一种羊胎素及其制备方法

专利名称：一种羊胎素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及胚胎提取物及其制备方法，特别是涉及一种羊胎素及其制备方法。
背景技术：
皮肤会自然发生衰老，主要原因有1)随年龄增长机体全面老化；2)过度紧张、疲劳致生活失调；3)不合理的饮食致营养失去平衡；4)神经-内分泌-紊乱致免疫功能降低；5)不良生活习惯。其中，年龄是主要原因。随着年龄增加，丘脑-垂体轴及免疫功能降低，性腺、肾上腺和甲状腺等腺体萎缩，机体出现衰老征象。自由基是生命代谢产物，是衰老的分子基础。机体通过抗氧化系统如抗氧化酶(SOD、CAT、GSH)和抗氧化剂(VitE、C，辅酶Q)清除有害自由基。年龄增加或机体功能失调，自由基生成增高、清除力下降，生物膜被攻击，引起脂质过氧化，破坏细胞功能，皮肤细胞脱水干燥、角化，松弛、失弹性、少光泽，皱纹形成，色素沉着等一系列皮肤老化症状。
皮肤健美在很大的程度上是抗衰老的问题。追溯祖国医学理论认为只有脏腑阴阳平衡、经脉气血通畅，容颜才不至于过早的衰老，并保持面色红润皮肤白嫩。早在西汉，《神农本草经》就记载了百余种养颜美容的药物，远流日本和欧洲，并逐渐融入了现代医学美容的理念，形成了里表并重的美容方针。因此，以引进新理论、新技术为研究和开发的宗旨，在现代科学氛围中诞生了“生物活性素”。广义上的“生命活性物质”，是指那些维持生命活动的最基本成分，如一般的蛋白、脂肪、糖、水和电解质等，然而，在生命活动中，还存在着一类重要物质，尽管含量很低，但其生物活性很高，如果这些物质缺乏，将影响生命活动正常运行，甚至导致疾病的发生。科学家们对“生命活性物质”产生了广泛关注，据报道1995年，日本东京神经心理药理学系报告了老化小鼠年龄相关的学习记忆与胆碱型神经功能的改变。用Y形迷宫实验，老化小鼠学习能力和逃避反应性降低，乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱脂酶活性降低。这些结果表明老化过程伴随胆碱能神经紊乱。(Nitta Aage-related changes inlearning and memory and cholinergic neuronal function in senescenceaccelerated mice(SAM).Behav Brain Res 1955 Dec 14；72(1-2)49-55)；2000年，德国医学中心报告了细胞因子和激素是神经-内分泌-免疫调节网络的联系，年轻和年老者的神经-内分泌-免疫调节网络不同，老年发生免疫衰老(Straub RH，Cytokinesand hormones as possible links between endocrinosenescence andimmunosenescence.J Neuroimmunol 2000 Sep 1；109(1)10-5)；2000年，美国科罗拉多大学提出了在免疫衰老过程中，内分泌功能起主要作用，以及激素和神经递质的合成释放降低的证据，随年龄增加，生长激素、IGF1、交感神经活跃、儿茶酚胺代谢、生殖激素都发生改变，也反应在老龄个体对体力的耐受度和刺激反应性下降(MazzeoRS.Aging，immune function，and exercisehormonal regulation.Int J SportsMed 2000May；21Supp1S10-3)；2001年，日本东京大学化学药物实验室报告神经递质、神经肽、激素和细胞因子介导神经内分泌与免疫系统相互作用，以维持机体的正常生理功能，并认为神经内分泌-免疫调节网络失去平衡，在老化过程中起重要作用(Nishiyama N.Thymectomy-induced deterioration of learning and memory.CellMol Biol(Noisy-le-grand).2001Feb；47(1)161-5)；2001年，德国神经内分泌实验室进一步报告了神经、内分泌和免疫系统通过细胞因子、激素、神经递质特殊的受体和信号传导途径进行调节，机体老化时，多个水平发生改变，这些变化依赖于氧化损伤、非酶性的糖基化和加速老化进程(Straub RHThe process of aging changes theinterplay of the immune，endocrine and nervous systems.Mech Ageing Dev 2001Sep 30；122(14)1591-611)。