专利名称：显微线阵扫描器在测定活生物体的变化率上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及显微扫描器在生物学上的应用。确切地说，本发明涉及用显微扫描器来测定活生物体的变化率并最大限度地降低扫描过程对活生物体的光干扰的方法。
背景技术：
CCD阵列传感器是常用的电子元件。它有两种类型线性阵列和区域阵列。区域阵列传感器多被用在数字照相机中，而线性阵列传感器则被用在扫描机中。目前线性阵列传感器在生物应用上的研发远远落后于区域阵列传感器的应用水平。举例来说，Aperio公司(位于美国加州维斯塔市，美国专利7，457，446)，利用显微镜上的线阵传感器来为病理学家们制作临床与教学上用的虚拟显微图像。为了将线阵扫描数据组成一幅完整的虚拟显微图像，病理组织标本必须经受反复的来回的一行行的扫描。 每行之间必须重迭。扫描的结果必须经由计算机程序处理后才能形成一幅巨大的电子虚拟图像。不幸的是，Aperio公司的技术只能用于死的病理切片而不能用于活生物体。另外， Aperio公司的超大型图像依靠强大的计算机处理能力从而使计算机成为瓶颈。Palcic等人在美国专利4700248中提出一种大面积扫描的方法来寻找低密度生长状态下的活体细胞。Palcic等人没有领悟到的是，在大面积扫描过程中，扫描器的光源。 如高强度紫外光束，正在杀死他们的活体细胞。由此产生的结果是，自从1984年专利申请以来，他们所提出的方法一直不被接受。延时电影在生物科研领域是一种已知的有效方法。延时电影的制作是对培养器皿中的一个活体细胞在不同的时间点上进行反复的延时显微照相，然后将所有照片快速回放，从而了解这段时间里这个活体细胞的变化。延时电影在科学上是有意义的，但是它的应用只限于少数的豪华用户而不能成为大众日常工作中负担得起的工具。延时电影需要一整套昂贵的系统，包括高档全自动显微镜，显微平台培养装置，摄像装置，计算机及特殊的操控程序。为了拍摄一个细胞，这一整套系统就必须被占用很长的一段时间，使得其他使用者无法工作。再者，一个未解的统计学上的疑问是在延时电影中所用的单个细胞能代表整个细胞群体吗？
由于负担不起延时电影的费用，目前绝大多数细胞培养研究人员仍然是只能从已被固定的死细胞中去收集数据，活体细胞在培养过程中的宝贵信息被浪费了。科研中有两大类问题，定性问题和定量问题。对定性问题可以用是或不是来回答，而绝大多数科研问题是定量问题，其回答方式必须是精确的百分比或变化率。但是由于技术上的困难，目前绝大多数的科研定量问题没有办法用有效的定量工具来回答。
发明内容
本发明的目的是建立可行的生物学定量测试方法。经由综合学科知识的研发，使得本发明能做到在科学上意义重大，在实际中行得通，在价格上负担得起。本发明可使低挡手动显微镜具有测定活生物体的变化率的功能，从而将延时电影从豪华专品转化为日常工
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为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
用由计算机程序控制的显微自动扫描系统对培养器皿中活生物体中的一部分个体进行扫描取样的方法，由如下步骤组成
1.1.提供上述显微自动扫描系统并使之与上述培养器皿相匹配， 1. 2.预设上述计算机程序对上述培养器皿沿一系列XY坐标进行不重迭的单线扫描取样以求降低扫描对上述活生物体的光干扰，
1. 3.第一次执行上述预设的计算机程序并收集到上述一部分个体在第一时间的图像
A,
1. 4.等待一段时间让上述活生物体在培养中发生变化，
