相关申请本申请要求2018年12月4日提交的美国临时专利申请第62/775,005号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。根据35u.s.c.§119和任何其他适用法规要求优先权。
技术领域：
：通常涉及全息显微镜装置和方法。更具体地，
技术领域：
：涉及用于对晶体成像的紫外(uv)全息显微镜装置。紫外全息显微镜装置使用户能够区分蛋白质晶体和盐晶体。
背景技术：
：：蛋白质晶体学家依靠由明场和紫外(uv)诱导荧光模式组成的双模光学显微镜对蛋白质晶体成像，并将其与结晶过程期间可能形成的盐晶体区分开。这种区别主要基于对紫外照射的响应，其中，与大多数盐晶体不同，大多数蛋白质晶体吸收紫外光并通过色氨酸残基发出荧光。除了紫外荧光之外，有机材料内的紫外光的强吸收已经用作组织样本、细胞、细胞内核酸和蛋白质、病毒和蛋白质聚集体成像的固有造影剂，使得紫外显微镜成为研究人员的重要工具。然而，常规基于透镜的紫外显微镜是一种相对昂贵的成像方式，除了用于明场成像的紫外光源和紫外敏感相机之外，还需要使用为紫外波长专门设计的相对笨重的光学组件，这增加了显著的成本(例如，$35,000-$200,000)。参见例如gilleta1.，evaluatingtheefficacyoftryptophanfluorescenceandabsorbanceasaselectiontoolforidentifyingproteincrystals，actacrystallograph.sect.fstruct.biol.cryst.commun，66，364-372(2010)。此外，基于透镜的显微镜的固有限制也适用于常规紫外显微镜，其中，视场(fov)与分辨率之间的权衡限制了可以成像的总样本区域。因此，常规基于紫外的显微镜不仅笨重且昂贵，而且这些显微镜通常仅能够对相对大的fov成像。这可能需要在相当大的区域上扫描样本，这可能是耗时且费力的。因此，需要解决这些挑战的替代的基于紫外的显微镜。技术实现要素：在一个实施例中，提供了一种便携式全息成像平台或系统。该平台或系统包括小型便携式全息成像装置，该全息成像装置包括壳体或外壳，该壳体或外壳包含沿着光路发射光的发射紫外(uv)光的一个或多个光源。紫外带通滤光器可选地沿着光路设置在壳体或外壳中以阻挡边带并使基本上纯的紫外光朝向样本。在一个实施例中，光具有约280nm的波长和约10nm的带宽。图像传感器(例如，互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器)沿着光路位于壳体或外壳内，并且用于捕获包含在样本保持器中的晶体的原始同轴全息图像，样本保持器插入壳体或外壳中以沿着光路放置样本。样本保持器通常被放置得非常靠近图像传感器(例如，距离图像传感器有源表面几十到几百微米)，而一个或多个光源定位为距离样本保持器更远(例如，几厘米)。从目标晶体散射的光与背景照明之间的干涉产生由图像传感器数字化/记录的同轴全息图。便携式成像装置包括计算装置、数字电路和/或微控制器，该计算装置、数字电路和/或微控制器被配置为控制一个或多个光源，并且在一些实施例中，接收从图像传感器获得的样本的一个或多个图像。在一些实施例中，多个光源可以用于合成或生成晶体的像素超分辨全息图像，该像素超分辨全息图像与当依次激活单个光源时由图像传感器获得的单个较低分辨率图像相比具有更高的空间分辨率、更高的对比度和/或更高的信噪比。然后，由图像传感器获取或获得的图像由在计算装置上执行的图像处理软件进行处理，以将包含晶体的样本的图像数字反向传播到样本的对应的振幅和/或相位图像。在一些实施例中，执行图像处理软件的计算装置可以是便携式成像装置的一部分。在其他实施例中，执行图像处理软件的计算装置可以与便携式成像装置分离，并且经由有线或无线连接连接到便携式成像装置。例如，用便携式全息成像装置获得的图像可以被传送到诸如个人计算机、膝上型计算机、平板电脑、服务器、虚拟服务器等的计算机进行处理。样本中存在的基于蛋白质的晶体呈现深色，而其他非蛋白质晶体(诸如，基于盐的晶体)不呈现相同的深色外观。