本发明属于光学领域，具体涉及一种基于多面体棱镜和频率调制的多光束激光共聚焦高速扫描成像方法与装置。
背景技术：
共焦显微技术是提供物体的一个或多个层面的高分辨率图像的现有技术，单个点光源发出的光束经物镜聚焦到物体表面，光束经物体反射荧光或透射荧光后再经聚焦透镜聚焦到针孔后进入光电探测器。
为了提高激光扫描共焦显微技术的成像速度，通常采用多焦点光束形成多个具有衍射极限质量并且能够分散聚焦的焦点同时激发样品。多焦点扫描显微技术和单光束激发扫描显微技术主要区别在于多焦点扫描显微技术需要一个多焦点光束产生装置和多焦点光束探测装置，现有的多焦点显微技术主要采用微透镜阵列、光束分离器和衍射光学元件等方法实现激光光束的分光和产生多个焦点；或者利用照明光束的振幅调制、位相调制上实现激光束直接聚焦产生多个焦点。例如，在先技术中，参见“多焦点光束产生装置及多焦点共焦扫描显微镜.授权号：ZL 201210030310.9”，多焦点的产生是通过对照明光束引入和振幅调制。在先技术中，参见“一种相位板多焦点产生装置及方法.申请号：201210030296.2”，多焦点的产生是通过对照明光束的波前相位分布进行了0相位和π相位调节。
为了配合共焦扫描显微镜的逐点扫描成像过程，用于实现多焦点共焦扫面显微技术的多焦点光束经聚焦后的焦斑应该成单列、等距分布，且每个焦点应该具有尽可能高地均匀性，即各个焦点的强度应保持一致，目的是为了避免图像重构时的误差。另外，必须有合适的探测方法能够区分多焦点的每一个焦点激发的样品荧光信号，为共焦扫描显微镜的逐点扫描成像提供依据。
然而现有的多焦点显微技术均无法有效地实现上述单列、等距分布的多焦点和多焦点激发荧光信号的区分。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题，目的之一在于提供一种多面体棱镜和频率调制的多光束激光共聚焦高速扫描成像方法与装置，本发明利用多面体棱镜和频率调制器产生单列、等距的具有不同调制频率的多焦点，采用频率解调算法区分出探测器接收的多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。
本发明提供了一种基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的装置，具有这样的特征，包括聚焦物镜、光束变换透镜单元、二维振镜、二向色镜、聚焦透镜单元、针孔组件、多面体棱镜、探测器、频率调制器，其中，频率调制器、二向色镜、多面体棱镜以及所述二维振镜沿第一光轴线依次设置，二维振镜、光束变换透镜单元、聚焦物镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，二向色镜、聚焦透镜单元、针孔组件以及探测器沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，聚焦透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。
本发明提供了一种基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法，利用上述的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的装置，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将频率调制器、二向色镜、多面体棱镜以及二维振镜沿第一光轴线依次设置；
步骤2，将二维振镜、光束变换透镜单元、聚焦物镜、样品沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；
步骤3，将二向色镜、聚焦透镜单元、针孔组件以及探测器沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，其中，聚焦透镜单元面对二向色镜的反射面；
步骤4，入射光束经过频率调制器后，输出多束具有不同载频的平行光；
步骤5，多束具有不同载频的平行光经过二向色镜进入多面体棱镜后，输出多束与光轴有一定夹角的折射光束(该发明中简称多束折射光束)；
步骤6，多束折射光束经过二维振镜、光束变换透镜单元、聚焦物镜后在样品上产生多个聚焦光斑；
步骤7，多个聚焦光斑激发样品产生荧光，形成多个与聚焦光斑对应的荧光光斑；
步骤8，荧光光斑经过聚焦物镜、光束变换透镜单元、二维振镜、多面体棱镜、二向色镜、聚焦透镜单元后，在针孔组件上形成一个荧光聚焦光斑，并被探测器接收；
