新的抗神经诱向因子-1抗体的制作方法

新的抗神经诱向因子-1抗体的制作方法
【专利摘要】本申请公开了神经诱向因子?1上的线性或基本上线性表位，所述表位可能对应于神经诱向因子?1特异性结合受体具体是UNC5类，特别是UNC5B和UNC5A的区域，或者可选地对应于神经诱向因子?1特异性结合受体的区域的附近区域，当该表位结合抗体时阻止神经诱向因子?1/受体相互作用。线性表位的这种确定允许
【申请人】生产这样的抗体，所述抗体结合神经诱向因子?1并干扰神经诱向因子?1/受体相互作用，从而诱导表达或过表达神经诱向因子?1和至少一种神经诱向因子?1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡，这是由于这种相互作用抑制神经诱向因子?1结合到受体和受体的多聚化的事实。本申请公开了针对该表位的鼠单克隆抗体和它们的各种人源化形式。
【专利说明】新的抗神经诱向因子-1抗体
[0001] 本发明涉及可用于在神经诱向因子-l(netrin-l)(特别是肿瘤表达的神经诱向因 子-1)的存在下诱导具有神经诱向因子-1受体(诸如UNC5受体)的肿瘤细胞的细胞死亡或细 胞凋亡的神经诱向因子-1结合多肽或抗体，及其治疗癌症的用途。
[0002] 神经诱向因子-1是神经诱向因子家族的成员，并且在吸引和排斥的两者的背景下 是轴突导向提示，并且在神经系统发育中起重要作用。神经诱向因子-1的主要受体是DCC (在结直肠癌中缺失）和UNC5 (人中的UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D，小鼠中的UNC5H1、UNC5H2、 UNC5H3、UNC5H4)，其都属于依赖性受体家族（Keino-Masu，1996 ,Ce 11 87: 175-185; Ackermann，1997,Nature 386:838-842;Hong，1999,Ce11 97:927-941;MehIen，1998， Nature 395:801-804)。依赖性受体共有在不存在它们的各自配体的情况下诱导细胞凋亡 的能力，由此这种能力在结合各自配体后被阻断(Mehlen，2004,Cell Mol Life Sci 61: 1854-1866；Bredesen,2005,Cell Death Differ 12:1031-1043)〇
[0003] 在各种人类癌症中，已经观察到DCC表达的减少或损失，和因此DCC诱导的细胞凋 亡的减少或损失（Kinzler ,1996 ,Proc Natl Acad Sci 100:4173-4178)。此外，已经观察 到，UNC5基因在大多数结直肠肿瘤中也被下调，这表明依赖性受体UNC5的损失代表对于肿 瘤细胞的选择性优势（Bernet ,2007 ,GastroenteroIogy 133 :180-1848; Shin ,2007， Gastroenterology 133:1849-1857)。然而，不仅依赖性受体DCC和UNC5的下调提高各种肿 瘤细胞的存活，而且还已经观察到它们的配体神经诱向因子-1的自分泌表达。具体地，已经 显示，大多数乳腺肿瘤（即转移性乳腺癌）表现出神经诱向因子-1的表达增加(Fitamant， 2008，Proc Natl Acad Sci 105:4850-4855)。到现在为止，已经证实UNC5的胞外部分的这 两个免疫球蛋白（Ig)子结构域负责结合神经诱向因子-1，但并不清楚这两个结构域对于充 分的神经诱向因子-1结合是否是必需的（6641^6(31^，2003，1.8丨〇1.(：116111.278:32561-32568；Kruger,2004,J.Neur.24:10826-10834)〇
[0004] 如先前已经证明的，神经诱向因子-1被DCC的胞外域或此胞外域的部分的中和(充 当神经诱向因子-1诱饵蛋白）可以在表达依赖性受体DCC和/或UNC5的肿瘤细胞中诱导细胞 凋亡（EP-A1-1 989 546)。此胞外域或此胞外域的部分能够减少乳腺癌细胞转移到肺 (Fitamant等，2008)。此外，也已证明此胞外域或此胞外域的部分增加表达高水平的神经诱 向因子-1的非小细胞肺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的细胞死亡百分比（〇 611〇5^-Bourgeois,2009,J Natl Cancer Inst 101:237-247；Delloye-Bourgeois,2009,JEM 206: 833-847)。恥2012025618公开了具有改进的DCC诱饵的DCC-融合蛋白。
[0005] EP 1 989 546(W02007099133)公开了作为药物的针对神经诱向因子-1或神经诱 向因子-1受体的单克隆抗体或多克隆抗体，特别是针对神经诱向因子-1受体的胞外结构域 或针对能够与神经诱向因子-1受体的胞外结构域相互作用的神经诱向因子-1的片段。
[0006] 本
【申请人】现已确定了神经诱向因子-1上的线性或基本上线性表位，所述表位可能 对应于神经诱向因子-1特异性结合受体(具体是UNC5类，特别是UNC5B和UNC5A)的区域，或 者备选地对应于神经诱向因子-1特异性结合受体的区域的附近区域，当该表位结合抗体时 阻止神经诱向因子-1/受体相互作用。线性表位的这种确定允许
【申请人】生产这样的抗体，所 述抗体结合神经诱向因子-1并干扰神经诱向因子-1/受体相互作用，从而诱导表达或过表 达神经诱向因子-1和至少一种神经诱向因子-1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡，这 是由于这种相互作用抑制神经诱向因子-1结合到受体和受体的多聚化的事实。本
【申请人】也 生产针对该表位的鼠单克隆抗体和它们的各种人源化形式。
[0007] 神经诱向因子-1的全长氨基酸序列作为SEQ ID NO: 1给出并且编码其的CDNA以 SEQ ID NO: 2给出。在神经诱向因子-1的第二EGF样结构域中的线性表位已经被表征并描绘 于SEQ ID N0:3、更特别是SEQ ID N0:35。编码这种表位的cDNA分别描绘于SEQ ID N0:4和 36 〇
[0008] 本发明的第一个目的因此是代表神经诱向因子-1的线性表位或所述线性表位的 片段或变体的多肽。更具体地，本发明涉及：
[0009] -序列为SEQ ID N0:3的分离的或纯化的多肽，
[0010]-与SEQ ID N0:3具有至少85、90、95、96、97、98或99%同一性的变体多肽，
[0011]-至多200、150、100、90、80、70、60、50个氨基酸，并包括如上所述的SEQIDN0:3或 变体序列的变体多肽，诸如由SEQ ID NO: 3的从位置9(A)到位置30(C)(包括这些氨基酸）的 22个连续氨基酸组成的变体多肽，所述变体表示为SEQ ID NO:35，
[0012]-包含SEQ ID N0:3的至少20、25或30个连续氨基酸的变体多肽诸如序列SEQ ID NO: 35的变体多肽，或如上所述的变体序列，
[0013]-序列为SEQ ID N0:35的多肽，或如上述变体序列，
[0014]-由序列为SEQ ID N0:4或36的cDNA编码的分离的或纯化的多肽。
[0015] 本发明的另一个目的是编码所述代表神经诱向因子-1的线性表位或所述线性表 位的片段或变体的多肽的cDNA。更具体地，本发明涉及：
[0016] -序列为SEQ ID NO:4的cDNA序列，
[0017]-借助于遗传密码简并性，编码序列SEQ ID N0:3或其变体的多肽的变体cDNA，
[0018]-编码如早先所定义的变体多肽的变体cDNA，尤其是编码变体多肽SEQ ID NO: 35 的cDNA，诸如SEQ ID NO:36的cDNA，
[0019]-与SEQ ID N0:4或36具有至少85、90、95、96、97、98或99%同一性的变体。0嫩。 [0020]根据本发明，变体多肽能够产生仍然保留下列能力的抗体，所述能力是特异性结 合至神经诱向因子-1上的线性表位，并抑制神经诱向因子-1与其受体(具体是UNC5或DCC， 尤其是UNC5B和UNC5A)的相互作用，并诱导表达或过表达神经诱向因子-1和神经诱向因子-1受体的肿瘤细胞的细胞凋亡或细胞死亡。变体cDNA编码SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:35的多 肽或变体多肽。
[0021]本发明的另一个目的是SEQ ID NO: 3或35的多肽或其变体产生单克隆抗体的用 途，并且这样产生的单克隆抗体也是本发明的一个目的。本领域技术人员知道允许使用浆 细胞和杂交瘤技术产生单克隆抗体的方法。本发明涵盖使用这些方法来产生特异性针对 SEQ ID N0:3或35的多肽或其变体的抗体。由于VH和VL的⑶R的确定和公开，通过基于编码 所述特定多肽或抗体的核酸序列进行遗传工程产生多肽或单克隆抗体，也在本发明的范围 之内。提供具有特异性针对本发明的线性表位其片段或变体的可变区的抗体片段和/或人 源化抗体或抗体片段也在本发明的范围内。术语"结合多肽"在本文将用于涵盖保持抗体的 结合功能的抗体和抗体变体、片段和组合。
[0022]本发明因此还涉及神经诱向因子-1多肽，其特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3或35的多肽或其变体。所述结合多肽具有结合神经诱向因子-1并诱导经由UNC5或DCC 受体的肿瘤细胞的细胞死亡或细胞凋亡的性质。事实是，游离或有活性的神经诱向因子-1 不再存在或以不足的水平存在，以便神经诱向因子-1的细胞凋亡信号转导被活化。
