用于对物体成像的显微镜的制作方法

本发明涉及一种用于对物体成像的显微镜，包括通过成像光路对物体成像的物镜、用于产生照明辐射的光源以及用于监测照明辐射的能量参数的监测装置，其中所述监测装置对入射在其上的辐射的能量参数加以确定。

背景技术：

在显微镜、基于激光的方法(例如激光扫描显微镜)和光学操纵技术(例如光学镊子)中，经常需要监测照明辐射的强度。这支持测量的可重复性。已知通过布置辐射检测器而不是样本来确定光源的强度，以这种方式可以确定照明辐射的入射在物体中的强度。这样的方法例如在ep2458420b1或us8619252b2中公开。由于强度的测量只能在样品的测量之前或之后进行，因此ep1260848b1或ep1353210b1提出在光源附近的照明光路中提供强度检测器。以这种方式，还可以在样品的测量期间确定由光源发出的照明辐射的强度。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种显微镜，其提供对照明辐射的能量参数的改善的监测方案。

本发明在权利要求1中定义。优选实施方案是从属权利要求的主题。

本发明创造了一种用于对物体成像的反射光显微镜，包括通过成像光路对物体成像的物镜、用于产生照明辐射的光源、用于监测照明辐射的能量参数的监测装置以及分束器装置。监测装置对入射在其上的辐射的能量参数加以确定。分束器装置在照明方向上布置在物镜的前面，并将来自照明辐射的测量辐射耦合输出到监测装置。优选地，显微镜还具有至少一个光学元件，所述光学元件用于将照明辐射耦合输入到成像光路中。成像光路在耦合输出测量辐射的分束器装置与物体之间没有光学成像元件。

由于显微镜是反射光显微镜，因此照明辐射在成像辐射的相反方向上耦合输入到成像光路中，然后通过物镜引导到物体(通常是样品)中。因此，在该耦合输入位置与物体之间，成像光路包含照明光路。这里，照明辐射朝向物体行进，并且成像辐射远离物体行进。该部分通常也称为共用光路。该术语也将在以下描述中使用。

用于将测量辐射耦合输出到监测装置的分束器装置布置在物镜附近的共用光路中，使得通过分束器装置耦合输出的测量辐射与通过物镜聚焦在物体上的照明辐射的能量参数非常精确地成比例。特别地，因此由监测装置通过监测装置检测由先前穿过的滤光器、光学元件或其他效果引起的照明辐射的能量参数的所有这些变化。以这种方式，由于物镜处的分束器装置，监测装置检测一信号，该信号特别精确地对应于物体本身中的照明辐射的能量参数。特别是，不需要通过计算或其他考虑来考虑插入的滤光器、透镜或分束器的影响，因为只有当照明辐射穿过这些元件等时才从照明辐射耦合输出测量辐射。同时，即使在检验物体期间也可以确定照明辐射的能量参数。这尤其允许根据物体中的照明辐射的恒定能量参数来调节光源。这减少了用户交互，由此简化了实验。关于物体的照明获取的测量数据可以结合到记录的图像，使得可以获得关于照明条件的特别精确的存档。

能量参数可以是强度或功率或能量密度。

该显微镜既可用于荧光显微镜，也可用于基于激光的技术，特别是宽视场的。此外，可以在照明辐射的情况下使用显微镜，其实现光学操纵技术，例如frap(光漂白后的荧光恢复)或flip(光漂白中的荧光损失)。另外，显微镜可以用不同的波长对物体进行照明和/或成像和/或处理，例如通过激光烧蚀。显微镜可以是共聚焦显微镜或用于在宽视场中对物体成像的显微镜。优选地，显微镜被设计为刺激物体中的荧光发射并检测由物体发射的荧光。为此，可以例如为物体提供荧光染料。该物体可以理解为要借助显微镜成像的任何样品、主体或结构。该物体尤其可以包括生物样品。

物镜将照明辐射聚焦到物体中，同时用于对物体成像，即用于检测由物体产生或在物体上反射的辐射。借助成像光路产生物体的图像，在所述路径末端有图像检测器，其用于将从成像光路引导的辐射转换成电信号。控制装置可以例如将电信号转换成物体的电子图像，其例如在显示装置上表示和/或存储。

光源可包括激光器、白光源，例如卤素灯或汞灯，或发光二极管(led)，或其组合。特别地，光源可以产生宽波长范围的照明辐射或具有各个离散波长或波长范围的照明辐射；光源优选地包括多个单独的光源，每个光源产生不同的、例如离散的波长范围的辐射。优选地，光源与控制装置连接，所述控制装置控制照明辐射的强度或功率。光源可以提供平行的照明辐射，或者在光源的前面布置透镜或透镜系统，例如微透镜阵列，通过其可以将由光源提供的辐射平行化。或者，照明光路中的照明辐射可以以非平行方式引导。照明辐射是否平行行进至少依赖于使用显微镜执行的成像方法。在激光扫描显微镜和光学操纵技术的情况下，照明辐射通常平行地行进；相反，在宽视场成像或tirf实验(全内反射荧光)的情况下，照明辐射通常以会聚方式穿过照明光路行进。

