一种3d打印制备生物支架的方法
【专利摘要】本发明提供一种3D打印制备生物支架的方法，以同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机低温研磨制得打印材料，通过计算机辅助建模3D打印，然后在京尼平溶液中后处理；制得的生物支架具有良好的生物相容性，骨移植材料在体内无毒性、无排斥反应、无诱变性、无抗原性，不干扰骨与组织再生；且制备的生物支架可逐渐降解而被自体骨组织吸收、替代，与正常骨皮质能承受的符合接近（20MPa），具有良好的初始力学性能；且弹性模量逐渐降低，不会产生应力遮挡，避免长期愈合过程中内置物骨折、塌陷及松动，可促进骨融合，最终完全转化为自体骨组织。
【专利说明】
一种3D打印制备生物支架的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物支架，具体涉及一种3D打印制备可吸收生物支架的方法。
【背景技术】
[0002]对于发生了病变或损伤的骨组织，需使用替代骨材料进行骨修复以促进骨融合。使用自体骨移植是公认的融合率最高的“金标准”。但自体骨材料取材难度高，取材量有限，增加额外创伤，支撑强度不足。因此，探索理想的骨移植替代材料是本领域重要的研究课题。
[0003]目前常用的骨移植材料包括同种异体骨、金属材料及聚醚醚酮(PEEK)树脂材料。同种异体骨虽然具有较好的可降解、吸收与替代性，但速率控制困难，导致机械性能不可靠，过快易发生植骨块骨折致椎间隙塌陷，过慢则产生应力遮挡，影响骨融合。金属材料如不锈钢、钛合金、钴-铬-钼合金等，虽然初始稳定性和固定效果满意，但金属材料弹性模量远远大于骨组织，应力遮挡现象显著，长期随访发现Wolf f氏现象，影响骨融合;且金属材料腐蚀会引发非细菌性炎症，术后持续疼痛、植入物松动等并发症并不少见。PEEK材料较金属材料优势明显，具有较好的生物相容性，骨接触面未见明显的骨吸收现象，但其弹性模量较骨组织仍然太高，在长期生长中也无法被降解、吸收和替代。因此，寻找一种满足临床需求的骨移植材料，必将为广大患者带来福音。
[0004]3D打印是一种以数字模型文件为基础，结合计算机辅助，通过逐层打印各种材料来构造物体的新型增材制造技术。自问世以来，在航空航天、机械制造领域广泛应用，并取得了巨大成功。和传统制作工艺相比，3D打印技术具有快速成型的特点。目前在医疗行业，该技术主要用于外用支具和手术导板制备，在内置物方面研究较少。制约3D打印技术发展的关键是打印材料，而生物支架，尤其是作为骨代替材料的生物支架，作为内置物直接与人体内部器官相接触，需要具有良好生物相容性、可降解、吸收与替代性以及适当递减的机械性能。一旦解决了 3D打印生物支架的材料问题，该技术将快速运用到骨科疾病的治疗中。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种3D打印制备生物支架的方法，该方法制备的生物支架具有良好的生物相容性、可降解、吸收与替代性以及适当递减的机械性能。
[0006]除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。
[0007]本发明的目的是这样实现的:
一种3D打印制备生物支架的方法，包括制备打印材料、3D打印和生物支架后处理步骤，其特征在于:所述制备打印材料为将同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机中，液氮环境下撞子粉碎研磨2?4小时，常温干燥后用40?80目分筛得到骨粉体;然后以胶原蛋白凝胶、聚己内酯或者聚乙烯醇水溶液为粘结剂，以重量百分比为40?80的%骨粉体和20?60wt%的粘结剂混合后球磨制备得到浆料原料;将浆料原料于2?10°C用离心机离心3?5min，转速2000?3000转/min，制得3D打印材料。
[0008]根据本发明的一个实施方案，上述生物支架为骨代替材料。
[0009]根据本发明的一个实施方案，上述异种骨包括各种异种骨材料，尤其包括小牛骨。
[0010]根据本发明的一个实施方案，上述胶原蛋白凝胶、聚己内酯或者聚乙烯醇水溶液的浓度为3?10wt%。
[0011]根据本发明的一个实施方案，上述液氮环境温度为-30?_75°C，撞子粉碎时间为2?4小时;上述常温干燥时间为10?60分钟;上述分筛的骨粉体直径为I?200μηι。
[0012]根据本发明的一个实施方案，上述粘结剂为胶原蛋白凝胶时，可加入3_10wt%的醋酸溶液作为助粘剂，所述醋酸溶液的浓度为5?20%。
[0013]根据本发明的一个实施方案，上述3D打印为采用三维CT或MRI扫描植骨部位，用计算机建模设计植骨支架形态，用上述制备的打印材料打印生物支架。
[0014]根据本发明的一个实施方案，上述后处理为将打印好的生物支架于I?5%的京尼平溶液中浸泡4?10分钟，取出后在温度为2?10°C，湿度80?90%的条件下自然晾干20?28小时;然后用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0015]一种3D打印制备生物支架材料的方法，采用如下步骤:
(1)将同种异体骨或异种骨放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，于-30?-75°C中撞子粉碎研磨2?4小时，常温干燥后，采用40?80目分样筛筛选出直径I?200μηι的骨粉体备用;
(2)以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用浓度为3?5%的胶原蛋白凝胶水溶液或者聚乙烯醇水溶液作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为40?80的%骨粉体和重量百分比为20?60wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30?60min制作成楽料原料；
(3)将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为2?10°C，湿度80?90%条件下离心机离心3?5min，转速2000?3000转/min，得到打印楽料备用；
(4)三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5)将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(d)中得到的个体化植骨支架形态打印植骨支架；