[0023]本发明还涉及神经诱向因子-1结合多肽，其包含一个或多个具有氨基酸序列SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:30或SEQ ID N0:9的互补决定区（CDR)，其中所述结合多肽具有结合神 经诱向因子-1并诱导经由UNC5或DCC受体的肿瘤细胞的细胞死亡或细胞凋亡的性质。
[0024]所述多肽可以是抗体或其抗原结合片段。
[0025]使用頂GT定义，本发明因此涉及神经诱向因子-1结合多肽，其包含一个或多个具 有氨基酸序列SEQ ID N0:7(CDR3-H)、SEQ ID N0:9(CDR3-L)并优选具有以上两者的互补决 定区（⑶R)。
[0026] 更具体地，所述多肽可以进一步通过额外存在⑶Rl、CDR2或VH和/或VL的⑶Rl和 CDR2进行定义。因此，所述多肽可以包含一个或多个具有下列氨基酸序列的CDR:SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9和序列YAS;和/或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8。
[0027] 本发明的一个目的是包含序列为SEQ ID N0:5的CDR1-H、序列为SEQ ID N0:6的 CDR2-H、序列为SEQ ID N0:7的CDR3-H的多肽。
[0028] 本发明的一个目的是包含序列为SEQ ID N0:8的CDR1-L、序列为YAS的CDR2-L和序 列为SEQ ID N0:9的CDR3-L的多肽。
[0029] 本发明的多肽优选包含序列为SEQ ID N0:5的CDR1-H、序列为SEQ ID N0:6的 CDR2-H、序列为SEQ ID N0:7的CDR3-H、序列为SEQ ID 勵:8的0)1?1-1^、序列为￥45的0)1?2-1^ 和序列为SEQ ID N0:9的CDR3-L。
[0030]使用Kabat定义，本发明因此涉及神经诱向因子-1结合多肽，其包含一个或多个具 有氨基酸序列SEQ ID N0:30(CDR3-H)、SEQ ID N0:9(CDR3-L)并优选具有以上两者的互补 决定区(⑶R)。
[0031] 更具体地，所述多肽可以进一步通过额外存在⑶Rl、CDR2或VH和/或VL的⑶Rl和 CDR2进行定义。因此，所述多肽可以包含一个或多个具有下列氨基酸序列的CDR:SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:28;SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29;SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:32;和/ 或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:31。
[0032] 本发明的一个目的是包含序列为SEQ ID N0:28的CDR1-H、序列为SEQ ID N0:29的 CDR2-H、序列为SEQ ID 从):30的〇)1?3-!1的多肽。
[0033] 本发明的一个目的是包含序列为SEQ ID N0:31的CDR1-L、序列为SEQ ID N0:32的 CDR2-L、序列为SEQ ID N0:9的CDR3-L的多肽。
[0034] 本发明的多肽优选包含序列为SEQ ID N0:28的CDR1-H、序列为SEQ ID N0:29的 CDR2-H、序列为SEQ ID N0:30的CDR3-H、序列为SEQ ID N0:31 的CDR1-L、序列为SEQ ID NO: 32的CDR2-L和序列为SEQ ID N0:9的CDR3-L。
[0035]这些多肽是神经诱向因子-1结合多肽，其中所述结合多肽具有结合神经诱向因 子-1并诱导经由UNC5或DCC受体的肿瘤细胞的细胞死亡或细胞凋亡的性质。这些多肽优选 是抗体，尤其是单克隆抗体。结合多肽或抗体(包括其片段和组合）的各种形式稍后将在本 文描述。
[0036]在第一系列实施方案中，本发明的多肽或抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10、11、 12或13。典型地，其包含序列SEQ ID NO: 10和11两者，或SEQ ID NO: 12和13两者。
[0037]在第二系列实施方案中，所述多肽或抗体是人源化的并且包含选自SEQ ID NO: 14-19的组和/或选自SEQ ID NO: 20-27的组的氨基酸序列。典型地，所述多肽或抗体是人源 化的并且包含选自SEQ ID NO:14-19的组的氨基酸序列和选自SEQ ID NO :20-27的组的氨 基酸序列。
[0038]具体实施方案是下面的人源化的抗体。此表格中首先列举对应小鼠 CDR中移植入 人IgGl。其它称为HUM的是具有可变人框架区的单克隆抗体。该表格对于人IgGl的CH和CL也 给出了引用。也可以使用其它的同种异型。
[0041]本发明的另一个目的是包含至少一种根据本发明的神经诱向因子-1结合多肽或 抗体和药学可接受的媒介物或赋形剂的药物组合物。在实施方案中，所述多肽或抗体是人 源化的。
[0042] 本发明的又一个目的是癌症的治疗方法，其中用治疗有效量的包含至少一种根据 本发明的神经诱向因子-1结合多肽或抗体和药学可接受的媒介物或赋形剂的药物组合物 施用给有需要的受试者。在实施方案中，所述多肽或抗体是人源化的。
[0043] 因此，所述组合物和方法可以包含如就本文公开的多肽或抗体所公开的特征中的 任一特征或特征的组合。
[0044] 根据一个特征，癌症是其中肿瘤细胞表达或过表达神经诱向因子-1受体(具体是 UNC5类，特别是UNC5B和/或UNC5A和/或DCC)的癌症。典型地，所述肿瘤细胞逃避神经诱向因 子-1受体相关的细胞凋亡，这是由于在神经诱向因子-1的存在下，神经诱向因子-1结合到 所述受体，具体是UNC5类，特别是UNC5B和/或UNC5A，和/或DCC。根据一个特征，癌症是其中 肿瘤细胞表达或过表达神经诱向因子-1的癌症。
[0045] 癌症的一些实施方案包括转移性乳腺癌、非小细胞肺癌、侵袭性神经母细胞瘤、胰 腺癌、原发性黑素瘤、黑素瘤转移、卵巢癌、胶质母细胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细 胞白血病、侵袭性B细胞淋巴瘤、肉瘤、肾腺癌、头颈癌、睾丸癌(例如胚胎性癌、畸胎瘤、卵黄 囊瘤）、肾癌、胃癌、子宫癌。
[0046] 确定是否给定细胞在表面上表达神经诱向因子-1依赖性受体DCC和/或UNC5或显 示神经诱向因子-1基因表达的显著上调的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于FACS (荧光激活细胞分选）的IHC(免疫组化）、定量PCR(例如，用六聚体引发的cDNA)或备选地与 基于显色染料的蛋白检测技术(诸如银染或考马斯亮蓝染色)配对的蛋白质印迹或对溶液 中或凝胶、斑点和微阵列上蛋白的基于荧光和基于发光的检测方法，诸如免疫染色，以及免 疫沉淀、ELISA、微阵列和质谱。在本发明的背景下，待治疗的癌症的实例在本文中列举，包 括任何所提及癌症的难治性形式。神经诱向因子-1过表达可以因此通过RT-PCR使用合适的 如本文所公开和提供的那些引物，相对于不过表达神经诱向因子-1的正常组织或类似癌症 进行测量。
[0047] 在本发明的实施方案中，所述组合物和方法用于治疗表达或过表达神经诱向因 子-1的癌症，其中此表达或过表达与癌症本身有联系或通过化疗药物治疗诱导，单独或两 者皆有。
[0048] 本发明的目的是组合的抗癌治疗方法，包括向有需要的患者施用化疗药物和如本 文公开的多肽或抗体。所述化疗药物和多肽或抗体是有效量的形式。
[0049] 本发明的另一个目的是包含如本文所公开的多肽或抗体的组合物，其用作抗癌药 物以与化疗药物一起在患者中组合使用。本发明还涉及包含如本文所公开的多肽或抗体的 组合物，其在用化疗药物治疗的患者中用作抗癌药物。
[0050] 本发明的另一个目的是包含化疗药物的组合物，其用作以与本文公开的多肽或抗 体一起在患者中组合使用。本发明还涉及包含化疗药物的组合物，其在用如本文所公开的 多肽或抗体治疗的患者中用作抗癌药物。
[0051] 本发明的另一个目的是包含如本文公开的化疗药物和多肽或抗体的组合物或成 套药包(kit of parts)，用于同时、分开或顺序施用给患者。
[0052] 本发明的另一个目的是包含如本文公开的化疗药物和多肽或抗体的组合物或成 套药包，用于同时、分开或顺序施用给患者，用作抗癌药物或抗癌治疗。
[0053] 本发明的另一个目的是在药学可接受的载体或媒介物中包含如本文公开的化疗 药物和多肽或抗体的组合物。
[0054] 本发明的另一个目的是在药学可接受的载体或媒介物中包含如本文公开的化疗 药物和多肽或抗体的组合物，用作抗癌药物的。
[0055] 又一个目的是如本文公开的多肽或抗体用于制备旨在用于与化疗药物组合治疗 患者的抗癌药物中的用途。
[0056] 又一个目的是化疗药物用于制备旨在用于与如本文公开的多肽或抗体组合治疗 患者的抗癌药物中的用途。
[0057] 又一个目的是如本文公开的多肽或抗体和化疗药物用于制备组合的抗癌药物中 的用途。
[0058] 又一个目的是如本文公开的多肽或抗体和化疗药物用于制备组合的抗癌药物组 合物或成套药包的用途，用于同时、分开或顺序施用给患者。
[0059] 根据本发明的特征，和下面的进一步解释，所述化疗药物是诱导神经诱向因子-1 在癌症细胞中的过表达的药物，并且如本文公开的多肽或抗体即使在这种过表达的情况下 也促进神经诱向因子-1诱导的细胞凋亡或细胞死亡。
