用于工业过程的获自褐色高温单孢菌的纤维素酶的制作方法

专利名称：用于工业过程的获自褐色高温单孢菌的纤维素酶的制作方法
背景技术：
本发明涉及的方法包括纤维素酶在工业过程中的用途以及用于此目的之组合物的用途。特别的，本发明涉及用源于褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)的特别适合于此目的之纤维素酶来处理纺织品，例如浆洗和加工。本发明还涉及源于褐色高温单孢菌的纤维素酶用于增强动物饲料的可消化性的用途，用于去污剂中的用途，用于纸浆和纸的处理中的用途，以及用于淀粉的生产及其副产品的处理中的用途。
纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-D葡聚糖键)并产生葡萄糖、纤维二糖和纤维寡糖为主要产物的酶。纤维素酶可由许多微生物产生并且包含一些不同的酶种类，包括已鉴定为外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)的那些酶(M.Schulein，酶学方法(Methods in Enzymology),160卷，235-242页(1988))。目前理论认为这些种类中的酶能被分离成单个组分。例如，微生物纤维素酶组合物可能由一种或多种CBH组分、一种或多种EG组分以及可能的β-葡糖苷酶组成。包含CBH、EG和BG组分的完整的纤维素酶体系协同作用将晶态纤维素转换成葡萄糖。外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶共同作用将纤维素水解成小的纤维寡糖。纤维寡糖(主要是纤维二糖)随后被占主要部分的β-葡糖苷酶水解为葡萄糖。
已知单独或联合使用的纤维素酶及其各组分可用于去污剂组合物和处理纺织品。纺织品工业中，已知在含棉织物生产过程之中或其后不久，用纤维素酶处理此织物可赋予织物期望的特性。此处理的一个目的是去除绒毛(即从纱线或织物表面伸出的解开的纤维末端)以及纤维绒球(即由一根或多根纤维固定于织物表面的纠缠的纤维束或团)。因而，纺织品工业中，纤维素酶已被用于改善含棉织物的手感和/或外观，从含棉针织物上去除表面纤维，并且也用于赋予粗斜纹棉布石洗外观。特别是日本专利申请号58-36217和58-54032以及Ohishi等，“纤维素酶对棉织物的改造”和“新成果——减重处理以软化棉织物的手感”日本纺织品新闻(Japan Textile News),(1988年12月)都公开了用纤维素酶处理含棉织物导致织物手感的改善。通常认为，这种纤维素酶处理去除了棉绒毛和/或表面纤维，从而减少了织物重量。这些效果综合起来赋予织物改善的手感。
由纤维素织物制成的布例如棉粗斜纹棉布，由于存在为方便衣服的制造、搬运和包装的上浆组合物而使其质地坚硬，且一般有新且深的染色外观。靛蓝染色的粗斜纹棉布一个期望的特征是用白线改变染色的线，这给予粗斜纹棉布上蓝色的外观。例如，持续穿着和浆洗一段时间后，衣服特别是粗斜纹棉布，在饰条和线缝中会出现颜色的深度或密度降低的多个局部区域。另外，常常出现衣服的普遍褪色、线缝起皱和织物饰条起折。近年来这种破旧的或“石洗的”外观，特别在粗斜纹棉布衣服上，对相当一部分公众来说很有吸引力。
以前用于产生故意磨损外观的方法包括在大桶中用颗粒大小约1到10英寸的浮石和用由加工过程的研磨性质所产生的更小的浮石来石洗一件或多件衣服。典型的情况下，衣服在湿时用浮石滚翻足够时间以使浮石磨损织物，在织物饰条中产生颜色较浅的局部磨损区域，以及在线缝产生类似的浅色区域。另外，浮石软化织物并产生与由于织物持续穿着和浆洗产生的相似的绒毛表面。
使用浮石有一些缺点，包括对机器发动机的超负荷损伤、对运输机械和清洗圆桶的机械损坏、产生的沙砾造成的环境废料问题和与人工将石头从衣服口袋去除相关的高劳动力成本。考虑到与浮石石洗相关的问题，用纤维素酶溶液代替浮石，在搅动和冲流条件下，即在滚桶洗涤机中，以给予粗斜纹棉布“石洗”外观(美国专利号4,832,864)。
已发现了源于嗜热、丝状、土壤细菌褐色高温单孢菌的纤维素酶体系并研究了此体系及其组分的生化特征(Wilson，生物工程评述Critical Reviews in Biotechnology,12卷，45-63页(1992))。褐色高温单孢菌体系一个特异性的内切葡聚糖酶组分E5已被测序(Lao等，细菌杂志(J.Bacter.),173卷，3397-3407页(1991))，并描述了其二硫键排列和功能结构域(McGinnis等，生物化学(Biochemistry),32卷，8157-8161页(1993))。McGinnis公开了用获自浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的蛋白酶处理E5，产生一个14kD的纤维素结合结构域和一个有催化活性的已失去纤维素结合能力的32kD片段。纯的有催化活性的浅青紫链霉菌蛋白酶处理的E5显示出的活性与完整的酶对CMC的活性相似。然而，当与获自褐色高温单孢菌的完整E3或者与获自Trichoderma reesei的完整E3和CBHI联用时，包含有催化活性的E5片段的混合物比包含完整E5而非此片段的类似混合物显示出效能降低(PCT公开文本96/00281)。
尽管大量研究涉及工业过程中纤维素酶的用途，本领域中已知和已使用的纤维素酶显示出明显的缺陷。例如，许多纤维素酶存在低活性、碱或酸稳定性差、温度稳定性差和氧化稳定性差等问题。令人惊奇的是，申请者发现E5纤维素酶拥有与之相符合的特性，因而使其尤其适用于特定的工业应用。
发明概述根据本发明，提供了一种处理纤维素类材料的方法，其包含用获自褐色高温单孢菌的相应于E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶接触纤维素类材料。在本发明的一个工艺实施方案中，纤维素类材料包含含纤维素的织物，并且该方法的结果是产生石洗效果或改善织物手感和/或外观。在本发明的另一工艺实施方案中，将含纤维素的织物与含去污剂组合物的水溶液相接触，该去污剂组合物含有获自褐色高温单孢菌的相应于E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶。在本发明的另一个工艺实施方案中，纤维素类材料包含木纸浆，纤维素酶的加入促进了以其生产纸产品。在本发明的另一个工艺实施方案中，纤维素类材料包含动物饲料，并且其方法增强了该动物饲料的可消化性或价值。在本发明另一实施方案中，纤维素类材料包含用于生产食物、淀粉、酒精或糖的谷物或谷物副产品。
