一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第一偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色镜、第二透镜、柱面镜、第一CMOS照相机、偏心孔径光阑、第一反射镜、第三透镜、第二反射镜、第二CMOS照相机；本发明不改变4Pi显微镜的原有架构，利用二色镜将聚焦锁定系统引入整个4Pi系统中，可以实现对双镜头相对位置以及镜头与样品相对位置的实时锁定，整个聚焦锁定系统十分紧凑。本发明可以克服4Pi显微系统中上下镜头单独成像的造成的差异，避免传统4Pi显微镜中后期图像处理所导致的图像失真的问题，工作精度高。
【专利说明】
-种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统
技术领域
[0001] 本发明设及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体设及一种基于4Pi显微镜 架构的显微镜头与样品锁定系统。
【背景技术】
[0002] 目前在生物医药领域的研究对分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种亚 百纳米尺度上微小形态物质的=维结构信息，然而传统光学显微镜无法达到运样的分辨 率，特别是在光轴方向上的分辨能力远远不足。电镜和原子力显微镜虽然可W提供更高的 分辨率，但是只能局限于提供表面图像，无法对深层组织和活细胞进行成像，而4Pi共聚焦 系统的出现完美地解决了运个问题。根据瑞利数据，增加物镜的数值孔径，可W减小点扩散 函数的尺寸，从而提高显微镜的分辨率。4Pi显微镜正基于此原理，利用通过样品前后的双 物镜，使显微镜总的立体接收角接近4Pi，从而提高数值孔径，提高显微镜分辨率特别是轴 向分辨率。通常4Pi显微镜基于宽场或共聚焦显微镜平台，采用两个相对的相同物镜，可将 轴向分辨率大幅提升，获得极佳的=维效果，因此在亚细胞结构、细胞内寄生虫和病毒等的 观察方面具有广泛的应用。
[0003] 对于显微镜而言，必须保证其工作的时候，物镜聚焦于样品表面。作为一套自动化 仪器，具备焦平面锁定功能的显微镜，可W很好的保证系统的位相关系，为显微镜使用者获 得高质量图片提供极大的便利。作为一种干设系统，在4Pi架构的显微系统中，必须同时保 证两个相对的物镜均聚焦在样品上相同位置。因此，两个显微镜头与样品相对位置锁定系 统对于4Pi架构的显微系统而言显得更为关键。而与一般单镜头相比，4Pi架构的显微系统 对于机械振动、热膨胀等因素更为敏感，焦平面锁定功能是一般4Pi架构显微系统的必要组 成部分。Roman Schmidt等人在《自然》杂志中发表的题为《Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells》的论文中，应用了经典4Pi架构的显微系统，采用 两套独立的锁定系统分别锁定两个镜头与样品间的相对位置。运种设计可W充分借鉴单镜 头显微系统的已有成果，提高设计效率，但是，该种设计方案的最大问题在于:无法保证两 个镜头间相对位置的稳定。当镜头位置偏移量较大(横向偏移大于100纳米，轴向大于300纳 米)时，可W在系统图像中观察到"重影"现象。运种重影现象原理上可W通过后期图像处理 算法，如自相关算法等加 W矫正。但在现实中，由于上下镜头单独成像图像不可避免存在微 小差异，后期图像处理本身即有可能导致图像失真等严重问题。对于基于4Pi架构的超分辨 显微系统，如4Pi单分子定位显微系统(4P1-SMS)而言，由于其自身设计分辨率较高《50纳 米），并且在原理上依赖巧光干设实现对于单分子的定位，对于镜头位置的相对偏移的容忍 度更低（横向偏移小于20纳米，轴向小于50纳米）。因此，现有的锁定系统设计并不能满足 4Pi显微架构显微镜的需要。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有4Pi显微系统中无法保证两个镜头相对位置、精度较低，W及后期 图片处理易失真等诸多问题，提出了一种新型的基于4Pi架构的显微镜头与样品锁定系统。 该结构高效、精确，可W同时实现对4Pi显微镜系统中双镜头相对位置的实时调节。
[0005] -种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第 一偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色 镜、第二透镜、柱面镜、第一CMOS照相机、偏屯、孔径光阔、第一反射镜、第S透镜、第二反射 镜、第二CMOS照相机；
[0006] 所述激光器发射的光束经过第一透镜的扩束准直后，发射至第一偏振分束镜：
[0007] 光束中垂直偏振分量继续沿原方向传输，经过第二偏振分束镜出射后被第一二色 镜反射进入上显微镜头，被上显微镜头汇聚到样品面;从样品下表面出射后，被下显微镜头 收集，之后被第二二色镜反射，经过第=透镜、柱面镜后被第一 CMOS相机收集并成像；
[000引光束中水平偏振分量被反射，经过偏屯、孔径光阔后，形成细光束，之后被第一反射 镜反射，经第=透镜会聚到第二反射镜表面，第二反射镜反射后，进入第二偏振分束镜后再 次被反射至第一二色镜表面;经过第一二色镜反射后，进入上显微镜头，会聚入射在样品表 面，然后由于入射角较大，被样品表面反射回上显微镜头，再次经过第一二色镜后，被第二 偏振分束镜反射到第二反射镜表面;之后通过第S透镜形成平行光束，被第二CMOS相机收 集并成像；