[0060] 所述化疗药物具体是诱导神经诱向因子-1在癌症细胞中的过表达的药物。药物诱 导神经诱向因子-1过表达的确定可以容易地在任何癌细胞(诸如细胞系或来自活检的细 胞)上进行。在实施方案中，在来自待治疗的癌症(例如来自活检）的细胞上进行测定。在另 一个实施方案中，测定在细胞(诸如细胞系）上进行，所述细胞对于待治疗的癌症是代表性 的。在另一个实施方案中，测定在A549或H460细胞系上进行。测定可以包括比较神经诱向因 子-1基因在用化疗药物处理的细胞和未处理的细胞间的表达。表达可以通过PCR测量，尤其 是定量RT-PCR，例如使用本文公开和提供的引物（SEQ ID N0:33和34)，如公开于PCT/ EP2013/068937中，其完整的内容通过引用并入或技术人员可以查阅。药物在诱导此过表达 的那些家族中的分类可以简单地按照描述于下文材料和方法中的方法对A549或H460细胞 系进行，如描述于PCT/EP2013/068937中。
[0061] 化疗药物特别是细胞毒性药物。在一些优选的实施方案中，药物是多柔比星、5-氟 尿嘧啶(5FU)、紫杉醇(例如泰素 (Taxo 1))或顺铂。
[0062] 在实施方案中，药物是细胞毒性抗生素。细胞毒性抗生素可以是放线菌素、蒽环 类、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素。蒽环类可以是多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比 星（丨(^10113；[(3；[116)或表柔比星。
[0063] 在实施方案中，药物是烷化剂。烷化剂可以是铂衍生物，诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂 或其它烷化剂诸如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派。其他类包括表鬼白毒素 (epipodophylotoxine)，例如依托泊苷、拓扑异构酶抑制剂（喜树碱(camptotecines))，例 如伊立替康、托泊替康、DNA小沟烷化剂，例如曲贝替(Y0NDELIS )、氨甲蝶呤、培美曲塞、雷替 曲塞。
[0064]在实施方案中，药物是紫杉烷或其它微管蛋白靶向剂。紫杉烷可以是紫杉醇或多 西紫杉醇，或艾日布林(eribuline)(最近批准用于乳腺癌）。
[0065] 在实施方案中，药物是抗肿瘤剂，诸如：
[0066] -乳房激素治疗剂：例如他莫昔芬、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、氟维司群 (faslodex)；
[0067] -前列腺激素治疗剂:例如LHRH激动剂、比卡鲁胺、阿比特龙；
[0068] -单克隆抗体:例如西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗；
[0069] -激酶抑制剂：例如伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿法替 尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、克里唑替尼(crizotinib)、阿西替尼。
[0070] 定义和进一步的实施方案，变体以及本发明的替代：
[0071] 如本文所用的，序列"与参考序列具有至少85%的同一性"是指序列在其整个长度 上与参考序列的全长具有85%或更多，特别是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%、99·5%、99·6%、99·7%、99·8%、99·9% 或 100% 的序列同一性。
[0072 ] "序列同一性"百分比可以通过比较两个序列，最佳地在比较窗口进行比对，其中 对于两条序列的最佳比对，在比较窗口中的多肽序列部分可以相比于参考序列（其不包括 添加或缺失)包含添加或缺失（即缺口）。百分比可以通过如下计算:确定在两条序列中出现 的相同氨基酸残基所在位置的数目以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗 口中位置的总数，并将结果乘以1〇〇,以获得序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比 对通过全局配对比对进行，例如使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol .Biol .48:443的 算法。序列同一性百分比可以例如使用Needle程序用BL0SUM62矩阵和以下参数:缺口-开放 = 10,缺口-延伸= 0.5容易地确定。
[0073] 在本发明的上下文中，"保守氨基酸取代"是其中一个氨基酸残基被具有相似化学 性质(例如，电荷或疏水性)侧链基团的另一个氨基酸残基取代。在一般情况下，保守氨基酸 取代基本上不会改变蛋白质的功能性质。具有相似化学性质侧链的氨基酸组的实例包括1) 脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;2)脂肪族-羟基侧链:丝氨酸和苏 氨酸;3)含酰胺侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5) 碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;和7)含硫侧链:半胱 氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨 酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0074] 在整个本申请中，术语"包含（comprising)"应被解释为涵盖所有具体提及的特 征，以及任选的、另外的、未指定的特征。如本文中所使用的，使用术语"包含"也公开了其中 除特别提到的特征之外，不存在其它的特征（即"由......组成（consisting of )"）的实施 方案。
[0075] "抗体"可以是其中两条重链通过二硫键互相连接，并且每条重链通过二硫键连接 到轻链的天然或常规抗体。存在两种类型的轻链，Iambda(A)和kappa(K)。有五种主要的重 链类别(或同种型），其决定抗体分子的功能活性:IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同 的序列结构域。轻链包括两个结构域或区域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括 四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3,统称为CH)。轻链可变区 (VL)和重链可变区(VH)二者决定对抗原的结合识别和特异性。轻链恒定区结构域(CL)和重 链恒定区结构域(CH)赋予重要的生物特性，诸如抗体链结合、分泌、透过胎盘的移动性、补 体结合和结合Fc受体(FcR) 片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，并由一条轻链和 一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补 性。抗体结合位点是由主要来自于高变区或互补决定区（CDR)的残基构成。偶尔地，来自非 高变区或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构，并因此影响结合位点。
[0076] "互补决定区"或"^"是指这样的氨基酸序列，它们一起限定天然免疫球蛋白结 合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分 别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和0?1-!1、0)1?2-!1、001?-!1。因此，常规的抗体抗原结合位点 包括6个⑶R，其包含来自每条重链和轻链V区的⑶R组。
[0077] "框架区"（FR)是指CDR之间插入的氨基酸序列，即在单一物种的不同免疫球蛋白 中相对保守的免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各自具 有四个 FR，分别称为 FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-UPFR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
[0078] 如本文所使用的，"人框架区"是与天然存在的人抗体框架区基本上相同的（约 85%或者更多，特别是90%、95%、97%、99%或100% )的框架区。
[0079]在本发明的上下文中，在免疫球蛋白轻链或重链中的⑶R/FR定义基于頂GT定义进 行确定（Lefranc等（2003)Dev Comp Immunol .27(1) :55_77;www. imgt.org) 〇
[0080] 如本文中所使用的，术语"抗体"是指常规抗体及其片段，以及单结构域抗体及其 片段(特别是单结构域抗体的可变重链)和嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异 性抗体。
[0081] 如本文所用，抗体或免疫球蛋白还包括最近已被描述的"单结构域抗体"，并且所 述单结构域抗体是这样的抗体，其互补决定区是单结构域多肽的一部分。单结构域抗体的 实例包括重链抗体，天然缺乏轻链的抗体，衍生自常规四链抗体的单结构域抗体，工程化单 结构域抗体。单结构域抗体可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼 (IIama)、山羊、兔和牛。单结构域抗体可以是天然存在的被称为重链抗体(缺乏轻链）的单 结构域抗体。特别是，骆驼科物种(例如骆驼、单峰驼、美洲驼、羊驼和原驼)产生天然缺乏轻 链的重链抗体。骆驼重链抗体也缺乏CHl结构域。
