和腰椎的骨密度均无明显变化（乃0. 05)。
[0050] 五.骨生物力学检测 测试时，将_20°C保存的股骨。用858 Mini Bionix型材料测试系统检测和分析右侧 股骨近端的生物力学性能，测量右侧股骨弹性载荷、最大载荷、断裂载荷等。
[0051] 从表20可见，与阴性对照组A比较，模型组A各项参数均无明显变化（/M). 05)，与 模型组A比较，芪骨胶囊组A各项参数均无明显变化（乃0. 05)。
[0052] 从表21可见，与阴性对照组B比较，模型组B的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚 性系数均降低（P〈〇. 05&P〈0. 01)。与模型组B比较，芪骨胶囊组B的最大载荷、断裂载荷、刚 性系数均增加（P〈〇. 05)，双膦酸盐组和联合用药组的刚性系数均增加（P〈0. 05)。与芪骨胶 囊组B比较，联合用药组各项参数均无明显变化（P>0. 05)。与双膦酸盐组比较，联合用药组 各项参数均无明显变化（P>〇. 05)。
[0053] 从表22可见，与阴性对照组C比较，模型组C的最大载荷、断裂载荷均降低 (K0. 01)。与模型组C比较，芪骨胶囊组C各项参数均无明显变化（乃0. 05)。
[0054] 从以上的分析可以得到如下的结论： 观察了相当于临床剂量的芪骨胶囊对三个阶段（30、90、180天)去卵巢大鼠骨质疏松的 作用，并分析发现： 1.模型描述：三个阶段（30、90、180天）去卵巢大鼠在不同部位分别引起骨量丢失，随 着时间延长，血清主要骨形成标记物(骨钙素 BGP、骨碱性磷酸酶BALP)降低，骨吸收标记物 (I型胶原C端肽CTX)增高。骨形态计量学动态参数显示，该模型在早期是骨转换增高，后 期是包括骨形成降低的低骨转换骨质疏松。
[0055] 2.对照药物双膦酸盐结果：双膦酸盐能有效对抗本模型引起的骨丢失(与0VX比 较增加骨量102%)，但较明显同时抑制了骨形成和骨的矿化。
[0056] 3.芪骨胶囊作用：芪骨胶囊0. 342g/kg/d在三个阶段均未观察到对抗本模型引 起的骨丢失，即并没有增加0VX大鼠的骨小梁面积百分数（％Tb. Ar)和骨密度。然而，单独 或与双膦酸盐联合用药中，芪骨胶囊显示作用优势：芪骨胶囊作用90天时能增加股骨的 骨生物力学，提高模型大鼠股骨的最大载荷与和断裂载荷。芪骨胶囊本身并不抑制骨矿化 形成，但可降低血中骨吸收指标CTX-I。
[0057] 4.芪骨胶囊与双膦酸盐联合应用，可对抗双膦酸盐抑制骨形成的作用，与双膦酸 盐协同增加股骨近端的骨密度。
[0058] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明方法也可以用在其它中药上， 通过去卵巢大鼠的骨质疏松模型的建立的实验方法，用于评价受试中药的防治骨质疏松症 的疗效。
【主权项】
1. 一种评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 动物给药，采用雌性SD大鼠分为如下组别给药：基础组，蒸馏水5ml/kg/d灌胃；阴 性对照组，做假手术，蒸馏水5ml/kg/d灌胃，实验30~180天；模型组，手术去除大鼠双侧 卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模型，以蒸馏水5ml/kg/d灌胃，实验30~180天；服药组，手 术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模型，中药粉0. 342g/kg/d灌胃，实验30~ 180天；实验过程中，每周称重一次，称重前一天禁食不禁水，第二天给药前称重，然后调整 给药剂量并进行给药； (2) 动物体内荧光标记，所有雌性大鼠处死前13、14两天和3、4两天分别皮下注射 0. 7%钙黄绿素1 ml/kg各一次，两荧光标记间隔10天，每周称量一次体重，自由饮水给食， 实验结束后，用3%，1. 5ml/kg的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死； (3) 测定骨相关评价指标。2. 如权利要求1所述的评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于：所述的骨 相关评价指标为：骨转化的血生化指标，骨组织形态计量学测定，骨密度检测，骨生物力学 检测。3. 如权利要求1或2所述的评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于：动物 给药阶段的组别还包括双膦酸盐组，即手术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模 型，以阿仑磷酸钠 lmg/kg/d灌胃，实验90天。4. 如权利要求3所述的评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于：动物给药 阶段的组别还包括综合给药组，即手术去除大鼠双侧卵巢，诱导建立大鼠骨质疏松模型，阿 仑磷酸钠 lmg/kg/d加中药粉0. 342g/kg/d灌胃，实验90天。5. 如权利要求1所述的评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于：所述的SD 大鼠采用3月龄未交配SPF级雌性SD大鼠，在SPF级环境饲养至6月龄，饲养温度为20~ 26°C，湿度为40~70%，采用10h :14h昼夜间断照明。6. 如权利要求1所述的评价中药防治骨质疏松症的实验方法，其特征在于：所述的 0.7%钙黄绿素的制备方法为：在闭光环境中用2% NaHC03生理盐水100ml，磁力搅拌，同时 缓慢加入钙黄绿素粉末〇. 7g，待完全溶解后用微孔过滤器过滤，置于4°C冰箱避光保存。
【文档编号】A61K49/00GK105833292SQ201510017529
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】崔燎, 王春凤, 吴铁, 郑珊珊, 南淑华, 赖志成
【申请人】厦门中药厂有限公司