通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法与流程

本发明涉及一种通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法。

背景技术

磺酰脲类除草剂的应用在现代化农业生产中发挥了极其重要的作用，但其农药残留问题也给生态环境和农产品质量安全造成诸多负面影响。农药在施药过程中，真正作用于作物上的仅占施用量的10%-30%，磺酰脲类除草剂水溶性极强，易进入土壤，造成水体污染，通过水循环抑制周边及大范围内水体中植物生长，降低水生生物繁殖率，破坏生态环境，并可以通过食物链富集传递对人体造成危害，影响人类健康。近年来的研究发现，磺酰脲类除草剂的抗药性杂草在草种、地域等方面呈继续扩大的趋势，且某些微生物的代谢过程或是中间代谢产物具有加速降解环境中残留的磺酰脲类除草剂的功效。因此，解除草剂在环境中的归趋及其生态毒理效应，寻找、挖掘高效广谱的微生物降解资源，对受污染的土壤进行微生物修复具有重要的经济、社会和生态意义。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供了一种通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，确定了适合复合菌系降解磺酰脲类除草剂的实验方法及材料，同时确定了最佳测定条件，其目的是通过探究复合菌系对磺酰脲类除草剂的降解效果和最佳条件，更加有效地减少磺酰脲类除草剂对环境的危害和影响。同时，通过高通量测序确定了复合菌系的组成和结构。

技术方案：

通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，包括以下步骤：

第一次活化：

在四个容器中分别加入无机盐培养基，灭菌；无菌环境下加入维生素溶液和钙镁溶液，

菌液分为四份，所述四个容器中每个容器中加入一份；恒温培养；

第二次活化：

将全部菌液倒入一个容器中，摇匀后再分为四等份分别加入到四个容器中，恒温摇床培养7d；

第三次活化：

重复以上培养步骤，得活化后的菌液；

所述活化过程中加入氯嘧磺隆；

所述菌液中包括贪嗜菌属、假黄单胞菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属、噬几丁质属、杆菌科、申氏杆菌、无色杆菌属、天然细菌、鞘脂单胞菌中的一种或多种；

将除草剂放入培养基中，混匀，维持除草剂浓度50mg/l，然后按10%的接种量接种复合微生物菌液，恒温摇床培养7d，控制转速为130r/min，ph=7；得经富集驯化后适应一定浓度氯嘧磺隆除草剂的复合微生物菌剂。

所述通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，优选地：容器为四个250ml的三角瓶，瓶内加入90ml无机盐培养基。所述培养基中加入维生素溶液1μl，钙镁溶液1μl。

所述通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，优选地：将100ml的菌液等分为四份，每一个锥形瓶中放入一份，恒温培养7d。

所述通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，优选地：所述第二次活化中将全部菌液倒入一个500ml的三角瓶中，摇匀后再分为四等份分别加入到四个250ml的三角瓶中，恒温摇床培养7d。

所述通过复合菌系降解磺酰脲类除草剂的方法，优选地：对于100ml的菌液，加入氯嘧磺隆0.005g。

优点及效果：

通过菌系间协同作用提高了对除草剂的降解效率，丰富了磺酰脲类除草剂降解资源的多样性；确定除草剂原位生物修复机制；

测定影响因子ph值及外界温度对降解率的影响，得出磺酰脲类除草剂控制用量及解决办法，防治对后茬作物产生药害，对土壤的使用及民生具有重要意义。

附图说明：

图1左为复合菌种，右为降解苯磺隆后的菌液。

图中标注：

1.其他菌种或杂质；2.贪嗜菌属（variovorax）；3.假黄单胞菌属（pseudoxanthomonas）；4.产碱杆菌属（unclassified_f_alcaligenaceae）；5。不动杆菌属（acinetobacter）；6赫夫勒氏菌(hoeflea);7噬几丁质属（chitinophaga）;8杆菌科（unclassified_f_microbacteriaceae）;9申氏杆菌（shinella）;10无色杆菌属（achromobacter）;11天然细菌（elizabethkingia）;13鞘脂单胞菌（unclassified_o_sphingomonadales）.