[0082]这些缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链在现有技术中称为"VHH"或"纳米抗 体"。与常规VH结构域类似，VHH含有四个FR和三个CDR。纳米抗体相对常规抗体具有以下优 势：它们比IgG分子约小十倍，并且因此适当折叠的功能性纳米抗体可以通过体外表达来生 产，同时实现高收率。此外，纳米抗体都非常稳定，而且对蛋白酶的作用有抗性。纳米抗体的 性质和生产已由Harmsen和De Haard进行了综述（Harmsen和De Haard(2007) Appl.Microbiol.Biotechnol·77:13-22)〇
[0083] 如本文所用的术语"单克隆抗体"或"mAb"指的是针对特定抗原的单一氨基酸组成 的抗体分子，并且不被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。单克隆抗体可以通过B细胞 或杂交瘤的单克隆来生产，但也可以是重组的，即，通过蛋白质工程生产。
[0084] (常规)抗体的"片段"包括含完整抗体的一部分，特别是完整抗体的抗原结合区或 可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、F(ab'）2、Fab '、dsFv、（dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双功能 抗体、从抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单结构域抗 体，诸如重链抗体或VHH。
[0085]术语" ^"表示具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通 过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中，大约H链的N末端侧的一半和整个L链，通 过二硫键结合在一起。
[0086]术语"F(ab'）2"是指在通过用蛋白酶（胃蛋白酶）处理IgG得到的片段中，具有约 100,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其比经由铰链区的二硫键结合的Fab稍 大。
[0087] 单链Fv( "scFv" )多肽是共价连接的VH: : VL异二聚体，其通常表达自包括通过肽编 码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体。本发明的人scFv片段包括特别是通过使用基 因重组技术保持适当构象的CDR。二价和多价抗体片段可通过单价scFv的结合自发形成，或 可经由肽接头通过偶联单价ScFv生成，诸如二价sc(Fv)2。
[0088] "dsFv"是通过二硫键稳定的VH: : VL异二聚体。
[0089] "(dsFv)2"表示通过肽接头偶联的两个dsFv。
[0090]术语"双特异性抗体"或"BsAb"表示在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点 的抗体。因此，BsAbs能够同时结合两种不同的抗原。已经以越来越高的频率使用遗传工程 来设计、修饰和产生具有所需的一组结合性质和效应子功能的抗体或抗体衍生物，如例如 在EP 2 050 764 Al中所述。
[0091]术语"多特异性抗体"表示在单个分子内组合两种或更多种抗体的抗原结合位点 的抗体。
[0092]术语"双功能抗体"指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在相同的多肽 链中包含连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH) (VH-VL)。通过使用太短而不 能允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配 对，并产生两个抗原结合位点。
[0093] 在具体实施方案中，表位结合片段选自Fv、Fab、F(ab'）2、Fab'、dsFv、（dsFv)2、 80?￥、80$￥)2、双功能抗体和￥冊。
[0094]如本文所使用的"嵌合抗体"，是其中恒定区或其部分被改变、替换或交换的抗体， 使得可变区连接到不同物种或属于另一抗体类别或亚类的恒定区。"嵌合抗体"也指其中可 变区或其部分被改变、替换或交换的抗体，使得恒定区连接到不同物种或属于另一抗体类 别或亚类的可变区。
[0095]术语"人源化抗体"是指这样的抗体，其初始全部或部分是非人类来源并且其已经 过修饰以替换某些氨基酸，特别是在重链和轻链的框架区中，以避免或最小化在人中的免 疫应答。人源化抗体的恒定结构域大部分时间是人CH和CL结构域。在实施方案中，人源化抗 体具有人类来源的恒定结构域。如本文所用，术语"人源化抗体"是指包含衍生自非人免疫 球蛋白的最小序列(例如CDR)的嵌合抗体。
[0096] 使用术语"多肽"或"神经诱向因子-1结合多肽"涵盖所有这些类型的抗体、片段或 其组合。
[0097] 人源化的目标是引入到人的异种抗体(诸如鼠抗体)的免疫原性降低，同时保持抗 体完全的抗原结合亲和力和特异性。人源化抗体，或适于其它哺乳动物无排斥的抗体，可使 用几种技术诸如表面重塑(resurfacing)和CDR移植来产生。如本文所用，表面重塑技术使 用分子建模、统计分析和诱变的组合来改变抗体可变区的非CDR表面以类似于目标宿主的 已知抗体的表面。
[0098]可以使用各种其它技术进行抗体人源化，所述技术包括CDR移植（EP0239400; W091/09967;美国专利号 5,530,101 和5,585,089)，镶面（veneering)或表面重塑 (EP0592106;EPO519596;Padlan(1991)Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka等（1994)Protein Engineering 7(6):805-814;Roguska等（1994) Proc .Natl .Acad. Sci U. S·A. 91:969-973)，和链改组（chain shuffling)(美国专利号5， 565,332)。人抗体可通过各种本领域已知的各种方法包括噬菌体展示方法进行制备。还参 见美国专利号4,444,887、4,716，111、5,545,806和5,814,318;以及国际专利申请恥98/ 46645、恥98/50433、恥98/24893、恥98/16654、恥96/34096、恥96/33735和恥91/10741。 [00"]在本发明的上下文中，如本文所使用术语"治疗"（"treating"或"treatment"），指 逆转、减轻、抑制该术语应用的病症或病况或这样的病症或病况的一种或多种症状的进展， 或预防所述病症或病况或这样的病症或病况的一种或多种症状。
[0100]通过如本文中所用的术语"治疗癌症"是指肿瘤的恶性细胞生长和/或从所述肿瘤 的转移进展的抑制。这样的治疗也可导致肿瘤生长的消退，即，可测量的肿瘤的大小减小。 在具体的实施方案中，这样的治疗导致肿瘤或转移的部分消退。在另一具体实施方案中，这 样的治疗导致肿瘤或转移的完全消退。
[0101]根据本发明，术语"患者"或"有需要的患者"意在用于受恶性肿瘤侵袭或可能受恶 性肿瘤侵袭的人或非人哺乳动物。
[0102] 在具体的实施方案中，待治疗的患者可先前已经用其它抗癌疗法治疗。特别是，待 治疗的患者可先前已经用基于奥沙利铂、顺铂、卡铂和/或紫杉醇、多西紫杉醇的方案治疗。
[0103] 通过本发明的多肽或抗体的"治疗有效量"是指其以适用于任何医学治疗的合理 利益/风险比治疗所述癌症疾病的足够量。然而，可以理解，本发明的多肽或抗体的每天的 总用量将通过主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效 剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和该病症的严重程度;所采用的具体多肽 或抗体的活性;所采用的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;所采 用的具体多肽或抗体的施用时间、施用途径和排泄速率;治疗的持续时间；与所采用的具体 多肽或抗体组合或同时使用的药物;和在医学领域中熟知的类似因素。在具体实施方案中， 所述施用给患者的多肽或抗体的治疗有效量是体表面积的剂量范围为5mg/m 2-500mg/m2、更 具体范围为 150mg/m2-450mg/m2。
[0104] 在进一步的实施方案中，本发明的多肽或抗体，根据依赖于待治疗患者(年龄、体 重、治疗史等)的操作方案重复施用，其可以由熟练的医师来确定。
[0105] "药学上"或"药学上可接受的"是指当适当地施用给哺乳动物(尤其是人)时，不产 生不利的、变应的或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是 指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
[0106] 包括本发明的多肽或抗体的药物组合物形式和施用途径自然取决于待治疗的病 况、疾病的严重程度、患者的年龄、体重以及性别等。