在此申请者鉴定了获自褐色高温单孢菌的一种特异性的纤维素酶，在文献中已知为E5，此酶有大量令人惊奇的特性特别有益于纺织品加工(特别包括粗斜纹棉布石洗和生物上光)、清洁用产品和去污剂、纸浆和纸的生产、食物加工以及作为动物饲料的添加剂。特别是申请者已发现E5对不溶性底物有尤其广的pH/活性范围，在从约pH5.0到10.5的pH范围内有活性，在碱性区域活性降低极小。而且，E5在温和的pH和温度时具有显著的活性水平，在延长的时间期间和超过80℃的温度下保持稳定，基本上对许多缓冲液组分和强度不敏感，长时间的蛋白酶裂解后仍有活性，并且在有氧化剂例如过硼酸盐和过硼酸/TAED共同存在下以及在去污剂中保持稳定。在E5尤其令人惊奇的特性中，其中之一是与其对可溶性底物的活性相比，它对不溶性底物例如棉织物具有异常的高pH下的活性，而对可溶性底物的活性在超过其约6.0的最佳pH后显著降低。因而，E5特别适合于高pH的纺织品应用，例如同时进行的漂白和生物上光或在用于浆洗去污剂以及为高pH配制的前或后处理。另一令人惊奇的特性是褐色高温单孢菌在液体去污剂中保持几乎不受温育影响的能力。本发明另外一个新奇的特性是截短的E5也具有许多与E5一样的异常特点。例如，申请者发现截短的E5酶能表现出与E5几乎相同的表面纤维去除活性。
现有技术未提出E5或截短的E5在工业应用中重要的优点。通过参考下列详细说明以及附图，可以最好地理解此发明本身和进一步的目的以及具有的优点。
附图简述

图1阐明了E5在70℃对可溶性底物的pH曲线。
图2阐明了E5在从40℃到80℃对可溶性底物的活性。
图3阐明了E5在20℃,20ppm,pH8和10时的稳定性。
图4阐明了E5在37℃,20ppm,pH6、pH8和pH10的稳定性。
图5阐明了E5在50℃,20ppm,pH6、pH8和pH10的稳定性。
图6阐明了在有0ppm、90ppm、250ppm、500ppm和900ppm浓度的过硼酸盐存在下E5的稳定性。
图7阐明了E5在pH6、pH7.5、pH8.5和pH9.5时的表面纤维去除活性。
图8阐明了有蛋白酶存在下在50℃和pH7时E5的活性。
图9阐明了在38℃与商业途径可得的和经热处理的Cheer相比E5的pH反应。
图10阐明了在60℃与商业途径可得的和经热处理的Cheer相比E5的pH反应。
图11阐明了与获自T.longibrachiatum的代表性纤维素酶相比，E5在Wisk强效洗涤液中35天以上的稳定性。
发明详述“含棉织物”是指经缝纫或未经缝纫的由纯棉或棉混纺纱制成的织物、纱线或纤维，包括棉机织纤维、棉针织物、棉粗斜纹棉布、棉纱线、原棉及类似物。当采用棉混纺纱时，织物中棉的量优选至少约占棉重量的35％。当作为棉混纺纱使用时，织物中采用的伴随材料可包括一或多种包括纤维素类或合成纤维的非棉纤维，例如聚酰胺纤维(例如，6号尼龙和66号尼龙)、丙烯酸纤维(例如，聚丙烯腈纤维)，以及聚酯纤维(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇纤维(例如，维尼仑)、聚氯乙烯纤维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨基甲酸乙酯纤维、聚脲纤维和芳族聚酰胺纤维。
“含纤维素的织物”是指任何经缝纫或未经缝纫的由含棉或不含棉纤维素或者含棉或不合棉纤维素混纺纱制成的织物、纱线或纤维，包括天然纤维素类和人造纤维类(例如黄麻、亚麻、苧麻、人造丝和lyocell)。含人造纤维素的织物类中包括本领域众所周知的再生织物例如人造丝。其它含人造纤维素的织物包括化学改良的纤维素纤维(例如，纤维素的乙酸酯衍生物)和溶纺纤维素纤维(例如，lyocell)。在含纤维素的织物的定义中尤其包括任何由这样的材料制成的纱线或纤维。
“石洗组合物”是指用于石洗含纤维素的织物的制剂。石洗组合物被用于在递呈给消费者售卖前，即，在生产过程中改良含纤维素的织物。与之相反，去污剂组合物意在用于清洁弄脏的衣服。
“石洗”是指用纤维素酶溶液在搅动和冲流条件下，即在滚桶洗衣机中处理含纤维素的织物，以赋予粗斜纹棉布“石洗”外观。根据本发明，纤维素酶溶液将在功能上全部或部分地取代石头在这一领域认可的方法中的应用。美国专利号4,832,864中描述了赋予粗斜纹棉布石洗外观的方法，在此完整地引入作为参考。通常，石洗技术被应用于靛蓝染色的棉粗斜纹棉布。
“去污剂组合物”是指意在用于清洗弄脏的含纤维素的织物的清洗介质中使用的混合物。本发明的正文中，这样的组合物除纤维素酶和表面活性剂之外，可包括另加的水解酶、助洗剂、漂白剂、漂白激活剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、纤维素酶激活剂、抗氧化剂以及增溶剂。与石洗组合物相反，这样的组合物通常被用于清洁弄脏的衣服而不用于生产过程中。在例如，Clarkson等，美国专利号5,290,474和欧洲公开号271004中描述了含有纤维素酶的去污剂组合物，在此引入作为参考。
“衍生物”是指通过在C-末端和N-末端中的一端或两端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点替换一个或多个氨基酸、在蛋白质的一端或两端或在氨基酸序列中的一个或多个位点删除一个或多个氨基酸、或者在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而从前体蛋白质(例如，天然蛋白质)衍生得到的蛋白质。优选通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将此DNA序列转化进合适的宿主，以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的酶来完成酶衍生物的制备。本发明的衍生物包括含有与前体酶氨基酸序列(例如，野生型或天然状态的酶)相比改变了的氨基酸序列的肽类，此肽保留前体酶的特征性酶特性，但在一些特定方面具有改变的特性。例如，改变了的E5或改变了的截短的E5可具有升高的最佳pH或增强的温度或氧化稳定性，但会保留其特征性的纤维素分解活性。相似地，依据本发明的衍生物包括一个纤维素结合结构域，它或者已被全部去除，或者以这样的方式被修饰以严重损伤其纤维素结合能力。经考虑后认为，根据本发明的衍生物可源于编码E5或截短的E5之DNA片段(如下所述)，其中表达的E5衍生物或截短的E5之功能活性被保留。例如，编码截短的E5之DNA片段还可包括编码附着于截短的E5DNA序列5’或3’端的铰链或连接头的DNA序列或其一部分，其中编码截短的E5结构域的功能活性被保留。衍生物还包括通过化学修饰以改变酶的特性。