(6)将步骤(5)得到的植骨支架放入I?5%的京尼平溶液中浸泡4?10分钟后取出，于温度为2?10°C，湿度80?90%条件下自然晾干24小时；
(7)将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0016]根据本发明的一个实施方案，上述3D打印可吸收生物支架孔隙直径为2?500μπι，孔隙率O?80%。
[0017]根据本发明的一个实施方案，上述3D打印可吸收生物支架，其表面和或孔隙间可粘附一层促进骨形成的细胞或因子覆盖，如骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白(ΒΜΡ)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，增骨融合概率以及促进成骨替代。
[0018]有益效果
1、本发明采用同种异体骨或异种骨作为植骨支架的基础材料，通过冷冻研磨机低温研磨成特定大小的骨粉体，与生物相容性良好的粘结剂相配合，充分利用自然骨的理化性质，制备的骨组织具有良好的生物相容性，骨移植材料在体内无毒性、无排斥反应、无诱变性、无抗原性，不干扰骨与组织再生。
[0019]2、本发明制备的生物支架可逐渐降解而被自体骨组织吸收、替代，与正常骨皮质能承受的符合接近(20MPa)，具有良好的初始力学性能;且弹性模量逐渐降低，不会产生应力遮挡，避免长期愈合过程中内置物骨折、塌陷及松动，可促进骨融合，最终完全转化为自体骨组织。
[0020]3、本发明具有适当递减的机械性能，骨移植材料具有足够的初始力学强度以维持早期力量支撑，随着逐渐降解吸收，力学强度与骨融合同步衰减，至完全被自身骨组织替代，到达正常骨组织的力学强度。
[0021]4、本发明采用3D打印技术制作骨移植支架，可在计算机辅助下，根据每个患者影像学结果定制个体化支架，以完全符合骨缺损或医生需求的支架形态，而且具有速度快、可调整孔隙率以及可粘附各种促骨形成细胞或因子的优势。
【具体实施方式】
[0022]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。以下实施例所用计算机辅助设计软件及3D生物打印机均由西安点云先进材料科技有限公司提供。
[0023]实施例1
小牛骨3D打印制备骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮(-30?-50°C)，撞子粉碎研磨2小时，常温干燥60min后，采用80目分样筛筛选出直径<180μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液(5wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50的%骨粉体和重量百分比为50的％的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成楽料原料；
(3).将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8°C，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印楽料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤(5)得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为80C，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0024]制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
[0025]实施例2
对实施例1制备的生物支架进行性能测试，包括生物相容性、吸收降解性能以及力学性能等。
[0026]生物形容性:按实施例1的方法制备10X 10 X Imm的生物支架薄片，置于96孔培养皿的底部，用α-ΜΕΜ浸润24小时。取兔骨髓间充质干细胞(温度37°C，C02浓度5%，湿度95%条件下)传代培养至第三代，调节细胞密度3 X 15个/ml，将细胞接种于底部有支架薄片的培养孔，设无膜片的对照培养孔，5个平行培养孔，培养基为α-ΜΕΜ培养基加10%新生牛血清，每孔800 μ?，于37° C，5% CO2，95%湿度条件下培养，定期换液。24小时后加入CKK8溶液，于370C孵育I小时。酶标仪测量450nm处的标本吸光值(η=5)，计算相对增殖率(RGR)。实验结果显示，细胞在小牛骨支架薄片上的相对增值率为94.18 土 5.25%，增值率大于75%，不显示细胞毒性，表明小牛骨支架的细胞相容性好。
[0027]吸收降解性:按实施例1的方法制备直径5mmX长度1mm的圆柱体小牛骨支架，以雄性12周龄新西南大白兔为实验动物(体重3.12 ± 2.3kg)，在股骨髁无菌制取直径5mm X长度1mm的圆柱体骨缺损，将制备的小牛骨支架植入缺损中，骨蜡封闭，缝合伤口。抗生素处理，继续培养至2、4、8、12周后处死。取出小牛骨支架(n=5 )，扫描电镜观察植入支架的降解吸收情况。实验结果显示，小牛骨植入大白兔皮下，未见明显的毛细血管充血等组织炎症反应，骨生物相容性良好。支架材料在各时间节点骨体积分数(BV/TV)逐渐减少，表明支架材料被逐渐吸收。
[0028]逐渐递减机械性能:按实施例1的方法制备直径5_X长度1mm的圆柱体小牛骨支架，以雄性12周龄新西南大白兔为实验动物(体重3.12±2.3kg)，在股骨髁无菌制取直径5mmX长度1mm的圆柱体骨缺损，将制备的小牛骨支架植入缺损中，骨錯封闭，缝合伤口。抗生素处理，继续培养至0、2、4、8、12周后处死。取出小牛骨支架(n=5)，材料试验机测试各标本的最大压缩强度。实验结果显示，支架材料在各时间节点，最大压缩强度逐渐降低，0、2、
4、8、12周最大压缩强度分别20.5±3.211^&，18.4±1.511^&，15.3±2.111^&，10.5±1.211^&，9.5±1.1mPa，表明支架材料在体内的机械性能呈逐渐递减的趋势。
