光扫描系统的制造方法与工艺

光扫描系统相关申请的交叉引用该申请要求2011年1月20日提交的临时申请号61/434,557的权益。技术领域本公开涉及荧光显微术，并且特别地涉及可以在显微术仪器中使用以照亮并且扫描样本的焦平面的扫描系统。

背景技术：
激光扫描共聚焦显微术已经成为光学显微术中的重大进步，主要因为该技术使活的并且固定的细胞和组织内的深部可视化成为可能，并且给予收集清晰可辨的光学片段（可以由此创建样本的三维渲染）的能力。共聚焦显微术提供若干超过常规宽视野光学显微术的优势，包括对景深的控制、远离焦平面的背景信息的排除或减少以及从厚样本收集系列光学片段的能力。共聚焦成像典型地依赖来自空间过滤个体样本点的光的顺序收集，接着电子信号处理并且最终视觉显示为对应的图像点。典型的共聚焦显微镜使用激发光的聚焦束或线来照亮样本内的点或线。跨样本焦平面扫描聚焦激发束可以通过相对于聚焦激发束的固定位置机械平移显微镜台而完成。然而，机械平移该台是耗时的过程。备选地，可以通过将该束从可旋转反射镜反射而跨焦平面扫描激发束。然而，旋转反射镜形成枢转轴线，其常常导致激发束的一部分被位于物镜后方的板裁剪，由此减少到达焦平面的激发束的辐照度。工程师和显微镜设计师已经尝试通过设计各种基于透镜的系统来控制激发束的路径而纠正这些问题。然而，透镜对于大扫描角以及大大增加的路径长度向系统引入不可接受的偏差，并且透镜还要求另外的对准自由度，其会增加系统复杂度。由于上文描述的原因，工程师、科学家和显微镜制造商继续搜寻用于扫描焦平面的共聚焦照明的更快系统和方法。

技术实现要素：
公开了可以用于进行样本内焦平面的快速逐线照明的各种光扫描系统。这些光扫描系统可以纳入共聚焦显微术仪器来形成激发束枢转轴线，其位于物镜透镜（objectivelens）的背板处的光阑内。这些光扫描系统从光源接收激发光束并且引导该激发束通过物镜透镜的背板的光阑中的枢转点同时跨焦平面连续扫描聚焦激发束。这些光扫描系统用平面反射镜实现，其限制激发束的偏差和衰减。这些反射镜可以采用紧凑设置安装来限制路径长度。因为这些光扫描系统不用透镜实现，仅使用四个自由度来调准激发束。附图说明图1A示出示例共聚焦显微术仪器的示意表示。图1B示出图3中示出的共聚焦显微术仪器，其中从样本内的焦平面发射三个荧光束。图2示出示例共聚焦显微术仪器的示意表示。图3A-3B示出示例光扫描系统的顶平面视图和等轴视图。图4示出图3中示出的光扫描系统，用于沿通过枢转点的不同路径输出激发光束。图5A-5C示出激发束传播通过图3中示出的光扫描系统的三个不同路径的快照。具体实施方式图1A示出示例共聚焦显微术仪器100的示意表示。存在许多不同类型的共聚焦显微术仪器和对应的光学路径。仪器100不意在代表共聚焦显微术仪器的所有不同的众所周知的变化形式内的光学路径，而相反意在说明包括集成光扫描系统的共聚焦显微术仪器的一般原理。该仪器100包括光源102、线形成元件103、光扫描系统104、二向色反射镜106、具有背板110的物镜透镜108、台112、过滤器和成像光学器件114、采用卷帘线快门（rollinglineshutter）模式的检测器116以及控制单元118。该光源102可以是发射高强度、大致上单色的激发光束120的激光器，该激发光束120选择成激励荧光从荧光探头的荧光团发射，这些荧光团设计成结合于样本122中的特定材料。该光扫描系统104包括扫描反射镜302和两个固定反射镜304和306，它们在下文参照图3-5更详细地描述。激发束120通过线形成元件103，其可以是将激发束120整形成大致上垂直于反射镜304、306和308的平面而引导的线形激发束的powel透镜。控制单元118控制反射镜308的位置使得激发束120在从反射镜304、306和308六次反射后最终沿许多不同路径（在称为“枢转点”的点124交叉）中的一个输出。例如，图案化的线126-128代表光扫描系统104输出线形激发束所沿的单独路径的连续集中的仅仅三个。路径126-128在枢转点124交叉。光源102和光扫描系统104安置在仪器100内使得二向色反射镜106和激发束路径交叉使得枢转点124位于背板110的光阑130处或附近。例如，如在图1A中示出的，当激发束通过光扫描系统104而被置于路径126-128中的任一个上时，线形激发束从二向色反射镜106反射并且通过位于光阑130内的枢转点124。物镜透镜108将激发束聚焦到位于焦平面132内的焦线。