一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜的制作方法

一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光显微镜领域。通过在激发光路中设置光束光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；和快速光强调制装置，用于快速调制光强；发明了一种在不改变光片厚度的条件下，可以增加并且调节扫描范围的光片显微镜。这项新技术能够提供亚微米级的z轴分辨率，在深层组织中(大于500μm)170×170μm2大小的视野以及高达1毫秒的时间分辨率。2P3A-DSLM解决了小型模式生物体的亚细胞结构以及活体动态过程的长时间成像问题。
【专利说明】一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光 显微镜【技术领域】。

【背景技术】

【背景技术】 [0002] ：
[0003] 最近出现的光片突光显微镜技术（light-sheet fluorescent microscopy,LSFM) 已经给生物三维成像技术带来了革命性变化。LSFM具有高时间分辨率以及很小的光损伤等 特点，使得通过荧光成像对小型模式生物或组织的长时间观察成为可能。
[0004] 光片显微镜使用一层光束从样品侧面激发荧光样品，通过照相设备检测成像，其 入射照明光路和照相设备接收突光光路互相垂直。传统光片显微镜分类：从激光光源讲： 分为连续光光片显微镜和双光子光片显微镜。前者的好处是造价低，结构简单。缺点是：穿 透能力很弱，不适合深层组织成像。后者的好处是成像深度深，可以做活体组织成像。从系 统构架来讲：分为水平构架，垂直构架和倒置构架三种。水平构架中，光片照明的物镜和信 号接收的物镜都是水平放置，即整个光路平面与水平面垂直，而样本固定在一个琼脂糖柱 里坚直放置。这种构架的好处是，系统稳定，样本可以360度自由移动。缺点是样本制备相 对繁琐。垂直构架中，接收信号的物镜垂直放置，与普通的正置显微镜相同。而激发光片的 物镜水平放置，使得产生的光片与水平面平行。优点是可以与现有的传统正置显微镜兼容。 缺点是激发光物镜的光片厚度较厚，无法进行亚细胞结构观察。倒置构架中，激发物镜和发 射物镜成垂直的V字形倒置在样本之上，形成的光片和成像面都与水平面成45度并互相垂 直。该构架的好处是可以与传统的样本制备标准兼用。劣势是结构不够稳定，并且样本不 能随意转动。从光片形成方式来讲，分为柱面镜式和扫描式。柱面镜式是通过一个柱面镜 让一束激光在一个方向上聚焦，而另一个方向上保持准直而形成光片。这种方法的好处是 结构简单，劣势是单位面积下的光功率较低，不适合做多光子扫描显微镜。扫描式是通过扫 描器件，将一束准直的高斯光束在y轴方向上快速扫描，进而在照相机一次曝光时间内形 成均匀的片状光。优点是单位时间内的光功率强，可以做双光子成像。缺点是结构相对复 杂。
[0005] Truong等人通过将双光子技术和光片显微镜结合起来实现了双光子数字扫描光 片显微镜（2P-DSLM)，该系统能够在高散射的果蝇胚胎或者快速跳动的斑马鱼心脏中进行 深层组织成像[1]。与经典的光片荧光显微镜结构相似，双光子数字扫描光片显微镜使用 一个低数值孔径的物镜（NA < 0. 1)来实现长时间均匀照明，然而这导致产生的光片过厚， 从而降低轴向分辨率和图像的对比度。另一方面，Betzig和他的同事利用贝塞尔光束来 产生一个纤薄的单光子光片，得到了相当不错的轴向分辨率[2]。然而，这样的系统中，视 野和穿透深度是非常有限的。常规的LSFM显微镜或者双光子数字扫描光片显微镜还有一 个非常显著的问题，就是在工作的时候，其光片的厚度主要是由扫描的数值孔径NA决定， 当增加扫描范围的时候，必然会增加光片厚度。目前有关于光片显微镜的专利文献比如 CN102455501A，其利用机械移动的透镜组进行光学变焦，变焦频率十分低，导致不能实现快 速拍照，限制了其实际产业方面应用范围；并且其只能通过改变数值孔径来改变照射区域 的大小。在其增加扫描范围的时候，也不能避免光片厚度的增加。
[0006] 引用文献：
[0007] l.Truong TV, Supatto ff, Koos DS, Choi JM, Fraser SE. Nat Methods2011 ；8 ： 757-760.
[0008] 2.Gao L，Shao L，Higgins CD et al. Cell 2012 ;151 :1370-1385.