光学元件用于将照明辐射耦合输入到成像光路中。光学元件可以是例如二向色镜，其反射照明辐射的波长范围内的辐射并透射成像波长范围内的辐射，例如由物体产生的荧光辐射。也可以交换光学元件的反射和透射特性。在这种情况下，用于将照明辐射从光源引导到物体的照明光路和成像光路从光学元件相同地延伸到物镜/物体。

监测装置对入射在其上的辐射的能量参数加以确定，例如测量辐射的强度或功率。监测装置可以配置为光检测器、ccd传感器等，并且特别是设计成用于检测波长范围为355nm至700nm的辐射；例如，它还具有10⁵的动态范围。如果显微镜也用于光学操纵技术，例如光学镊子，则监测装置能够检测其中使用的波长，例如1064nm或800nm。优选地，监测装置与控制装置连接，使得监测装置向控制装置提供对应于入射在监测装置上的测量辐射的能量参数的信号。

分束器装置可以设计为具有预定透射和反射特性的分束器。此外可以的是，分束器装置是布置在成像光路中的玻璃板。特别地，分束器装置被配置成使得耦合输出到监测装置的测量辐射与继续行进到物镜/物体的照明辐射的比例相比较小。例如，只有15％、10％、5％或1％的照明辐射作为测量辐射耦合输出到监测装置。分束器装置可选地布置在无限空间中，该无限空间位于物镜与管状透镜之间的成像光路中。无限空间是物镜与管状透镜之间的空间。

在共用光路中，也就是说在分束器装置与物镜之间的区域中，优选地没有布置光学成像元件，其可以在入射到物体中时改变照明辐射的能量参数。例如，在分束器装置与物镜之间的成像光路中不提供滤光器、透镜、光阑、针孔或光学器件。

这是因为光学成像元件将具有这样的效果：物体中的照明辐射的能量参数将被改变，并且该改变将不会被监测装置检测到。因此，监测装置将不能直接检测物体中存在的照明辐射的能量参数。优选地，分束器装置布置在紧邻物镜的共用光路中。例外的是快门，其在关闭状态下阻挡照明辐射并在用显微镜检查期间打开。当然，它在用显微镜检查期间无效。

控制装置可选地具有存储器，其中存储测量辐射的能量参数与物体上的照明辐射的能量参数之间的关系。该关系用于由测量辐射的能量参数的测得的实际值确定物体上的能量参数的相关瞬时值。因此，该关系的使用是从测量辐射到物体照明的转换步骤。可选地，可以进行逆转换，因为该关系在数学上通常是可逆的(当使用等式时)或者可以容易地建立相应的逆表。控制装置可以控制光源，使得由光源产生的照明辐射的能量参数具有在公差范围内的预定的规定能量参数。在该关系中可以进一步作为参数包括照明辐射的由物镜吸收或反射的份额和/或照明辐射的由物镜透射的份额，例如以透射率的形式。该值可以对于相应的物镜为已知，或者在物体的实际测量之前确定。特别是，该值以依赖于波长的方式存储在存储器中；该关系可以是依赖于波长的。此外，在控制装置的存储器中存储测量辐射与剩余的照明辐射存在怎样的比例关系。这也可以事先已知或在实际测量之前通过校准确定。基于关于物镜和分束器装置的信息，控制装置可以优选地从监测装置检测的测量辐射的能量参数计算存在于物体中的照明辐射的功率。例如，物体中存在的功率lo、用监测装置确定的功率l、由分束器装置耦合输出的辐射a的份额以及物镜的透射率t通过以下等式相关联：

如果要用作能量参数的是强度而不是功率，则功率还将除以监测装置上的辐射的面积。该面积可以是已知的，或者监测装置是空间分辨的，因此允许同时进行测量辐射的光束横截面的面积测量。

控制装置可选地控制光源，使得由光源产生的照明辐射的能量参数在考虑所述关系的情况下在公差范围内对应于预定的规定能量参数。规定的能量参数可以是要用于照明物体的期望值。因此，控制装置可以保持物体中的能量参数的值恒定。

由于优选在分束器装置与物镜之间不设置另外的光学成像元件，因此不必考虑其他参数如滤光器、针孔或透镜以及其透射或反射特性。此外，控制装置可以具有检测装置，通过该检测装置确定布置在成像光路中的物镜的类型，并且知道关于布置在成像光路中的各个物镜的传输特性的数据。