蛋白质晶体表现出的显著较大的对比度用于识别和区分蛋白质晶体和非蛋白质晶体。样本和晶体的振幅和/或相位图像可以在显示器上呈现给用户以供查看和/或分析。在一些实施例中，图像处理软件可以自动识别样本中的那些晶体，其为蛋白质晶体。这可以通过将成像晶体的相对对比度与阈值进行比较来完成。例如，表现出高于某一水平的紫外对比度的晶体可以被表征为蛋白质晶体。图像处理软件还可以计数或量化样本中蛋白质晶体的数量和/或浓度。由装置捕获的图像具有仅受图像传感器的有源区域限制的大fov(例如，＞10mm2)。在一个实施例中，对包含晶体的样本成像的方法包括提供便携式全息显微镜的操作，该便携式全息显微镜包括发射紫外(uv)光的一个或多个光源、可选的紫外带通滤波器、图像传感器和可操作地与图像传感器通信的微控制器或机载处理器。将包含晶体的样本插入便携式全息显微镜中，并且用来自一个或多个光源的过滤光(例如，当使用滤波器时)照射样本。用图像传感器捕获包含晶体的样本的一个或多个原始全息图像。在一个特定实施例中，仅获得单个原始全息图像(例如，单次拍摄操作模式)。使用利用计算装置执行的图像处理软件对一个或多个原始全息图像进行数字反向传播以获得样本的一个或多个振幅和/或相位图像。样本的一个或多个振幅和/或相位图像可以呈现给用户以供查看和/或分析。在另一实施例中，便携式全息显微镜包括包含发射紫外(uv)光的一个或多个光源、可选的紫外带通滤波器、被配置为保持或接收其中包含晶体的样本的样本保持器以及图像传感器的便携式壳体或外壳。便携式全息显微镜包括处理器和/或微控制器，其被配置为控制一个或多个光源并且接收从图像传感器获得的样本的一个或多个图像。在另一实施例中，便携式全息显微镜系统包括便携式壳体或外壳，该便携式壳体或外壳具有在壳体内沿着光轴发射紫外(uv)光的一个或多个光源。可选的紫外带通滤波器沿着光轴设置在壳体内。图像传感器沿着光轴设置在壳体内。便携式全息显微镜包括处理器和/或微控制器，其被配置为控制一个或多个光源并且接收从图像传感器获得的样本的一个或多个图像。样本保持器被配置为保持或接收其中包含晶体的样本并且可插入到壳体中以沿着光轴并邻近图像传感器定位样本保持器。样本保持器可以是壳体或外壳的一部分，或者可以是可插入壳体或外壳的单独组件或装置。该系统包括与便携式壳体的处理器或微控制器通信的单独计算装置，该单独计算装置具有在其上执行的图像处理软件，该图像处理软件被配置为将包含晶体的样本的一个或多个图像反向传播到样本的对应的一个或多个振幅和/或相位图像。然后，样本的一个或多个振幅和/或相位图像可以在单独计算装置的显示器或另一显示器(例如，便携式电子装置或其他计算装置的显示器)上显示给用户。附图说明图1示出了包括便携式全息显微镜装置的系统，该便携式全息显微镜装置用于获得和/或获取其中包含晶体的样本的一个或多个原始全息图像，然后对这些图像进行图像处理(例如，反向传播)以生成包含晶体的样本的对应的一个或多个振幅和/或相位图像。图2示出了根据一个实施例的用于操作图1的便携式全息显微镜装置/系统的操作序列。图3示出了根据一个实施例的样本保持器的一个实施例。图4a示出了基于紫外的全息显微镜的摄影图像。使用带通滤波器对uvled进行光谱滤波以阻挡边带，使峰值波长为280nm且带宽为10nm的纯紫外光通过样本，该样本被放置在非常靠近图像传感器的位置(约300-400μm)，利用整个有源区域作为成像fov(＞10mm2)。图4b示出了便携式全息显微镜的简化示意图的局部剖视图。图5a示出了蛋白酶k、氯化钠和硫酸铵晶体的明场显微镜图像。图5b示出了图5a中相同fov的振幅重构，蛋白酶k晶体显著变暗。图5c示出了蛋白酶k、氯化钠和硫酸铵晶体样本的x射线衍射数据，最大间距值分别为和图6a示出了由便携式全息显微镜系统(图1、图4a、图4b)捕获的全fov(＞10mm2)图像，其中，矩形示出了使用具有5倍物镜的基于透镜的紫外显微镜的可能的典型fov。图6b示出了在同一腔室中包含蛋白酶k和盐晶体(乙酸锂和硫酸锂)的样本，通过基于透镜的紫外显微镜以明场和紫外荧光模式两者成像。蛋白酶k晶体强吸收280nm的紫外光并且发射荧光，而盐晶体则没有。