一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法与应用。是以氯磺隆为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，二氯甲烷为溶剂，采用沉淀聚合法来合成具有高选择性吸附材料的氯磺隆分子印迹聚合物。本发明成本低廉，合成过程简单，反应条件容易控制，所制备的氯磺隆分子印迹结合物可用于固相萃取填料与高效液相色谱联用，可用于对烟叶样品的净化和痕量氯磺隆的含量检测。
【专利说明】
一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]氯磺隆是目前最常用的一种磺酰脲类除草剂。磺酰脲类除草剂自上世纪80年代被开发出来并投入使用之后，迅速成为当今世界上使用最广泛的除草剂之一。但在磺酰脲类除草剂的使用过程中，遇到了一些问题，其中最突出的就是一些该品种的除草剂对农作物的农药残留。据报道，农业部已将氯磺隆列为禁限用范围，而现今氯磺隆相关的农残检测以及其预处理方法的研究还十分有限，因此研究并探索出一种针对氯磺隆农残检测的简便快速的预处理方法，具有重要的意义。
[0003]分子印迹是一项具备特异识别功能的新兴技术，具有预定性、识别性和实用性三大优点，并且其理化性质稳定，耐强酸强碱，容易制备。因此，它在许多领域展现了良好的应用前景。特别是近几年来，分子印迹在农药痕量残留分析中也得到了广泛的研究和应用。
[0004]固相萃取(SPE)是利用固体吸附剂对液体样品中各组分进行选择性吸附而对样品实现富集，净化，分离的一项技术。鉴于分子印迹技术和固相萃取的优点，将两者结合应用，即为分子印迹固相萃取技术(MISPE)。将分子印迹技术应用于固相萃取中可有效地提高柱效与重现性，而分子印迹技术模板选择的多样性也使得分子印迹聚合物可广泛应用于物质的分离与分析过程。
【发明内容】
[0005]本发明的第一目的在于提供一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法;第二目的在于提供制备的氯磺隆分子印迹聚合物的应用。
[0006]本发明的第一目的是这样实现的，包括聚合反应、模板分子洗脱步骤，具体包括:
A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:4?1:8混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积200?800倍的二氯甲烷溶液中，于温度20?50°C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡3-5h，然后加入交联剂和引发剂，于温度20?50 °C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡卜3h，再充入氮气8?12min除氧，密封，以温度55?65 °C下聚合反应20?28h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率2?20Hz下震荡3?5min得到粒径0.5-2mi的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:5?20的丙酮沉淀2~3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱55?65h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱10?14h洗去乙酸，晾干，以温度45?55°C真空干燥20?28h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。
[0007]本发明的第二目的是这样实现的，将氯磺隆分子印迹聚合物作为MISPE柱的填料，用于检测痕量的氯磺隆除草剂。
[0008]本发明制备的氯磺隆分子印迹固相萃取小柱能特异性地吸附烟叶中的氯磺隆，附效果显著，简化对样品富集和净化步骤，提高预处理效率，同时提高了检测方法的灵敏度和准确性。氯磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法简单，成本低，并可重复使用。还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。
[0009]本发明的有益效果:
本发明合成的氯磺隆分子印迹聚合物，形态较好，如图2，不需要研磨和过筛。此外，模板分子也更容易洗干净。而且聚合物热稳定性良好，如图3。在洗脱过程中也较本体聚合法节省了 20%的溶剂，成本低廉，有利于环保。其模板分子的残留量几乎为0，避免了模板化合物残留在聚合物中影响吸附效果。
【附图说明】
[0010]图1为本发明洗脱前分子印迹聚合物、空白印迹聚合物和洗脱后分子印迹聚合物的红外光谱图；
图2为氯磺隆分子印迹聚合物的SEM图；
图3为氯磺隆分子印迹聚合物和非分子印迹聚合物的热重图；
图4为氯磺隆标准液相色谱图；
图5为空白烟叶液相色谱图；
图6为加标烟叶液相色谱图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0012]本发明所述的氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法，包括聚合反应、模板分子洗脱步骤，具体包括:
A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:4?1:8混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积200?800倍的二氯甲烷溶液中，于温度20?50°C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡3-5h，然后加入交联剂和引发剂，于温度20?50 °C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡I?3h，再充入氮气8?12min除氧，密封，以温度55?65 °C下聚合反应20?28h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率2?20Hz下震荡3~511^11得到粒径0.5?2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:5?20的丙酮沉淀2~3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱55?65h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱10?14h洗去乙酸，晾干，以温度45?55°C真空干燥20?28h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。
[0013]A步骤中所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，交联剂与氯磺隆的摩尔比为4:1?20:1。
[0014]A步骤中所述的引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂于氯磺隆的摩尔比为1:5?10:5。
[0015]B步骤洗脱模板分子的过程中，每5?7h更换一次洗脱液，洗脱温度控制在80?85°C。
[0016]本发明所述的制备的氯磺隆分子印迹聚合物的应用是将氯磺隆分子印迹聚合物作为MISPE柱的填料，用于检测痕量的氯磺隆除草剂。
[0017]所述的应用是将氯磺隆分子印迹聚合物作为MISPE柱的填料，用于烟叶中的氯磺隆的检测。
[0018]烟叶中的氯磺隆的检测包括MISPE柱的制备、氯磺隆除草剂标准物质储备液的制备、氯磺隆除草剂HPLC标准曲线的绘制、净化样品溶液制备、待分析样品的HPLC分析步骤，具体包括:
A、MISPE柱的制备:称取10mg氯磺隆分子印迹聚合物，装填到3ml空的固相萃取小柱中，得到氯磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE，该柱子使用前先用7.5ml的体积配比9:1的甲醇-乙酸溶液进行洗脱，以洗去未被洗脱干净的模板分子，然后再用5ml甲醇进行活化处理；
B、氯磺隆除草剂标准物质储备液的制备:称取1mg氯磺隆标准物质防御10ml容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，配制得到lOOyg/ml的氯磺隆标准物质储备液；
C、氯磺隆除草剂HPLC标准曲线的绘制:分别移取B步骤制备得到的氯磺隆标准物质储备液，用乙腈稀释并定容得到浓度分别为0.20,1.00,2.00,4.00,5.00,10.00和20.00yg/ml的氯磺隆标准物质的工作液，然后在下述条件下进行HPLC分析，色谱条件:美国AgiLentSB-Cl8柱(4.6mmXL50mm，5μπι，美国AgiLent公司)；柱温:30°C；进样量:1OyL;流速I.0mL/min;测定波长:230nm;参比波长:400nm;流动相A:乙腈/水=20/80，用乙酸调节pH为3;流动相B:乙腈/水=80/20 ；梯度洗脱:Omin(60%A，40%B)^15miη(60%A, 40%Β)；流动相在使用前用有机相0.45μπι滤膜进行过滤，每个标准物质浓度重复进样3次，以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度作图，得到所述标准物质的HPLC标准曲线，由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程；
D、净化样品溶液制备:把加标烟叶样品溶于二氯甲烷溶液中，充分混匀，离心，过滤，旋转蒸发至干，之后溶解在Iml乙腈溶液中用于分子印迹固相萃取柱的上样液，在上样之前，为了避免未洗脱的模板分子对后面吸附的影响，活化前先用7.5ml体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液进行洗脱，之后再用5ml甲醇溶液活化柱子，之后再淋洗，最后进行洗脱，收集每一步的过滤液，旋转蒸发至干，残留物用Iml乙腈溶解，得到净化样品溶液；
E、待分析样品的HPLC分析:将D步骤得到的净化样品溶液在步骤C的HPLC分析条件下进行分析，计算得到氯磺隆的含量。
[0019]本发明使用氯磺隆分子印迹聚合物分析磺酰脲类除草剂的方法具体操作如下:
A、MISPE柱的制备
称取10mg氯磺隆分子印迹聚合物，装填到3mL空的固相萃取小柱中，得到氯磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE;该柱子使用前先用7.5mL的甲醇:乙酸=9:1(ν/ν)进行洗脱，以洗去未被洗脱干净的模板分子，之后再用5mL甲醇进行活化处理。