术语“截短的E5”指含有保留了纤维素分解活性的完整E5酶之衍生物(通常是缩短的)的蛋白质。完整形式的E5被认为包含了催化核心和结合结构域。催化核心和纤维素结合结构域可以协同方式一起发挥作用以影响功效，并且时常有害地水解含纤维素的织物中的纤维素纤维，从而常常导致不期望的强度丧失。无功能结合结构域的截短的E5可包括其它不合可归于纤维素结合结构域的纤维素结合活性的实体。例如，特别考虑的是连接头或铰链的存在。相似地，也特别考虑到另一酶实体或非E5纤维素结合结构域共价结合到截短的E5上。当都在相似条件下进行分析并基于相似的蛋白量的给予剂量时，预期根据本发明的截短的E5或其衍生物将保留至少10％的E5所表现的活性。
截短的E5可用任何制备截短的酶的标准方法获得。特别有效的方法包括使用蛋白酶或化学裂解(例如，溴化氰)来裂解酶，或用基因工程方法直接在微生物宿主中表达截短的E5。McGinnis等(出处同前)建议浅青紫链霉菌蛋白酶在E5酶的N-端切下120个氨基酸，酶的剩余部分作为催化活性核心。因而，本发明的一个优选实施方案考虑使用不同于E5的截短的E5，不同之处在于此酶长度少于121个氨基酸的N端片段被删除掉，优选的不同于E5之处在于截短的E5包含由完整E5的121位残基的苏氨酸开始的序列。在本发明另一个优选实施方案中，截短的E5与E5的不同之处在于其1-120位氨基酸区域的氨基酸序列被改变以降低或消除纤维素结合活性。
根据本发明，提供了处理纤维素类材料的方法，其包含使纤维素类材料与获自褐色高温单孢菌的相应于E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶接触。在本发明的工艺实施方案中，纤维素类材料包含含纤维素的织物，并且此方法的结果是使织物产生石洗效果或改善其手感和/或外观。在本发明另一可选的工艺实施方案中，使含纤维素的织物与含去污剂组合物的水溶液相接触，此组合物含有获自褐色高温单孢菌的相应于E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶。在本发明另一工艺实施方案中，纤维素类材料包含木纸浆，并且纤维素酶的加入促进了以其生产纸产品。在本发明另一工艺实施方案中，纤维素类材料包含动物饲料，并且其方法引起该动物饲料可消化性或价值的增加。此处使用的E5指具有约45-47kD分子量(由氨基酸序列推导出来并经SDS胶证实)和约pH4.5-4.8的等电点(在IEF胶上测定)，并且是获自褐色高温单孢菌的纤维素酶。褐色高温单孢菌是嗜热的、丝状、在土壤中发现的放线菌，在腐败的有机物质例如腐烂的木头中很常见。在Lao等(出处同前)中描述了E5的序列。根据本发明的纤维素酶可由褐色高温单孢菌通过在文献中已描述的条件下进行培养而生产，从而产生可从中纯化E5的发酵培养基(见例如，Walker等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.),40卷，1019-1026页(1992))。或者，如例如McGinnis等(出处同前)中用已被进行了基因修饰以生产E5或截短的E5的微生物可产生E5。如此处采用的，纤维素酶意在包括E5、截短的E5或其衍生物。优选地，此截短的E5包含催化结构域且缺乏明显的纤维素结合活性。
一般说来，根据本发明的含纤维素酶的组合物可以通过建立于本发明的纤维素酶的已知特性和特点基础上的纯化技术而得到。特别是，在根据本发明的纤维素酶是培养的生物体产生的纤维素酶混合物的一部分的情况下，全部纤维素酶混合物(全纤维素酶)能通过在文献中公开的已被认可的分离技术纯化成基本上纯净的组分，包括在适当pH下的离子交换层析法、亲和层析法和体积排阻层析法。例如，在离子交换层析法中(通常为阴离子交换层析法)，通过用pH梯度或盐梯度或者pH及盐梯度洗脱来分离纤维素酶组分是可行的。纯化后，再混合所需组分以得到必需的量。或者，可用基因工程技术来调节产生的纤维素酶混合物，例如通过使用纤维素酶基因缺失的菌株，其中将编码根据本发明的纤维素酶的基因转化到其它纤维素酶缺失的宿主菌株并被表达。
根据本发明的纺织品的处理方法考虑用含纤维素酶的组合物进行纺织品加工或清洁。这样的处理方法包括但不限于石洗，修饰结构、修饰含纤维素的织物手感和/或外观，或其它在生产或清洁/重整合纤维素的织物的过程中使用的其它技术。另外，本发明正文中的处理方法考虑从纤维素织物或纤维中去除“不成熟”或“死亡”的棉，即比成熟棉更加无定形的不成熟棉。已知死亡棉能导致染色不均因而是不想要的。因而，本发明中构思的组合物包括意在清洗弄脏的、生产出来的含纤维素的织物所使用的纤维素酶组分。例如，纤维素酶可被使用于清洗衣服的去污剂组合物中。根据本发明的有用的去污剂组合物包括专用制剂，例如预洗、预浸和家用的色彩还原组合物。这样的处理组合物，如此处所描述，可以采用需要稀释的浓缩物的形式，或采用稀释溶液的形式，或采用能直接应用于含纤维素的织物的形式。在例如欧洲专利公开号220016和英国申请号1,368,599和2,095,275中描述了用于纺织品之纤维素酶处理的本领域中已知的常用处理技术。
为本领域中已知的目的，根据本发明的纤维素类材料的处理还考虑到动物饲料、纸浆和/或纸、食物和谷物的处理。例如，已知纤维素酶增加动物饲料的价值、改善木纸浆的沥水能力、强化食物以及在谷物湿磨加工或干磨加工过程中减少谷物中的纤维。
根据本发明的优选实施方案，上述的纤维素酶组合物可被用作石洗组合物。优选地，根据本发明的石洗包括制备含有效量的纤维素酶连同可选成分的水溶液，可选成分包括例如缓冲液、表面活性剂和擦洗剂。有效量的纤维素酶酶组合物具有满足其设想目的之纤维素酶浓度。因此根据本发明的石洗组合物中纤维素酶的“有效量”是指能提供所需的处理(例如石洗)的量。采用的纤维素酶的量也依赖于所采用设备、所采用的加工参数(纤维素酶处理液的温度、暴露于纤维素酶溶液的时间等)和纤维素酶的活性(例如，特定的溶液将需要较低的纤维素酶浓度，此处采用了较高活性纤维素酶组合物而不是较低活性的纤维素酶组合物)。其中将加入被石洗之织物的处理水溶液中的纤维素酶之确切浓度能被熟练技术人员很容易地依据以上因素以及所需结果确定。优选地，纤维素酶采用从1到5,000ppm总蛋白质的浓度，最优选从10到200ppm。
可以选择地，缓冲液被用于石洗组合物中，以使缓冲液的浓度足够维持溶液pH在所采用的纤维素酶能表现活性的范围内，而此pH则依赖于所采用的纤维素酶的性质。所采用的缓冲液的确切浓度依赖于技术人员能很容易考虑到的一些因素。例如，在一优选实施方案中，选择缓冲液和缓冲液的浓度以维持最终纤维素酶溶液的pH在最佳纤维素酶活性所要求的范围内。因为E5对不溶性底物有从约5.0直到约10.5的宽pH范围，所以依据纺织品加工者的特定需要，纤维素酶可被用于微酸、中性或碱性pH中而具最佳活性。在E5活性范围内pH下的合适缓冲液为本领域的技术人员周知。