[0107] 本发明的多肽或抗体可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下 或眼内施用等。在具体实施方案中，本发明的多肽或抗体静脉内施用。
[0108] 具体地，包括本发明的多肽或抗体的药物组合物可以含有药学上可接受用于能够 注射的制剂的媒介物。这些可以具体是等渗、无菌的盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、 氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物），或干燥，特别是冻干组合物，其取 决于情况，在加入后灭菌水或生理盐水后，允许构成注射液。
[0109] 为了制备药物组合物，有效量的本发明的多肽或抗体，可以溶解或分散在药学上 可接受的载体或含水介质中。
[0110]适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射液或分散 体的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是达到存在易注射 性的程度的流体。其必须在制造和贮存的条件下是稳定的，并且必须保存免受诸如细菌和 真菌的微生物的污染。 Com]载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、及 其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用包衣(诸如卵磷脂)通过在分散液的情 况下维持所要求的粒径和通过使用表面活性剂、稳定剂、防冻剂或抗氧化剂可以保持适当 的流动性。可通过抗菌剂和抗真菌剂可防止微生物作用。在许多情况下，将优选包括等渗 剂，例如糖、或氯化钠。
[0112] 通过将所需量的活性化合物加入具有以上列举的几种其它成分的适宜溶剂中，根 据需要之后进行过滤灭菌，制得无菌注射液。通常，通过将各种无菌活性成分加入含有基本 分散介质和来自上述列举的那些所需的其它成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备 无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由先前无 菌过滤的溶液获得活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
[0113] 配制后，将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用溶液。制剂容易以各 种剂型施用，诸如上述类型的注射液，但也可以采用药物释放胶囊等。
[0114] 对于以水溶液肠胃外施用，例如，如果需要的话，将溶液应当适当地缓冲，并且液 体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖使其等渗。这些特定水溶液特别适用于静脉内、肌内、 皮下和腹膜内施用。在这方面，可以采用的无菌含水介质将是本领域技术人员根据本公开 内容知晓的。例如，可以将一个剂量溶解在ImL等渗NaCl溶液中，并且加入到1000 mL皮下输 液用流体中或在输注的目的部位注射，（参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版，第1035-1038页和第1570-1580页）。根据所治疗受试者的病况，可对剂量 进行必要的改变。无论如何，负责施用的人应确定用于个体受试者的适当剂量。
[0115] 表1:序列描述：
[0123] 頂GT下的⑶R在表1中在适当情况下以粗体突出显示。
[0124] 本发明现在将使用实例进行详细说明，所述实例被视为非限制性实施方案。
[0125] 附图简述
[0126] 图1:鼠4C11对人神经诱向因子-1的ELISA结合测定。各种浓度的4C11孵育到包被 加 FLAG标签的神经诱向因子-l(APOTECH)的96孔微量滴定板。使用缀合有辣根过氧化物酶 的山羊抗小鼠 IgG(Jackson Immunoresearch)和化学发光底物(PIERCE ECL蛋白质印迹底 物)检测结合的4C11。在Tecan Infinite F-500光度计上读取发光。
[0127] 图2:4C11对神经诱向因子-1结合UNC5B-FC上的抑制。在各种浓度的4C11存在的情 况下，加 FLAG标签的神经诱向因子-l(APOTECH)孵育到包被有UNC5B-Fc(Netris)的96孔微 量滴定板上。使用缀合有辣根过氧化物酶的抗FLAG抗体（Sigma)和化学发光底物(PIERCE ECL蛋白质印迹底物)检测结合的神经诱向因子-1。在Tecan Infinite F-500光度计上读取 发光。
[0128] 图3:使用覆盖人神经诱向因子-1的整个序列具有14个氨基酸的肽-肽重叠的590 个15-氨基酸线性肽的阵列进行4C11的线性表位作图。肽上4C11的结合用过氧化物酶(POD) 标记的抗小鼠 IgG和化学发光底物显现出来。
[0129] 图4:显示由鼠4C11抗体识别的神经诱向因子-1表位的氨基酸序列（位于第二EGF 样层粘连蛋白结构域)的示意图。
[0130] 图5:在鼠4C11抗体存在的情况下，A549腺癌性人肺泡基底上皮细胞中胱天蛋白酶 3的诱导。
[0131] 图6:用鼠4C11抗体治疗的裸鼠中人异种移植物的生长抑制。将A549人肺腺癌上皮 细胞皮下注射到无胸腺（即免疫缺陷）的裸鼠。一旦肿瘤达到约IOOmn^tdHtU=IOH/ 组）用5mg/kg 4C11或同种型对照(M0PC21)每周一次腹膜内治疗。
[0132] 图7:用鼠4C11抗体治疗的裸鼠中人异种移植物的生长抑制。将GRANTA-519人套细 胞淋巴瘤细胞皮下注射到无胸腺（即免疫缺陷）的裸鼠。一旦肿瘤达到约IOOmm 3时，小鼠 （η =10只/组）用2mg/kg 4C11或媒介物(PBS)每周一次或每周两次腹膜内治疗。
[0133] 图8:人源化的4C11抗体(hum03)在大鼠移植骨肉瘤的生长中的体内作用。大鼠骨 肉瘤肿瘤在骨膜剥脱术后移植到胫骨旁(paratibial)位置(n = 7只）。将大鼠用4.4mg/kg的 人源化4Cllhum03或同种型对照用或不用多柔比星(2mg/kg)或用PBS腹膜内注射每周治疗 两次。该图显示了在第17天肿瘤倍数增加。
[0134] 图9:抗神经诱向因子-1的人源化4C11单克隆抗体(NETl-H-mAb)HUM03的NETl结合 结构域的肽扫描分析。通过针对590个线性肽的重叠肽文库筛选人源化4CllmAb获得的原始 肽扫描数据（X轴）。相互作用的信号强度在y轴上可视化。峰对应于以下的氨基酸序列： ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC(SEQ ID N0:35)。
[0135] 实施例1:抗体的产生、筛选和人源化
[0136] HTP?小鼠接受IOOyg神经诱向因子I-Fc(Adipogen)的8次注射(每天2天;第一次注 射在完全弗氏佐剂的存在下，其它注射用不完全佐剂）。杂交瘤融合在第一次免疫(Abpro， Lexington, MA) 2周后进行。杂交瘤上清液使用双抗原ELISA测定法(神经诱向因子-I-Fc和 无关的Fc嵌合蛋白）针对特异性单克隆抗神经诱向因子-1抗体进行筛选。使用次级ELISA型 测定法来选择能够阻断神经诱向因子-1与DCC或UNC5h2相互作用的单克隆抗体。然后选择 鼠单克隆抗体（鼠4Cll或NETl-M-mAb)。该抗体由序列SEQIDN0 :12和13构成。
[0137] 如下进行人源化:编码鼠4C11轻链和重链CDR序列的双链DNA片段与人框架的库合 并。然后将全长可变结构域克隆到哺乳动物表达载体中。将轻链可变结构域与分泌信号和 人κ恒定结构域一起同框（in frame)克隆。将重链可变结构域与前导序列和人IgGl恒定结 构域一起同框克隆。文库的多样性和LC和HC阅读框的完整性通过测序进行验证。单个克隆 以96孔格式进行阵列排列并且制备用于转染到CHO细胞中的质粒DNA。将人源化文库转染到 以96孔格式的CHO细胞。然后在转染后48个小时的时候收集来自转染的CHO细胞的上清液， 并用通过神经诱向因子-1结合和竞争性ELISA测定法进行筛选。前10个命中的轻链和重链 可变结构域进行测序、比对，并分析。如上所述生成人源化抗体HUM01-10。
[0138] 实施例2 :MAb生产和蛋白A纯化
[0139] 基于编码重链和轻链的核酸序列产生单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知 的。基于本文公开的序列，本领域技术人员可产生针对SEQ ID N0:3或35或其任何变体的线 性表位的各种鼠、人源化和完全人源化的抗体，诸如鼠4C11和人源化HUM1-10和HUM1'-10' 抗体。
[0140] 哺乳动物细胞优选作为宿主用于生产治疗性糖蛋白，由于它们以用于人类应用的 最兼容的形式糖基化蛋白质(Jenkins等,Nat Biotech. 1996; 14:975-81)。可使用的哺乳动 物宿主细胞包括人Hela、283、H9和Jurkat细胞、小鼠 NIH3T3和C127细胞、Cosl、Cos7和CVl非 洲绿猴细胞、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠 L细胞和中国仓鼠卵巢细胞。细菌极少糖基化蛋白质，并 且与其它类型的常见宿主(诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞)一样获得与从血流中快 速清除相关的糖基化模式。