[0020]分子印迹是一项具备特异识别功能的新兴技术，具有预定性、识别性和实用性三大优点，并且其理化性质稳定，耐强酸强碱，容易制备。因此，它在许多领域展现了良好的应用前景。特别是近几年来，分子印迹在农药痕量残留分析中也得到了广泛的研究和应用。
[0021]固相萃取(SPE)是利用固体吸附剂对液体样品中各组分进行选择性吸附而对样品实现富集，净化，分离的一项技术。鉴于分子印迹技术和固相萃取的优点，将两者结合应用，即为分子印迹固相萃取技术(MISPE)。将分子印迹技术应用于固相萃取中可有效地提高柱效与重现性，而分子印迹技术模板选择的多样性也使得分子印迹聚合物可广泛应用于物质的分离与分析过程。
[0022]所述氯磺隆分子印迹聚合物是采用下述制备方法得到的:
(i)聚合反应步骤:
在10mL硼硅酸玻璃瓶中，加入二氯甲烷溶液，氯磺隆和甲基丙烯酸混合液，恒温震荡4h，之后再加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，恒温震荡2h，通氮气lOmin，并在60 0C下聚合24h，得到絮状的高分子聚合物；
(ii)模板分子洗脱步骤:
用力摇动步骤(i)使用的聚合反应瓶，得到具有一定粒径的高分子聚合物，然后在通风橱中晾干，丙酮沉淀2-3次，晾干。再把聚合物装入到索氏提取装置中，用甲醇:乙酸=9: l(v/V)洗脱以上所述模板分子，洗脱60h，直到用紫外检测不到模板分子为止。之后再用甲醇洗脱12h，直到洗去多余的乙酸。晾干，在50 °C真空干燥箱下干燥24h;
同时，按照上述相同的方式制备空白印迹聚合物(NIP)，即除不加模板分子外，其他步骤均与上述印迹聚合物制备方法相同。
[0023]所述的氯磺隆分子印迹聚合物、空白印迹聚合物以及洗脱后的分子印迹聚合物进行了红外光谱分析，其分析条件如下:
红外光谱仪:BRMKER。
[0024]红外光谱测定条件:采用溴化钾压片法，扫描波数在4000-400011-1范围。
[0025]氯磺隆分子印迹聚合物、空白分子印迹聚合物以及洗脱后的分子印迹聚合物的红外光谱图列于附图1中。从MIP洗前，MIP洗后，以及空白NIP三种聚合物的红外光谱图中可以看出，在MIP洗前有四个明显的吸收峰是MIP洗后和空白NIP中所没有的。在3245cm—1处出现了一个-NH的伸缩振动，而在MIP洗后与NIP的红外光谱图中并未出现该特征吸收峰。同样的，在MIP洗前的红外光谱图中，在1566cm—1处出现了NIP与洗脱后MIP都未出现的仲酰胺-NH的弯曲振动。在1364 cm—1处，MIP洗前出现了磺酰胺-R-S02-NH2-的极强吸收峰，而在空白NIP与洗脱后的MIP并没有。在洗前MIP的759 cm_l处检测到了C-H的弯曲振动，这同样是MIP洗后与NIP没有的。以上四个吸收峰都是模板分子氯磺隆的红外特征吸收峰，由此可以说明洗脱前的MIP中含有氯磺隆，而洗脱后的MIP与NIP中是没有氯磺隆的。故此，说明模板分子氯磺隆被成功地印迹在了MIP中，并且在洗脱过程中成功地将氯磺隆分子洗脱了下来。
[0026]在本发明中，所述的活化处理应该理解为一种湿润其聚合物并使该聚合物达到良好吸附效果的处理方法。
[0027]根据本发明，所述的磺酰脲类除草剂是氯磺隆。
[0028]根据本发明，在制备氯磺隆分子印迹聚合物的步骤(ii)中，洗脱模板分子的洗脱剂是甲醇:乙酸=9:1 (v/v)的混合溶剂。
[0029]根据本发明的另一种优选实施方案，在制备氯磺隆分子印迹聚合物的步骤(ii)中，在洗脱模板分子的过程中，每6h更换一次洗脱剂，洗脱温度控制在80-85°C。
[0030]根据本发明的另一种优选方案，在制备氯磺隆分子印迹聚合物的步骤(ii)中，洗脱的高分子聚合物在温度50°C下干燥24h。
[0031]根据本发明的另一种优选方案，在制备氯磺隆分子印迹聚合物的步骤(ii)中，所述的丙酮洗涤进行2-3次。
[0032]B、磺氯磺隆标准物质储备液的制备
称取1mg氯磺隆标准物质放于10mL容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，配置得到100yg/mL的标准物质储备液；
将制备的标准物质储备液放在4°C的冰箱里，可使用I个月左右。
[0033]本发明使用的氯磺隆标准物质纯度在99%以上。
[0034]C、氯磺隆除草剂HPLC标准曲线的绘制
分别移取一定量的在步骤B中制备的氯磺隆标准物质储备液于25mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得到其浓度分别为0.20,1.00,2.00,4.00,5.00,10.00,20.00yg/mL标准物质的工作液，然后在下述条件下进行HPLC分析。
[0035]本发明使用的HPLC仪是目前市场上销售的产品，AgiLent1100，配有二极管阵列检测器(DAD)。
[0036]色谱条件:美国AgiLentSB-C18柱(4.6mmXL50mm，5ym，美国AgLient公司)；柱温:30°C ;进样量:1yL;流速I.0mL/min;测定波长:230nm;参比波长:400nm;流动相A:乙腈/水=20/80(用乙酸调节pH为3);流动相B:乙腈/水=80/20;等度洗脱:0min(60%A，40%B)—15min(60%A,40%B)o