除纤维素酶和缓冲液外，石洗组合物任选地含有表面活性剂。合适的表面活性剂包括任何与纤维素酶和织物相适合的表面活性剂，包括例如阴离子、非离子和两性表面活性剂。此处使用的合适的阴离子表面活性剂包括线性或有分支的烷基苯磺酸盐；含线性或分支烷基基团或链烯基基团的烷基或链烯基醚硫酸盐；烷基或链烯基硫酸盐；烯属磺酸盐；烷基磺酸盐等。对于阴离子来说合适的配对离子包括碱性金属离子例如钠和钾；碱土金属离子例如钙和镁；铵离子；以及含1到3个碳原子数为2或3的烷醇基团的链烷醇胺。两性表面活性剂包括季铵盐磺酸酯和甜菜碱型两性表面活性剂。这样的两性表面活性剂在同一分子中有正和负电荷基团。非离子表面活性剂通常包含聚氧乙烯醚，以及高级脂肪酸烷醇酰胺或其氧化烯加成化合物和脂肪酸甘油单酯。也能按照本领域的技术人员已知的方法采用表面活性剂的混合物。
在优选的实施方案中，可制备浓缩的石洗组合物以用于此处描述的各种方法。这样的浓缩物含有浓缩量的上述纤维素酶组合物、缓冲液和表面活性剂，优选在水溶液中。当如此配制时，石洗浓缩物可以很容易地用水稀释以快速并准确地制备根据本发明的石洗组合物，并且具有这些添加物所需的浓度。当配制水性浓缩物时，这些浓缩物能被稀释以达到如上指出的纤维素酶溶液中的组分所需的浓度。因此显而易见，这样的石洗浓缩物将使纤维素酶溶液易于配制，并且使此浓缩物易于运输到其所使用的地点。此石洗浓缩物可以采用本领域认可的任何形式，例如，液体、乳液、凝胶或糊剂。这样的形式为本领域的技术人员周知。
当采用固态石洗浓缩物时，纤维素酶组合物可为颗粒剂、粉末、团块或固体片。当使用颗粒剂时，颗粒剂优选地进行配制以含有纤维素酶保护剂。参见例如，美国系列号07/642,669(在1991年1月17日提交，代理卷号No.010055-073，题目为“含有酶和酶保护剂的颗粒剂以及含有此颗粒剂的去污剂组合物”)，该申请在此完整引入作为参考。类似地，颗粒剂可以如此进行配制以使其含有能降低颗粒剂在清洗介质中的溶解速率的物质。美国专利号5,254,283公开了这样的物质和颗粒剂，在此完整引入作为参考。
其它物质也能按需要与本发明的石洗组合物合用或放置于其中，包括石头、浮石、填料、溶剂、酶激活剂和抗再沉积剂。
通过混合处理组合物与石洗组合物，使含纤维素的织物与含有效量纤维素酶的石洗组合物接触，因而将纤维素酶带到织物周围。随后，搅动含纤维素酶的水溶液和织物。如果处理组合物是水溶液，则可直接将织物浸于溶液中。相似地，在石洗组合物是浓缩物的情况下，浓缩物在有含纤维素的织物的水中被稀释。当石洗组合物为固体形式时，例如预洗凝胶或固体棒，可通过直接将组合物应用于织物或清洗液中使织物接触石洗组合物。
在有效地允许酶发挥作用以赋予含纤维素的织物石洗外观的条件下将含纤维素的织物与石洗组合物一起温育。例如，在石洗过程中，可将pH、液体比率、温度和反应时间调整到使石洗组合物起作用的最佳条件。“有效条件”必须指允许纤维素酶与含纤维素的织物进行有效反应的pH、液体比率和温度。本发明的石洗组合物的有效反应条件基本上类似于众所周知的现有技术中的纤维素酶组合物的使用方法。因此，利用本领域范围内的技术可以将使用根据本发明的石洗组合物的条件扩大到最大限度。
石洗中此处采用的液体比率，即石洗组合物溶液的重量(即，清洗液)与织物重量的比率，通常是足够获得所需的粗斜纹棉布织物石洗效果的量，并且取决于所采用工艺。优选地，液体比率从约4∶1到约50∶1；更优选地从5∶1到约20∶1；最优选地从约10∶1到约15∶1。
用本石洗组合物进行石洗过程中的反应温度由两个竞争因素支配。第一，较高的温度通常相当于反应动力学增强，即更快的反应，与较低反应温度下所需的反应时间相比它容许较少的反应时间。因此，反应温度通常是至少约10℃和更高。第二，纤维素酶是当超过给定反应温度时则失去活性的蛋白质，此温度依赖于所用纤维素酶的性质。因而，如果容许反应温度太高，纤维素酶变性的结果导致丧失了纤维素分解活性。因为E5显示了出色的热稳定性，所以石洗温度可以相当高，即必要时可超过80℃。然而，本领域中的标准温度通常是35℃到65℃的范围内，这也适合本发明的纤维素酶。
反应时间依赖于进行石洗的特定条件。例如，pH、温度和纤维素酶的浓度都将影响最佳反应时间。通常，反应时间是从约5分钟到约5小时，优选从约10分钟到约3小时，更优选从约20分钟到约1小时。
根据本发明另一优选实施方案，上述纤维素酶组合物可被用于去污剂组合物中。根据本发明的去污剂组合物可用作预洗组合物、预浸组合物或用于常规清洗或漂洗循环中的清洁。优选地，本发明的去污剂组合物包含有效量的纤维素酶、表面活性剂以及任选地包括下述的其它成分。
本发明去污剂组合物中采用的纤维素酶的有效量，是足够赋予含纤维素的织物所需效果的量，所需效果已知由纤维素酶产生，例如为去球、软化、抗起球、去除表面纤维和清洁。优选地，去污剂组合物中采用的纤维素酶浓度为去污剂的约10ppm到约20,000ppm。
优选地选择去污剂中采用的纤维素酶的浓度，是使其在清洗介质中稀释时，纤维素酶浓度在约0.01到约1000ppm总蛋白质的范围内，优选从约0.02ppm到约500ppm，最优选从约0.5ppm到约250ppm总蛋白质。去污剂组合物中采用的纤维素酶的量将依赖于去污剂加入到水中以形成清洗液的稀释程度。
本发明的去污剂组合物可采用本领域认可的任何形式，例如，液态稀释剂，颗粒剂、乳液、凝胶或糊剂。这样的形式为熟练技术人员周知。采用固态去污剂组合物时，纤维素酶优选配制成颗粒剂。优选地，配制此颗粒剂以使其另外含有纤维素酶保护剂。参见，例如，美国序列号07/642,669(在1991年1月17日提交，代理卷号010055-073，题目为“含有酶和酶保护剂的颗粒剂以及含有此颗粒剂的去污剂组合物”)，在此完整引入该申请作为参考。同样地，颗粒剂可以如此进行配制以使其含有能降低颗粒剂在清洗介质中的溶解速率的物质。美国专利号5,254,283公开了这样的物质和颗粒剂，在此完整引入作为参考。
本发明的去污剂组合物采用了表面激活剂，即表面活性剂，包括用于去污剂组合物中的众所周知的阴离子、非离子和两性表面活性剂。