优选地，显微镜还具有用于自动聚焦装置的接口，其用于确定物镜在物体中的焦点，其中接口包括用于将自动聚焦辐射引导到物体的自动聚焦光路。于是，分束器装置具有双重功能，这在于一方面在物镜侧它将自动聚焦辐射耦合输入和/或输出于共用光路，并且另一方面在光源侧它将测量辐射耦合输出到监测装置。因此，在一种配置中，反射光显微镜具有自动聚焦装置，其用于确定物体的物镜焦点。自动聚焦装置具有用于将自动聚焦辐射引导到物镜的自动聚焦光路。分束器装置具有双重功能，这在于一方面在物镜侧它将自动聚焦辐射耦合输入和/或输出于共用光路，并且另一方面在光源侧它将测量辐射耦合输出到监测装置。在已知的反射光显微镜中，在共用光路中不存在足够的空间用于在其中适当地布置所有光学元件。特别是在物镜与管状透镜之间的光路部分中，也就是说在无限空间中，在传统显微镜中存在很小的空间。然而，由于分束器装置的双重功能，自动聚焦装置和监测装置都可以在空间受限区域中移动，并且尽管安装空间不足，但是可以设置监测装置和自动聚焦装置两者。关于物镜、光源、光学元件和/或监测装置，上述考虑类似地适用于该改进。此外优选的是，共用光路在耦合输出测量辐射的分束器装置与物镜之间没有光学成像元件。该接口被设计为使得自动聚焦装置可以连接于其上，并且同时可以引导与自动聚焦装置相关的辐射通过接口。当然，自动聚焦装置可以具有用于监测装置的可选接口。也可行的是，自动聚焦装置是由自动聚焦装置和监测装置组成的模块。接口例如是螺纹，并且自动聚焦光路可以包括横截面，自动聚焦辐射被引导通过该横截面。自动聚焦装置可以是与显微镜分离的元件，并且如wo2007/144197a1、de102008018562a1或de102008018864a1中所述设计。自动聚焦装置具有用于产生自动聚焦辐射的自动聚焦光源。通过自动聚焦光路经由分束器装置将自动聚焦辐射引导至物镜并因此引导到物体上。自动聚焦辐射被物体反射或散射，由物镜收集，并且通过自动聚焦光路经由分束器装置供给自动聚焦检测器。为此，可以在自动聚焦装置中提供分束器，借助于该分束器，进行由自动聚焦光源产生的自动聚焦辐射的耦合输入和/或源于物体的自动聚焦辐射到自动聚焦检测器的耦合输出。由自动聚焦光源产生的自动聚焦照明辐射和被引导到自动聚焦检测器的自动聚焦测量辐射在这里合并为术语“自动聚焦辐射”。它们通过分束器装置一起耦合输入或输出。然而，还可以在成像光路中提供另外的分束器，通过该分束器将自动聚焦辐射耦合输入到共用光路中或从共用光路中耦合输出。因此，在该实施方案中可行的是，自动聚焦光源和自动聚焦检测器布置在显微镜中的相距很远的不同位置上。

例如，在自动聚焦光路中可以放置成像到物体中的倾斜放置的光栅，使得借助自动聚焦检测器监测物体上的反向散射，并因此确定焦点的位置。在另一个实施方案中，自动聚焦光源可以在物体中产生点状光点，其锐度或范围借助自动聚焦检测器测量，因此可以得出与焦点位置有关的结论。特别地，自动聚焦装置与控制装置连接，其中控制装置可以基于由自动聚焦装置确定的值来设置或调整焦点的位置。因此，可以借助自动聚焦装置补偿焦点位置的漂移。自动聚焦辐射优选地在不用于对物体成像的波长范围内。例如，自动聚焦辐射处于红外波长范围内，并且照明辐射处于可见波长范围内。

分束器装置尤其设计为一体的或单件的，使得分束器装置的物镜侧表面和分束器装置的光源侧表面彼此靠近。在物镜侧，分束器装置可以设计为二向色镜的形式，它例如透射在物体的荧光辐射和照明辐射的波长范围内的光，并且反射自动对焦辐射的波长范围内的辐射。