步骤9，利用频率解调算法，并通过分析探测器上多个荧光聚焦光斑的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，多面体棱镜为具有底面和多个棱面的柱体，其横截面为多边形，光束的方向与底面垂直且光束先进入底面，聚焦光斑为一维阵列分布，聚焦光斑的数量与棱面的数量相同。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，光束变换透镜单元用于光束变换，将从多面体棱镜出射的多束折射光始终充满聚焦物镜的入瞳，实现聚焦物镜的最佳成像性能，光束变换透镜单元包括两个光束变换透镜或多个光束变换透镜的组合。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，多个聚焦光斑的位置由多面体棱镜的折射率、聚焦物镜的焦距以及棱面与底面的角度决定。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，多面体棱镜的横截面为三角形的三棱镜时，三角形包括底边、第一棱边以及第二棱边，聚焦物镜对来自第一棱边、第二棱边的折射光束进行聚焦后在样品上得到第一聚焦光斑、第二聚焦光斑，第一聚焦光斑与第二光轴线的距离h1表达式为：
h1＝fsin[asin(nsinθ1-θ1)]
第二聚焦光斑与第二光轴线的距离h2表达式为：
h2＝fsin[asin(nsinθ2-θ2)]
θ1为第一棱边与底边的夹角，θ2为第二棱边与底边的夹角，n为三棱镜的折射率，f为聚焦物镜的焦距。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，当多面体棱镜为具有底面和多个棱面的锥棱镜，底面与光束方向垂直，聚焦光斑为二维阵列分布，聚焦光斑的数量与棱面的数量相同。
另外，在本发明提供的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的方法中，还可以具有这样的特征：其中，二向色镜与入射光束的夹角为45度。
本发明提供了一种多焦点共焦扫描显微镜，具有这样的特征，包括上述的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的装置。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的装置和方法，利用多面体棱镜在聚焦物镜的聚焦面上产生阵列聚焦光斑，实现多点同时扫描成像，显著提高了激光共聚焦扫描成像的帧速，达到高速成像的目的。
另外，也可以在帧速不变的情况下，提高单帧图像的像素数。理论上，相比于传统的单点扫描成像，对于相同像素的一帧图像，N个聚焦光斑的多点扫描成像的成像速度可以提高N倍；对于帧速相同，一帧图像的像素数可以提高N倍。例如，可以将当前行业中单点激光共聚焦扫描成像的典型参数512*32像素/帧、帧速400帧/秒，提高为512*32像素/帧、帧速400N帧/秒,或者为512*32N像素/帧、帧速400帧/秒。
附图说明
图1是本发明的实施例中多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像示意图；
图2是本发明的实施例一中多面体棱镜的三维示意图；
图3是本发明的实施例一中扫描样品时提高成像速度的示意图；
图4是本发明的实施例二中样品上的聚焦光斑分布示意图；
图5是本发明的实施例三中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；
图6是本发明的实施例四中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；
图7是本发明的实施例五中棱镜剖面及聚焦光斑分布示意图；以及
图8是本发明的实施例六中立体棱镜及聚焦光斑分布示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像装置及方法作具体阐述。
实施例一
多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像装置包括聚焦物镜2、光束变换透镜单元、二维振镜5、二向色镜6、聚焦透镜单元、阵列探测器8、多面体棱镜、探测器10、频率调制器11。聚焦透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合；多面体棱镜为柱体，其横截面为具有底边和多条棱边的多边形，光束g的方向与底边垂直且光束g先进入底边，聚焦光斑的数量与棱边的数量相同，多面体棱镜的作用是产生多束与光轴(y轴)有一定夹角的平行光束。
本实施例中，光束变换透镜单元包括透镜3、透镜4，聚焦透镜单元为单透镜7，多面体棱镜为多面体棱镜为图1、2所示的三棱镜9。
如图1所示，频率调制器11、二向色镜6、三棱镜9以及二维振镜5沿第一光轴线依次设置，二维振镜5、透镜4、透镜3、聚焦物镜2沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，二向色镜6、透镜7、针孔组件8以及探测器10沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置。
一束平行光经过频率调制器11后，输出两束具有不同载频的平行光f1、f2，经过三棱镜9后，两个棱面产生两束具有不同载频，分别与光轴(y轴)有一个倾斜角的斜入射平行光g1、g2，该斜入射平行光g1、g2作为激光共聚焦扫描显微镜的照明光源。
根据光学原理，这两束斜入射平行光经过二向色镜6、二维振镜5、透镜3、透镜4、聚焦物镜2后在样品1上产生两个具有不同调制频率聚焦光斑(如图4所示的聚焦光斑A和聚焦光斑B)。这两个聚焦光斑的位置由三棱镜9两个锐角的角度及其折射率、聚焦物镜2的焦距决定。此时聚焦光斑A和聚焦光斑B在xy平面上沿着y轴排列。如果多面体棱镜的面沿着一个维度(如x轴方向)是不变的，得到如图4所示的一维阵列的聚焦光斑。