具体实施方式：

取四个250ml的三角瓶，在其中加入90ml无机盐培养基，进行灭菌。在无菌实验室中，加入维生素溶液1μl，钙镁溶液1μl，将100ml的菌液等分为四份，每一个锥形瓶中放入一份，恒温培养7d；第二次活化，前面进行相同处理，再将全部菌液倒入一个500ml的三角瓶中，摇匀后再分为四等份分别加入到四个250ml的三角瓶中，恒温摇床培养7d；第三次进行同上培养，得到活化后的菌液。

本发明中用到的复合菌种是在降解氯嘧磺隆的过程中得到的，所以在驯化过程中需要加入氯嘧磺隆。取四个250ml的三角瓶，在其中加入90ml无机盐培养基，进行灭菌。然后称取氯嘧磺隆0.005g，在无菌实验室中，将除草剂放入培养基中，混匀，维持除草剂浓度50mg/l，然后按10%的接种量接种复合微生物菌液，恒温摇床培养7d，控制转速为130r/min，ph=7；由此得到经富集驯化后适应一定浓度氯嘧磺隆除草剂的复合微生物菌剂。

将转接培养后的第n代菌种及经降解苯磺隆后的培养基进行高通量测序，如图1所示：

图中左边的是第n代复合菌种，右边的是经降解苯磺隆后的菌液，其中菌种主要成分为：贪嗜菌属（variovorax）、假黄单胞菌属（pseudoxanthomonas）、产碱杆菌属（unclassified_f_alcaligenaceae）、不动杆菌属（acinetobacter）、噬几丁质属（chitinophaga）、杆菌科（unclassified_f_microbacteriaceae）、申氏杆菌（shinella）、无色杆菌属（achromobacter）、（aquamicrobium）、天然细菌（elizabethkingia）、鞘脂单胞菌（unclassified_o_sphingomonadales）、hoeflea等。结果表明复合菌种和经降解苯磺隆后的菌液中菌种组成基本无变化，而结构的变化是由除草剂的选择造成的，这可以说明本发明中复合菌种成分稳定，可以长期应用。

其次，测定复合菌系对磺酰脲类除草剂的降解效率：

设置实验组和对照组两组对比实验，向实验组里加入菌种，而对照组设置为空白，其他条件均相同，经过20天的降解培养后进行测定并计算降解率。由此判断哪些除草剂可以被复合菌系降解，并从12种除草剂中筛选出4种降解效果较好的农药除草剂作为后续实验研究对象。

实验方法：分别称量氯胺磺隆、氯嘧磺隆、氯唑磺隆、氯吡嘧磺隆、烟嘧磺隆、甲磺隆、甲酰胺磺隆、丙苯磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、三氯嘧磺隆、四唑嘧磺隆共12种农药各0.005g，每种8份，用硫酸纸包好标记名称备用。

（1）实验组：配制无机盐培养基，调节ph=7，准备48个250ml锥形瓶，每个锥形瓶分装90ml无机盐培养基，121℃，相对蒸汽压力0.103mpa条件下恒温灭菌20min。灭菌后转移至无菌室放置至室温，在无菌条件下操作，每瓶加入农药0.005g，用移液枪加入0.02ml（20μl）维生素溶液（5x）、0.1ml（100μl）钙镁溶液，摇匀后用移液枪每瓶加入菌液10ml，标记农药名称，放在20℃恒温摇床上，控制转速为130r/min，培养20天。共做四组，每组12瓶，12种农药，每瓶中的农药浓度为50mg/l。