[0037]流动相在使用前用有机相0.45μπι滤膜进行过滤.每个标准物质浓度重复进样3次，以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度作图，得到所述标准物质的HPLC标准曲线，由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程。
[0038]按照上述方法得到如下线性方程:
标准物质线性方程相关系数R2
氯磺隆y=34.5345x+2.409030.99927
式中:
y是峰面积积分；
X是标准物质的浓度yg/mL。
[0039]相关系数R2表明，该分析方法满足其定量要求。
[0040]采用本HPLC方法对同一标准物质平行测定3次，其测定结果的相对标准偏差小于5%，说明本HPLC方法的精密度很好。
[0041 ] D、净化样品溶液配制
把加标烟叶样品溶于二氯甲烷溶液中，充分混匀，离心，过滤，旋转蒸发至干，之后溶解在ImL乙腈溶液中用于分子印迹固相萃取柱的上样液。在上样之前，为了避免未洗脱的模板分子对后面吸附的影响，活化前先用7.5mL甲醇:乙酸=9:1(ν/ν)进行洗脱，之后再用5mL甲醇溶液活化柱子，之后再淋洗，最后进行洗脱，收集每一步的过滤液，旋转蒸发至干，其残留物用ImL乙腈溶液溶解，得到一种净化样品溶液；
在本发明中，活化前要先用甲醇:乙酸=9: l(v/v)进行洗脱，以防止没洗干净的模板分子对后面的吸附量产生干扰。
[0042]淋洗是本技术领域里的一种常规操作。在本发明中，淋洗的目的在于去除杂质。本发明使用水:甲醇=8:1 (v/V)进行淋洗，流速约为0.5mL/min，淋洗液体积是2mL。
[0043]洗脱也是本技术领域里的一种常规操作。在本发明中，使用甲醇:乙酸=9:l(v/v)混合液进行洗脱，体积为5mL，洗脱速度不能太快，通常保持在0.2mL/min。
[0044]收集每一步的洗脱液，旋转蒸发至干，以除去有机溶剂，而待分析物残留在试管底部，其浓缩温度在40 °C左右。[0045 ] E、待分析样品的HPLC分析:
步骤D中得到的净化样品溶液在步骤C描述的条件下进行HPLC分析，根据步骤C得到的线性方程，由其液相色谱峰面积积分代入公式得到氯磺隆的含量。
[0046]本发明可用于测定烟叶中的痕量氯磺隆含量，具有不错的效果。
[0047]本发明制备的氯磺隆分子印迹固相萃取小柱能特异性地吸附烟叶中的氯磺隆，附效果显著，简化对样品富集和净化步骤，提高预处理效率，同时提高了检测方法的灵敏度和准确性。氯磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法简单，成本低，并可重复使用。还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。
[0048]本发明的有益效果:
本发明合成的氯磺隆分子印迹聚合物，形态较好，如图2，不需要研磨和过筛。此外，模板分子也更容易洗干净。而且聚合物热稳定性良好，如图3。在洗脱过程中也较本体聚合法节省了 20%的溶剂，成本低廉，有利于环保。其模板分子的残留量几乎为0，避免了模板化合物残留在聚合物中影响吸附效果。
[0049]下面以烟叶为例，本发明制备的氯磺隆分子印迹聚合物固相萃取小柱能特异性吸附烟叶中的痕量氯磺隆。
[0050]实施例1
A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:4混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积200倍的二氯甲烷溶液中，于温度20°C、振荡频率为2Hz下恒温震荡3h，然后加入交联剂和引发剂，于温度20°C、振荡频率为2Hz下恒温震荡lh，再充入氮气Smin除氧，密封，以温度55 °C下聚合反应20h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率2Hz下震荡3min得到粒径0.5-2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:5的丙酮沉淀2次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱55h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱1h洗去乙酸，晾干，以温度45°C真空干燥20h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。
[0051]—种氯磺隆非分子印迹聚合物的制备方法，包括聚合反应、模板分子洗脱步骤，具体包括:
A、聚合反应:将甲基丙烯酸溶于甲基丙烯酸总体积200倍的二氯甲烷溶液中，于温度20°C、振荡频率为2Hz下恒温震荡3h，然后加入交联剂和引发剂，于温度20°C、振荡频率为2Hz下恒温震荡lh，再充入氮气Smin除氧，密封，以温度55°C下聚合反应20h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率2Hz下震荡3min得到粒径0.5-2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:5的丙酮沉淀2次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱55h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱1h洗去乙酸，晾干，以温度45°C真空干燥20h得到非分子印迹聚合物。