当以高的的强度或功率照明物体时，有时希望通过仅暂时照明物体来避免物体中的荧光源的漂白。因此优选的是，在分束器装置与物体之间的成像光路中设置上述快门，其在一个操作状态下阻挡共用光路，使得没有照明辐射到达物体。快门通常与控制装置连接。即使使用起阻挡作用的快门，还可以检测照明辐射的能量参数。在快门位于分束器装置前面的情况下，则这是不可能的。在挡板打开的情况下，则照明辐射可以不受阻碍地通过。快门任选地还用于光学操纵实验，例如frap和/或激光烧蚀和/或flip。这里，照明装置用于操纵物体。在光学操纵实验中，照明辐射具有显著更高的功率。这意味着例如用照明装置漂白或烧蚀，并且对物体成像以记录荧光。在一些变型中，这些实验用两种不同的波长进行，于是同时使用；一个波长范围用于漂白或烧蚀，另一个波长范围用于成像。为了在能量参数具有正确的值或它达到恒定之前避免不期望的漂白，快门可以可选地是二向色的，即用于阻挡(仅)照明辐射并且其他波长可以透过它。

可以借助照明场光阑设定物体中的照明辐射的伸展，该照明场光阑布置在与物平面共轭的中间像平面中。照明场光阑布置在光源的后面，并且特别是沿照明方向布置在分束器装置的前方，例如在照明光路中的共用光路之外，例如在光学元件与光源之间。优选地，照明场光阑具有与控制装置连接的驱动器。此外，控制装置可以被设计为检测照明场光阑的开度，例如以便检测照明场光阑的手动调节。

当照明辐射和自动聚焦辐射平行行进时，可以特别容易地实现来自照明辐射的测量辐射的耦合输出或自动聚焦辐射的耦合输入或输出。因此优选的是，分束器装置布置在光学元件与物镜之间的其中共用光路平行延伸的部分中。因此，分束器装置可以布置在无限空间中。上述快门通常设置在共用光路的在无限空间中的部分中。

为了能够更好地确定物体中存在的照明辐射的能量参数，显微镜具有监测光阑，其布置在分束器装置与监测装置之间并且其开度可调节，并具有控制装置，它根据物镜的有效孔径设定监测光阑的开度。有效孔径特别对应于照明辐射在照明方向上进入物镜时的范围。如果照明辐射的范围大于物镜的孔径，则有效孔径对应于物镜的孔径。如果物镜处的照明辐射的范围小于物镜的孔径，例如因为它受到照明场光阑的限制，则有效孔径对应于照明场光阑的直径。

此外，可以更换具有不同开度的监测光阑，例如通过用滑块将所需的监测光阑插入测量辐射中。

如果有效孔径不对应于测量辐射的直径，则可以借助监测光阑使测量辐射的直径适应于有效孔径。为此，监测光阑可以与控制装置连接，该控制装置使监测光阑的开度适应于有效孔径。例如，有效孔径可以确定为物镜的孔径，特别是如果照明辐射的直径大于物镜的直径，或者通过检测照明场光阑的开度。以这种方式，可以更精确地监测物体中的照明辐射的能量参数，因为透过物镜的照明辐射和测量辐射的范围是相同的。特别地，测量辐射的横截面适配成使得照明辐射的相同份额可以通过物镜和监测光阑。以这种方式，由于照明辐射的不均匀强度分布或功率分布，例如高斯分布，可以使测量的能量参数与物体中存在的能量参数之间的偏差最小化。

为了减小结构尺寸并降低显微镜的制造成本，优选的是将测量辐射聚焦到监测装置上的监测光学器件布置在分束器的后面，其中监测装置优选地具有非空间分辨检测器，例如光电二极管。于是可行的是与监测光阑一起使用非空间分辨检测器，并且仍然考虑照明辐射的直径或有效孔径。由于非空间分辨检测器通常具有比空间分辨检测器更小且更简单的结构，因此可以节省安装空间和费用。

然而，有效孔径的检测也可以通过具有空间分辨检测器的监测装置进行，例如ccd(电荷耦合器件)传感器。借助空间分辨检测器可确定测量辐射的光束横截面。特别地，可以确定照明辐射的光斑的强度分布和/或形状和尺寸。借助这些结果可以更准确地给出物体中存在的照明辐射的能量参数。

此外优选的是，显微镜具有至少一个滤光器，该滤光器用于衰减和/或吸收照明辐射的至少一个波长范围，布置在分束器装置与监测装置之间。滤光器可用于衰减照明辐射的整个波长范围。通过它可以使用监测装置检测具有高能量参数的照明辐射，而不会损坏监测装置。滤光器使得可以借助监测装置检测更大的能量参数范围。此外，滤光器也可以设计为带通滤光器，其仅允许特定波长范围的辐射通过。特别是当监测装置被设计为用于检测预定波长范围的辐射时，这种滤光器可以避免由于来自其他波长范围的辐射引起的测量误差。此外，滤光器可以设置为长通或短通滤光器，以在监测装置之前阻挡不希望的辐射，例如自动聚焦辐射或荧光的辐射。优选地，将一个或多个滤光器以上述方式设置在分束器装置与监测装置之间。