天然的生命活性物包括以下几类物质1)免疫活性因子，如淋巴因子；2)活性酶，如超氧歧化酶；3)细胞生长因子，如表皮生长因子；4)内分泌素，如促性激素；5)有益的磷脂，如脑磷脂、卵磷脂；6)丰富的氨基酸和维生素。二十世纪末兴起的生物活性物有①酶类胶原酶、透明质酸酶、组织蛋白酶、糖苷酶等，参与皮肤角质细胞代谢，能够抑制皮肤老化和色斑形成；②肽类脑素肽类，具有防皱、止痒、防秃和扩张血管的功效，日本已开发出恼素系列产品，如恼素晚霜等；③蛋白鱼蛋白与维生素复合，可增加皮肤弹性、改善皮肤老化状态。
胚胎的研究与应用是二十世末生物医学的重大课题，医学革命和治疗学新的里程碑。中医认为“胚胎虽秉后天之形，却承先天之气”，具有返老还童之功效。补精益阳，益精血，助肾阳，养血益气，滋润肌肤，安神定志，以心血养颜。九十年代初，欧洲用一种纯种的黑色胎羊制备羊胎素，并风靡欧洲及东南亚，价格之昂贵只有一些名人和富者能够使用。羊胎素的问世，为现代科学美容开辟了一条崭新的思路(羊胎素世界知识画报，2005，1，A版，P62)。现代科学已经证实，胚胎组织中含有丰富的生命活性因子，采用先进的科学技术提取和纯化的胚胎活性因子，在临床上显示出高效的健肤养颜的奇特功效。这是因为胚胎组织中含有的众多的细胞因子、促激性素类因子、酶类、细胞生长素、磷脂和多肽等多种生物活性分子。胚胎组织中含有的生物活性物质及其作用为1)活性肽促进皮肤新陈代谢；2)免疫活性因子调节机体免疫功能；3)酶激活转化因子清除自由基；4)细胞生长因子促进生长修复；5)天然生态调节因子保湿。
胚胎干细胞，可分裂成专职干细胞，发育成包括多种脏器的完整的机体，表明胚胎细胞具有非常强大的生命活力，这种活力是由存在于胚胎的活性因子提供的。目前已经证实胚胎素中含有30余种活性物质，以必要氨基酸、多肽、微量元素复合体的形式存在，对出生后机体的生长、发育、代谢，以及抵抗衰老和促进损伤修复起到十分重要的作用。胚胎发育过程中的内分泌活动十分活跃，特别是下丘脑-垂体-肾上腺发育，在人和羊表现为mRNA编码的糖皮激素蛋白表达水平升高和前列腺素(PGHS-II)合成增加，介导11β-羟基类固醇脱氢酶增加；胚胎代谢活跃的另一个证据是胚胎血管内皮细胞含有丰富的糖原酵素和原形蛋白，调节糖原代谢。这些特征与胚胎含有多种丰富的生命活性物质有关。细胞因子是生物医学领域中最热门的研究课题，因其涉及生命活动的各个环节，构成了生命调节网络和中心，控制心血管、呼吸、消化、生殖、生长、发育和老化，甚至人的心理和行为。胚胎含IL-2、IL-3、IL-6、SCF和IFN等造血和免疫刺激因子，肝细胞生长因子、脑活素、生长素和类胰岛素生长因子(IGF)。人和绵羊胎膜EPO及受体表达很高，胚胎皮肤和肝组织中含有丰富的生长激素受体，分泌的3种类胰岛素生长因子结合蛋白量比成年高出10倍。解毒酶胚胎肝合成谷胱甘肽转移酶(GSTs)是一种重要的生命活性物，负责细胞内许多成分的结合转运体。最近发现几乎胚胎的所有组织中解毒酶的含量都很高，参与细胞内膜转运活动，催化谷胱甘肽与毒物结合，进一步水解后将产物排除体外，因此，该酶在机体解毒过程中起到控制作用。胚胎脑组织含有神经营养因子(NF)，胚胎7-8周，在端脑囊的神经胶质和脉络膜血管呈强阳性反应，第10周室管膜也出现强阳性染色，15-16周移到脑皮质板和星形细胞，因此，NF对胚胎脑发育、分化、移动甚至存活起关键作用。胚胎脑组织表达强烈的另一种神经营养因子(GDNF)在胚胎的活存、分化和发育中也起到关键作用。此外，胚胎中含有多种生物活性肽，如垂体腺苷酸环化酶激活肽，血管紧张肽，胃泌素和分泌素等，对上皮性组织的增殖和分化起到重要作用。胚胎肝有含量丰富的细胞色素P450超家族成员，是重要的生物活性成分，在所有的胚胎肝中，含量高于成人。许多天然的生物活性肽对出生后机体的性功能促进、延缓皮肤微循环障碍、弹性下降、色素沉着、老化的组织再生和修复具有重要的多功能活性。
基于上述功效，国内外现已开发出多种羊胎素产品，目前市场中的羊胎素的制作方法主要为85％以上选用羊胎盘为原料，用中空纤维柱进行超滤(蛋白吸附率约为40％)，粉碎烘干，或采用流化喷雾法(温度50℃以上)，制粒。产品呈褐色、有腥臭味、不溶于水，且含有防腐剂，多采用胃溶胶囊或软胶囊剂型。