用于本发明的去污剂中的合适的阴离子表面活性剂包括线性或分支的烷基苯磺酸盐；含线性或分支烷基基团或链烯基基团的烷基或链烯基醚硫酸盐；烷基或链烯基硫酸盐；烯属磺酸盐；和烷基磺酸盐等。阴离子的合适的配对离子包括碱性金属离子例如钠和钾；碱土金属离子例如钙和镁；铵离子；以及含1到3个碳原子数为2或3的烷醇基团的链烷醇胺。两性表面活性剂包括季铵盐磺酸酯和甜菜碱型两性表面活性剂。这样的两性表面活性剂在同一分子中有正和负电荷基团。非离子表面活性剂通常包含聚氧乙烯醚，以及高级脂肪酸烷醇酰胺或其氧化烯加成化合物、脂肪酸甘油单酯等。在英国专利号2094826A中公开了本发明中适用的表面活性剂，此处引入公开内容作为参考。也可以采用这样的表面活性剂的混合物。表面活性剂或表面活性剂的混合物通常用于本发明的去污剂组合物中，其用量从占总去污剂组合物的约1个重量百分比到约95个重量百分比，优选从占总去污剂组合物的约5个重量百分比到约45个重量百分比。除纤维素酶组合物和表面活性剂之外，本发明的去污剂组合物可以任选地含有一种或多种下列组分除纤维素酶外的水解酶合适的水解酶包括作用于酯键的羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸单酯水解酶和磷酸二酯水解酶；作用于糖基化合物的葡萄糖苷水解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于酯键的硫酯水解酶；以及作用于肽键的α-氨酰肽水解酶、肽酰基氨基酸水解酶、酰基氨基酸水解酶、二肽水解酶和肽酰基肽水解酶。它们中优选的有羧酸酯水解酶、葡萄糖苷水解酶和肽酰基肽水解酶。合适的水解酶包括(1)属于肽酰基肽水解酶的蛋白酶例如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、肾素、胰蛋白酶、糜蛋白酶A、糜蛋白酶B、弹性蛋白酶、肠激酶、组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、凝血酶、纤维蛋白溶酶、肾素、枯草杆菌蛋白酶、曲霉菌肽酶A、胶原酶、梭菌肽酶B、激肽释放酶、胃泌素、组织蛋白酶D、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、糜蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉菌肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B以及氨肽酶；(2)葡萄糖苷水解酶(从此组中排除了作为必需成分的纤维素酶)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、转化酶、溶菌酶、果胶酶、壳多糖酶和葡聚糖酶。它们中优选的是α-淀粉酶和β-淀粉酶。它们在酸性至中性体系中能发挥作用，但是获自细菌的一种水解酶在碱性体系中显示了高活性；(3)羧酸酯水解酶包括羧酸酯酶、脂肪酶、果胶酯酶和叶绿素酶。它们中特别有效的是脂肪酶。
根据目的所要求的尽可能将除纤维素酶以外的水解酶引入去污剂组合物中。以纯化蛋白质而言，应当优选的引入量为0.001到5个重量百分比，更优选为0.02到3个重量百分比。此酶应当以由粗品酶单独制成的或其与去污剂组合物中的其它组分共同制成的颗粒的形式被使用。粗品酶颗粒以纯化酶占颗粒中0.001到50的重量百分比这样的量被使用。颗粒以0.002到20的重量百分比的量被使用，优选为0.1到10的重量百分比。和应用纤维素酶一样，这些颗粒可以如此进行配制以使其含有酶保护剂和溶解延缓剂物质。阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐该阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐包括饱和或不饱和脂肪酸盐、烷基或链烯基醚羧酸盐、磺基脂肪酸盐或酯、氨基酸型表面活性剂、磷酸酯表面活性剂、包括含3到4个烷基取代基和被最多1个苯基取代的烷基取代基的季铵盐。在英国专利号2094826A中公开了合适的阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐，在此引入其公开内容作为参考。组合物可含有从约1到约20的重量百分比的该阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐。助洗剂A．二价螯合剂此组合物可含有从约0到约50的重量百分比的一种或多种助洗剂组分，此组分选自下列化合物的碱性金属盐和烷醇胺盐磷酸、膦酸、膦酰羧酸盐、氨基酸盐、氨基多乙酸盐高分子电解质、非解离聚合物、二羧酸盐和硅铝酸盐。在英国专利申请号2094826A中公开了合适的二价螯合剂，在此引入其公开内容作为参考。B．碱性或无机电解质此组合物可含有从约1到约50重量百分比的，优选从约5到约30重量百分比的，基于一或多种碱性金属盐成分的下列碱性或无机电解质化合物硅酸盐、碳酸盐和硫酸盐以及有机碱，例如三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺和三异丙醇胺。抗再沉积剂此组合物可含有从约0.1到约5重量百分比的一或多种下列抗再沉淀剂化合物聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。
在它们之中，羧甲基纤维素和/或聚乙二醇与本发明的纤维素酶组合物合用可提供一种特别有用的去垢组合物。漂白剂本发明的纤维素酶与漂白剂例如单过硫酸钾、过碳酸钠、过硼酸钠、硫酸钠/过氧化氢加成化合物和氯化钠/过氧化氢加成化合物或/和光敏感漂白剂例如磺化酞菁染料的锌盐或铝盐一起使用，进一步提高去污效果。类似的，可使用如EP684304中描述的漂白剂和漂白催化剂。上蓝剂和荧光染料如果需要，可在组合物中引入各种上蓝剂和荧光染料。在英国专利申请号2094826A中公开了合适的上蓝剂和荧光染料，此处引入其公开内容作为参考。结块抑制剂可在粉末去污剂中引入下列结块抑制剂对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、乙酸盐、硫代琥珀酸盐、滑石粉、磨成微细粉末的二氧化硅、无定形二氧化硅、粘土、硅酸钙(例如Johns Manville公司的MicroCell)、碳酸钙和氧化镁。抑制纤维素酶活性因素的掩蔽剂本发明的纤维素酶组合物在一些有铜、锌、铬、汞、铅、镁或银离子或它们的化合物存在的情况下失活。多种金属络合剂和金属沉淀剂有效地抵抗这些抑制剂。它们包括，例如上面关于可选择性添加物项中列出的二价金属离子螯合剂以及硅酸镁和硫酸镁。
纤维二糖、葡萄糖和葡萄糖酸内酯有时起抑制剂作用。优选地尽可能避免这些糖类与纤维素酶共存。万一共存不可避免时，必须通过例如包被它们的方法来避免糖类与纤维素酶直接接触。
在一些情况下长链脂肪酸盐和阳离子表面活性剂起抑制剂作用。然而，如果通过一些方法例如制锭或包被来阻止它们的直接接触，那么这些物质与纤维素酶的共存是允许的。