[0141] 在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞允许遗传稳定的，高产的克隆细胞系的一致产生。它们 可以在简单的生物反应器中使用无血清培养基培养到高密度，并且允许开发安全和可重现 的生物过程。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾（BHK)细胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细 胞。已经也测试了来自转基因动物的生产(Jenkins等,Nat Biotech. 1996; 14:975-81)。
[0142] 典型的哺乳动物表达载体含有启动子元件(来自SV40的早期和晚期启动子，来自 逆转录病毒例如RSV、HTLV1、HIV1的长末端重复序列(LTRs)和巨细胞病毒(mCMV，hCMV)的早 期启动子）（启动子元件介导mRNA转录的启动）、蛋白质编码序列、以及转录终止和转录物的 多聚腺苷酸化所需的信号(BGH多聚A、单纯疱疹病毒的疱疹胸苷激酶基因多聚A( TKpa ))，晚 期SV40多聚A和3'UTR_Beta_Globin_多聚A)。附加元件包括增强子江以，11此1)、1(〇231^序列、 信号肽和侧接用于RNA剪接的供体和受体位点的插入序列。在实施本发明的实践中使用的 合适的表达载体包括，例如，载体诸如pcDNA3. l、pcDNA3.3、p0ptiVEC、pRSV、pEyMCMV、 pMCMVHE-UTR-BG、pHCMVHE-UTR-BG、pMCMV-UTR-BG、pHCMV-UTR-BG、pMCMVHE-SV40、pHCMVHE-SV40、pMCMV-SV40、pHCMV-SV40、pMCMVHE-TK、pHCMVHE-TK、pMCMV-TK、pHCMV-TK、pMCMVHE-BGH、pHCMVHE-BGH、pMCMV-BGH、pHCMV-UTR-BGH。
[0143] 按照通常瞬时或稳定转染程序，用针对轻链和重链的MAb表达载体共转染空的CHO Easy C细胞。各自的人类IgH前导序列使H和L链能够分泌。轻链和重链的编码区被引入到 MAb表达载体的多克隆位点中。分析了转化体的正确方向和阅读框，所述表达载体可以被转 染到CHO细胞系。
[0144] 将从CHO细胞产生的收获的细胞培养物上样到Hi Trap rProtein A柱（GE 他已11:11〇3代，33；[111:05^311101^(1'01'，？瓜1106)，所述柱用。!17.2的磷酸盐缓冲盐水平衡。 非结合蛋白流穿并通过随后用PBS缓冲液洗涤数次除去。使用在pH 3.0的0.1 M柠檬酸的洗 脱步骤将Mb洗脱出蛋白A柱。柱洗脱物通过A280监控。合并Mb峰。
[0145] 实施例3: 4C11抗体对神经诱向因子-1的ELISA型结合测定法（图1)
[0146] 用IOOyL磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的IOOng加 His标签的神经诱向因子-1(R&D 6419-N1)将白色96孔微量滴定板(Costar 3912 Corning)在4°C孵育过夜。用300yL PBS-0.05%吐温-20(roS-T)洗涤三次后，通过加入IOOyL PBS-3%BSA并在室温下孵育1小时封 闭板。用300yL PBS-T洗涤三次后，用各种量（IOng至1200ng)的抗神经诱向因子-1抗体孵育 板。用300yL PBS-T洗涤三次后，加入IOOyL在I3BST中的3%BSA中1/10，000稀释的缀合到辣 根过氧化物酶相关的第二抗体(例如山羊抗-人IgG(Fc)Sigma A0170或山羊抗小鼠 IgG轻链 特异性（1OJackson Immunoresearch 115-035-174)，并将板在室温下孵育1小时。用300yL PBS-T洗涤三次后，加入IOOyL HRP的发光底物(ECL蛋白质印迹底物，PIERCE)。5至10分钟 后，在Tecan Infinite F-500光度计上读取发光。
[0147] 图1显示了在ELISA型测定法中4C11鼠抗体对所吸附的神经诱向因子-1的典型的 剂量依赖性相互作用。
[0148] 允许50%结合(EC5q)的抗体浓度从图1中显示的S形结合曲线计算。表1显示了不同 的鼠（4C11整个抗体以及Fab和Fab'2片段）和人源化的4C11抗体的EC 5t^mygAiUiPWnM 计)。
[0149] 表1:各种4C11变体结合神经诱向因子_1(实施例3)或削弱神经诱向因子-1结合到 UNC5B(实施例5)的效价：
[0151] 选择HUM03用于进一步的实验。HUM03下文有时可以称为人源化4C11。
[0152] 实施例4:通过表面等离子体共振的抗体结合测定法
[0153] 抗体的结合性质使用具有相关软件TlOOControl Biacore TI 00 Evaluation的 Biacore T I 00(GE Healthcare)以及芯片:CM5芯片作为测定格式进行分析。
[0154] 鼠4(：11(1861)抗体颂〇10吣：12和13)经胺偶联的捕获分子捕获。注射一系列具 有递增浓度的神经诱向因子-1。仅具有胺偶联的捕获分子的芯片表面用作参考对照表面， 用于神经诱向因子-1的可能的缓冲作用或非特异性结合的校正。
[0155] 捕获分子:抗小鼠 IgG抗体(来自山羊，Jackson Immuno Research)。
[0156] 捕获分子的胺偶联。根据制造商说明书进行标准胺偶联:运行缓冲液:HBS-N缓冲 液，通过EDC/NHS的混合物活化，目的是10000RU的配体密度；捕获抗体稀释于偶联缓冲液 IOmM NaAc，pH 4.5，c = 30yg/mL中；最后剩余的活化羧基通过注射IM乙醇胺封闭。
[0157] 4C11抗体捕获:在流通池2-4上捕获4C11抗体;流量5yL/min，接触时间72秒，c (抗 小鼠 IgG抗体）=5nM。捕获缓冲液:PBS(pH7.4)，0.005%吐温20。
[0158] 分析物样品：经典浓度系列通过以5或6个递增浓度(c = 2-164nM)的50yL/min流速 的分析物连续注射进行测量。运行缓冲液：20mM Hepes pH7.4,600mM NaCl，0.005%吐温 20。注射分析物3分钟，随后是90s的解离期。
[0159]使用如本发明所提供和描述的4C11鼠抗体对人神经诱向因子-1结合的BIAcore分 析神经诱向因子-1对捕获的4C11的结合动力学进行半定量表面等离子体共振(SPR)分析。 经由胺偶联的抗-人IgG(Fc)分子将4C11抗体捕获于芯片表面上。注射一系列具有递增浓度 的人神经诱向因子-1并通过SPR变化监测动力学结合行为。在y轴上记录相比对照芯片的作 为相对单位(RU)随时间（X轴）的变化。观察到以不同浓度注射的人神经诱向因子-1所捕获 的分析物4C11的代表性结合和解离曲线。
[0160]然后通过使用常用的双参考(对照参考:分析物与捕获分子的结合;流通池：神经 诱向因子-1浓度"〇"作为空白）和用模型"滴定动力学1:1结合"计算来计算动力学参数。 [0161] 表2给出了在25°C在PBS中通过SPR(B丨ACORE?T100)测量的亲和性数据：
[0163] 实施例5:4C11抑制神经诱向因子-1与UNC5B的结合(图2)
[0164] 用在IOOyL磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的 IOOng UNC5B-Fc (R&D1006-UN-050)或DCC-Fc(R&D 844-DC-050)将白色96孔微量滴定板(Costar 3912Corning)在4°C孵育过夜。用300 41^?83-0.05%吐温-20(?83-1')洗涤三次后，通过加入10(^1^?83-2%834并在室温下孵育1 小时封闭板。用300yL PBS-T洗涤三次后，用IOOyL的含有50ng/mL加 FLAG标签的神经诱向因 子-I(Adipogen)和不同量(0.2ng-3000ng)4Cll抗体的PBS-I %BSA，将板在室温下孵育1小 时。用300yLPBS-T洗涤三次后，加入IOOyL在I3BST-I % BSA中1/5000稀释的缀合到辣根过氧 化物酶(HRP)的抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma A8592)，并将该板在室温下孵育1小时。用300 yL PBS-T洗涤三次后，加入IOOyL HRP的发光底物(ECL蛋白质印迹底物，PIERCE)。5至10分 钟后，在Tecan Infinite F-500光度计上读取发光。
[0165] 图2显示通过在ELISA型测定法中增加量的鼠4C11鼠抗体的神经诱向因子-1结合 UNC5B的典型剂量依赖性抑制。
[0166] 允许50%抑制（IC5q)的抗体浓度从图5中显示的S形结合曲线计算。表1给出了不同 的鼠（4C11整个抗体以及Fab和Fab ' 2片段）和人源化的4C11抗体的IC5Q值（以yg/mL和以nM 计)。
[0167] 实施例6:小鼠4C11的神经诱向因子-1表位作图（图3和4)
[0168] 使用590个15-氨基酸线性肽的阵列进行表位作图，所述线性肽具有14个氨基酸的 肽-肽重叠，覆盖人神经诱向因子-1的整个序列(无信号肽）。使用标准的Fmoc-化学合成线 性肽，并使用三氟乙酸(trifluoric acid)去保护。含有共价连接的肽的455孔信用卡格式 的聚丙烯卡片在含有5%的SQ(SQ，Super-Q，在PBST中4%马血清(v/v)，5%卵清蛋白（w/v)) 的PBST(PBS-1 %吐温80)中在25°C孵育30分钟。洗涤后，将肽与4C11 (lyg/mL)PBST-0.1 % SQ 一起孵育。洗涤后，将肽用1 / 1 〇 〇 〇稀释的抗小鼠抗体的过氧化物酶缀合物 (SouthernBiotech)在25°C下孵育一小时。洗涤后，加入过氧化物酶底物2，2连氮基_二_ 3-乙基苯并噻唑啉磺酸（ABTS)和2微升3 %过氧化氢。一小时后，显色用电荷耦合器件 (CCD)-摄像机和图像处理系统定量。