特别有利的是，滤光器可以在照明辐射的以测量辐射形式耦合输出的部分中引入和引出。以这种方式，可以根据照明辐射的波长范围来优化测量辐射的检测。特别优选的是，显微镜包括滤光器驱动装置，其用于将至少一个滤光器从测量辐射中移出或移入测量辐射中。滤光器驱动装置可包括例如电动机或线性驱动器。滤光器驱动装置尤其与控制装置连接，使得可以借助控制装置控制至少一个滤光器的位置。控制装置可以例如根据分束器装置与监测装置之间的照明辐射的能量参数和照明辐射的波长范围自动地移动相应的滤光器。或者，这也可以手动进行。

此外优选的是，分束器装置可以移入或移出共用光路。为此，分束器装置可具有优选地与控制装置连接的驱动器。在共用光路中没有分束器装置的情况下，照明辐射以最大可能的能量参数耦合输入到物体中，因为此时没有分离出测量辐射。此外，可以仅当实际需要监视光源时才将分束器装置放置到共用光路中。在该实施方案中，当分束器装置处于/不处于共用光路中时，通过计算，即关于测量辐射，校正照明辐射的能量参数。

监测装置可以具有用于检测宽带波长范围内的照明辐射的检测器。此外可行的是，监测装置具有一个或多个检测器，其仅检测特定波长范围的辐射。然而，为了检测多个波长范围，可以提供用于根据波长范围分离照明光束的装置，例如棱镜和/或光栅。于是将它们沿照明方向布置在监测装置的检测器的前面。此外可行的是，监测装置包括光谱仪。由于检测多个波长范围的可能性，可以借助监测装置检测当前使用多个光源中的哪一个来照明物体。特别是当物体相继或同时用不同波长范围内的照明辐射照明时，这是有帮助的。

在一个改进方案中提出，开头提到的存储在控制装置中的关系是依赖于波长的，并且控制装置确定照明辐射的波长和/或布置在照明辐射中的激发滤光器。可以通过检测瞬时激活的光源来确定照明辐射的波长或波长范围，其中光源的光谱范围存储在控制装置中。可以通过激发滤光器修改照明辐射的波长范围。例如，激发滤光器用作带通滤光器，其透射范围为510nm至550nm。为了确定激发滤光器，可以例如手动输入其透射光谱。此外，控制装置可以检测其上布置有多个激发滤光器的转台的位置。为了确定激发滤光器的特性，可以提出控制装置使用数据库，其中存储所使用的激发滤光器的透射光谱。

通过知晓所使用的激发滤光器和/或照明辐射的一个或多个波长，因此知道哪个波长范围覆盖照明辐射。如果同时该关系是依赖于波长的，则可以相对于照明辐射的波长范围调整用以照明物体的能量参数。

可选地设置为，该关系依赖于物镜的参数。物镜的参数可以是数值孔径、瞬时视场、放大率、孔径和/或物场。如上所述，参数也可以是透射特性和/或反射特性，也是以依赖于波长的方式。物镜的参数可以手动输入，存储在控制装置中，或者由控制装置确定。例如，多个物镜布置在转台上，并且控制装置可以检测转台的位置并因此确定哪个物镜布置在照明光路中。为此，控制装置可以与可以检测转台位置的传感器连接。此外还可行的是为物镜设置标记，例如rfid芯片，并且基于相应物镜的标记确定与控制装置连接的传感器。通过确定物镜，该关系可以适应于物镜的不同透射或反射特性。由此更准确地确定照明辐射的能量参数。

可选地提出，该关系依赖于照明辐射的直径、照明辐射的轮廓、照明辐射的会聚程度和/或存在于物体与物镜之间的浸没介质。照明辐射的直径可以例如通过照明场光阑来设定。为此，控制装置可以与传感器连接，该传感器可以检测照明场光阑的开口的尺寸。此外可行的是手动输入照明辐射的直径，例如在相应地设定照明场光阑之后。此外，也可以通过已知各个光源的照明辐射的直径而设定照明辐射的直径。类似地，例如可以通过对于所使用的每个光源已知照明辐射的轮廓而确定照明辐射的轮廓。照明辐射的会聚程度可以依赖于显微镜的相应类型或要进行的测量。例如，辐射对于宽视场成像或在全内反射显微镜(tirf)的情况下是会聚的。在激光扫描显微镜、光学镊子或光学操纵中，照明光束可以平行行进。这可以例如通过输入接口传送到控制装置。