1.5.第二次执行上述预设的计算机程序并收集到上述一部分个体在第二时间的图像B。沿多组XY坐标在手动型显微镜下对培养器皿中的活生物体进行可快速回访的显微照象的方法，由如下步骤组成
2.1.提供一套机械系统，该机械系统包括
2. 1. 1. 一个锁栓装置可与上述手动型显微镜结合并绕过其原有的可动部件， 2. 1. 2. 一个移位装置确立上述多组XY坐标位置并使之可快速回访， 2. 1. 3. 一个报告装置与上述移位装置联动并显示出其移位的顺序， 2. 1. 4. 一个接口装置可与上述培养器皿匹配并提供上述显微照象的光通路， 2. 2.将上述机械系统与上述手动型显微镜相结合，使上述手动型显微镜具有对上述活生物体在两个时间点上沿上述多组XY坐标进行快速回访拍照的功能。在以上方法中，所述的移位装置做圆周运动。用具备图像传感器的显微装置来对培养器皿中的活生物体的一部分个体进行变化率测量的方法，由如下步骤组成
4. 1.提供一个一号装置对多组XY坐标进行可回访性定位， 4. 2.提供一个二号装置使上述显微装置与上述培养器皿相匹配， 4.3.通过计算机操控或人力驱动移位，对上述一部分个体在第一时间点沿着上述多组XY坐标依次拍摄出第一套图像，
4. 4.将上述活生物体培养一段适当的时间使其发生变化，
4.5.通过计算机操控或人力驱动移位，对上述一部分个体在第二时间点沿着上述多组XY坐标依次拍摄出第二套图像，
4. 6.计算变化率两套图像之间的净差异/时间长度=变化率。在以上方法中，一台全自动显微扫描仪器或者一台带有照相机的手动型倒置显微镜均可被用作为上述显微装置。在科研调查中，取样策略的关键是在数据可靠性与可行性之间取得适当的平衡。 Aperio公司的虚拟显微图像对整个群体进行全面扫描取样。这在临床诊断上是需要的，但作为科研调查来说则是典型的取样过量。其产生的问题往往大于收益。这也许就是为什么 Aperio公司的技术无法应用到活生物体上的原因。活生物体在体外培养中是非常脆弱的并对光线很敏感。扫描器所用的光源，如高强度的紫外光束，会对活体细胞产生光损伤及光毒性。因此，过量的曝光会导致活生物体的死亡。与取样过量相反，延时电影只对单一细胞拍摄，此为取样不足。用一个细胞来代表整个群体是不足以提供充分可信度的。本发明在理论上提出用“活体二次不重迭单线扫描取样法”从活生物群体的一部分个体中提取数据。二次扫描是指对活体细胞在两个不同的时间点上各进行一次拍摄，从而采集到两套图像数据。每个活体细胞在两次拍摄之间的生命变化被收集为数据，由此可以精确地计算出此活体细胞在单位时间的变化率。不重迭单线扫描是只对这些活体细胞中的一部分个体进行快速的扫描取样，从而最大限度的降低光束对活生物体的光干扰以确保活生物体作为样本的可行性。本发明认识到对培养器皿只需进行单线扫描就可以复盖足够的面积。举例来说，一个8毫米直径的圆型培养孔的培养面积为50. 24平方毫米。用一个4096象素的线阵扫描器按0. 23微米/ 象素的分辨率进行扫描时(相当于放大40倍的显微镜头)，其单线扫描宽度为0.94毫米。 所能扫描到的面积为7. 5平方毫米，占总培养面积的百分之14. 9。如果把分辨率降低为 0. 46微米/象素(相当于放大20倍的显微镜头)，则被扫描的面积更高达总培养面积的百分之29.80大多数生物细胞在体外培养中是均勻分布的。单线扫描所能达到的百分之14. 9 的面积覆盖比例代表着百分之14. 9的取样比例，这足以提供统计学上的充分可信度。另外，单线扫描不需要图像文件后处理及强大的计算机和程序。在自然界生命过程中，巨大的个体差异是不可避免的。绝大多数现行的研究手段都局限于在单一时间点对死的标本进行分析。这往往会导致不精确甚至错误的结论。为帮助理解，以下用甲乙两人赛跑的例子来加以说明。