【发明内容】

[0009] 为了克服现有技术的缺陷，我们发明了一种在不改变光片厚度的条件下，可以增 加并且调节扫描范围的光片显微镜。为了同时获得高轴向分辨率和大视野，我们利用激发 光路快速变焦装置和快速光强调制装置制作了基于轴向超高速扫描的新型三轴数字扫描 光片显微镜（下文称2P3A-DSLM)。这项新技术能够提供亚微米级的Z轴分辨率，在深层组 织中（大于500 ii m) 170X 170 ii m2大小的视野以及高达1毫秒的时间分辨率。2P3A-DSLM 解决了小型模式生物在体的亚细胞结构以及动态过程的活体成像问题。
[0010] 根据本发明，一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜包括：激发光 源，其发射的光束沿着X轴方向照射到样品上；成像设备，其沿着Z方向检测样品上发射和 /或反射的光，Z方向与X方向基本垂直；扫描仪，用于Y方向形成光片和/或Z方向改变光 片的位置，所述Y方向沿着与X和Z方向基本垂直的方向延伸；其特征在于：激发光路快速 变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；快速光强调制装置，用于快速调制光强；所述激发 光路快速变焦装置和快速光强调制装置处于激发光路中。
[0011] 激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置在激发光路中的位置及顺序并不限 制，只要能够实现其功能即可。
[0012] 其中优选的技术方案激发光路快速变焦装置选自可调声学梯度折射率指数透镜 (TAG)、电控可变焦透镜、微机械可变反射镜（MEMSMIRR0R)中的一种。
[0013] 其中优选的技术方案快速光强调制装置包括电光调制器，优选高速普克尔斯盒。
[0014] 其中优选的技术方案快速变焦装置的变焦频率在IOOHz以上，优选IkHz以上，更 优选500kHz以上。
[0015] 其中优选的技术方案快速变焦装置在所述光片荧光显微镜的激发物镜后焦面的 共轭范围内。
[0016] 其中优选的技术方案所述的共轭范围是共轭距离的80%到120%。
[0017] 其中优选的技术方案所述二维扫描镜包括单个二维扫描镜。
[0018] 其中优选的技术方案所述二维扫描镜包括一组的两个一维扫描镜。
[0019] 其中在发射光路中，优选的技术方案进一步包括发射光路快速变焦器件，使得成 像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。
[0020] 其中优选的技术方案在于激发光路中，用作光片垂直方向扫描的扫描反射镜与发 射光路中快速变焦透镜连用；可以实现不同成像焦面的快速切换。
[0021] 其中优选的技术方案所述快速声光调制装置的调制频率是变焦装置频率的10倍 以上。
[0022] 其中优选的技术方案所述光片显微镜用于mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫连续的 三维成像。
[0023] 其中优选的技术方案所述快速调焦装置是TAG，电光调制器是高速普克尔斯盒。
[0024] 其中优选的技术方案当激发物镜的放大倍数为40倍，数值孔径为0. 8的条件下， 通过调节TAG强度，可以控制XY平面扫描区域在IOxlOiim2到170 X 170 ii m2的范围内。
[0025] 其中优选的技术方案所述所述快速光强调制装置的频率是IOkHz以上，优选 IOMHz。
[0026] 其中优选的技术方案所述激发光源选自双光子飞秒激光光源或三光子飞秒激光 光源。
[0027] 在所述超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，其快速变焦装置使得光片沿着光 轴方向得到扩展，在成像设备一次曝光时间内；使得光片等效被拉长；并且根据不同的样 本大小实时调节光片的长度。快速变焦装置与快速光强调制装置连用，补偿了样品的吸收 和散射造成的照明光沿着轴向的衰减。快速变焦装置、快速光强调制装置与二维扫描镜连 用，可以实现在三维任意形状、任意位置的光片照射，从而实现随机位置光激活或随机位置 光漂白恢复技术。其中快速声光调制装置和快速变焦装置的频率匹配属于本领域的常规技 术知识。
[0028] 其中所述在发射光路中，包括光路快速变焦器件，用于快速调制光的焦点位置，使 得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。
[0029] 由上所述，本发明具备以下突出的特点：
[0030] 在不移动样品的条件下，可以实现快速的三维扫描。
[0031] 在1毫秒之内，当激发物镜的放大倍数为40倍时，可形成170X17011 m2的光片； 当激发物镜的放大倍数为20倍时，可形成680 X 680 ii m2的光片。
[0032] 在相机速率足够的情况下，可以达到1000张每秒的二维扫描速度，或者达到100 层每秒的三维扫描速度。