所述的所有参数和存在于物镜与物体之间的浸没介质对物体中的照明辐射的能量参数具有影响。通过知晓一个、多个或所有这些参数可以修改该关系，使得其提供测量辐射的能量参数与物体中的照明辐射的能量参数之间的更准确的关联。因此，所述参数可以作为变量包含在该关系中。

在一个改进方案中提出，光源被设计为同时产生具有至少两个不同波长的照明辐射，和/或监测装置被设计为对于至少两个不同波长确定照明辐射的能量参数。在该优选的改进方案中还可行的是对于两个不同的波长范围同时控制物体中的照明辐射的能量参数。优选地，这也可以对三个或更多个不同的波长范围实施。为此提出对于每个波长范围在控制装置中存储相应的关系。

在用于从照明辐射耦合输出测量辐射的分束器与物镜之间可选地设置元件。特别是与激光扫描显微镜结合，经常使用“微分干涉对比度”，其中将棱镜例如沃拉斯顿棱镜直接在物镜后面在成像方向上插入物镜光瞳中。这也可以是依赖于波长的，于是在该实施方案中也可以优选地考虑波长。

当然，在不脱离本发明的范围的情况下，上述特征和下面还要说明的特征不仅可以以给定的组合使用，而且可以以其他组合使用或单独使用。

附图说明

下面示例性地基于附图更详细地解释本发明，附图还公开了本发明的基本特征。在图中：

图1示出显微镜的第一实施方案的示意图；

图2示出显微镜的第二实施方案的示意图；并且

图3示出显微镜的第三实施方案的示意图。

具体实施方式

根据图1中所示的实施方案的反射光显微镜10用于对物体12成像，特别是在宽视场中。显微镜10也可以设计为共聚焦显微镜；在这种情况下，光路中通常存在针孔。物体12可包含荧光染料或在刺激后发出荧光辐射的物质。显微镜10包括物镜14、光源16、光学元件18、监测装置20、分束器装置22、用于自动聚焦装置24的接口23、成像检测器26和控制装置28。

物镜14、分束器装置22、光学元件18和透镜元件30以及成像检测器26形成成像光路32。光源16、光学元件18、分束器装置22和物镜14形成照明光路34。成像光路32和照明光路34在物镜14与光学元件18之间在共用光路中延伸。

因此，物镜14既用于将照明光路34的照明辐射聚焦到物体12上，也用于通过成像光路32对物体12进行成像。使用物镜14和透镜元件30将物体12成像到成像检测器26上；透镜元件30可以被认为是管状透镜。成像检测器26将入射在其上的辐射转换成电信号，该电信号例如通过线路传输到控制装置28。控制装置28由电信号产生物体12的图像，该图像可以显示在未示出的显示装置上。例如，物体12的图像可以是荧光图像。

光源16可以设计为激光器、发光二极管(led)或白光源。光源16优选地产生平行化照明辐射；为此，光源16可具有图中未示出的透镜或透镜系统，其使照明辐射平行化。经由例如被设计为二向色镜的光学元件18将照明辐射耦合输入到成像光路32中。照明辐射包括例如用于刺激物体12中的荧光辐射的波长范围。由物体12发射的辐射通常优选地具有与照明辐射的波长范围不同的波长范围，因此光学元件18通常是二向色的并且仅作用于照明辐射。

借助例如可以设计为分束器的分束器装置22将一部分照明辐射作为测量辐射从共用光路分离，特别是以与波长无关的方式，并将其供给至监测装置20。照明辐射的耦合输出的部分可以达到例如分离之前的照明辐射的强度或功率的10％、5％或1％。在图1中的显微镜10的实施方案中，监测装置20被设计为空间分辨检测器，例如ccd传感器(电荷耦合器件)，其以空间分辨的方式将入射到其上的辐射转换成电信号。由监测装置20产生的电信号通过线路被引导到控制装置28。由监测装置20产生的电信号特别地与入射到监测装置20上的辐射的强度或功率成比例，使得控制装置28可以由这些信号对入射在监测装置20上的测量辐射的强度加以确定。

优选地，控制装置28具有存储器36，在其中存储可选地依赖于波长的关系，所述关系描述由分束器装置22作为测量辐射从共用光路分离到监测装置20的照明辐射的百分比。存储器36可以是例如可写或不可写的存储介质，例如ram或rom。基于由监测装置20检测的测量辐射的能量参数，控制装置28可以确定由光源16提供的照明辐射的能量参数。然而更重要的是，控制装置28通过该关系确定物体12中的照明辐射的能量参数。该关系将测量辐射的能量参数与物体12上的照明辐射的能量参数相关联。然后，控制装置28可选地控制光源16，使得由光源16产生的照明辐射的能量参数在公差范围内对应于预定的规定能量参数。