[0169] 图3显示鼠4C11 与包括在SEQ ID N0:3:VACNCNLHARRCRFNMELYKLSGRKSGGVCLNCRHN TAGRHCH中的肽特异性相互作用。
[0170] 图4是显示由鼠4C11抗体识别的表位的位置的草图（cartoon)。该表位由神经诱向 因子-1的第二EGF样结构域携带。
[0171] 使用覆盖人神经诱向因子-1的整个序列的590个15-氨基酸线性肽的点阵列进行 肽扫描表位作图。如图9所示，抗体HUM03结合对应氨基酸序列"ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC" (SEQ ID N0:35)的8个重叠肽，其存在于NETl的V-2结构域内。该抗体的结合表位因而和涉 及与UNC5B发生相互作用的NETl结构域重叠。为了确认NETl的V-2结构域确实负责与HUM03 的相互作用，我们生成了突变体的集合，并在体外进行这些突变体与抗体以及与UNC5B的结 合测定。点突变K358L足以降低与HUM03的相互作用。三重突变R348A-R349A-R351A降低该相 互作用。
[0172] 实施例7:在人A549肺腺癌上皮细胞中4C11诱导的胱天蛋白酶_3(图5)
[0173] 在第1天，将细胞铺板在无血清培养基中（每孔1.8 X IO5个细胞，在6孔板中，每孔 Iml)。第2天，将培养基用含有媒介物(对照）、小鼠4C11抗体或鼠 IgGl、k无关抗体(Ab) (1 Ομ g/mL)的ImL新鲜的无血清培养基替换。处理均以一式两份进行。在第3天，收获来自2个相同 处理孔的细胞并合并为一个池。离心后，细胞沉淀重新悬浮于55yL的在胱天蛋白酶3/CPP32 焚光测定试剂盒(Gentaur Biovision,Brussels,Belgium)中提供的裂解缓冲液中。然后使 用上述试剂盒，通过测量胱天蛋白酶-3活性监测细胞凋亡。所有的值都相对于对照进行标 准化。
[0174]图5显示鼠4C11抗体诱导人A549肺腺癌上皮细胞中胱天蛋白酶3的活性。
[0175] 实施例8:体内4C11诱导的A549(人肺腺癌上皮细胞）（图6)和GRANTA (人套细胞淋 巴瘤细胞)细胞异种移植物(图7)的肿瘤生长抑制。
[0176] 七周龄(体重20_22g)的雌性无胸腺nu/nu小鼠获得自Charles River动物设施。将 小鼠安置在顶部有灭菌过滤器的笼中并维持在无病原体的动物设施中。所有肿瘤通过皮下 注射在200yLPBS中的肿瘤细胞（IO 7个A549细胞或IO6个GRANTA细胞)到小鼠的右肋进行植 入。当肿瘤建立时(V~IOOmm 3，约15-20天注射后)开始用4C11抗体治疗。小鼠接受4C11抗体 (各种剂量和时间表）、媒介物(PBS)、或同种型对照(M0PC21)的腹膜内注射(n= 10只小鼠）。 肿瘤大小用卡尺测量。肿瘤体积用式V=O.5*(长度*宽度2)进行计算。
[0177] 具有A549异种移植物的小鼠用5mg/kg的4C11每周治疗一次，而具有GRANTA异种移 植物的小鼠接受较低剂量的4C11 (2mg/kg)每周一次或两次。
[0178] 图6和7证实了在免疫缺陷小鼠中异种移植人A549肺腺癌上皮细胞(A)和人GRANTA 人套细胞淋巴瘤(B)的肿瘤生长的显著抑制。
[0179] 4C11抗体显示抑制A549和GRANTA肿瘤生长。
[0180] 实施例9:人源化4Cll(hum03)和多柔比星之间在大鼠骨肉瘤中的协同作用（图8)。
[0181] 辐射诱导的大鼠骨肉瘤已被转化成在骨膜剥脱术后移植到胫骨旁的可移植的模 型(参见Al louche M.等，1980，Int. J. Cancer 26，777-782)。因为在此肿瘤中不表达神经诱 向因子-1，我们按最近发表的（参见Paradisi等2013EMB0 Mol Med(2013)5,1821-1834)使 用化疗剂(D0X，多柔比星)刺激神经诱向因子-1及其受体表达。移植有骨肉瘤的大鼠接受每 周两次人源化4Cllhum03(4.4mg/kg)或媒介物(ctr)的腹膜内注射。一些动物接受额外的多 柔比星(2mg/kg)的腹腔内注射。肿瘤大小用卡尺测量。肿瘤体积用式V = 0.5*(长度*宽度2) 进行计算。平行地，使用MRI以跟踪生长模式。
[0182] 图8显示，在4C11和多柔比星同时治疗的动物中实现骨肉瘤生长的抑制。
[0183] 实施例10:在由炎症产生的自发的结肠癌炎症模型中鼠4C11的效果。（IBD(炎症性 肠病)相关性结直肠癌的小鼠模型）
[0184] (参见Proc Natl Acad Sci U S A.20090ct 6; 106(40): 17146-51)。
[0185] 如先前所述（参考文献：Neufert C等（2007)Nat Protoc 2:1998-2004)，用AOM+ DSS处理小鼠，并用PBS或4C11腹膜内2mg/kg每周两次治疗(n = 7)。简言之，无病原体的8周 龄雌性野生型Balb/c小鼠用溶于PBS中的10mg/kg体重的AOM腹膜内注射。一天后，在饮用水 中给予2.5%DSS超过一周，随后是2周的正常水。每2周用DSS处理小鼠1周，直到实验的第十 周并且每周用4C11或用PBS注射三次。动物在第十周的开头处死并且移除结肠用于组织学 分析。表3清楚地表明，用4C11抗体治疗小鼠阻止或减慢炎症驱动的结肠腺癌的发展。
[0186] 表3:抗神经诱向因子mAb 4C11在体内对炎症驱动的结肠肿瘤的影响。如早先描述 (Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Oct 6; 106(40) :17146-51)生成IBD(炎症性肠病）相关 的结直肠癌的小鼠模型。首先用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)处理小鼠以诱导 结直肠癌。用PBS或4C11腹膜内2mg/kg每周治疗小鼠两次(n = 7)。处死小鼠。移除的结肠在 甲醛中固定用于组织学分析。表3显示展示各种癌前或癌性结肠病变的小鼠的百分比。
[0188] 实施例11:在人癌细胞中的神经诱向因子-1蛋白定量：
[0189] 对于免疫印迹分析，将细胞在改良的RIPA缓冲液（50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、I %NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1 % SDS、ImM EDTA、蛋白酶抑制剂混合物和5mM DTT) 中通过超声处理裂解，并在4°C孵育1小时。细胞碎片通过离心(在4 °C，10.0 OOg 15'）沉淀并 且将蛋白提取物（每泳道200yg)上样到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并印迹到PVDF片材 (]\1;[111卩0代00印0瓜1:;[011，13;[1161'；^&，]\^，1].3.厶.）上。滤纸（;1^]^61')用在？133/0.1%吐温20 (PBS-T)中10 %脱脂奶粉和5 % BSA封闭过夜，并且然后与兔多克隆α-神经诱向因子-1 (1: 500稀释，克隆H104，Santa Cruz Biotechnology，Santa 〇112,〇4，1134)和小鼠单克隆0-肌 动蛋白（Santa Cruz Biotechnologies)抗体孵育2小时。用PBS-T洗涤三次后，滤纸与适当 的HRP缀合的第二抗体（1:10000，Jackson ImmunoResearch，Suffolk，UK)孵育1 小时。使用 West Dura化学发光系统(Pierce，Rockford，IL，U· S · A·)进行检测。
[0190] 对于免疫焚光研究，使细胞脱壁，用离心涂片器（Shandon Cytospin 3，Thermo Scientif ic)离心到盖玻片上，并用4% (v/v)低聚甲醛固定30分钟。然后将细胞在0.2%的 Triton X-100/PBS中透化30分钟，并在含有2%BSA和2%正常驴血清的PBS中封闭。内源性 的神经诱向因子-1使用大鼠单克隆α-神经诱向因子-1抗体(R&D 8}^七61118)和41613-488驴 抗大鼠 IgG(Molecular probes)染色。核使用Hoescht染色(Sigma)进行对比染色。
[0191] 实施例12:过表达神经诱向因子-1和表达DCC和/或UNC5A和/或B和/或C和/或D待 作为候选用于用UNC5-TRAP或人源化4C11抗体治疗的癌症的实例。
[0192] 对于神经诱向因子-1及其受体的表达已被量化的每种类型癌症，给出神经诱向因 子-1过表达情况的百分比。
[0193] -转移性乳腺癌60% (Fitamant等，PNAS 2008)，
[0194] -非小细胞肺癌47% (Delloye-Bourgeois等，JNCI 2009)，
[0195] -侵袭性神经母细胞瘤38%(Delloye_Bourgeois等，J_Exp.Med.2009)，
[0196] -膜腺癌61 % (Link等，Annals of Chir · Onco · 2007 ;Dumartin et al · ,Gastro 2010)，
[0197] -原发性黑素瘤 100% (n = 7)，黑素瘤转移（n = 6) (Kaufmann 等，Cellular Oncology 2009),