透镜3和透镜4组成一个光束变换透镜组，其作用是起光束变换作用，使三棱镜9出射的两束斜入射平行光始终充满聚焦物镜2的入瞳，实现聚焦物镜2的最佳成像性能。在实际应用中，透镜3和透镜4组成的光束变换透镜组并不一定由图1示意图所示的两个透镜3和透镜4两个透镜组成，可以为更多个透镜组成，来实现光束变换的作用。
根据光路传输的可逆原则，聚焦物镜2后在样品1上产生的两个具有不同调制频率的聚焦光斑激发样品1上的荧光，形成两个与聚焦光斑对应的荧光光斑，发出的荧光光斑经过聚焦物镜2、透镜3、透镜4、二维振镜5、三棱镜9、二向色镜6、透镜7，在针孔组件8上形成一个荧光聚焦光斑，并被针孔组件8后面的探测器10接收。
通过分析探测器10的光斑强度随着二维振镜5的扫描变化，同时利用频率解调算法，就可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品1信息的二维图像。
二维振镜5包括两个一维振镜，两个一维振镜通过机械方式固定为正交布置方式，两个一维振镜分别是聚焦光斑在x方向和y方向移动，从而实现两个聚焦光斑在xy平面上实现二维扫描。一维振镜可以为检流计振镜或者共振振镜，如Cambridge Technology公司Galvanometer Optical Scanner 6230H，与CRS 8kHz Resonant Scanner，实施例中，一维振镜采用共振振镜。
二向色镜6放在三棱镜9与频率调制器11之间，用于将返回的荧光信号反射至透镜7后在针孔组件8上形成一个荧光聚焦光斑，并被针孔组件8后面的探测器10接收。实施例中，二向色镜6与平行光f1、f2的夹角为45度。
频率调制器11可以是液晶斩波器、机械斩波器，或者其它能够给入射光束实时频率调制的方案。
探测器10为光电探测器，包括点式光电探测器和阵列式光电探测器，如光电倍增管、雪崩二极管、电子倍增CCD等。通过结合频率解调算法实现多聚焦光斑的同时探测。
多面体棱镜采用光学玻璃、塑料等光学材料制成，实施例中，三棱镜9采用光学玻璃制成。每一个聚焦光斑的强度决定于其对应棱面的面积相对于整个入射光束截面积之比，频率调制器11采用液晶斩波器，探测器10采用光电倍增管。
样品1、聚焦物镜2、透镜3、透镜4、二维振镜5、二向色镜6、透镜7、针孔8、探测器10构成典型的激光共聚焦扫描显微镜。
聚焦物镜2、透镜3、透镜4、二维振镜5、二向色镜6、透镜7、针孔组件8、探测器10构成典型的激光共聚焦扫描显微镜，然而该激光共聚焦扫描显微镜根据一束平行光在样品上只能得到一个聚焦光斑，本实施例中，采用三棱镜9将一束平行光g经过两个棱面后产生两束斜入射平行光g1、g2，在样品1上可以得到两个聚焦光斑。样品1上与聚焦光斑对应的荧光光斑经过聚焦物镜2、透镜3、透镜4、二维振镜5、三棱镜9、二向色镜6、透镜7，在针孔组件8上形成一个荧光聚焦光斑，并被针孔组件8后面的探测器10接收，通过分析探测器10的光斑强度随着二维振镜5的扫描变化，同时利用频率解调算法，就可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品1信息的二维图像。
如图3所示，假设共焦扫描成像最终要得到一辐n行n列的图像，如果利用多面体棱镜产生2个点的列分布焦点，则只需扫描n/2行，成像速度可以比现有的成像速度提高1倍。
进一步地，如果利用多面体棱镜产生m个点的列分布焦点，则只需扫描n/m行，成像速度可以提高m倍。
一种基于多面体棱镜的多光束共聚焦高速扫描成像的方法，包括以下步骤：
步骤1，将频率调制器11、二向色镜6、多面体棱镜9以及二维振镜5沿第一光轴线依次设置；
步骤2，将二维振镜5、光束变换透镜单元、聚焦物镜2、样品1沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；
步骤3，将二向色镜6、聚焦透镜单元7、针孔组件8以及探测器10沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，其中，聚焦透镜单元7面对二向色镜6的反射面；
步骤4，入射光束经过频率调制器11后，输出多束具有不同载频的平行光；
步骤5，多束具有不同载频的平行光经过二向色镜6进入多面体棱镜9后，输出多束折射光束；
步骤6，多束折射光束经过二维振镜5、光束变换透镜单元、聚焦物镜2后在样品1上产生多个聚焦光斑；
步骤7，多个聚焦光斑激发样品1产生荧光，形成多个与聚焦光斑对应的荧光光斑；
步骤8，荧光光斑经过聚焦物镜2、光束变换透镜单元、二维振镜5、多面体棱镜9、二向色镜6、聚焦透镜单元后，在针孔组件8上形成一个荧光聚焦光斑，并被探测器10接收；
步骤9，利用频率解调算法，并通过分析探测器10上多个荧光聚焦光斑的强度并随着二维振镜5的扫描变化，可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。
实施例二