图6c示出了由便携式全息显微镜系统捕获的相同fov的对应的振幅重构。由于更强的吸收，在图6b中发射荧光的相同晶体与背景相比显著更暗，而不发射荧光的晶体(即，盐晶体)在振幅重构中没有示出显著的对比度。图6d是示出蛋白质晶体与盐晶体相比如何示出显著更强的紫外对比度的曲线图(p＜0.02)。标准偏差条表示用于计算目标对象的平均对比度的矩形区域内对比度的变化。图7a示出了用基于透镜的紫外显微镜(明场和紫外荧光)获得的蛋白质晶体(ring1b复合物和麦芽糖结合蛋白质晶体)的图像以及用本文所述的便携式全息显微镜获得的重构紫外图像。乙酸锂晶体(例如，盐晶体)用作对照。蛋白质晶体通过基于透镜的紫外成像平台成像时示出荧光，而盐晶体没有示出任何显著的荧光。以同样的方式，蛋白质晶体的振幅重构示出显著的对比度，而盐晶体则没有。图7b是示出蛋白质晶体(ring1b复合物和麦芽糖结合蛋白质晶体)和盐晶体(乙酸锂)的紫外对比度的曲线图。这种显著的对比度差异(p＜0.003)清楚地示出了便携式全息显微镜系统在区分蛋白质晶体和盐晶体方面的功效。标准偏差条表示用于计算目标对象的平均对比度的矩形区域内对比度的变化。具体实施方式图1示出了包括便携式全息显微镜装置10的系统2，该便携式全息显微镜装置10用于获得和/或获取其中包含晶体的样本12的一个或多个原始全息图像44，然后对这些图像进行图像处理(例如，如本文所述的反向传播)以生成包含晶体的样本12的对应的一个或多个振幅和/或相位图像60。输出或生成的一个或多个振幅和/或相位图像60显示具有高对比度的蛋白质晶体16(即，它们在振幅图像60中显得暗)。相反，非蛋白质晶体18的对比度不高，并且在振幅图像60中显得更亮。在其他实施例中，相位图像60可以相对于某些晶体显示高对比度，并且可以代替振幅图像60或结合振幅图像60生成。尽管系统2设想可以获得样本12的多个原始全息图像44，但是应当理解，仅需要单个原始全息图像44。因此，在一个实施例中，系统2对由便携式全息显微镜装置10获得的“单次拍摄”原始全息图像44进行操作。便携式全息显微镜装置10包括保持全息显微镜装置10的组件的壳体或外壳20。便携式全息显微镜装置10小且重量轻，并且可以由人容易地携带和移动，并且不需要像常规显微镜那样指定的工作台区域。壳体或外壳20包括内部部分22，该内部部分22保持各种光学组件并且隔离任何外部环境光以免进入。壳体或外壳20可以由诸如聚合物或塑料的轻质材料形成，尽管也可以使用其他材料。参考图1，壳体或外壳20包括用于用紫外(uv)光照射样本12的一个或多个光源24。一个或多个光源24可以包括发射紫外范围内的光的一个或多个发光二极管(led)或激光二极管。在一个实施例中，一个或多个光源24包括在大约280nm的峰值波长下操作的单个深uvled。应当理解，一个或多个光源24可以在紫外范围内的波长范围内操作，并且不必在单个波长下操作。使用约280nm峰值波长的原因是因为蛋白质晶体16由于氨基酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的存在而强吸收该波长的紫外光。盐晶体18不吸收该波长的紫外辐射。如果使用多个光源24，则邻近多个光源24(例如，在光源24与紫外带通滤波器30之间)设置孔径或孔25，以避免图像传感器36上的阴影效应。然而，孔径或孔25是可选的，并且例如当使用单个光源24时不是必需的。另外，在另一可选实施例中，存在多个光源24用于照射样本12。多个光源24可以布置成大致正交于光轴或路径31的阵列。多个光源24可以可选地耦合到终止于由多个光源24中的每一个光源依次照射的光纤阵列或图案(例如，行和列或其他二维图案)的相应的光纤。对于多个光源24中的每一个光源，用图像传感器36捕获一个或多个单独的原始全息图像44。横向偏移的光源24(在x、y平面中)然后可以用于像素超分辨率处理，由此较低分辨率偏移的全息图像44然后经受像素超分辨率处理以生成具有较高空间分辨率、较高对比度和/或较高信噪比(snr)的全息图像44。然后，这些较高分辨率的图像44可以被数字反向传播以产生如在图2的上下文中所描述和示出的振幅和/或相位图像60。