发明内容
本发明的目的是提供一种生物活性较高、不含防腐剂的羊胎素及其制备方法。
本发明所提供的制备羊胎素的方法，包括以下步骤1)在无菌条件下，以2-3个月龄的羊胚胎为原料，经清洗、绞碎、冻融和匀浆，得到粒度为2-50μ的组织液；2)将组织液在65-70℃下加热杀菌、过分子筛和超滤进行纯化，收集分子量小于30000道尔顿的组分；3)对收集的组分进行微孔过滤除菌，滤膜孔径为0.20-0.45μ；4)冷冻干燥后得到羊胎素。
在上述制备方法中，为使胚胎中的活性物质得到充分释放，所述步骤1)中冻融的次数为2-4次，优选为3次，其中冷冻的温度为-10℃至-30℃。
步骤2)中加热杀菌的时间为9-11小时，优选为10小时，温度优选为65℃；分子筛的孔径依次为100目、200目；超滤所用的滤膜为生物纤维素膜，优选为美国PALL公司生产的SER#33094048R超滤纤维素膜。
本发明的羊胎素可以制成胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、口服液等任何一种便于服用和携带的剂型，将步骤4)中经冷冻干燥后得到的羊胎素造粒，装胶囊，即可得到胶囊剂型的产品；所述胶囊优选为肠溶胶囊。
用上述方法得到的羊胎素即为生物活性高、不含防腐剂的羊胎素。
本发明提供了一种羊胎素及其制备方法。该制备方法具有以下优点1)精选2-3个月龄的羊胚胎为原料，生物活性物质含量丰富；2)用美国PALL公司的生物纤维素膜进行提纯，蛋白吸附率仅为0.04％；3)经冷冻干燥(温度-30℃以下)后得到产品，可使其生物活性不受损失；4)采用肠溶胶囊，可保证多肽不被胃酸水解、吸收完全；5)制备工艺简单，具有工业化生产的可行性。本发明的羊胎素为白色微粒、微甜、无异味、易溶于水，不含防腐剂，服用方便、适用人群广、保质期长，与市场上现有的羊胎素相比，色泽、气味、水溶性等方面均得到显著改善。实验证明，本发明羊胎素可促进创伤愈合，促进心、肝、肺、脑多种组织呼吸，抗感染，提高机体免疫力和抗缺氧能力，并可直接或间接地激活肌肤的生理活性，经皮肤吸收后，能够调节和改善因年龄或工作节奏过快、生活紧张、久坐少动等造成的皮肤衰老如弹性降低等现象，具有较好的美容功效(尤其是祛黄褐斑，总有效率达70.00％)。基于上述优点，本发明具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景，可以在制药、保健品生产及化妆品生产中得到广泛应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、羊胎素的制备其制备过程，包括以下步骤1)在万级净化间内，以2-3个月龄的羊胚胎为原料，对其进行清洗、绞碎、反复冻融2次和匀浆，得到粒度为45μ的组织液；2)将组织液在65℃下加热9小时进行杀菌、依次过100目、200目的分子筛，用美国PALL公司生产的超滤纤维素膜进行纯化，收集分子量小于30000道尔顿的组分；3)对收集的组分用孔径为0.20μ的滤膜进行过滤除菌；4)-40℃冷冻干燥后得到产品。
经检测，用上述方法制备的羊胎素白色、微甜、无异味、易溶于水，不含防腐剂，符合标准。
实施例2、羊胎素胶囊的制备其制备过程，包括以下步骤1)在万级净化间内，以2-3个月龄的羊胚胎为原料，对其进行清洗、绞碎、反复冻融4次和匀浆，得到粒度为2μ的组织液；2)将组织液在70℃下加热11小时进行杀菌、依次过100目、200目的分子筛，用美国PALL公司生产的超滤纤维素膜进行纯化，收集分子量小于30000道尔顿的组分；3)对收集的组分用孔径为0.24μ的滤膜进行过滤除菌；4)-60℃冷冻干燥后造粒，装肠溶胶囊(180mg/粒)，得到胶囊剂型的产品。
经检测，用上述方法制备的羊胎素为白色微粒、微甜、无异味、易溶于水，不含防腐剂，符合标准。
实施例3、氨基酸含量分析分析仪器日立L-8500氨基酸分析仪。
分析条件分析柱日立#2622SC，缓冲液流速0.4mL/min。
对实施例1制备的羊胎素进行氨基酸含量分析，结果如表1A所示