甲跑得慢但是起步早并已到半途中，然后乙才开始从后面快步追赶甲。现行的研究手段用单一时间点的方法会判定出甲比乙快，因为在这个单一时间点上看甲在乙前面。 本发明用二次时间点的比较方法判定出乙比甲快，因为乙在两个时间点之间移动的距离大于甲的移动距离。本发明之所以能提供高精度的正确测定，是因为只有二个时间点之间的变化被提取定量，而其他阶段积累的误差，比如起跑时间的早晚，统统都被加以排除了。为计算变化率，本发明对样品进行两次相同的扫描，其所得数据称为扫描A和扫描B。在两次扫描之间设有一段特定的时间长度，然后用公式计算(扫描B-扫描A)/时间=变化率。两次扫描的间隔时间长度应由具体的实验内容决定，例如30分钟间隔可用于蛋白质浓度变化的测定，而20小时的间隔可用于细胞生长率的测定。活体二次测定的方法可用于研究各种生命现象，例如细胞生长，细胞死亡，细胞迁移，或蛋白质的积累过程。本发明可与各种形式的硬件糸统相结合，如全自动显微扫描仪器或者带有照相机的手动型倒置显微镜。
图1是一个示意图展现单扫描线4通过多孔盘2的一种方式。活生物群体6中只有一部分个体被单扫描线4所取样。图2是一个转盘机械装置的正视图。此转盘机械装置可使低档的手动显微镜具备对活生物体变化率进行测定的功能。其详细设计在以下的实例方案二中加以论述。图3是上述转盘机械装置的局部放大图，显示其定位装置的结构。图4是上述转盘机械装置的侧面局部放大图，显示其旋转轮结构。图5是侧面安装示意图，显示卡栓530使上述转盘机械装置与显微镜平台座板结
I=I O图6是一个拍摄轨迹示意图。通过上述转盘机械装置的圆周移动可从培养器皿中采集到系列图像630。系列图像630有序地分布于拍摄轨迹620上。
具体实施例方式实施方案一用全自动显微扫描器测定活生物体的变化率。计算机程控显微线性扫描是一套昂贵的系统。由特殊的计算机软件控制其XYZ的微米级的精密三维移动以及迅时自动聚焦。用于96孔盘的显微平台培养装置可由许多供应商提供，例如美国的Warner仪器公司。基于上述装置，本发明可对活生物体中的一部分个体实施二次单线扫描取样，其步骤如下
1.选择适宜的分辨率并预设上述计算机程序对一个96孔盘沿一系列XY座标进行不重迭单线扫描取样以求降低扫描对上述活生物体的光干扰。2.将96孔培养盘定位于平台培养装置中。3.第一次执行上述预设的计算机程序从而取得一部分个体在笫一时间的图像，命名为A图。4.对各个培养孔加入不同浓度的待测药物，从零到高浓度。5.将96孔培养盘置于适宜的培养条件下一段时间让活生物体发生相应的生命变化。如有需要可将96孔培养盘撤出扫描系统放回培养箱。6.第二次执行预设的计算机程序从而取得上述一部分个体在笫二时间的图像，命名为B图。B图所经过的XY坐标序列与A图所经过的系列是完全吻合的。也就是说，A图与B图所显示的是同一组个体。7.比较B图与A图的差异再除以时间即可得出单位时间的变化率。8.比较各个培养孔之间不同药物浓度的的差异从而计算出待测药物的功效。
实施方案二 用手动方式测定活生物体的变化率
经数十年间的长期积累，在世界范围内已有成千上万台手动型倒置显微镜投入使用。 就日常观察的用途来说，这类低档的手动型显微镜比电机驱动型更受欢迎。它们的引人之处在于其快速自由的手动调节，但问题在于他们不能纪录下平台所经厉过的XY坐标。从而无法对同一组目标群依顺序进行二次拍摄。不幸的是，低档手动型工作的习惯性导致了创新力的丧失。事实上，日常的细胞观察过程是收集活体细胞数据的宝贵机会。本发明运用来自于仪器工程和机械工程的综合知识，创造出一种简单的旋转机械系统可与低挡手动型倒置显微系统相结合，从而使其具有用手就能快速方便地对活生物体进行反复拍摄的功能。