[0029]按实施例1制备小牛骨支架，同时在制备的支架表面和/或孔隙间粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进骨形成的细胞或因子。重复以上三个实验，实验结果表明，小牛骨支架粘附促骨形成的细胞或因子，不与人体及生物支架产生排斥，可促进支架吸收降解并促进骨融合与替代速率。
[0030]实施例3
同种异体骨3D打印骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).将同种异体骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮(-50?-65°C)，撞子粉碎研磨4小时，常温干燥30分钟后，采用分样筛筛选出直径小于150μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用聚己内酯水溶液(10wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为70的%骨粉体和重量百分比为30的％的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成楽料原料；
(3).将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为4°C，湿度85%条件下离心机离心5min，转速2500转/min，得到打印楽料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架； (6).将步骤(5)得到的植骨支架放入5%的京尼平溶液中浸泡6分钟后取出，于温度为40C，湿度85%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0031 ]制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为lOOum，孔隙率为30%。
[0032]实施例4
小牛骨3D打印骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮(-65?-75°C)，撞子粉碎研磨3小时，常温干燥60分钟后，采用分样筛筛选出直径小于80μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用聚乙烯醇水溶液(3wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为60的％骨粉体和重量百分比为40^%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成楽料原料；
(3).将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为6°C，湿度85%条件下离心机离心5min，转速2000转/min，得到打印楽料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤(5)得到的植骨支架放入4%的京尼平溶液中浸泡6分钟后取出，于温度为60C，湿度85%条件下自然晾干28小时；
(7).将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0033]制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为50um，孔隙率为60%。
[0034]参照实施例2，测定实施例3和实施例4制备的生物支架性能，实验结果显示，细胞在支架薄片上的增值率均大于75%，且未见明显的毛细血管充血等组织炎症反应，骨生物相容性良好。而且支架材料在各时间节点骨体积分数(BV/TV)逐渐减少，表明支架材料均被逐渐吸收。同时支架材料在体内的机械性能也均呈逐渐递减的趋势。
[0035]按实施例3、4制备的生物支架，同时在制备的支架表面和/或孔隙间粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进骨形成的细胞或因子。重复实验，实验结果表明，支架粘附促骨形成的细胞或因子，不与人体及生物支架产生排斥，可促进支架吸收降解并促进骨融合与替代速率。
[0036]对比实施例1
小牛骨3D打印骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).小牛骨常温、常规方式研磨直径为800μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液(5wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50的%骨粉体和重量百分比为50的％的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成楽料原料；
(3).将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8°C，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印楽料备用； (4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤(5)得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为80C，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(7).将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0037]制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
[0038]参照实施例2的方法检测对比实施例1制得的生物支架性能，实验结果显示，支架薄片生物相容性好，但吸收降解速率慢，力学强度递减慢。
[0039]对比实施例2
小牛骨3D打印骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，撞子粉碎研磨2小时，常温干燥后，采用80目分样筛筛选出直径<180μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液(5wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50的%骨粉体和重量百分比为50的％的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成打印楽料；