如果需要，在本发明中可采用上述掩蔽剂和方法。纤维素酶激活剂激活剂依赖纤维素酶不同而不同。在有蛋白质、钴及其盐、镁及其盐以及钙及其盐、钾及其盐、钠及其盐或单糖例如甘露糖和木糖存在时，纤维素酶被激活并且它们的去污能力显著提高。抗氧化剂抗氧化剂包括，例如，叔丁基羟甲苯、4,4’-亚丁基双(6-叔丁基-3-甲基酚)、2,2’-亚丁基双(6-叔丁基-4-甲基酚)、单苯乙烯甲酚、二苯乙烯甲酚、单苯乙烯酚、二苯乙烯酚和1,1-双(4-羟苯基)环己烷。增溶剂增溶剂包括，例如，低级醇例如乙醇、苯磺酸盐、低级烷基苯磺酸盐例如对甲苯磺酸盐、二元醇例如丙二醇、乙酰苯基磺酸盐、乙酰胺、吡啶二羧酸酰胺、苯甲酸盐和尿素。
本发明的去污剂组合物能被使用于从酸到碱性pH的宽pH范围内。在一优选实施方案中，本发明的去污剂组合物能被使用于有从pH5以上到不超过约pH12的微酸、中性或碱性去污剂清洗介质中。
除上面的成分以外，如果需要，香料、缓冲液、防腐剂、染料等能和本发明的去污剂组合物共用。这些组分常规地采用本领域中在此以前使用的量。
当本发明中使用的去污剂基质为粉剂形式，它可以是通过任何已知的制备方法包括喷雾干燥法和制粒法来制备的。优选尤其通过喷雾干燥法、聚集法、干混合法或非塔路径法得到的去污剂基质。至于制备条件，通过喷雾干燥法得到的去污剂基质没有限制。通过喷雾干燥法得到的去污剂基质是通过将耐热成分例如表面活性剂和助洗剂的水浆喷进热空间而得到的中空颗粒。喷雾干燥后，可加入香料、酶、漂白剂、有机碱助洗剂。在基质制备后，各种成分也可与通过例如喷雾干燥制粒法或聚集法得到的高密度的颗粒状去污剂基质共同加入。
当去污剂基质为液体时，它可以是匀浆溶液或非匀浆分散剂。为了去除去污剂中纤维素酶对羧甲基纤维素的分解作用，期望羧甲基纤维素在引入组合物中之前被制成颗粒或被包被。
本发明的去污剂组合物在工业和家庭使用时可与含纤维素的织物，例如弄脏的织物在这些环境中常规采用的温度、反应时间和液体比率下共同温育。温育条件，即用根据本发明的去污剂组合物处理含纤维素的织物的有效条件，对本领域的技术人员很容易确定。因此，用该去污剂进行处理的合适的有效条件相当于使用类似的含已知纤维素酶的去污剂组合物时的那些条件。
根据本发明的去污剂还可在中间pH下于合适的溶液中制成预洗剂，其存在足够的活性以提供所需的改善效果如软化、去球、阻止起球、去除表面纤维或清洁。当去污剂组合物是作为液体、喷雾、凝胶或糊剂组合物的预浸(例如，预洗或预处理)组合物时，通常采用占预浸或预处理组合物总重量的从约0.0001到约1重量百分比之截短的纤维素酶。在这样的组合物中，可选择性地采用表面活性剂并且当其被采用时，通常以占预浸剂总重量的从约0.005到约20的重量百分比的浓度存在。组分的其它部分包括以其常规浓度用于预浸剂中的常规组分，即稀释剂、缓冲液、其它酶(蛋白酶)等。
考虑后认为，此处描述的含截短的纤维素酶的组合物能作为单独使用的适合于使褪色织物颜色复原的组合物用于家庭用途(参见，例如，美国专利号4,738,682，此处完整引入作为参考)以及用于斑点去除剂和用于去球和抗起球(阻止起球)。
根据本发明的纤维素酶可以特别有效地用于饲料添加剂和纸浆和纸的加工。例如，PCT公开号95/16360和芬兰授权专利号87372中分别描述了这些另外的工业应用。
为了进一步阐明本发明及其优点，给出以下具体实施例以阐明本发明，并且任何情况下其都不应当认为限制本发明的范围。
实施例实施例1E5的制备与纯化按照McGinnis等人，生物技术(Biotechnology)32卷，8157-8161页(1993)制备的克隆被用于在浅青紫链霉菌中表达E5，并且应当在适合于此质粒表达的条件下进行培养。然后按照Walker等人，生物技术，生物工程(Biotechnol.Bioeng)卷40,1019-1026页(1992)与Irwin等人，生物技术与生物工程(Biotechnology and.Bioengineering)，出处同前，卷42,1002-1013页(1993)中叙述的方法从所获发酵上清液中纯化E5酶。或者，E5糊状物可溶于缓慢旋转的pH7的MOPS中并制得保存的上清液(粗品E5)。对松散的粒状沉淀进行再次重新溶解和旋转，总回收率约为75％。上清液在冷室中搅拌的条件下用0.65M硫酸铵沉淀后进行离心(用SS-34转子14000转/分离心20分钟)。粒状沉淀重新溶解于含0.25M硫酸铵、5mM KP,pH6.0的缓冲液中。为消除泡敌(使过滤更容易进行)，溶液被加热到室温进行离心(用SS-34转子15000转/分离心30分钟)。从顶部除去白色膜，混合物用可拆卸型过滤装置在真空下通过0.45微米滤膜进行过滤。用0.25M硫酸铵、5mM KP,pH6来预平衡苯基琼脂糖凝胶柱。经过滤的E5上柱，然后用平衡缓冲液洗柱直到流出液吸收值降回低水平。然后用一倍体积0.125M硫酸铵、5mM KP,pH6来洗柱(观察到低吸收值)。用5mM KP,pH6洗脱E5，收集小级分。吸收值降低到背景后，再用水洗脱柱并收集级分。从可能感兴趣的各级分中取出少量样品于旋转柱中浓缩，水洗，浓缩3-4倍。而后用IEF凝胶分析这些级分，最纯的级分是接近于5mM KP洗脱末端和水洗脱开始的那些。无论用小柱(25ml)还是大柱(450ml)，从上述步骤获得的最纯的级分合并后产生的活性为总活性的30％。这些级分或者在银染IEF上只有一条带，或者还包括有两条小带。
活性水平的分析按如下进行以足够提供终溶液所需量的酶的浓度加入5到20μl合适的酶溶液。加入250μl RBB-CMC(RemazolBrilliant Blue R-羧甲基纤维素，可以从Mega Zyme,North Rocks，澳大利亚以商业途径获得)重量百分比为2的50mm,pH5.5的乙酸钠缓冲液。涡旋振荡且在40℃下温育30分钟。冰浴中冷却5-10分钟。加入1000μl含0.3M乙酸钠和0.02M乙酸锌的80％乙醇。涡旋并放置5-10分钟。离心并加上清液于比色杯中，在590nm测各杯中溶液的光密度。高水平的光密度相应于较高的酶活性。用BCA方法以BSA作为标准按照供应商指南(Pierce,BCA Protein Assay Reagent,Prod.No.23225)进行蛋白质测定。经测定粗品E5(再次溶解的糊状物)的比活性为约1.6单位/毫克蛋白质，纯化的E5的比活性约为11单位/毫克。实施例2蛋白酶处理E5以得到截短的E5按照实施例1溶解和纯化的完整的E5，被用几种蛋白酶处理以产生截短的E5。五种均具有不同催化方式的蛋白酶，Alcalase(可获自于Novo Nordisk，丹麦)，Purafect(可获自于Genencor International,Inc.)和三种不同的变体细菌蛋白酶(BA、B1和B2)，可用于产生一系列不同的切割样式。0.5或5mg/ml浓度的E5与2.5mg/ml的蛋白酶温育，温育在温度20、37和50℃,pH5(NaOAc缓冲液)、pH7(TES缓冲液)和pH9(甘氨酸缓冲液)中进行。加入终浓度为15gpg(克每加仑)的Ca2+，在时间为0、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时时取出等份样品迅速冷冻。按照实施例1所述用IEF凝胶分析蛋白酶处理的样品(考马斯亮蓝染色)并测对RBB-CMC的活性。