[0033] 在光片厚度小于1微米并且基本保持不变的情况下，可以使光片的扫描区域根据 变焦的大小相比于常规的光片荧光显微镜扩展1-100倍；
[0034] 在不改变光片厚度的前提下，可以任意改变光片的尺寸，面积，大小。同时，在扫描 的过程中，可以对光强的损耗进行动态的补偿。
[0035] 通过扫描镜，可变焦透镜和电光调制器的连用，可以补偿光沿着入射方向在样品 中的衰减，使得整个成像区域获得最好的成像质量。
[0036] 双光子和可变焦透镜的连用，可以使得光片厚度降到最低。从而提高轴向分辨率。
[0037] 相同条件下，2P3A-DSLM的光漂白速度是常规的2P-LSM的50%左右。

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1，常规的光片显微镜基本结构及原理示意图。
[0039] 图2,2P3A_DSLM的结构示意图。
[0040] 图3,2P3A-DSLM的光片大小能够通过调节TAG调制强度来调整，尺寸范围从 10x10 i! m2到170 X 170 i! m2,所用条件为：激发物镜放大倍数为40倍，数值孔径为0. 8。
[0041] 图4,普克尔斯盒对照明的补偿能有效克服整个视野深度的非均匀照明。在补偿之 前，照明强度随着穿透深度的增加而衰退。在用普克尔斯盒动态调整照明功率之后，光照强 度在整个穿透深度范围内都变得非常均匀。最右边的图表示的是调制前和调制后在图中直 线上的强度分布曲线。比例尺：l〇〇um。
[0042] 图5,所示的是不同TAG调制强度（0%?35%)下的光片侧视图。比例尺：50 iim。
[0043] 图6,空间分辨率和极限视野深度的关系。在不同的TAG调制强度下用900nm的激 光去激发嵌在琼脂凝胶的直径为50nm的绿色荧光小球。沿着轴向IOOnm步进收集每个小 球的荧光图像。
[0044] 图7, 2P3A-DSLM与2P-LSM在实验和理论上的光漂白程度对比。
[0045] 图 8, 2P3A-DSLM，2P-DSLM 以及 Static light-sheet 理论上的光损伤对比。
[0046] 图9,光片显微镜不同的光片厚度所能达到的分辨率的分析。

【具体实施方式】
[0047] 为了本发明的技术方案、目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图对本 发明做进一步的说明。本发明中涉及到的光学显微镜部件，除特殊说明的以外，均为常规的 光学部件。
[0048] 图1是现有的常见光片显微镜的结构及功能示意图，其由X方向的片光源照射xy 平面内的物体，检测方向基本垂直于片光源的照射方向。如图1所示，其通常包括光源，柱 面镜或扫描仪，激发物镜，检测物镜，相机等部件，根据不同的功能可以选择不同的部件。透 镜1和透镜2用来进行扩束。透镜3和透镜4进行第二次扩束，并将扫描仪的扫描角度共 轭到激发物镜后焦面上去。聚焦的厚度一般和数值孔径NA成反比。当需要大的扫描范围 的时候，需要小的数值孔径。但是随着聚焦厚度的增加，其降低了 XY平面的分辨率。
[0049] 实施例1 :
[0050] 图2是2P3A-DSLM的一个结构示意图。如图所示，在传统光片显微镜的基础上，在 激发光路设置快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；设置快速光强调制装置，用于快 速调制光强；快速变焦装置是TAG。反射式扩束镜根据实际情况，可以先进行一次扩束，使 光斑符合TAG孔径要求，并减小色差。透镜1和透镜2用来将TAG透镜的变焦平面共轭到 显微镜物镜后焦面上去。透镜3和透镜4进行第二次扩束，并将扫描仪的扫描角度共轭到 激发物镜后焦面上去。
[0051] 实施例2 ：
[0052] 快速变焦装置是电控可变焦透镜、微机械可变反射镜（MEMSMIRR0R)中的一种。
[0053] 实施例3 ：
[0054] 快速光强调制装置是普克尔斯盒（Conoptics，350-160LA)。
[0055] 实施例4 ：
[0056] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，所述快速变焦装置是TAG，快速光强调制装置是 普克尔斯盒，利用一个检流计扫描振镜（galvo scanning mirror，GSM)，即扫描器，用来实 现激光束与照明物镜轴向（X轴）垂直的方向（y轴）的扫描。使用双光子作为光源。
[0057] 实施例5 ：
[0058] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，使用TAG作为快速调焦装置。TAG使用声波径 向激发一个充满液体的圆柱形谐振腔并使液体的折射率产生连续变化，使得轴向焦平面快 速变化，达到IOy S。这里我们用它来实现飞秒激光（140fs，重复频率80MHz，Chameleon Version II，Coherent)沿着光轴方向在照明物镜（40XNA 0.8, Nikon)前端的快速变焦。 一个检流计扫描振镜（galvo scanning mirror，GSM)，即扫描器，用来实现激光束与照明物 镜轴向（X轴）垂直的方向（y轴）的扫描。