例如，当光扫描系统104将激发束置于三个路径126-128中的任一个上时，物镜透镜108将线形激发束分别聚焦到焦线134-136上，焦线134-136位于焦平面236内并且被引导成垂直于包含反射镜304、306、308和106的平面。光扫描系统104用于在通过枢转点124的束路径的连续集上扫描线形激发束从而来进行焦平面236的线扫描。对于焦平面132中的每个焦线，由物镜透镜208捕捉并且准直从围绕焦线的样本122中的荧光团发射的荧光的一部分。例如，图1B示出共聚焦显微术仪器100，其中从围绕焦点134-136的区域中的样本122发射三个荧光束138-140。这些束138-140由物镜透镜108形成，通过二向色反射镜106，并且由过滤器和成像光学器件114过滤并且聚焦到检测器116的二维传感器上。过滤器阻挡激发光到达检测器116并且成像光学器件将线形束中的荧光聚焦在检测器116的传感器上。检测器116可以是具有二维设置的像素的CMOS检测器或CCD检测器，该二维设置的像素形成检测器116的二维传感器。检测器116的传感器采用卷帘线快门模式操作，其通过控制单元118而与焦平面132的线扫描同步。在卷帘线快门模式中，通过跨焦平面132扫描线形激发束而形成焦平面132的图像，同时跨检测器116的二维传感器来扫描对应的聚焦和过滤线形荧光束。在传感器的一端开始，当跨传感器扫描束直至传感器的相对端时，成行的传感器像素读取线形荧光束中的光。当跨传感器扫描荧光束时，在荧光束前面的像素行被清除或归零来使这些像素准备好读取荧光束。当荧光束到达传感器的相对端时，处理由像素读取的信息来形成焦平面132的二维图像。同步成读取线形荧光的当前位置的像素行之外的像素行的光检测被丢弃以便排除来自焦平面132之外的杂散光。图2示出示例共聚焦显微术仪器200的示意表示。该仪器200与仪器100相似，不同的是仪器100的二向色反射镜106由全反射镜202代替，并且包括位于从线形成元件103输出的激发束120的路径中的二向色反射镜204。该仪器200还包括线过滤器206和线检测器208。二向色反射镜204配置成允许通过激发束120，其如上文参照图1A描述跨焦平面132而被扫描。荧光沿与激发束相同的路径传播回到二向色反射镜204，其将荧光沿路径210反射通过过滤器和成像光学器件114、过滤器206中的线缝212并且到线检测器208的线形传感器上。例如，当安置反射镜308来将激发束120反射到路径126上到焦线136时，从焦线136周围的荧光团发射的荧光沿相同的路径126传播回到反射镜308并且反射到二向色反射镜204。对该荧光过滤来去除杂散激发波长并且聚焦成通过缝212的线形束。线过滤器206阻挡来自位于焦线136之外的源的杂散光，使得基本上仅从位于焦线136附近或沿焦线136的荧光团发射的荧光到达线检测器208的线形传感器。线检测器208可以是CMOS拍摄装置或CCD拍摄装置，其具有与缝212对准的一维或二维传感器像素阵列。通过控制单元118使传感器区域的清除和读取与焦平面132的扫描同步。例如，当反射镜308从第一位置旋转到第二位置时，其将激发束从第一焦线移动到焦平面132的第二焦线，清除线检测器208的传感器来读取从第二焦线发射的荧光。当激发束扫过焦平面132时，处理由检测器208收集的信息来形成焦平面132的二维图像。图3A-3B示出示例光扫描系统204的顶平面视图和等轴视图。该系统204包括居中扫描反射镜302、具有朝该扫描反射镜302倾斜的反射面的第一平面固定反射镜304以及具有朝该扫描反射镜302倾斜的反射面的第二平面固定反射镜306，如上文在图2中示出的。该第一和第二固定反射镜304和306也朝彼此倾斜。在图3A-3B的示例中，反射镜304、306和308取向成使得反射镜304、306和308的反射面大致上垂直于相同的xy平面。扫描反射镜302可以是检流计反射镜，其包括附连到检流计马达310的可旋转轴的平面枢转反射镜308。备选地，扫描反射镜可以是压电受控的反射镜。如在图3A-3B中示出的，反射镜308由马达310在xy平面中来回连续旋转通过一系列角度。图4示出与光束400一起操作的光扫描系统204，其中光束400经由光纤402被引入系统204。例如，光束可以是从例如上文描述的光源202等光源输出的激发束，其由光纤402传送进入系统300。