像素超分辨率是从同一场景或对象的一组子像素移位的较低分辨率图像合成较高分辨率图像的计算方法。相对移位以及较低分辨率全息图像44被设置为最小二乘优化问题的输入，以估计较高分辨率(超分辨率)全息图。关于像素超分辨率的细节可以参见例如greenbaumetal.，field-portablepixelsuper-resolutioncolourmicroscope，plosone8(9)：e76475.doi：10.1371/journal.pone.0076475(2013)和bisharaetal.，holographicpixelsuper-resolutioninportablelenslesson-chipmicroscopyusingafiber-opticarray，labchip11∶1276-1279(2011)，其通过引用并入本文。led驱动电路26可以用于驱动一个或多个光源24，尽管这种电路可以结合到位于印刷电路板(pcb)38上的微控制器或处理器40中，如下所述。也可以完全省略led驱动电路26并且直接驱动led光源24。一个或多个光源24可以使用诸如与便携式全息显微镜装置10相关联的一个或多个电池的电源28供电。也可以经由专用电源线或通过也用于数据/图像传输的通信电缆(例如，usb电缆)提供电力。便携式全息显微镜装置10包括用于阻挡来自一个或多个光源24的边带发射的可选的紫外带通滤波器30。紫外带通滤波器30沿着从一个或多个光源24延伸并穿过壳体或外壳20的内部22的光轴或路径31定位。如图1所示，包含样本12的样本保持器32插入光轴或路径31中，并且接收过滤后的紫外光。样本保持器32可以包括其中保持包含晶体的液体的三维体积。样本保持器32可以包括用于保持晶体样本的比色皿、试管、毛细管、腔室、井或基于载玻片的样本保持器32。例如，在一个实施例中，在紫外熔融石英载玻片与标准聚氯三氟乙烯(pctfe)之间形成三维样本腔室，例如，其中包含井的盖。样本保持器32优选地对紫外辐射是光学透明的，以允许紫外过滤的光照射样本12。在一些实施例中，样本保持器32可以定位在可以将样本32移入/移出壳体或外壳20的托盘或支撑件34上。图3示出了样本保持器32的一个实施例，该样本保持器32包括下衬底33a，该下衬底33a包括在其中形成的用于保持样本12的井或腔室35。上衬底33b设置在下衬底33a的顶部，并且将流体样本12保持在井或腔室35内。下衬底33a和上衬底33b两者对紫外光基本上是光学透明的。例如，下衬底33a可以由pctfe形成，并且上衬底33b可以是载玻片或盖玻片。然后，样本保持器32可以直接或使用托盘或支撑件34插入便携式全息显微镜装置10的壳体或外壳20中。如图1所示，图像传感器36设置在壳体或外壳20的内部22中，并且沿光轴或路径31与包含样本12的样本保持器32对准，该样本保持器32插入在图像传感器36与一个或多个光源24之间。在一个实施例中，图像传感器36可以包括互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器36。图像传感器36可以包括单色或颜色图像传感器36。图像传感器36可以包括颜色图像传感器36，但是仅保留一种颜色的像素值(例如，绿色)用于图像处理。具有样本12的样本保持器32的位置被设置为邻近或靠近图像传感器36的有源区域。通常，样本12被放置在距离图像传感器36的有源区域几十到几百微米的地方(例如，200-600μm)。相反，一个或多个光源24被定位为离样本保持器32和样本12更远。通常，一个或多个光源24(和可选的孔径或孔25)位于距离样本保持器32和样本12几厘米的地方。在这种配置中，图像传感器36的有源区域被完全用作成像fov(例如，＞10mm2)，并且过滤的紫外光通过样本12散射，从而通过其与由图像传感器36捕获的背景光的干涉生成同轴全息图。然后，对这些原始全息图像44进行数字处理以从样本12中的对象(例如，晶体16、18)提取在干涉图案中编码的振幅和/或相位信息。仍然参考图1，图像传感器36位于印刷电路板(pcb)38或其他衬底上。