该关系可以依赖于物镜14的参数。物镜14的参数可以是数值孔径、瞬时视场、放大率、孔径或物场。物镜14的参数可选地是物镜14的透射和/或反射特性。为此，控制装置28可以与物镜14连接，以确定例如当时设置在共用光路32中的物镜的类型。例如，多个物镜14可以布置在转台上，并且控制装置28可以检测当时哪个物镜14存在于共用光路中。优选地，在存储器36中存储以依赖于波长的方式给出物镜14的透射和/或反射特性的关系。此外，还可以存储要在显微镜10中使用的物镜14的孔径。基于物镜14的透射和/或反射特性以及照明辐射强度的知识，控制装置28尤其可以精确地确定存在于物体12中的照明辐射的能量参数。例如，物体12中存在的功率lo、用监测装置20确定的功率l、由分束器装置22耦合输出的辐射a的份额以及物镜14的透射率t通过以下等式关联：

由于监测装置20具有空间分辨检测器，因此控制装置28还确定测量辐射的光束横截面。如果照明辐射的范围大于物镜14的孔径，则并非所有照明都通过物镜14，并且并非所有可用的照明辐射都聚焦到物体12上。因此，借助空间分辨监测装置20，如果所述关系具有物镜14的孔径作为参数，当确定物体中的照明辐射的能量参数时，可以考虑未被利用的照明辐射的份额。

此外，存储的关系可以依赖于照明辐射的直径、照明辐射的轮廓、照明辐射的会聚程度和/或存在于物体12与物镜14之间的浸没介质。照明辐射的直径可以例如通过照明场光阑41来设定。为此，控制装置28可以与传感器连接，该传感器检测照明场光阑41的开口的尺寸。此外可行的是手动输入照明辐射的直径，例如在相应地设定照明场光阑41之后。此外，由于对于相应的光源16是已知的，也可以确定照明辐射的直径。类似地，可以确定照明辐射的轮廓，这通过对于使用的每个光源16已知其照明辐射的轮廓而实现。照明辐射的会聚程度可以依赖于显微镜的相应类型或要进行的测量。例如，辐射对于宽视场成像或在全内反射显微镜(tirf)的情况下是会聚的。在激光扫描显微镜、光学镊子或光学操纵中，照明辐射可以是平行的。该信息例如可以通过输入接口提供给控制装置28。

所有所述的参数和存在于物镜14与物体12之间的浸没介质对物体12中的照明辐射的能量参数具有影响。通过知晓一个或多个或所有这些能量参数，可以修改该关系，使得其由测量辐射的能量参数提供物体中的照明辐射的能量参数的更准确信息。因此，该关系可以具有所述参数作为变量。

光源16可以被设计为同时产生具有至少两个不同波长的照明辐射。监测装置20还可以被设计为在至少两个不同波长的情况下确定照明辐射的能量参数。在该改进方案中，可以对于两个、三个或更多个不同的波长范围控制物体12中的照明辐射的能量参数。为此提出对于每个波长范围将相应的关系存储在控制装置28中。

显微镜具有自动聚焦装置24，其辐射可以被引导通过接口23。接口23例如是螺纹，并且自动聚焦光路可以包括开口，自动聚焦辐射通过该开口被引导。自动聚焦装置24用于检测物镜14的焦点位置。举例来说，在wo2007/144197a1中描述了合适的自动聚焦装置24。自动聚焦装置24可以是与显微镜10分开的元件，并产生自动聚焦照明辐射，其波长范围优选地与照明辐射的波长范围或者由物体12产生的荧光辐射的波长范围不一致。监测装置20从物体接收的自动聚焦测量辐射中检测物镜14的焦点位置，并将该信息发送到控制装置28。于是，控制装置28可以保持物镜14的焦点恒定。然而，这也可以通过单独的控制来实现。因此，例如可以通过物镜14的控制来补偿漂移和其他影响。

在物镜侧，分束器装置22设置有二向色镜，该二向色镜反射自动聚焦辐射并透射照明辐射以及荧光辐射。在光源侧，分束器装置22具有分束器，其用于将测量辐射从照明光路耦合输出。可选地，二向色镜和分束器的特性可以在单个光学分束器层中实现。分束器装置22优选地是具有涂层的单件元件，所述涂层影响其反射或透射特性。

共用光路在物镜14与分束器装置22之间没有光学成像元件；在图1中所示的实施方案中，在该区域中没有设置元件。这里，辐射以近似平行的方式行进；这对应于无限空间。

图2中所示的显微镜10的实施方案在基本结构方面与图1中所示的实施方案一致。尽管图2中未示出自动聚焦装置24，但是同样可以在图2中提供。下面仅涉及根据图1和2的两个实施方案之间的其他差异：