在所有这些温育步骤中，当用IEF分析时出现了两条等电点略高于E5的新带。用RBB-CMC覆盖其上证明至少其中之一总具有活性。Alcalase能在最短时间作用于E5产生条带，因而对E5具有最强的效果。例如，给定浓度为1∶5的E5∶Alcalase(按毫克蛋白/毫升计算)，在37℃和pH7和pH9的条件下，在30分钟后形成IEF凝胶上所有的三条带，8小时后最高等电点的条带占优势。其它蛋白酶攻击效果较弱。Purafect在pH5,37℃下对E5只有微弱的活性。在pH7和pH9时，至少需要温育2小时才能出现明显的高等电点的条带。BA和B1对E5表现的效果弱于Alcalase和Purafect的对E5的效果，至少需要温育4小时才能出现明显的高等电点的条带。BA酶解E5产生其它条带，但也可能进一步降解E5(条带变得很弱)。在37℃和pH9条件下用Purafect、B2和Alcalase按照1∶1的E5∶蛋白酶(按毫克蛋白/毫升计算)进行酶解。依然是Alcalase酶解E5最快，8小时后产生一条带；用Purafect和B2时，新的条带都在30小时后出现，说明这些蛋白酶酶解E5要慢于Alcalase。
E5对Purafect随时间的稳定性见图8。图8还显示出，在50℃,pH7条件下超过25小时后，E5还保留有对RBB-CMC的大部分原有活性。此外，其它处理E5混合物的每一种蛋白酶都保留有至少50％的活性。实施例3E5的温度稳定性、pH稳定性、保存稳定性和氧化稳定性E5的pH范围通过在70℃将粗品E5的各等份与RBB-CMC温育30分钟进行测定。从pH4-9用柠檬酸-磷酸缓冲液，pH9-11用甘氨酸缓冲液。通过测量620nm的吸收值测定活性，结果见图1。如图1所示，E5对RBB-CMC的最适pH约为6。
粗品E5的各等份在pH5.5 0.05M乙酸钠缓冲液中与RBB-CMC在40℃至80℃之间的不同温度下进行温育，然后通过测量590nm的吸收值测定活性，结果见图2。如图2所示，E5最适温度范围为70-75℃。
延长的时间区段后E5的pH稳定性通过在稀释浓度(20ppm)下，在20℃、37℃和50℃和在pH6(50mM MOPS缓冲液)、pH8(50mMMOPS缓冲液)和pH10(50mM甘氨酸缓冲液)时进行测定。经过九天的过程，取出等份样品并按照实施例1所述用RBB-CMC活性测定方法进行测定，结果见图3-5。如图3-5所示，在37℃和50℃及pH6时，九天后至少剩余60-70％的活性。pH8时，九天后没有任何一种温育物的活性损失超过20％，在pH10时，在20℃和37℃下活性无明显损失，而在50℃温育九天后活性损失50％。从图3-5的结果可以看出，E5在每一检测延长的时间区段条件下都很稳定。
E5的氧化稳定性通过将15ppm粗品E5与90至900ppm过硼酸盐在MOPS缓冲液(pH7)中40℃预温育进行测定。在30分钟的时间区段内取出等份的样品并按照实施例1用RBB-CMC检测活性。与任何一种温育物中的对照相比，都没有可检测到的活性损失(图6)。相对比，来源于Trichoderma longibrachiatum的EGⅢ在pH5.5及50℃下被约500ppm过硼酸盐+170ppm TAED完全失活。
过硼酸盐存在下E5的活性也可以用耐洗牢度试验仪通过表面纤维去除实验来测定。通过将粗品纤维素酶在60℃,pH9与棉样布接触一小时来进行此测定。结果表明用过硼酸盐可能会有少量的活性损失，但这不依赖于过硼酸盐的浓度。即使与900ppm的过硼酸盐温育也表现出很好的表面纤维去除效果。作为对照的没有酶的900ppm过硼酸盐表现了较弱的表面纤维去除效果。实施例4不同缓冲液对E5活性的效果在具有不同pH的不同缓冲液中将E5与RBB-CMC温育来测定每一种缓冲液对活性的效果。每一种缓冲液以20、100和200mM进行检测。在pH5时用柠檬酸盐、琥珀酸盐及乙酸钠；在pH7时用磷酸盐、MOPS及TES；在pH9时用硼酸盐及CHES。含有E5的缓冲液与RBB-CMC的溶液在40℃温育30分钟，然后按照实施例1所述分析纤维素酶的活性。在每一种缓冲液条件下活性都标准化到20mM缓冲液浓度。如下面表1所示，证明E5对所用的缓冲液或浓度相对不敏感。
表1pH5的活性缓冲液浓度，mM 乙酸钠柠檬酸盐琥珀酸盐20 100100 10010084 87 9510078 65 88pH7的活性缓冲液浓度，mM MOPS 磷酸钾 TES20 100100 100100127118 12020012983 117pH9的活性缓冲液浓度，mM 硼酸盐 CHES20 100100100100113200130129实施例5E5和蛋白酶处理过的E5的表面纤维去除作用在60℃用400ml pH6、pH7.5、pH8.5和pH9.5缓冲液中的100、300、500和1000RBB-CMC单位来检测E5。观察到一个剂量反应，在500或1000单位时都具有很好的表面纤维去除(SFR)活性。E5在一个至少从约pH6.0至pH9.5宽的范围内具有最佳活性。这些结果概述于图7。如图7所示，E5与不溶性底物的pH范围明显地不同于图1中所示的E5与RBB-CMC的pH范围。
用E5进行两组耐洗牢度试验，所有试验均在耐洗牢度试验仪中含350单位的纤维素酶。首先，在加入耐洗牢度试验仪之前E5先与蛋白酶预温育。所选的两种代表性蛋白酶为Purafect和Alcalase。对于预温育，将40mg蛋白酶(1000ppm，在耐洗牢度试验仪中稀释后为100ppm)在37℃及pH9(甘氨酸缓冲液)时与纤维素酶及15ppm的钙放置20小时，申请者已经按照足以将E5切成截短的E5蛋白建立了所用的条件。用不含蛋白酶进行预温育的E5制备一种对照，并且单独用缓冲液制备第二种对照(不加酶)。在60℃,pH9(甘氨酸缓冲液)下用预温育的混合物对棉样布进行1小时的耐洗牢度试验，然后用衣物干燥机干燥布料(jeans)，并让一组4名评估者评定等级。表面纤维去除的等级范围从1(表面绒毛最多)至5(表面绒毛最少)，结果见表2。如表2所示，与不含蛋白酶温育的E5相比，与两种蛋白酶的任一种预温育的E5样品未表现出明显的表面纤维去除活性的降低。
表2