pcb38还可以保持用于操作便携式全息显微镜10的电子设备的微控制器或一个或多个处理器40。这包括操作一个或多个光源24和图像传感器36。微控制器或一个或多个处理器40也用于存储由图像传感器36获得的原始全息图像44。这些可以存储在与微控制器或处理器40相关联的存储器(未示出)中。微控制器或处理器40还用于控制将原始全息图像44传送到单独计算装置50，如本文更详细地描述的。可以在pcb38上设置一个或多个通信端口42(例如，lan或usb端口)，用于从/向便携式全息显微镜10传送图像/数据。可选地，微控制器或处理器40可以包括无线功能(例如，wi-fi、蓝牙等)，使得图像文件44和数据可以无线传输到单独计算装置50。如图1所示，单独计算装置50可以包括个人计算机、膝上型计算机、服务器、虚拟服务器或者甚至诸如智能电话的便携式电子装置。计算装置50包括一个或多个处理器56，并且在一些实施例中，包括一个或多个可选的图形处理单元(gpu)。单独计算装置50可以与便携式全息显微镜10共同定位，或者可以位于远离便携式全息显微镜10的地方(例如，位于不同地理区域中的服务器)。计算装置50可以具有一个或多个输入装置52和用于显示样本16的反向传播的振幅和/或相位图像60的显示器54(在一些实施例中，显示器54也可以在输入装置52中)。显示器54可以是单独显示器或集成到计算装置50(例如，智能电话、平板电脑、ipad等的屏幕)中。计算装置50包括一个或多个处理器56和使用一个或多个处理器56执行的图像处理软件58。在一个实施例中，图像处理软件58被配置为接收原始全息图像44作为输入，并且将全息图像反向传播到样本12内的平面(或样本12内的对象)，并输出振幅和/或相位图像60。然后，反向传播的振幅和/或相位图像60可以显示在显示器54上，如图1所示。振幅和/或相位图像60将基于蛋白质的晶体16显示为暗的，而非蛋白质晶体(例如，盐晶体)18不显示为暗的。图像处理软件58可以以任何数量的语言或程序来实现。本文所描述的示例利用了matlab(美国mi的mathworks)，但是应当理解，可以使用其他语言和程序。示例包括例如python、c++等。在一个实施例中，图像处理软件58软件被配置为至少部分地基于在样本12的一个或多个振幅和/或相位图像60中识别的晶体的测量对比度来自动识别蛋白质晶体16和非蛋白质晶体。例如，振幅和/或相位图像60中的不同晶体16、18可以使用图像处理软件58进行分割，并且然后测量其相应的对比度值(在分割区域或其一部分内)并与阈值进行比较。阈值可以基于已知样本凭经验设置，其中，基于蛋白质的晶体16和非蛋白质晶体18正在用系统2进行分析。振幅和/或相位图像60内具有超过该阈值的平均值、均值等紫外对比度值的那些晶体可以被识别为蛋白质晶体16，而没有超过该阈值的那些晶体可以被识别为非蛋白质晶体18。图2示出了根据一个实施例的对包含晶体16、18的样本12进行成像的方法。在操作100中，包含晶体16、18的样本12被装载到样本保持器32中。样本12可以包括生物样本，诸如生物流体或生物流体的提取物。样本12也可以包含在例如用于晶体学合成或研究应用的一种或多种缓冲溶液中。样本12还可以包括环境样本或反应产物或过程的样本。样本12通常包含在水基流体中，并且其中包含晶体16、18。因此，晶体16、18可以包含在载体流体中。载体流体可以包括常规的缓冲溶液、水溶液或者甚至生物流体。然后将样本保持器32插入便携式全息显微镜10的壳体或外壳20中。这可以通过将样本保持器32直接插入壳体或外壳20来完成。可选地，样本保持器32可以被装载到可移动托盘或支撑件34中，样本保持器32搁置在该托盘或支撑件34上，并且被移动到壳体或外壳20内的光路中。接下来，如操作110所示，然后用来自一个或多个光源24的紫外光照射样本12。这可以是过滤的紫外光或未过滤的紫外光。接下来，在操作120中，图像传感器36获取或获得一个或多个原始全息图像44。这些图像44可以临时本地存储在便携式全息显微镜10中，并且然后传送到单独计算装置50，或者它们可以立即传送到单独计算装置50。