如图1所示，如果三棱镜9的两个棱面m1和m2与z轴的夹角分别为θ1和θ2，三棱镜9的折射率为n，则可以得到棱面m1的折射光与第一光轴线(y轴)夹角为θ1′＝asin(nsinθ1-θ1),如图4所示，聚焦光斑A到第二光轴线(x轴)的距离h1＝fsin[asin(nsinθ1-θ1)]，其中f是聚焦物镜2的焦距。同理，聚焦光斑B到第二光轴线的距离h2＝fsin[asin(nsinθ2-θ2)]。因此，可以通过三棱镜的折射率为n、棱面m1、m2与z轴的夹角，以及聚焦透镜2的焦距f可以精确控制聚焦光斑的位置。如果平面m1与m2关于第一光轴线不对称，则聚焦光斑A与聚焦光斑B的强度不同。聚焦光斑A与聚焦光斑B的强度决定于棱面m1、m2的面积与整个入射光束截面积之比。
实施例三
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图5中左面所示的多面体棱镜以及频率调制器11输出三束具有不同载频的平行光。该多面体棱镜为四面柱体棱镜，具有底面和三个棱面，三个棱面沿第一光轴线对称设置。
一束平行光经过频率调制器11后，输出三束具有不同载频的平行光，本实施例中聚焦光斑分布为：在样品1上形成如图5中右面的三个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。如果棱面与光束g垂直且沿第一光轴线对称设置，经过该棱面得到的聚焦光斑在坐标轴的原点上。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一辐n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生3个点的列分布焦点，则只需扫描n/3行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高3倍。
实施例四
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图6中左面所示的多面体棱镜以及频率调制器11输出四束具有不同载频的平行光。该多面体棱镜为五面柱体棱镜，具有底面和四个棱面，四个棱面沿第一光轴线对称设置。
一束平行光经过频率调制器11后，输出四束具有不同载频的平行光，本实施例中聚焦光斑分布为：在样品1上形成如图6中右面的四个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一辐n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生四个点的列分布焦点，则只需扫描n/4行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高4倍。
实施例五
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图7中左面所示的多面体棱镜以及频率调制器11输出五束具有不同载频的平行光。该多面体棱镜为六面柱体棱镜，具有底面和五个棱面，五个棱面沿第一光轴线对称设置。
一束平行光经过频率调制器11后，输出五束具有不同载频的平行光，本实施例中聚焦光斑分布为：在样品1上形成如图7中右面的五个在xy平面上沿着y轴排列的聚焦光斑。
进一步地，假设共焦扫描成像最终要得到一辐n行n列的图像，利用本实施例的多面体棱镜产生五个点的列分布焦点，则只需扫描n/5行，成像速度可以比现有的单焦点成像速度提高5倍。
实施例六
本实施例与实施例一中其它结构及设置相同，只是多面体棱镜在本实施例中换成了如图8中左面所示的多面体棱镜以及频率调制器11输出四束具有不同载频的平行光。该多面体棱镜为锥棱镜，具有底面和四个棱面，四个棱面沿轴线y旋转设置，则产生关于z轴旋转分布的二维阵列的聚焦光斑。
一束平行光经过频率调制器11后，输出四束具有不同载频的平行光，本实施例中聚焦光斑分布为：在样品1上形成如图7中右面的四个在xy平面上沿着x、y轴均布排列的聚焦光斑。
如果多面体棱镜的面沿着两个维度进行变化，得到二维阵列的聚焦光斑。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的基于多面体棱镜与频率调制的高速扫描成像的装置和方法，利用多面体棱镜在聚焦物镜的聚焦面上产生阵列聚焦光斑，实现多点同时扫描成像，显著提高了激光共聚焦扫描成像的帧速，达到高速成像的目的。
另外，当多面体棱镜为三棱镜时，如果利用三棱镜产生2个点的列分布焦点，则只需扫描n/2行，成像速度可以比现有的成像速度提高1倍。
进一步地，当多面体棱镜为四棱镜时，如果利用四棱镜产生3个点的列分布焦点，则只需扫描n/3行，成像速度可以比现有的成像速度提高3倍。
进一步地，也可以在帧速不变的情况下，提高单帧图像的像素数。理论上，相比于传统的单点扫描成像，对于相同像素的一帧图像，N个聚焦光斑的多点扫描成像的成像速度可以提高N倍；对于帧速相同，一帧图像的像素数可以提高N倍。例如，可以将当前行业中单点激光共聚焦扫描成像的典型参数512*32像素/帧、帧速400帧/秒，提高为512*32像素/帧、帧速400N帧/秒,或者为512*32N像素/帧、帧速400帧/秒。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。