（2）对照组：配制无机盐培养基，调节ph=7，准备24个250ml锥形瓶，每个锥形瓶分装100ml无机盐培养基，121℃，相对蒸汽压力0.103mpa条件下恒温灭菌20min。灭菌后转移至无菌室放置至室温，在无菌条件下操作，每瓶加入农药0.005g，用移液枪加入0.02ml（20μl）维生素溶液（5x）、0.1ml（100μl）钙镁溶液，摇匀，标记农药名称，放在20℃恒温摇床上，控制转速为130r/min，培养20天。共做两组，每组12瓶，12种农药，每瓶中的农药浓度为50mg/l。

（3）空白组（用来测初始浓度）：配制无机盐培养基，调节ph=7，准备24个250ml锥形瓶，每个锥形瓶分装100ml无机盐培养基，每瓶加入农药0.005g，用移液枪加入0.02ml（20μl）维生素溶液（5x）、0.1ml（100μl）钙镁溶液，摇匀，标记农药名称。

实验样品处理：每次取50ml培养液置于150ml分液漏斗中，分别用50ml、30ml、20ml二氯甲烷萃取三次，每一次剧烈震荡3-5min，静止1min，合并有机相，过无水硫酸钠柱除去水分，有机相（二氯甲烷）进行旋转蒸发，待蒸到近干时，然后用10ml乙腈溶解样品10min，过0.2μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

本实验中采用的高效液相色谱法检测：agilent1200高效液相色谱仪；柱温：室温；检测波长：241nm；流动相：乙腈：1%乙酸:水溶液=80:20（v/v）；流量：1.0ml/min；进样体积：20μl。

结果：

12种除草剂的降解率

通过测定其降解率筛选出降解效果好的4种除草剂：甲磺隆（97.3%）、甲酰胺磺隆（87.9%）、烟嘧磺隆（86%）、苄嘧磺隆（90%）。

最后，探究影响复合菌系对磺酰脲类除草剂降解效率的因素。其中影响因素包括：设置不同温度：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃；对复合菌系降解除草剂的影响;检验不同的ph值对降解过程的影响，其中设定的ph分别为5、6、7、8、9。以下将结合具体实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明的保护范围并不受下列实施例的限制。

实施例1：

在ph为7.0，温度分别设置为10℃、15℃、20℃、25℃和30℃，将对照组和实验组均放置在恒温摇床上，培养20天后测得其降解率。结果表明20℃是复合菌系降解除草剂的最佳温度，此时4种除草剂的降解率均可达到85%以上，温度在15℃时，降解率也能达到50%以上，而当温度超过20℃，降解率则发生下降，由此说明复合菌系适宜在较低温环境中生长。

实施例2：

设置反应温度为20℃，ph为5、6、7、8、9，将对照组和实验组均放置在恒温摇床上，培养20天后测得其降解率。结果表明ph=7时复合菌系降解除草剂的效果最佳，此时4种除草剂的降解率均可达到85%以上，而当偏酸或偏碱时，降解率在30%以下，原因是复合菌系成分复杂，ph稍有变化，某些菌种由于不适应环境导致失活死亡。

实施例3：

设置反应温度为20℃，ph为7.0，培养时间分别设为5天、10天、15天、20天和25天，将对照组和实验组均放置在恒温摇床上，培养20天后测得其降解率。结果表明降解率随着时间的增加而增加，其中当培养到20天时，降解率可以达到85%以上，培养到15天时，降解率也可以达到40%-50%，这说明当温度为20℃，ph为7.0，在复合菌系的作用下，4种除草剂的半衰期为15天。

结论：本发明利用复合菌系降解磺酰脲类除草剂，通过除草剂降解率的测定可知该发明可有效降解除草剂。重视了菌种间的协同作用，解决了传统方法中只利用单种菌种对微生物降解而利用不充分的问题。而且微生物修复具有安全性、有效性且价格低廉,该方法无毒、无残留且无二次污染。还可以通过总结规律来提高降解效率，采用生物强化来加速降解速率，为微生物创造温度适宜、水分充足的条件，从而促进水解反应及微生物降解。这对防治对后茬作物产生药害，对土壤的使用及民生具有重要意义。