可选地，在另一实施例中，使用便携式全息显微镜10的微控制器或一个或多个处理器40来反向传播图像44，从而消除了将原始全息图像44传送到单独计算装置50的需要。一旦在计算装置50中(或使用微控制器或一个或多个处理器40)，原始全息图像44经受数字反向传播操作，如操作130所示，其中，图像处理软件58将一个或多个原始全息图像44数字反向传播到一个或多个振幅和/或相位图像60。角谱方法是一种模拟波场传播的技术，并且涉及将复杂的波场扩展成无穷多个平面波的总和。首先使用快速傅里叶变换(fft)将全息图变换到空间频率域。然后，作为波长、传播距离和介质折射率的函数的相位因子与角谱相乘。最后，将其逆傅立叶变换到空间域以获得样本12的反向传播图像。然后，如图1中的操作140所示，显示和/或分析对象平面处(即，样本12内)的反向传播的振幅和/或相位图像60。分析可以包括自动识别样本12中的蛋白质晶体16和/或非蛋白质晶体18。分析还可以包括计数或量化样本12中的蛋白质晶体16(或非蛋白质晶体18)的数量或量。可选地，菲涅耳传播方法可以用于使用单个fft的反向传播，但是由于其基于菲涅耳近似，具有有限的分辨率。参见例如gorocsetal.，on-chipbiomedicalimaging，ieeereviewsinbiomed.eng.，vol.6，pp.29-46(2012)，其通过引用并入本文。在另一实施例中，一个或多个额外光源24可以包括在发射电磁波谱的可见部分的光的便携式全息显微镜10中。这些一个或多个额外光源24将位于任何带通滤波器30之后，并且可以用于提供关于来自不同通道(例如，蓝光、红光或绿光)的样本12的额外信息，该额外信息可以与紫外图像60一起用于评估对比度的变化等以提供用于晶体评估的另一维度。实验被测试的便携式全息显微镜10(图1、图4a、图4b)建立在多功能树莓派3(raspberrypi3)机载/微控制器40上，其具有易于获得的8兆像素cmos相机，所有相机容纳在定制设计和3d打印的壳体或外壳20内，该壳体或外壳20还保持在280nm峰值波长下操作的uvled光源24、具有带通滤波器30以阻挡边带发射。应当理解，树莓派3仅是一个示例，并且其他微控制器/处理器40或控制电路可以用于为光源24和图像传感器36供电和控制光源24和图像传感器36。在使用树莓派3机载/微控制器40的特定实施例中，cmos相机被去盖，移除透镜模块，并且样本被放置得非常靠近(约300-400μm)图像传感器36的有源区域，该有源区域被完全用作成像fov(＞10mm2，图6a)。过滤的紫外光通过样本12散射，从而通过其与由图像传感器36捕获的背景光的干涉生成同轴全息图。然后对这些全息图像44进行数字处理以从样本12中的目标对象提取在干涉图案中编码的振幅和/或相位信息，并且生成振幅和/或相位图像60。测试便携式全息显微镜10以验证强紫外吸收在振幅重构、对蛋白质晶体进行成像中的影响(图5b)。通过使用紫外熔融石英玻璃载玻片和蛋白质结晶盖片构建成像室32来制备样本12，该蛋白质结晶盖片是也是紫外透明的蛋白质晶体学家使用的标准材料。重要的是注意到，对于如全息的相干成像模式，必须额外考虑材料的透明度，因为材料体积的不规则性可能导致强的背景失真。由蛋白质晶体学家使用的标准紫外透明适用于全息成像，仅在背景中产生不影响成像质量的微弱调制(图5b)。首先通过制备具有蛋白酶k易于可用于结晶的丝氨酸蛋白酶的样本和两个盐晶体样本(氯化钠和硫酸铵)来测试成像平台(图1、图4a、图4b)，该丝氨酸蛋白酶包含在280nm光激发时发出荧光的芳香族氨基酸(图5a和图5b)，其中，在图5c中示出相应的x射线衍射数据。将单个晶体与约1μl溶液一起移液至片上(粘性面朝上)，并使用紫外熔融石英将液滴密封在腔室32中。全息图44的振幅重构60清楚地示出，与盐晶体不同，蛋白质晶体与背景相比显得更暗(图5b)。图5b所示的振幅重构图像60可以使用额外的相位恢复技术来进一步改进以减轻双图像伪影，然而，这可能以额外的计算和/或全息测量为代价。尽管在本文成像的特定晶体使用振幅重构图像60，但是应当理解，其他晶体样本可以使用相位重构图像60或者振幅和相位重构图像60两者的组合。