[0052]实施例2
A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:8混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积800倍的二氯甲烷溶液中，于温度50°C、振荡频率为20Hz下恒温震荡5h，然后加入交联剂和引发剂，于温度50°C、振荡频率为20Hz下恒温震荡3h，再充入氮气12min除氧，密封，以温度65°C下聚合反应28h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率20Hz下震荡5min得到粒径0.5?2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:20的丙酮沉淀3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱65h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱14h洗去乙酸，晾干，以温度55°C真空干燥28h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。
[0053]一种氯磺隆非分子印迹聚合物的制备方法，包括聚合反应、模板分子洗脱步骤，具体包括:
A、聚合反应:将甲基丙烯酸溶于甲基丙烯酸总体积800倍的二氯甲烷溶液中，于温度50°C、振荡频率为20Hz下恒温震荡5h，然后加入交联剂和引发剂，于温度50°C、振荡频率为20Hz下恒温震荡3h，再充入氮气12min除氧，密封，以温度65 °C下聚合反应28h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率20Hz下震荡5min得到粒径0.5-2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:20的丙酮沉淀3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱65h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱14h洗去乙酸，晾干，以温度55°C真空干燥20h得到非分子印迹聚合物。
[0054]实施例3
A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:6混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积400倍的二氯甲烷溶液中，于温度30°C、振荡频率为1Hz下恒温震荡4h，然后加入交联剂和引发剂，于温度30°C、振荡频率为1Hz下恒温震荡2h，再充入氮气1min除氧，密封，以温度60°C下聚合反应25h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率1Hz下震荡4min得到粒径0.5?2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:10的丙酮沉淀3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱60h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱12h洗去乙酸，晾干，以温度50°C真空干燥25h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。
[0055]实施例4
A、聚合反应:将甲基丙烯酸溶于甲基丙烯酸总体积400倍的二氯甲烷溶液中，于温度30°C、振荡频率为1Hz下恒温震荡4h，然后加入交联剂和引发剂，于温度30°C、振荡频率为1Hz下恒温震荡2h，再充入氮气1min除氧，密封，以温度60 °C下聚合反应25h得到絮状高分子聚合物；
B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率1Hz下震荡4min得到粒径0.5-2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比1:10的丙酮沉淀3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱60h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱12h洗去乙酸，晾干，以温度50°C真空干燥25h得到非分子印迹聚合物。
[0056]实施例5
把烟叶样品提前烘干，过80目筛子。分别称取8个烟叶样品，每个2g，放入50mL离心管中。分别记为附，吧少3，财，11，12肩3，14。其中，附，11分别为非分子印迹和分子印迹聚合物空白样，N2，N3，N4和M2，M3，M4分别为相应三个平行样。向两个空白样各加入ImL乙腈溶液，后六个样品各加入lmL100yg/mL的氯磺隆乙腈溶液。将8个样品在涡旋振动机上震荡4min，静置14h。之后加入1mL 二氯甲烷震荡溶解lOmin，静置。随后在离心机里离心5min，过滤，该滤液用于固相萃取柱的上样。