在共用光路中，在物镜14与分束器装置22之间设置快门38。快门38通过线路与控制装置28连接，并且可由控制装置28在两个操作状态之间切换。在一个操作状态中，快门38阻挡共用光路，使得没有照明辐射可以到达物体12。在另一个操作状态中，快门38打开，使得共用光路是敞开的。

作为独立于快门的选择，在光源16的后面布置照明场光阑41，通过其可改变照明辐射的视场尺寸。照明场光阑41经由线路与控制装置28连接，其中控制装置28可以控制和/或确定照明场光阑41的开口的位置和/或尺寸。以这种方式可以在共用光路之前改变照明辐射的横截面。

作为另一个独立选择，图2所示的实施方案中的监测装置20设计为非空间分辨检测器，例如光电二极管。它与根据图1的空间分辨检测器相比占用更少的空间，并且结构更简单。为了将测量辐射聚焦到监测装置20上，将监测光学器件42布置在分束器装置22与监测装置20之间。监测光学器件42可包括一个或多个透镜。监测光学器件42将从平行化照明光路34耦合输出的测量辐射聚焦到监测装置20上。

此外，在分束器装置22与监测装置20之间布置可选的可变光阑44和可选的滤光器46。可变光阑44与控制装置28连接，由此控制装置28可以改变和/或确定可变光阑的开口的尺寸。特别地，控制装置28控制可变光阑44，使得其开口与物镜14的有效孔径一致。以这种方式，测量辐射的横截面和照明辐射的横截面在物镜14穿过的照明光路34中具有相同的尺寸。因此，可以更好地确定物体12中存在的照明辐射的强度。如上所述，物镜14的有效孔径由物镜14的类型和照明场光阑41的开口的尺寸确定。

一方面，可以提供滤光器46用于衰减测量辐射，特别是以与波长无关的方式，例如以避免损坏监测装置20或增大监测装置20对于强度的测量范围。另一方面，滤光器46可以配置成使得它阻挡不期望的辐射，这可能使照明辐射强度的测量结果失真。例如，阻挡自动聚焦辐射或荧光的波长范围内的辐射。此外，滤光器46可以设计为带通滤光器，使得只有在可被监测装置20检测的波长范围内的辐射入射到监测装置20上。如上所述，显微镜10可包括一个或多个滤光器46。特别地，显微镜10具有滤光器驱动装置48，通过其可用于更换或移除分束器装置22与监测装置20之间的滤光器46。特别地，控制装置28控制滤光器驱动装置48，使得相应测量所需的滤光器46接入在分束器装置22与监测装置20之间。

分束器装置22可以由共用光路形成。为此，可以提供驱动器49，例如电动机或线性驱动器。驱动器49与控制装置28以数据技术方式通过图中未示出的线路或通过无线电连接。通过从共用光路或从照明光路34移除分束器装置22，在物体12处达到由光源16产生的最大强度，因为在这种情况下没有耦合输出测量辐射。

图3中所示的显微镜的实施方案与图2中所示的显微镜10的实施方案一致，除了提供光谱元件50代替滤光器46。然而也可行的是，滤光器46和光谱元件50均设置在监测装置20与分束器装置22之间。光谱元件50以依赖于波长的方式偏转测量辐射。例如，光谱元件50包括衍射光栅或棱镜。此外，监测装置20具有多个特别是非空间分辨的检测器，其分别检测一个波长范围内的入射辐射。由光谱元件50以依赖于波长的方式偏转的辐射借助监视光学器件42聚焦到监测装置20的相应检测器上。以这种方式，监测装置20以光谱分析的方式设计。这也可以以不同的方式实现，例如使用光谱仪。

控制装置28被设计为连续地或在选定的时间点在存储器36中存储所检测的照明辐射强度，使得对于用显微镜10记录的物体12的图像，给出照明辐射的强度。以这种方式，可以更好地记录并在需要时再现测量结果。

在图2和3中所示的实施方案中，可以提供布置在照明光路中的激发滤光器33。例如，激发滤光器33布置在照明场光阑41的后面。通过激发滤光器33，例如通过具有510nm至550nm的透射范围的激发滤光器33修改照明辐射的波长范围。为了考虑激发滤光器33，可以例如手动输入其透射光谱，使得该信息对于控制装置28可用。此外可行的是，控制装置28被设计为用于检测未示出的转台的位置，在转台上布置有多个激发滤光器33。为了确定激发滤光器33，还可以提出控制装置28使用数据库，其中存储可用的激发滤光器33的透射光谱。如果控制装置知晓使用的激发滤光器33，则它知晓照明辐射覆盖的波长范围。如果该关系是依赖于波长的，则可以对于照明辐射的波长范围调整用以照明物体12的能量参数。