上述氨基酸含量分析结果表明本发明的羊胎素氨基酸含量较高，生物活性物质含量丰富。
实施例4、本发明的羊胎素对表皮细胞产生超氧化物歧化酶(SOD)的影响自由基的积累损伤作用是皮肤衰老的重要原因之一。超氧化物歧化酶(SOD)可清除氧自由基，具有保护细胞、延缓衰老的作用。
由于SOD分子量大，皮肤难于吸收，加之SOD属于酶类，半衰期短且不稳定，易受理化因素影响而失活，故外捈SOD类化妆品，很难达到宣传效果。
现采用邻苯三酚自氧化法和皮肤原代细胞培养技术，对本发明的羊胎素促进表皮细胞内产生超氧化物歧化酶(SOD)的能力进行检测。
一、表皮角朊细胞的分离和原代培养1、用包皮环切术取儿童包皮组织，用无菌PBS清洗，将标本置于含100u/mL青霉素和100ug/mL链霉素的双抗液中浸泡30分钟后，在超净台中剪去皮下组织，并用PBS清洗两次，将包皮组织剪成条状，加入0.25％胰酶于4℃冷消化12-18小时，再置于37℃热消化30分钟，分离表皮层，将表皮层放入细胞培养液中，用研磨器轻轻研磨、吸管反复吹打成单细胞悬液，低速离心5分钟，弃上清后加入细胞培养液，调整浓度为5×104个/mL，接种于24孔板，置于二氧化碳孵箱中37℃培养24小时。
2、弃去细胞培养液，用新鲜培养液稀释实施例1制备的羊胎素样品为0mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL，加入24孔板中(每个样品浓度做3个平行孔)，继续培养24小时，其中0mg/mL为不加样品的对照。
3、弃去细胞培养液，用0.25％胰酶消化细胞，PBS洗涤三遍，细胞计数后，悬于PBS中，终浓度为50个/mL。反复冻融三次，涡旋器上剧烈振荡2分钟，10000rpm离心5分钟，取上清测定SOD活性。
二、邻苯三酚自氧化法测定SOD活性SOD标准品美国Sigma公司产品(目录号S-2515，批次号81K7587)，配制浓度1U/70μl。
对照品(空白参比)(0mg/mL)不加样品的细胞裂解液。
测试品步骤一制备的不同浓度样品的细胞裂解液。
溶液配制1)TE50mM Tris-HCl(pH8.2)，0.1mM EDTA。
2)PG6mM邻苯三酚(pyrograllol)，配于10mM HCl中。
测定液(见表1)表1 测定液