[0057]以上上样液按照前面所述方法进行处理，所得结果如图4，图5，图6。
【主权项】
1.一种氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括聚合反应、模板分子洗脱步骤，具体包括: A、聚合反应:将氯磺隆和甲基丙烯酸按摩尔比1:4?1:8混合，然后溶于氯磺隆和甲基丙烯酸总体积200?800倍的二氯甲烷溶液中，于温度20?50°C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡3-5h，然后加入交联剂和引发剂，于温度20?50 °C、振荡频率为2?20Hz下恒温震荡I?3h，再充入氮气8?12min除氧，密封，以温度55?65 °C下聚合反应20?28h得到絮状高分子聚合物； B、模板分子洗脱:将絮状高分子聚合物以震荡频率2?20Hz下震荡3~5min得到粒径0.5?2μπι的高分子聚合物，然后置于通风橱中自然晾干，加入高分子聚合物固液体积比I: 5?20的丙酮沉淀2~3次，收集沉淀，在室温条件下自然干燥，然后将沉淀置入索氏提取装置中，用体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液洗脱55?65h直至检测不到模板分子，再用甲醇洗脱10?14h洗去乙酸，晾干，以温度45?55°C真空干燥20?28h得到目标物氯磺隆分子印迹聚合物。2.根据权利要求1所述的氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，交联剂与氯磺隆的摩尔比为4:1?20:1。3.根据权利要求1所述的氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于A步骤中所述的引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂于氯磺隆的摩尔比为1:5?10:5。4.根据权利要求1所述的氯磺隆分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于B步骤洗脱模板分子的过程中，每5?7h更换一次洗脱液，洗脱温度控制在80?85°C。5.—种权利要求1?4任一制备的氯磺隆分子印迹聚合物的应用，其特征在于将氯磺隆分子印迹聚合物作为MISPE柱的填料，用于检测痕量的氯磺隆除草剂。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将氯磺隆分子印迹聚合物作为MISPE柱的填料，用于烟叶中的氯磺隆的检测。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于烟叶中的氯磺隆的检测包括MISPE柱的制备、氯磺隆除草剂标准物质储备液的制备、氯磺隆除草剂HPLC标准曲线的绘制、净化样品溶液制备、待分析样品的HPLC分析步骤，具体包括: A、MISPE柱的制备:称取10mg氯磺隆分子印迹聚合物，装填到3ml空的固相萃取小柱中，得到氯磺隆分子印迹固相萃取柱MISPE，该柱子使用前先用7.5ml的体积配比9:1的甲醇-乙酸溶液进行洗脱，以洗去未被洗脱干净的模板分子，然后再用5ml甲醇进行活化处理； B、氯磺隆除草剂标准物质储备液的制备:称取1mg氯磺隆标准物质防御10ml容量瓶中，用乙腈充分溶解后并定容，配制得到lOOyg/ml的氯磺隆标准物质储备液； C、氯磺隆除草剂HPLC标准曲线的绘制:分别移取B步骤制备得到的氯磺隆标准物质储备液，用乙腈稀释并定容得到浓度分别为0.20,1.00,2.00,4.00,5.00,10.00和20.00yg/ml的氯磺隆标准物质的工作液，然后在下述条件下进行HPLC分析，色谱条件:美国AgiLentSB-Cl8柱(4.6mmXL50mm，5μπι，美国AgiLent公司)；柱温:30°C；进样量:1OyL;流速I.0mL/min;测定波长:230nm;参比波长:400nm;流动相A:乙腈/水=20/80，用乙酸调节pH为3;流动相B:乙腈/水=80/20 ；梯度洗脱:Omin(60%A，40%B)^15miη(60%A, 40%Β)；流动相在使用前用有机相0.45μπι滤膜进行过滤，每个标准物质浓度重复进样3次，以液相色谱峰面积积分对其相应标准物质浓度作图，得到所述标准物质的HPLC标准曲线，由其相应标准曲线线性部分得到其相应的线性方程； D、净化样品溶液制备:把加标烟叶样品溶于二氯甲烷溶液中，充分混匀，离心，过滤，旋转蒸发至干，之后溶解在Iml乙腈溶液中用于分子印迹固相萃取柱的上样液，在上样之前，为了避免未洗脱的模板分子对后面吸附的影响，活化前先用7.5ml体积配比为9:1的甲醇-乙酸溶液进行洗脱，之后再用5ml甲醇溶液活化柱子，之后再淋洗，最后进行洗脱，收集每一步的过滤液，旋转蒸发至干，残留物用Iml乙腈溶解，得到净化样品溶液； E、待分析样品的HPLC分析:将D步骤得到的净化样品溶液在步骤C的HPLC分析条件下进行分析，计算得到氯磺隆的含量。
【文档编号】G01N30/02GK106046239SQ201610608657
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】孔光辉, 顾丽莉, 师君丽, 郑亚丽, 张梦晓
【申请人】云南省烟草农业科学研究院