[0059] 实施例6 ：
[0060] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，可以通过分别以450kHz和IkHz的频率驱动TAG 和GSM。使用双光子作为光源，我们就能在Ims内得到一个超薄的双光子光片。如图3所 示，光片的尺寸可以通过调节TAG(x方向）的调制强度以及GSM(y方向）的扫描振幅来调 整。这两个因素都会增加光片的照度不匀程度。为了补偿照度不匀，我们使用了一个超高 速普克尔斯盒（Conoptics，350-160LA)来动态调节照射功率，有效地消除轴向的非均匀照 射。
[0061] 实施例7 ：
[0062] 根据实施例5结构的2P3A-DSLM，使用双光子作为光源，40倍放大物镜，我们研究 了普克尔斯盒对于整个视野深度的非均匀照明的补偿，如图4所示，普克尔斯盒对照明的 补偿能有效克服整个视野深度的非均匀照明。在补偿之前，照明强度随着渗透深度的增加 而衰退。在用普克尔斯盒动态调整照明功率之后，光照强度在整个渗透深度范围内都变得 非常均匀。最右边的图表示的是调制前和调制后在图中直线上的强度分布曲线。比例尺： 100 U m〇
[0063] 实施例8 ：
[0064] 根据实施例5结构的2P3A-DSLM，我们通过对异硫氰酸荧光素（FITC)溶液的成像 对这套系统的性能进行了定量分析（图5)。当TAG的调制强度增加到35%时，X方向的视 野深度呈直线上升趋势，增加到170 um。当视野深度在5 iim到170 iim之间时，光片厚度在 近端和中间都保持在低于I U m。在35 %的TAG调制强度下，光片厚度在视野深度170 y m 的远端增加到I. 5 y m，依然低于普通的光片显微镜（2?8 y m)。因为照明物镜的校正范围 是有限的，当TAG调制强度超过35%时，光片在z方向上会突然扩展。降低照明物镜的数值 孔径和放大倍率，能够使视野深度的调节范围更大，但这样会增加光片的厚度并且牺牲系 统的空间分辨率。通过对FITC溶液的成像，我们定量分析了 2P3A-DSLM在不同视野深度下 所产生的光片厚度。图5所示的是不同TAG调制强度（0%?35%)下的光片侧视图。比 例尺：50 y m。
[0065] 实施例9 ：
[0066] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们利用测量嵌在琼脂糖凝胶中的荧光玻璃小 珠的方法来评估在不同TAG调制强度下的系统轴向（y-z平面）和侧向（x-y平面）分辨率， 如图6所示。荧光玻璃小珠在不同TAG调制强度下的侧向半高宽范围是420nm?450nm，接 近阿贝极限。当TAG调制强度在0%?35%时，荧光玻璃小珠的的轴向半高宽在激发场的 近端和中部维持在700nm?800nm。除了 35%的TAG调控强度之外，轴向分辨率在激发场 远端都保持在I U m以下。这些实验数据与理论分析吻合地很好，表明我们的系统比传统的 光片显微镜乃至配有高数值孔径的双光子点扫描显微镜都具有更高的分辨率。
[0067] 实施例10 ：
[0068] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，我们通过活体亚细胞结构和动态成像测试了该 系统在生物学研究方面的性能。线粒体是真核细胞中关键的细胞器，其直径在0. 5?I i! m 之间。在活细胞中，单个线粒体产生的超氧化合物瞬时爆发现象被称为"线粒体闪烁"。这 里我们定时监测3天龄的mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫的咽部线粒体动态过程。在记录帧 速率为5Hz和像素2048x2048的图像时，我们能够分辨出线粒体闪烁发生过程的波峰。另 夕卜，我们成功地对分离后体外培养的老鼠心肌细胞进行了二维空间上的钙火花成像，帧速 率为820Hz，帧尺寸为2048x256像素。
[0069] 实施例11 ：
[0070] 由于染色体尺寸太小，通常都需要使用一个高数值孔径、高放大倍率的物镜在 单细胞或者胚胎发育的早期观察细胞分裂过程中的染色体分离。根据实施例1结构的 2P3A-DSLM，，我们利用2P3A-DSLM，能够同时观察3天龄的斑马鱼心脏的数百个细胞核，并 且清晰地看到一些分裂期细胞的染色体结构。这主要得益于这一新型成像技术产生的纤薄 光片，从而得到低背景噪音和高对比度的荧光图像。
[0071] 实施例12 ：
[0072] 低曝光量是对生物样本长时间成像的关键。通过对mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线 虫连续的三维成像。根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们对比了 2P3A-DSLM和常规2P-LSM 的光漂白效应。经过15分钟的记录，我们的系统没有出现明显的漂白，这与已经被漂白超 过50%的2P-LSM形成鲜明对比。这主要是因为在同样的点扩展函数轴向宽度和信号速率 条件下，2P3A-DSLM需要的照明数值孔径更小，能有效减少激发光的峰值强度以及二阶光损 伤