光纤402还可包括位于纤维402的对接端的透镜404，来将束400聚焦到反射镜308的特定区域406上。备选地，束400可以直接从激光器输出，在该情况下可以省略光纤402。图4示出旋转至三个位置1、2和3的反射镜308，其代表反射镜308的旋转位置的连续集中的仅仅三个。不同图案化的线408-410分别代表当枢转反射镜308旋转至三个位置1、2和3中的一个时束传播通过系统300的路径。如在图4的示例中示出的，固定反射镜304和306与枢转反射镜308将束400置入经由位于xy平面所代表的相同平面内的六次反射的通过枢转点412的路径。实际上，反射镜308可以旋转至位置的连续集中的任一个，这些位置导致束沿通过枢转点412的路径从系统300输出。对于导致束400被置于通过枢转点412的路径上的枢转反射镜308的每个旋转位置，对于总共六次反射，束400从枢转反射镜308反射三次，从第一固定反射镜304反射一次，并且从第二固定反射镜306反射两次。图5A-5C分别示出当枢转反射镜308旋转至三个位置1、2和3时束400传播通过系统300的内部路径的快照。在图5A中，枢转反射镜308旋转至位置1。束400在点502照到枢转反射镜308并且经历从反射镜304、306和308的六次反射，其中这些反射顺序编号为1、2、3、4、5和6。在点502附近从枢转反射镜308的第6次反射将束置于图4中示出的路径408上。在图5B中，枢转反射镜308旋转至位置2。束400在点504照到枢转反射镜308并且经历从反射镜304、306和308的六次反射，其中这些反射顺序编号为1’、2’、3’、4’、5’和6’。在点506从枢转反射镜308的第6次反射将束置于图4中示出的路径409上。在图5C中，枢转反射镜308旋转至位置3。束400在点508照到枢转反射镜308并且经历从反射镜304、306和308的六次反射，其中这些反射顺序编号为1’’、2’’、3’’、4’’、5’’和6’’。在点510从枢转反射镜308的第6次反射将束置于图4中示出的路径410上。枢转点离反射镜308的距离可以由反射镜304、306和308彼此间隔多远而确定。反射镜304、306和308彼此间隔越远，枢转点离反射镜308越远。在另一方面，为了更靠近反射镜308安置枢转点，减小反射镜304、306和308之间的距离。产生下游枢转点的能力所基于的原理取决于从枢转反射镜的多个反射。在牵涉枢转反射镜的典型光学设置中，束从枢转反射镜仅反射一次。在该设置中，当枢转反射镜扫描通过机械角度Δθ时，通过角度2·Δθ扫描输出束，其中输出束的枢转轴线近似位于枢转反射镜的反射面。如果对该设置增加另外的固定反射镜，使得束被重新引导成从枢转反射镜第二次反射，额外的2·Δθ的扫描角增加到原始扫描角或从原始扫描角减去。如果在第一和第二枢转反射镜反射之间存在奇数个固定反射镜反射，增加从第二枢转反射镜反射的2·Δθ扫描角而得到4·Δθ的总扫描角。如果在第一和第二枢转反射镜反射之间存在偶数个固定反射镜反射，减去从第二枢转反射镜反射的2·Δθ扫描角，而得到0总扫描角。在该第二情况下，即使总扫描角是零，存在与第一和第二枢转反射镜反射之间的总光学路径长度成比例的非零横向束平移。当该横向束平移应用于第三枢转反射镜反射时，其通过经由一个或多个固定反射镜的反射再次将束重新引导到枢转反射镜上而完成，净效果是最终的扫描角等于原始2·Δθ，但具有平移的束枢转轴线。如果在第二和第三枢转反射镜反射之间存在偶数个固定反射镜反射，枢转轴线向上游平移到虚枢转点，但如果在第二和第三枢转反射镜反射之间存在奇数个固定反射镜反射，枢转轴线向下游平移到真实枢转点。基于这些原理并且利用额外枢转反射镜和固定反射镜反射，存在许多方式来以平移枢转轴线产生相同的束扫描。本文描述的系统仅代表许多方式的一个示例，这些方式中可以利用多个枢转反射镜反射来产生扫描束的枢转轴线中的期望平移。前面的描述为了说明的目的使用特定命名法来提供本公开的全面理解。然而，为了实践本文描述的系统和方法而不需要特定细节，这对于本领域内技术人员将是明显的。为了图示和描述的目的呈现特定示例的前面的描述。它们不意为穷举的或将本公开限于描述的确切形式。明显地，鉴于上文的教导，许多修改和变化是可能的。示出并且描述这些示例以便最好地说明本公开的原理和实际应用，由此使本领域内其他技术人员能够最好地利用本公开和具有如适合于预想的特定使用的各种修改的各种示例。规定本公开的范围由下列权利要求及其等同来限定。