测定方法为按表1中的剂量将TE分别与空白参比、SOD标准品及测试品混匀后，25℃恒温10min，然后加入PG，立即用岛津UV-1601分光光度计测量A320的吸光度变化率。再按下述公式计算SOD活性抑制率I＝(ΔA1/min-ΔA2/min)/(ΔA1/min)(ΔA1/min为空白参比的吸光度变化率，ΔA2/min为测试品的吸光度变化率)SOD活性(U)＝2ISOD活性测定结果如表2所示
表2 SOD活性测定结果

结果用上述检测方法，以未加样品的、同样培养条件的表皮细胞裂解液为空白参比，测得样品组细胞内有SOD活性，即加入本发明的羊胎素24小时，能提高表皮细胞内源性SOD活性。上述检测结果表明可以本发明的羊胎素为活性成分制备外用护肤品，例如，其中的一个配方为羊胎素88％，甘油10％，香精2％。
实施例5、本发明羊胎素的免疫调节作用检验待测样品(受试物)实施例2制备的胶囊剂型的羊胎素(推荐量0.54g/人·日，相当于9mg/Kg BW)，常温下保存。
实验动物清洁级昆明种小鼠，192只，雌性，体重20-24g，由军事医学科学院实验动物中心提供(合格证号京动许字99001，动物实验室合格证号SYXK(京)2002-0022)。
剂量选择与受试物给予方式分别按推荐日摄入量(9mg/Kg Bw)的1、10、30倍，即9、90、270mg/Kg BW为三个剂量组，以去离子水为溶剂，按0.1mL/10g Bw经口灌胃，每天一次，连续30天，同时另设阴性对照组，给予相同剂量的去离子水。
主要仪器与试剂电子秤、半自动生化分析仪、7200型分光光度计、血球计数仪、全自动酶标仪、显微镜、二氧化碳培养箱、游标卡尺、离心机、Hank’s液、新鲜羊血、新鲜鸡血、生理盐水、刀豆蛋白A、MTT、RPMI1640培养液、印度墨汁、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I等。
实验方案动物检疫3日，未见异常，可用于实验。选健康昆明小鼠192只，分为四批，每批48只，第一批为脏/体比值、迟发型变态反应(DTH)、抗体形成细胞数(PFC)、血清半数溶血值(HC50)实验组；第二批为腹腔巨噬细胞吞噬功能实验组；第三批为碳廓清实验组；第四批为小鼠脾淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定组。将每批动物再分为四组，每组12只，按设计剂量每天灌胃一次，连续30天，于末次给予受试物后对动物进行各项免疫指标测定。各项指标具体的测定方法及结果如下一、免疫器官重量及脏/体比值变化1、免疫器官重量变化分别于注射后第0、1、2、3、4周对上述不同批次、不同剂量组小鼠称重，采用”SPSS10.0for Windows”软件对数据进行统计分析。检测数据先经方差齐性检验，再进行方差分析，如组间差异有显著性，继续进行多个实验组语一个对照组间均数的两两比较。对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足“正态方差齐”要求后，用转换所得的数据进行统计处理。腹腔巨噬细胞吞噬率、NK细胞活性测定数据需经sin-1P1/2转换，并经方差齐性检验再进行方差分析。数据分析结果如表3-表6所示表3 第一批小鼠体重变化(X±S，g)