[0198] -卵巢癌76% (Panastasiou等，Oncotarget 2011)，
[0199] -胶质母细胞瘤65%，
[0200]-急性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病60%，
[0201]-侵袭性B细胞淋巴瘤50%，
[0202]-肉瘤 30%，
[0203]-肾腺癌 40%，
[0204]-头颈癌 22%，
[0205]-睾丸癌(胚胎性癌36%，畸胎瘤50%，卵黄囊瘤100%)，
[0206] -肾癌 50%，
[0207] -胃癌 26%，
[0208] -子宫癌 19 %。
[0209] 实施例13.定量RT-PCR允许根据PCT/EP2013/068937评估神经诱向因子-1的表达 或过表达：
[0210] 根据制造商的操作步骤使川]Sucle〇Spm*RNA II试剂盒(Macherey Nagel ,DU ren，Germany)提取总RNA。用iScript?cDNA合成试剂盒(Bi orad)进行RT-PCR反应。使用以 下程序反转录Iyg总RNA : 25 °C 5分钟，42 °C 30分钟和85 °C 5分钟。对于表达研究，在 LightCycljer?2.0设备（Roche Applied Science)中使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche Applied Science)扩增目标转录物。目标基因的表达 相对于用作持家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和磷酸甘油酸激酶(PGK)基因进行标 准化。相对于持家基因进行了标准化的目标转录物的量使用比较Ct法进行计算。进行验证 实验以证明目标基因和持家基因的效率大致相等。引物序列如下：
[0211 ]正向引物：aaaagtactgcaagaaggactatgc SEQ ID N0:33〇
[0212] 反向引物：ccctgcttatacacggagatg SEQ ID N0:34。
[0213] 实施例14.根据PCT/EP2013/068937在人癌细胞中神经诱向因子-1蛋白的定量：
[0214] 对于免疫印迹分析，将细胞在改良的RIPA缓冲液（50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、I %NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1 % SDS、ImM EDTA、蛋白酶抑制剂混合物和5mM DTT) 中通过超声处理裂解，并在4°C孵育1小时。细胞碎片通过离心(在4 °C，10.0 OOg 15'）沉淀并 且将蛋白提取物（每泳道200yg)上样到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并印迹到PVDF片材 (Millipore Corporation,BilIerica，MA，U.S.A.)上。滤纸用在PBS/0.1 %吐温20(PBS_T) 中10%脱脂奶粉和5%BSA封闭过夜，并且然后与兔多克隆α-神经诱向因子-1(1:500稀释， 克隆H104，Santa Cruz Biotechnology，Santa (^112,〇厶，1]3厶）和小鼠单克隆0-肌动蛋白 (Santa Cruz Biotechnologies)抗体孵育2小时。用PBS-T洗涤三次后，滤纸与适当的HRP缀 合的第二抗体（1:10000，Jackson ImmunoResearch，Suffolk，UK)孵育 1 小时。使用West Dura化学发光系统(Pierce，Rockford，IL，U· S · A·)进行检测。
[0215] 对于免疫焚光研究，使细胞脱壁，用离心涂片器（Shandon Cytospin 3，Thermo Scientif ic)离心到盖玻片上，并用4% (v/v)低聚甲醛固定30分钟。然后将细胞在0.2%的 Triton X-100/PBS中透化30分钟，并在含有2%BSA和2%正常驴血清的PBS中封闭。内源性 的神经诱向因子-1使用大鼠单克隆α-神经诱向因子-1抗体(R&D 8}^七61118)和41613-488驴 抗大鼠 IgG(Molecular probes)染色。核使用Hoescht染色(Sigma)进行对比染色。
[0216]实施例15:体内异种移植物模型。
[0217]指数生长中的不同的人细胞系（肺腺癌上皮细胞系H358和A549,和套细胞淋巴瘤 细胞系GRANTA-519和弥漫性大B细胞淋巴瘤oci-ly3)从培养物中收集，用无菌I3BS洗涤两 次，计数并且5. IO6个细胞重悬在PBS中，然后皮下植入到5周龄的雌性瑞士/裸鼠的右肋。月中 瘤体积(V)通过式V = 0.5(长度X宽度2)用游标卡尺测定。100+/-20mm3肿瘤建立后随机化 分入多个组(每组10只小鼠）。抗神经诱向因子1抗体或同种型对照人静脉内（H358、A549、 oci-ly3)或腹膜内（GRANTA-519)以10mg/kg每周两次注射入小鼠。确定在下表中指示的天 (d)移植的每种细胞系的肿瘤生长抑制的百分比（％TGI)，并通过式TGI(%) = (1-T/C)X 100计算，其中T指示测试组（用抗神经诱向因子1抗体治疗)在d天的平均肿瘤体积，并且C指 示同种型对照治疗组的平均体积。肿瘤生长抑制〈50%被认为是有意义的。
[0219]本发明的鼠和人源化抗体具有有效的抑制肿瘤生长的效果。
【主权项】
1. 分离的或纯化的多肽： -其序列为SEQ ID NO: 3,或所述多肽是与SEQ ID NO: 3具有至少85%同一性的变体多 肽，或 -其由序列为SEQ ID N0:4的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与SEQ ID NO: 4具有至少85%同一性的变体cDNA编码。2. 权利要求1的抗体，其序列如SEQ ID NO: 35所描绘，或是与SEQ ID NO: 35具有至少 85%同一性的变体多肽。3. 权利要求1的多肽，其由序列为SEQ ID N0:36的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简 并性的变体，或与SEQ ID NO:36具有至少85%同一性的变体cDNA编码。4. 序列为SEQ ID NO: 4或36的cDNA，或该cDNA的借助于遗传密码简并性的变体，或与 SEQ ID NO:4或36具有至少85%同一性的变体cDNA。5. 根据权利要求1-3任一项的多肽用于制备单克隆抗体的用途。6. 神经诱向因子-1结合抗体，其特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或35的多肽 或与SEQ ID N0:3具有至少85%同一性的变体多肽，其中结合多肽具有结合神经诱向因子-1并诱导肿瘤细胞经由UNC5受体或DCC受体的细胞死亡或细胞凋亡的性质。7. 神经诱向因子-1结合抗体，其包含序列为SEQ ID N0:5的CDR1-H，序列为SEQ ID NO: 6的CDR2-H，序列为SEQ ID N0:7的CDR3-H，和序列为SEQ ID N0:8的CDR1-L，序列为YAS的 ⑶R2-L，和序列为SEQ ID N0:9的⑶R3-L，其中所述抗体具有结合神经诱向因子-1并诱导肿 瘤细胞经由UNC5受体或DCC受体的细胞死亡或细胞凋亡的性质。8. 神经诱向因子-1结合抗体，其包含序列为SEQ ID N0:28的CDR1-H，序列为SEQ ID N0:29的CDR2-H，序列为SEQIDN0:30的CDR3-H，和序列为SEQIDN0:31的CDR1-L，序列为 SEQ ID N0:32的CDR2-L，和序列为SEQ ID N0:9的CDR3-L，其中所述抗体具有结合神经诱向 因子-1并诱导肿瘤细胞经由UNC5受体或DCC受体的细胞死亡或细胞凋亡的性质。9. 权利要求6-8任一项的神经诱向因子-1结合抗体，其是所述抗体的表位结合片段。10. 权利要求6-9任一项的神经诱向因子-1结合抗体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10、11、12或13,优选地序列SEQ ID NO: 10和11两者，或SEQ ID NO: 12和13两者。11. 权利要求6-10任一项的神经诱向因子-1结合抗体，其包含选自SEQ ID N0:14-19的 组和/或选自SEQ ID NO:20-27的组的氨基酸序列，优选地，其包含选自SEQ ID NO :14-19的 组的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:20-27的组的氨基酸序列。12. 药物组合物，其包含根据权利要求6-11任一项的抗体和药学上可接受的媒介物、载 体或稀释剂。13. 权利要求12的组合物，用于在神经诱向因子-1的存在下治疗受试者对抗癌症，其中 所述癌症具有表达神经诱向因子-1的肿瘤细胞。14. 权利要求12的组合物，其用于治疗受试者对抗癌症，其中所述癌症具有表达神经诱 向因子-1受体和神经诱向因子-1的肿瘤细胞，或具有在表达神经诱向因子-1的间质细胞内 表达神经诱向因子-1的肿瘤细胞。15. 治疗癌症的方法，其中对有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求12的药 物组合物。
【文档编号】C07K16/22GK105979966SQ201580007753
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】J-G·戴尔克罗斯, Y·迪安
【申请人】奈特里斯药物公司