为了进一步评估便携式全息成像系统2，对在同一fov内包含蛋白质(蛋白酶k)和盐晶体(乙酸锂和硫酸锂)两者的混合样本进行成像(图6a至图6d)，通过将包含晶体的约1μl缓冲溶液的液滴夹在紫外熔融石英载玻片与片之间来制备混合样本。晶体在其相应的缓冲溶液中生长，并且然后通过微环单独捞出并在密封之前沉积在液滴中。样本12首先用基于透镜的显微镜成像(图6b)，该显微镜能够通过蛋白质晶体的荧光来区分蛋白质和盐晶体，其中，观察到蛋白质晶体发射荧光而盐晶体保持黑暗。然后用便携式全息显微镜对样本成像(图6a、图6c)，其中，蛋白酶k晶体与盐晶体相比示出显著更强的对比度(p＜0.02)(图6c和图6d)。通过从平均背景信号值(sb)中减去目标晶体的平均振幅信号(sc)并将该差值除以平均背景信号值来计算紫外全息振幅重构中的对比度(c)，即，其中，sc在适合目标晶体内部的最大矩形区域内计算，并且sb在不包含任何对象的fov的清晰区域内计算。为了进一步测试便携式全息显微镜10用于蛋白质晶体学的成像能力，使用(1)与核膜相关联并且参与人类的组蛋白泛素化的ring1b复合物和(2)分解大肠杆菌中的麦芽糖糊精并且还形成紫外活性晶体的麦芽糖结合蛋白质执行额外的实验(图7a和图7b)。首先通过基于透镜的紫外显微镜(图7a-左两列)并且然后通过基于紫外的便携式全息显微镜10(图7a右列和图7b)对所有被测样本进行成像。用这些不同类型的蛋白质进一步验证了便携式紫外成像平台区分蛋白质和盐晶体的能力，与盐晶体(乙酸锂)相比，其示出显著更高的对比度(p＜0.003)(图7b)。本文所公开的便携式全息显微镜10和系统2是由蛋白质晶体学家使用的昂贵且笨重的双模紫外显微镜的替代方案。便携式全息显微镜系统2甚至可以被进一步强化为具有近实时成像能力，由深uvled功率输出效率的改进驱动，从而使得能够使用较低的传感器集成时间和嵌入式图形处理单元(gpu)作为单板计算机的一个或多个处理器56的增加的可用性。另外，尽管原始全息图像44被卸载到单独计算装置50以由图像处理软件58反向传播，但是应当理解，在其他实施例中，可以在与便携式全息显微镜10本地驻留的微控制器或处理器40上发生反向传播。例如，可以以由微控制器或处理器40在线执行的python实现反向传播，从而避免将原始全息图像44卸载或传送到单独计算装置50以进行图像处理的需要。紫外片上成像平台便携式全息显微镜10(图1、图4a、图4b)由去盖的8兆像素(3280水平×2464垂直，有源区域为约10.14mm2)、1.12μm像素间距、与树莓派3b单板计算机(微控制器/处理器40)接合的cmos图像传感器(imx219，日本东京索尼公司(sonycorporation，tokyo，japan))、在280nm峰值波长下操作的深uvled光源24(th-uv280j9-c-h-b，中国广东省天辉光电有限公司(tianhuioptoelectronicsco.，ltd，guangdongprovince，china))和中心波长为280nm且带宽为10nm的紫外带通滤波器(ff01-280/10-25，美国纽约塞姆罗克(semrock，ny，usa))组成以阻挡来自uvled光源24的边带发射。所有这些组件都容纳在定制设计和3d打印的丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)(strasys，dimensionselite)壳体或外壳20内。定制的python脚本用于从图像传感器36捕获、提取原始帧/全息图44并将其保存到树莓派3b的机载存储中。数据处理因为图像传感器36的绿色像素对紫外照射响应最多，所以原始全息图像帧44的红色和蓝色像素中的值被其相邻绿色像素的平均值替换。然后使用角谱方法对包含全息投影的图像帧44进行数字反向传播，通过将全息图的傅里叶变换与波传播的传递函数相乘来数值求解瑞利-索末菲积分，生成样本12的振幅和/或相位图像60。使用操作matlab(美国mi的mathworks)的标准台式计算机50(delloptiplex9010，inteli7，32gbram)，完整的数据处理花费约1分钟。