(3).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(4).将步骤(2)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(5).将步骤(4)得到的植骨支架放入3%的京尼平溶液中浸泡10分钟后取出，于温度为80C，湿度90%条件下自然晾干24小时；
(6).将步骤(5)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0040]结果显示，3D打印连续性不好，废品率较高。
[0041 ]对比实施例3
小牛骨3D打印骨移植支架实施例米用如下步骤:
(1).将小牛骨组织放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，撞子粉碎研磨2小时，常温干燥后，采用80目分样筛筛选出直径<180μπι的骨粉体备用；
(2).以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用胶原蛋白凝胶水溶液(5wt%)作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为50的%骨粉体和重量百分比为50的％的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30min制作成楽料原料；
(3).将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为8°C，湿度90%条件下离心机离心5min，转速3000转/min，得到打印楽料备用；
(4).三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态；
(5).将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(4)中得到的个体化植骨支架形态打印出植骨支架；
(6).将步骤(5)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。
[0042]制得的3D打印可吸收植骨支架，孔隙直径为200um，孔隙率为20%。
[0043]参照实施例2的方法检测对比实施例1制得的生物支架性能，实验结果显示，细胞相容性较好，可吸收降解，但是力学强度较低，易崩毁，并且不利于支架材料吸收替代过程中力学强度的维持。
【主权项】
1.一种3D打印制备生物支架的方法，包括制备打印材料、3D打印和生物支架后处理步骤，其特征在于:所述制备打印材料为将同种异体骨或异种骨于冷冻研磨机中，液氮环境下撞子粉碎研磨2?4小时，常温干燥后用40?80目分筛得到骨粉体;然后以胶原蛋白凝胶或者聚乙烯醇水溶液为粘结剂，以重量百分比为40?80的%骨粉体和20?60wt%的粘结剂混合后球磨制备得到浆料原料;所述胶原蛋白凝胶或者聚乙烯醇水溶液的浓度为3?10^%;将浆料原料于2?10°C用离心机离心3?5min，转速2000?3000转/min，制得3D打印材料。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述生物支架为骨替代材料。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述异种骨为小牛骨。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于:所述液氮环境温度为-30?-75V，撞子粉碎时间为2?4小时;所述常温干燥时间为10?60分钟;所述分筛的骨粉体直径为I?200μηιο5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于:所述后处理为将打印好的生物支架于I?5%的京尼平溶液中浸泡4?10分钟，取出后在温度为2?10°C，湿度80?90%的条件下自然晾干20?28小时;然后用环氧乙烷灭菌，无菌封装。6.一种3D打印制备生物支架材料的方法，采用如下步骤: 将同种异体骨或异种骨放入冷冻研磨机的研磨容器中，浸入液氮，于-30?-75 °C中撞子粉碎研磨2?4小时，常温干燥后，采用40?80目分样筛筛选出直径I?200μηι的骨粉体备用； (2)以步骤(I)得到的骨粉体为原料，采用浓度为3?5%的胶原蛋白凝胶水溶液作为粘结剂，室温条件下将重量百分比为40?80的%骨粉体和重量百分比为20?60wt%的粘结剂至于球磨罐中，经球磨30?60min制作成楽料原料； (3)将步骤(2)得到的浆料原料放入玻璃试管中，于温度为2?10°C，湿度80?90%条件下离心机离心3?5min，转速2000?3000转/min，得到打印楽料备用； (4)三维CT或MRI扫描需要植骨部位，采用计算机辅助设计软件根据实际需要设计出个体化植骨支架形态； 将步骤(3)得到的打印浆料加入3D生物打印机，根据步骤(d)中得到的个体化植骨支架形态打印植骨支架； 将步骤(5)得到的植骨支架放入I?5%的京尼平溶液中浸泡4?10分钟后取出，于温度为2?10°C，湿度80?90%条件下自然晾干24小时； 将步骤(6)得到的植骨支架用环氧乙烷灭菌，无菌封装。7.如权利要求1或6所述方法，其特征在于:所述生物支架孔隙直径为2?500μπι，孔隙率O?80%08.如权利要求1或6所述方法，其特征在于:所述生物支架，其表面和/或孔隙间可粘附一层骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白(BMP)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
【文档编号】A61L27/36GK105903078SQ201610330928
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】赵建华, 刘瑶瑶, 涂洪波, 刘鹏, 刘明永, 殷翔, 范伟力
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第三附属医院