图2从正面显示出这种旋转机械系统。定盘10经由三个滑轮50来卡住转盘20。转盘20是一个移位装置。在转盘20中的卡环30是用于卡住细胞培养器皿的接口装置。卡环30的中央空洞40提供显微镜头的光学通路用于观察培养器皿中的活体细胞。标记线70显示的是转盘20的起始位置。转盘20可用手指按逆时针方向平滑地从起始位置移到下一个位置。每一个位置都有其不同的XY坐标报告装置，这些不同的XY坐标序列由定位装置与显示报告装置之间的联动加以控制和显示，如弹簧80和标记90。图3显示的是转盘20的定位结构，沿着转盘20的边缘上开有很多缺口 310.用金属片制成的弹簧80以适当的力度与缺口 310进行咬合，经由转盘20的旋转移位使拍摄点被锁定于一系列不同的XY坐标位置上。这些不同的坐标系列可以轻而易举地重复找回而不需做任何额外的调节。弹簧80咬合缺口 310时会发出声响来告诉操作人员在这一位置上进行一次拍摄，下一次声响时做下一次拍摄。以这种操作方式进行，40张图像的拍摄可以在类似于日常细胞观察的短暂时间里快速完成。图4从侧剖面显示如何支撑转盘20，三个滑轮430经由钢针410被装置于定盘10 上。其中一个滑轮的位置是可调节的，以此保证滑轮430与转盘20之间有精确的吻合。图5以侧面图示范如何将此转盘机械系统的定盘10与一个手动式倒置显微镜的平台相结合。经典的平台有三层不动的底座Mo，做横向X移动的中层510，以及做纵向Y 移动的顶层520。将转盘机械系统平放在顶层520上面后，一对锁栓530可以插进并定位于不动的底座MO的孔中，从而避开平台原有的两个动层。为方便这台倒置显微镜的多用途性，转盘机械系统在平台上的安装和拆除应简单易行同时又确保位置的精确。定位精确度是回访原先经历过的一系列XY坐标的关键要素。本实施方案的设计可以增加定位精确度而不需付出高精度机械加工的天价。举例来说，如果在弹簧80与缺口 310之间的各次咬合过程有2微米误差的话，那么在前后两次不同时间的拍摄中细胞图像的位移可被缩小到0. 17微米，即增强了 12倍的精度。这种定位精确度的增强效应是由转盘结构的直径比来实现的。转盘20的直径为180毫米，而成像轨迹620的直径为15毫米， 如图6所示。两个直径之比变小了 12倍，从而可缩小12倍的位移。来看看如此的精度是否足够，当用20倍的显微镜头来拍摄时，所得图像的宽度大约为1300微米。上述误差为 0. 17微米，占图像的百分之0. 013。也就是说，前后两次拍摄中图像的位移仅为0. 013%，定位精度为99. 997%。用上述转盘机械系统对活生物体中的一部分个体的变化率进行手动测定，其步骤如下
1.将转盘机械系统安装于倒置显微镜平台座板上从而绕开其原有的可动部件。2.将转盘机械系统调到起始位点并准备好显微镜和照相设备。3.将培养器皿放进卡环30内，调整焦距，拍摄出序列图像630中的第一张，如图 6所示。4.用人力沿逆时针方向将转盘20移位到下一格并拍摄出序列图像630中的第二张。5.重复上述过程直到完成所需图像的数量。在此过程中如有需要可微调图像聚
焦ο6.将待测药物加入培养器皿并让活生物体有一段适当的时间去发生生命变化。7.在第二时间点重复上述1-5步骤，对上述一部分个体进行第二次拍照。8.计算出两次拍摄的图像数据中的净差异并除以时间即为该部分个体的变化率。