[0073] 实施例13 ：
[0074] 根据实施例5结构的2P3A-DSLM，进一步包括发射光路快速变焦器件，使得成像物 镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配
[0075] 实施例14 ：
[0076] 根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，我们计算了光片显微镜不同的光片厚度所能达 到的分辨率的对比。如图7所示，所有光片显微镜都要用到两个正交的物镜。因此，探测系 统中的点扩展函数由激发强度分布g(x，y，z)和探测物镜的模糊函数d(x，y，z)所决定：
[0077] P(x, y, z) = g(x, y, z)d(x, y, z) (3. I)
[0078] x, y, z三个方向的定义与正文中的相同。我们可以通过计算横向（x, y)和轴向 (z)点扩展函数的半高宽来理论地估计系统的光学分辨率。
[0079] 横向的照明是均匀的，因此g(x，y) = 1。因此，X和y方向上的点扩展函数被 dlateal(x，y) P隹一决定。艾里公式给出了探测物镜焦平面的径向模糊函数：

【权利要求】
1. 一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜包括： 激发光源，其发射的光束沿着X轴方向照射到样品上； 成像设备，其沿着Z方向检测样品上发射和/或反射的光，Z方向与X方向基本垂直； 扫描仪，用于Y方向形成光片和/或Z方向改变光片的位置，所述Y方向沿着与X和Z 方向基本垂直的方向延伸； 其特征在于： 激发光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置； 快速光强调制装置，用于快速调制光强； 所述激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置位于激发光路中。
2. 根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于激发光路快速变焦装置选自可调声 学梯度折射率指数透镜（TAG)、电控可变焦透镜、微机械可变反射镜（MEMSMIRROR)中的一 种。
3. 根据权利要求1-2所述的光片显微镜，其特征在于快速光强调制装置包括电光调制 器。优选高速普克尔斯盒。
4. 根据权利要求1-3所述的光片显微镜，其特征在于快速变焦装置的变焦频率在 100HZ以上，优选1KHZ以上，更优选500kHZ以上。
5. 根据权利要求1-4所述的光片显微镜，其特征在于快速变焦装置在所述光片荧光显 微镜的激发物镜后焦面的共轭范围内。
6. 根据权利要求5所述的光片显微镜，其特征在于共轭范围是共轭距离的80%到 120%。
7. 根据权利要求1-6所述的光片显微镜，其特征在于所述二维扫描镜包括单个二维扫 描镜。
8. 根据权利要求1-7所述的光片显微镜，其特征在于所述二维扫描镜包括一组的两个 一维扫描镜。
9. 根据权利要求1-8所述的光片显微镜，其特征在于在发射光路中，进一步包括发射 光路快速变焦器件，使得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。
10. 根据权利要求1-9所述的光片显微镜，其特征在于激发光路中，用作光片垂直方向 扫描的扫描反射镜与发射光路中快速变焦透镜连用；可以实现不同成像焦面的快速切换。
11. 根据权利要求1-10所述的光片显微镜，其特征在于所述快速声光调制装置的调制 频率是变焦装置频率的10倍以上。
12. 根据权利要求1-11所述的光片显微镜，其特征在于所述光片显微镜用于mt-cpYFP 转基因秀丽隐杆线虫连续的三维成像。
13. 根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于所述快速调焦装置是TAG，电光调 制器是高速普克尔斯盒。
14. 根据权利要求13所述的光片显微镜，其特征在于当激发物镜的放大倍数为40倍， 数值孔径为〇. 8的条件下，通过调节TAG强度，可以控制XY平面扫描区域在10x10 y m2到 170X170iim2的范围内。
15. 根据权利要求1-14所述的光片显微镜，其特征在于所述所述快速光强调制装置的 频率是10kHz以上，优选10MHz以上。
16.根据权利要求1-15所述的光片显微镜，其特征在于所述激发光源优选自双光子飞 秒激光光源或三光子飞秒激光光源。
【文档编号】G02B26/10GK104407436SQ201410460425
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】陈良怡, 宗伟健, 孙育杰, 陈宣杨 申请人:北京大学