在第二组耐洗牢度试验中，E5样品不进行预处理，但与1、10或50ppm的Purafect或Alcalase加入到耐洗牢度实验仪中。无蛋白酶的E5、无蛋白酶的EGⅡ(Trichoderma longibrachiatum)、缓冲液，以及单独的Alcalase或Purafect作为实验对照提供了可比较的结果，结果见表3。如表3所示，与无蛋白酶的E5相比，E5和蛋白酶处理的样布的评估定级仅表现出很少的表面纤维去除活性降低。
表3
如上所表明的，E5被蛋白酶酶解得到的截短的蛋白，其对RBB-CMC(见图8)和棉表面纤维都具有很好的活性。此结果在耐洗牢度试验仪实验中尤其明显，该实验表明即使在与样品进行的1小时温育中存在高水平的蛋白酶，E5依然有活性。实施例6用E5和截短的E5进行的粗斜纹棉布磨损实验用粗品E5在粗斜纹棉布上测试磨损情况以确定E5在石洗应用中的效果。石洗实验在Unimac中进行。将酶(与Alcalase温育得到的13500RBB-CMC单位的E5或截短的E5)加入到含有20mM MOPS、9.5gTriton X-100、pH7.0，以及八个预先脱浆的粗斜纹棉布牛仔裤裤腿的溶液中，温度为60℃。60分钟后取出4个牛仔裤样品在冷水中漂洗。30分钟后放回Unimac。此时，在70℃用50g去污剂进行洗后清洁。然后用衣物干燥机干燥牛仔布料并让一组评估者评定等级。等级范围是一组磨损程度从1(无磨损)到10(磨损非常多)的粗斜纹棉布样布。
表4
表5
从表4和表5可以看出，E5在经过60和90分钟后都具有出色的磨损效果。更令人惊奇的是，在此实验中，截短的E5的磨损效果没有降低。实施例7同时脱浆和漂白用12种大小经测定的牛仔布来证实E5在同时进行脱浆和漂白过程中的效果。这些牛仔布共同放置于含有最终缓冲液浓度为40mM的MOPS,pH7以及还含有10g Triton X-100的溶液中。在其中加入14000单位的粗品E5和5ml地衣芽孢杆菌产生的α-淀粉酶，65℃以36转/分旋转。30分钟后取出一半牛仔布样品用冷水漂洗，其余的继续作用直到60分钟，不进行洗后清洁。干燥后，牛仔布让一组评估者评定等级。等级范围是一组磨损程度从l(无磨损)到10(磨损非常多)的粗斜纹棉布样布。
表6
令人惊奇的是，磨损的程度和样式类似于用E5石洗之前先脱浆的牛仔布样品获得的结果(参见，如实施例6)。实施例8E5在去污剂中的效果E5对棉样布的表面纤维去除作用的评价在Terg-O-Tometer中进行，所用条件包括温度100°F或140℃，以125转/分的搅拌速度水中旋转2.5小时，150ppm的水硬度(CaCO3)。每个测试杯中加8个样布(4个针织物，4个机织物)。测试两种织物获自于Burling Mills北卡罗莱纳州的棉布双罗纹针织物，和获自于Testfabrics,Inc.新泽西州的400型机织棉布料。
所有测试均采用商业途径获得的购于当地超级市场的Cheer“free”液体衣服去污剂。95℃加热此液体去污剂30分钟以破坏纤维素酶的活性(HT Cheer)，然后按照5mg/l的浓度加入E5。同样的条件应用于作为对比实验的不加热处理的Cheer和加热处理的无E5的Cheer中。
让给出表面外观等级得分的一组评估者比较处理的样布和一组标准等级的样布。标准等级的样布范围从0=(表面绒毛及起球最多)到7=(无表面绒毛及起球)。结果经过平均显示于图9和10。实施例9E5在液体去污剂中的稳定性测试E5在液体去污剂中的稳定性。E5或获自于Trichodermalongibrachiatum的经分离的纤维素酶分别以1300mg/l和695mg/l的浓度在温度为38℃时与Wisk去污剂温育。在不同时间点取出样品，按照M.Lever，生物化学分析(Anal.Biochem)，卷47,273-279页(1979)所述用PAHBAH方法测定残留纤维素酶活性(测定条件包括12mg/mlCMC底物，12mM MOPS缓冲液，40℃温育30分钟)。
结果见图11。如图11所示，温育35天后E5的残留活性基本未变，而在少于15天内获自于T.longibrachiatum的纤维素酶的残留活性降到接近于零。
当然可以理解的是，上述优选实施方案能进行范围很广的改变和修饰。因而试图将上述详细描述在后面的权利说明书的内容中能被理解，包括用于限定本发明范围的各条款。
权利要求
1．一种处理纤维素类材料的方法，其包含用获自褐色高温单孢菌的相应于E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶接触该材料。
2．根据权利要求1的方法，其中该截短的E5通过蛋白酶解切割获得。
3．根据权利要求1的方法，其中该截短的E5通过基因工程技术获得。
4．根据权利要求1的方法，其中该纤维素类材料包括含纤维素的织物。
5．根据权利要求4的方法，其中该含纤维素的织物经过处理以发挥石洗的效果。
6．根据权利要求4的方法，其中该含纤维素的织物经过处理以改善该织物的外观和/或手感。
7．根据权利要求4的方法，其中该纤维素酶掺入到一种去污剂组合物中。
8．根据权利要求6的方法，其中该含纤维素的织物包含褪色的染色织物，并且所述改善包含通过恢复其上的颜色来改善该褪色的染色织物的外观。
9．根据权利要求6的方法，其中所述改善包含使该织物更柔软和光滑。
10．根据权利要求1的方法，其中该纤维素类材料包含木纸浆。
11．根据权利要求1的方法，其中该纤维素类材料包含动物饲料或谷物。
12．一种石洗组合物，其包含选自E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶。
13．根据权利要求12的组合物，其中还包含一种表面活性剂。
14．根据权利要求12的组合物，其中该组合物是一种浓缩物。
15．一种去污剂组合物，其包含选自E5、截短的E5或其衍生物的纤维素酶。
16．根据权利要求15的去污剂组合物，其中该纤维素酶以至少10ppm的浓度存在。
17．一种饲料添加剂，其包含E5、截短的E5或其衍生物。
18．根据权利要求12或15的组合物，其中该截短的E5与E5的不同之处在于，其具有E5氨基酸残基1-120中的任意片段的缺失。
19．根据权利要求15的去污剂组合物，其中该去污剂为液体。
全文摘要
公开了一种处理纤维素类材料的方法,其包括用获自褐色高温单孢菌的相应于E5或其衍生物的纤维素酶与纤维素类材料接触。尤其优选的方法包括棉织物的石洗和去污剂清洁,纸类产品的生产,作为动物饲料的添加剂以及用于食物、淀粉、酒精和糖的生产。
文档编号D06P5/02GK1237200SQ97199187
公开日1999年12月1日 申请日期1997年9月24日 优先权日1996年9月25日
发明者K·A·克拉克森, B·史万森, D·温尼茨基 申请人:金克克国际有限公司