表4 第二批小鼠体重变化(X±S，g)

表5 第三批小鼠体重变化(X±S，g)

表6 第四批小鼠体重变化(X±S，g)


表3-表6数据表明，实验期间对照组及试验组动物生长良好，体重增长正常，对每批动物各剂量组每周体重进行方差分析，其组间无显著差异(P＞0.05)，表明本发明的羊胎素对受试动物体重无显著影响。
2、脏器/体比值变化于注射后第30天取上述第一批小鼠的脾和胸腺，统计脾/体比值和胸腺/体比值，用与步骤1相同的方法进行数据进行分析，结果如表7所示表7 脏器/体比值变化(X±S)

表7数据表明，各剂量组小鼠脾/体比值、胸腺/体比值无显著变化，经方差分析，其组间差异无显著性(P＞0.05)二、细胞免疫功能测定1、迟发型变态反应(DTH)于末次给予受试物后，给每组12只小鼠腹腔注射2％(V/V)的绵羊红细胞(SRBC)。4天后在其左后足趾部皮下注射20％(V/V)SRBC进行攻击。于攻击前和攻击后24小时分别测量左后足趾部厚度，计算攻击前、后的差值，并进行方差分析，结果如表8所示表8 对小鼠DTH的影响(X±S)

*与阴性对照组比较，P＜0.05；**与阴性对照组比较，P＜0.01。
表8数据表明，中、高剂量组小鼠足趾增厚程度明显高于阴性对照组，经方差分析及多个实验组与一个对照组间均数的两两比较，其差异具有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。
2、脾淋巴细胞转化试验对每组12只小鼠无菌取脾，制成脾细胞悬液，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×106个/mL，按照MTT法，在570nm波长处测定吸光度值(OD)。用加ConA孔的吸光度值减去不加ConA孔的吸光度值代表淋巴细胞的增殖能力，并对数据进行方差分析，结果如表9所示表9 对淋巴细胞的增殖能力的影响(X±S)

*与阴性对照组比较，P＜0.05；**与阴性对照组比较，P＜0.01。
表9数据表明，中、高剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于阴性对照组，经方差分析及多个实验组与一个对照组间均数的两两比较，其差异具有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。
三、体液免疫功能测定1、血清半数溶血值(HC50)测定给小鼠腹腔注射SRBC 5天后，摘其有求取血，进行血清半数溶血值(HC50)测定，计算公式如下，并对数据进行方差分析，结果如表10所示

表10 对小鼠血清半数溶血值(HC50)的影响(X±S)

表10数据表明，各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)未见明显升高，经方差分析，其组间差异无显著性(P＞0.05)。
2、PFC测定将步骤1取血清后的小鼠处死，取胸腺、脾脏称重，计算脏器/体比值，同时制备脾细胞悬液，进行抗体生成细胞(PFC)测定，并对数据进行方差分析，结果如表11所示表11 对小鼠脾脏IgM PFC的影响(X±S)

表11数据表明，各剂量组小鼠脾脏抗体形成细胞数未见明显升高，经方差分析，其组间差异无显著性(P＞0.05)。
四、单核-巨噬细胞吞噬功能测定1、小鼠碳廓清试验给每组12只小鼠静脉注射0.2mL经稀释的印度墨汁(用生理盐水稀释5倍)，待墨汁注入1分钟和10分钟后，分别从内眦静脉丛取血20μl，并将其加到2mL 0.1％(V/V)Na2CO3溶液中，用7200型分光光度计在600nm波长处测吸光度值(OD)。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重，计算吞噬指数(a)，计算公式如下，并对数据进行方差分析，结果如表12所示

表12 对小鼠碳廓清能力的影响(X±S)