9.比较加药组与对照组的差异可知待测药物的功效。此实施方案中的转盘机械系统可由金属板加工加成以确保坚固性与移位的精密度。图像轨迹620的直径，如图6所示，是由转盘机械系统在显微镜平台上的安装位置所决定并可加以选择，如20毫米，15毫米，或10毫米。采用10毫米的小轨迹具有降低拍摄过程中的焦距漂移的优越性。尽管以上描述中含有具体的参数，但很明显地，具备业内技能的人士可以在本发明的精髓范围内进行修饰和变通。举例如下，单线扫描可以改成双线扫描，转盘20可以用于全自动扫描器，滑轮430可以用滚珠代替，弹簧80可以被其他类型的卡位结构代替，旋转移位方式可以改为直线移位方式，步进电机可取代人力用来驱动转盘20，两次拍摄之间可以不加入待测药物。因此，以上描述仅仅只是对本发明的解释而不是对本发明的限制。
权利要求
1.用由计算机程序控制的显微自动扫描系统对培养器皿中活生物体中的一部分个体进行扫描取样的方法，由如下步骤组成1.1.提供上述显微自动扫描系统并使之与上述培养器皿相匹配， 1. 2.预设上述计算机程序对上述培养器皿沿一系列XY坐标进行不重迭的单线扫描取样以求降低扫描对上述活生物体的光干扰，1. 3.第一次执行上述预设的计算机程序并收集到上述一部分个体在第一时间的图像A,1. 4.等待一段时间让上述活生物体在培养中发生变化，1.5.第二次执行上述预设的计算机程序并收集到上述一部分个体在第二时间的图像B0
2.沿多组XY坐标在手动型显微镜下对培养器皿中的活生物体进行可快速回访的显微照象的方法，由如下步骤组成2. 1.提供一套机械系统，该机械系统包括2. 1. 1. 一个锁栓装置可与上述手动型显微镜结合并绕过其原有的可动部件， 2. 1. 2. 一个移位装置确立上述多组XY坐标位置并使之可快速回访， 2. 1. 3. 一个报告装置与上述移位装置联动并显示出其移位的顺序， 2. 1. 4. 一个接口装置可与上述培养器皿匹配并提供上述显微照象的光通路，2.2.将上述机械系统与上述手动型显微镜相结合，使上述手动型显微镜具有对上述活生物体在两个时间点上沿上述多组XY坐标进行快速回访拍照的功能。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的移位装置做圆周运动。
4.用具备图像传感器的显微装置来对培养器皿中的活生物体的一部分个体进行变化率测量的方法，由如下步骤组成4. 1.提供一个一号装置对多组XY坐标进行可回访性定位， 4. 2.提供一个二号装置使上述显微装置与上述培养器皿相匹配， 4.3.通过计算机操控或人力驱动移位，对上述一部分个体在第一时间点沿着上述多组XY坐标依次拍摄出第一套图像，4. 4.将上述活生物体培养一段适当的时间使其发生变化，4.5.通过计算机操控或人力驱动移位，对上述一部分个体在第二时间点沿着上述多组XY坐标依次拍摄出第二套图像，4.6.计算变化率两套图像之间的净差异/时间长度=变化率。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于一台全自动显微扫描仪器或者一台带有照相机的手动型倒置显微镜均可被用作为上述显微装置。
全文摘要
本发明名称为显微线阵扫描器在测定活生物体的变化率上的应用,与显微扫描照象在生物学研究中的取样及定量方法有关。由于技术上和购买力的困难，目前绝大多数的生物科学研究中的定量性问题无法用有效的取样及定量工具来解答。广大的研究人员仍从被固定的死细胞中去收集数据，活体细胞在培养及日常观察过程中的宝贵信息被浪费了。本发明创造出用CCD线阵扫描器对活生物体中的一部分个体进行最低量光干扰的不重迭单线扫描取样方法。本发明进一步创造出一套手动式简单转盘机械系统，可使低档手动型倒置显微镜具备对活生物体的变化率进行定量测试的功能。
文档编号G02B21/36GK102156131SQ20111003494
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者斯蒂芬·立业·陈 申请人:斯蒂芬·立业·陈