使用t-测试用蛋白酶k的两个单独实验(图6d)和包括ring1b复合物和麦芽糖结合蛋白质的另外一组蛋白质的三个单独实验(图7a)来验证与盐晶体相比蛋白质晶体的振幅重构的增加的对比度的统计显著性。样本制备包括紫外熔融石英载玻片(10mm×10mm，0.2mm厚，美国加利福尼亚州mti公司)和由聚氯三氟乙烯组成的制成的标准蛋白质结晶盖片(美国俄勒冈州gracebio-labsprocrystalcover875238)的紫外兼容材料用于构建保持晶体样本12的样本室32。将包含晶体和对应缓冲溶液的0.8-1μl液滴沉积在包含一个井的片上(粘性面朝上)。然后使用紫外熔融石英载玻片轻轻地覆盖该井，将液滴密封在样本保持器32中。值得注意的是，标准蛋白质结晶覆盖材料适用于相干成像，并且仅导致不影响图像质量的微弱背景调制(图5b)。蛋白质和盐结晶ttplabtechmosquito(美国马萨诸塞州的ttplabtech公司)用于生成96井悬滴结晶设置。所有蛋白质晶体都是使用蒸汽扩散以天的方式生长。蛋白酶k(美国宾夕法尼亚州的vwr目录号97062-238)通过将冻干粉溶解在水中进行结晶以获得50mg/ml的储备液。将储备溶液与1.5m硫酸铵和0.1mtris-hcl(ph7.5)以1∶1混合。通过将20mmtris-hcl(ph8.0)和50mmnacl中的麦芽糖结合蛋白质80mg/ml与0.2m氯化镁六水合物、0.1mmesph6.0和20％w/vpeg6000以1∶1混合而结晶。ring1b、pcgf4、cbx8和phcl的寡聚化区域由加州大学洛杉矶分校的化学和生物化学系提供。该样本与0.7m甲酸钠(ph7.0)和20％w/vpeg3350以1∶1混合。所有300nl液滴在100μl对应结晶溶液中平衡。将1.0m氯化钠、2.0m硫酸铵、1.0m乙酸锂和1.0m硫酸锂以μl微升等分分配，并且允许在空气中蒸发，同时在立体显微镜中观察。通过在水溶液中脱水形成的晶体使用50微米的微环(美国纽约州的mitegenm5-l18sp-50ld)手动收集并放置在1μl的储备盐溶液中。通过移液管将包含晶体的这些溶液放置在表面上进行成像。基于透镜的紫外显微镜使用双模紫外显微镜(美国加利福尼亚州的korimaprs-1000)与便携式全息成像系统2进行比较。样本首先用紫外显微镜成像，并且然后用便携式全息显微镜10全息成像。晶体在280nm光下曝光不超过5秒钟，并且将所拍摄的图像与对应的重构的全息图像进行比较(图7a)。x射线衍射为了进一步区分蛋白质晶体和盐，拍摄了衍射图像。收集来自目标样本中的单个晶体并将其放置在加入33％乙二醇以防止形成结晶水的母液中。旋转阳极发生器(日本东京的rigakufre+)和成像板探测器(日本东京的rigakuhtc)用于x射线数据收集。高分子晶体与盐晶体的区别在于，由于晶体的对称元素之间的较大间距而产生的较低分辨率反射(图5c)。设计并制造了低成本且便携式的全息显微镜10，其在280nm的深紫外波长下操作以用于蛋白质晶体的高对比度成像。无需敏感、庞大且昂贵的组件，系统2提供了一种低成本、高通量且稳健的替代由明场和紫外(uv)诱导荧光模式组成的双模光学显微镜，该明场和紫外(uv)诱导荧光模式通常被蛋白质晶体学家用于对蛋白质晶体成像并将其与盐晶体区分开。通过与包括氯化钠、硫酸铵、乙酸锂和硫酸锂的几种不同的盐晶体相比对包括蛋白酶k、麦芽糖结合蛋白质和ring1b复合物的不同的蛋白质晶体进行成像来测试便携式全息显微镜10。尽管蛋白质晶体的振幅重构图像60与背景相比显得暗得多，但是盐晶体没有示出任何对比度，清楚地区分了两种类型的晶体。便携式全息显微镜10可以辅助蛋白质晶体学家和其他人作为低成本且稳健的替代平台对蛋白质晶体成像并将其与盐晶体区分开。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，但是在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种修改。因此，除了以下权利要求及其等同物之外，本发明不应受到限制。当前第1页12当前第1页12