**与阴性对照组比较，P＜0.01。
表12数据表明，经方差分析及多个实验组与一个对照组间均数的两两比较，高剂量组小鼠碳廓清指数明显高于阴性对照组，其差异具有显著性(P＜0.01)。
2、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验于末次给予受试物后，给每组12只小鼠腹腔注射1％(V/V)的鸡红细胞悬液1mL，间隔30分钟后处死动物，用2mL Hank’s液冲洗腹腔，取腹腔洗液0.5mL滴片，37℃温育30分钟，甲醇固定，Giemsa染色，于油镜下对每只动物计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数，并对数据进行方差分析，结果如表13所示表13 对巨噬细胞吞噬功能的影响(X±S)

**与阴性对照组比较，P＜0.01。
表13数据表明，中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数明显增高，经方差分析及多个实验组与一个对照组间均数的两两比较，中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数明显高于阴性对照组，其差异具有显著性(P＜0.01)。
五、NK细胞活性测定试验前24小时，将靶细胞(YAC-1细胞)进行传代培养，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，按乳酸脱氢酶(LDH)法在酶标仪490nm处测吸光度值(OD)，计算NK细胞活性，计算公式如下，并对数据进行方差分析，结果如表

表14 对小鼠NK细胞活性的影响(X±S)

表14数据表明，各剂量组小鼠NK细胞活性未见明显升高，经方差分析，其组间差异无显著性(P＞0.05)。
综上所述，本发明的羊胎素对小鼠具有免疫调节作用。
实施例6、美容(祛黄褐斑)功能人体试食试验受试物实施例2制备的肠溶胶囊剂型的羊胎素。
受试对象按自愿原则选择18-65岁，具有黄褐斑受试者30例。
诊断标准头面部肉眼观察可见黄褐色斑，多发于颧、颊、额、鼻、唇周等处，无痛痒等症状。
纳入者标准凡生有黄褐斑的自愿受试者，经体检合格均可进行试食观察。
排除者标准1)年龄在18岁以下或65岁以上者，妊娠或哺乳期妇女，对本发明的羊胎素过敏者；2)不符合纳入标准，未按规定用受试物，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
对照形式采用自身前后对照形式。
服用剂量及时间每次3粒，每日2次，连续服用30天，受试者在试验期间停止服用有关养颜祛斑的药物或其它保健品及化妆品。
仪器与试剂F-820型血球计数仪，MIDIRON尿十项分析仪(德国产)，Olympus全自动生化分析仪(日本产，型号AU600)，《实用标准色卡》(中国科学院地理研究所设计研制，测绘出版社出版，1992，第一版)。
对下述指标进行检测(试验前后各检查一次)一、功效性检测共观察黄褐斑受试者30例，均为女性，年龄最小25岁，最大48岁，平均38.93±5.69岁，平均病程5.07±2.96年。
1、临床症状改善情况受试前详细询问病史，了解受试者饮食情况，观察主要临床症状疲劳感、烦躁、睡眠等。按症状轻重(重症3分、中度2分、轻症1分)在试食前后统计积分值，并就其主要症状改善(每一症状改善2分显效，改善1分为有效)，计算改善率。主要症状改善情况如表15所示表15 主要症状改善情况

症状积分变化如表16所示表16 症状积分变化

**P＜0.01。
表15和表16的检测结果表明，本发明的羊胎素对受试者的疲劳感、烦躁及睡眠等症状均有改善作用。
2、祛斑功效检测1)头面部黄褐斑面积大小改变情况用标尺测量受试者受试前后同一黄褐斑的长径和宽径，计算面积(cm2)，结果如表17所示表17 黄褐斑面积大小变化

**P＜0.01。
2)头面部黄褐斑颜色深浅变化按照《实用标准色卡》(中国科学院地理研究所设计研制，测绘出版社出版，1992，第一版)中的棕色(Y+M+Bk，即黄+品红+黑的叠色)色卡为黄褐斑颜色深浅的判断标准I度(15、20、5)，II度(30、40、10)，III度(40、60、15)，结果如表18所示表18 黄褐斑颜色深浅变化

*P＜0.05。
3)功效判定现根据上述头面部黄褐斑面积大小及颜色深浅的改变情况对本发明的羊胎素的祛斑功效进行判定，判定标准如下显效黄褐斑颜色下降II度，或面积缩小≥30％，不产生新的黄褐斑。
有效黄褐斑颜色下降I度，或面积缩小＜30％，≥10％不产生新的黄褐斑。
无效黄褐斑面积缩小＜10％，颜色无明显变化。
根据上述判定标准得出的本发明的羊胎素的祛斑功效判定结果如表19所示表19 祛斑功效判定结果

30例黄褐斑受试者按要求服用本发明的羊胎素胶囊30天，黄褐斑面积平均缩小5.13±8.79cm2(P＜0.01)，黄褐斑颜色变浅，色卡平均降低0.42±0.40(P＜0.05)，其中显效3例，有效18例，总有效率达70.00％，表明本发明的羊胎素胶囊具有较高的美容(祛黄褐斑)效果。
二、安全性检测对试食前、后的受试者的下述生理、生化指标进行检测1)血液及尿常规检查红细胞、血红蛋白及白细胞计数，尿十项检测；2)生化指标血清蛋白ALB，总蛋白TP，心肝肾功能(谷草转氨酶AST，谷丙转氨酶ALT，尿素UREA，肌苷CRE)，血糖GLU，血脂(总胆固醇TC，甘油三酯TG)；3)腹部B超，心电图，X线胸部透视。
其中，1)和2)中的安全性指标检测结果如表20所示表20 安全性指标检测结果

表20的数据表明，受试者试食前、后各项指标均在正常范围内；此外，受试者腹部B超、心电图及X线胸部透视检测结果也均正常，表明本发明的羊胎素对人身体健康无不良影响，服用安全。
权利要求
1.一种制备羊胎素的方法，包括以下步骤1)在无菌条件下，以2-3个月龄的羊胚胎为原料，经清洗、绞碎、冻融和匀浆，得到粒度为2-50μ的组织液；2)将组织液在65-70℃下加热杀菌、过分子筛和超滤，收集分子量小于30000道尔顿的组分；3)对收集的组分进行微孔过滤除菌，滤膜孔径为0.20-0.45μ；4)冷冻干燥后得到羊胎素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中冻融的次数为2-4次，其中冷冻的温度为-10℃至-30℃；所述步骤2)中加热杀菌的时间为9-11小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述加热杀菌的时间为10小时，温度为65℃。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中分子筛的孔径依次为100目、200目；超滤所用的滤膜为生物纤维素膜。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述生物纤维素膜为美国PALL公司生产的SER#33094048R生物纤维素膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将所述步骤4)中得到的羊胎素造粒，装胶囊，得到胶囊剂型的羊胎素产品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述胶囊为肠溶胶囊。
8.用权利要求1-7所述方法制备得到的羊胎素。
9.一种护肤品，其活性成分为权利要求8所述的羊胎素。
10.权利要求8所述的羊胎素在制备护肤品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种羊胎素及其制备方法。其制备方法包括以下步骤1)在无菌条件下，以2－3个月龄的羊胚胎为原料，经清洗、绞碎、冻融和匀浆，得到粒度为2－50μ的组织液；2)将组织液在65－70℃下加热杀菌、过分子筛和超滤进行纯化，收集分子量小于30000道尔顿的组分；3)对收集的组分进行微孔过滤除菌，滤膜孔径为0.20－0.45μ；4)冷冻干燥后得到羊胎素。本发明的羊胎素为白色微粒、微甜、无异味、易溶于水，不含防腐剂，服用方便、适用人群广、保质期长，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
文档编号A61Q19/08GK1843377SQ200610003550
公开日2006年10月11日 申请日期2006年2月13日 优先权日2006年2月13日
发明者周中慧, 王玉芝, 王宏权 申请人:北京凯诗伦生物技术有限公司