[0009] 还包括控制单元，该控制单元实时读取第一 CMOS相机和第二CMOS相机的成像信 息，并将该成像信息与预先确定的锁定位置图像信息进行对比计算，根据计算结果对上显 微镜头和下显微镜头之间的相对位置、上显微镜头或下显微镜头与样品之间的位置进行补 偿调整。
[0010] 本发明中，所述第一透镜用于将光束扩束准直，使得激光束直径变大，发散角较 小，在垂直于光轴方向的横截面内光强分布更均匀，更接近于平行光，有利于光束会聚形成 更小的光斑。
[0011] 本发明中，所述第二透镜及第=透镜用于将光束聚焦;一般选择凸透镜。
[0012] 本发明中，所述上显微镜头与下显微镜头正对共焦放置。所述第=透镜的聚焦位 置为上显微镜头的后焦平面的位置。
[0013] 本发明中，所述偏屯、孔径光阔只允许宽光束边缘的部分光通过。
[0014] 作为优选，控制单元通过实时读取第一CMOS相机的成像信息，实现对上显微镜头 和下显微镜头之间的相对位置的补偿调整;控制单元通过实时读取第二CMOS相机的成像信 息，实现对上显微镜头或下显微镜头与样品之间的位置进行补偿调整。
[0015] 作为优选，所述激光器为红外波段激光器，平均输出功率为150yW。采用该技术方 案，可W保证系统在完成聚焦锁定功能的时候，不对4Pi系统中的成像光束造成较大的影 响。
[0016] 作为优选，所述红外波段激光器的波长为980纳米。
[0017]作为优选，经过偏屯、孔径光阔后的细光束的光束直径为0.2~0.5毫米。
[0018] 作为优选，所述控制单元采用闭环负反馈控制，其过量补偿参数设置为1.05。
[0019] 作为进一步优选，所述闭环负反馈控制公式为：
[0020] u(t) =K(t) ? e(t)
[0021] 其中u(t)为实时输出控制信号;K(t)为所述的过量补偿参数;e(t)为实时聚焦光 斑形状与锁定位置聚焦光斑形状差异。
[0022] 作为优选，上显微镜头和下显微镜头选用UPLSAP0100XS超级复消色差物镜，放大 倍率100倍，数值孔径1.35。
[0023] 作为优选，第一 CMOS相机和第二CMOS相机选用DCC1545M型高分辨率黑白CMOS相 机，像素为1280 X 1024。
[0024] 本发明中，控制单元可选择控制忍片，该控制忍片可单独设置，或者几成设置;所 述控制单元也可W选择计算机，通过计算机进行图像的实时采集和控制。
[0025] 本发明中，第一二色镜、第二二色镜具有两个重要的作用，一方面用于反射聚焦锁 定系统的光束，同时也用于透射4Pi显微镜系统的光束。
[0026] 相对于现有技术，本发明具有W下有益的技术效果：
[0027] 1、本发明不改变4Pi显微镜的原有架构，利用二色镜将聚焦锁定系统引入整个4Pi 系统中，可W实现对双镜头相对位置W及镜头与样品相对位置的实时锁定，整个聚焦锁定 系统十分紧凑。
[0028] 2、本发明可W克服4Pi显微系统中上下镜头单独成像的造成的差异，避免传统4Pi 显微镜中后期图像处理所导致的图像失真的问题，工作精度高。
[0029] 因此，该本发明的技术方案与原有技术相比，能够提高4Pi显微镜的工作效率和实 验精度。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统的一个实施例的 光路图；
[0031 ]其中：1、光纤激光器;2、第一透镜;3、第一偏振分束镜;4、第二偏振分束镜;5、第一 ^色镜;6、上显微镜头;7、样品台；8、下显微镜头;9、束^^色镜；10、束^透镜；11、柱面镜； 12、第一 CMOS照相机;13、偏屯、孔径光阔；14、第一反射镜；15、第S透镜、16、第二反射镜；17、 第二CMOS照相机；
[0032]图2为上显微镜头6和下显微镜头8共焦时，第一 CMOS相机12收集的光斑；
[0033]图3为上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向远离时，第一CMOS相机12收 集的光斑；
[0034] 图4为上显微镜头6和下显微镜头的往着光束传播方向靠近时，第一CMOS相机12收 集的光斑；
[0035] 图5为上显微镜头6、下显微镜头8之间在垂直光束传输方向发生相对位置的变化 时，第一 CMOS相机12收集的光斑；
[0036] 图6为平行细光束的光斑被第二CMOS相机17收集的光斑；
[0037] 图7为样品下沉时，平行细光束在第二CMOS相机的像面所呈现的光斑。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合【附图说明】本发明，但本发明并不限于此。
[0039] 如图1所示是本发明基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统的一个实施 例的双光束的光路图。该实施例的双光束光綴系统包括：
[0040]光纤激光器I，第一透镜2，第一偏振分束镜3，第二偏振分束镜4，第一二色镜5，上 显微镜头6,透明的样品台7(样品置于该样品台上），下显微镜头8,第二二色镜9,第二透镜 10，柱面镜11，第一 CMOS照相机12，偏屯、孔径光阔13，第一反射镜14，第=透镜15，第二反射 镜16,第二CMOS照相机17;
[0041 ] 其中，光纤激光器1为化orlabs公司的LP980-SF15型光纤激光器，功率为15mW，工 作波长为980纳米。
[0042] 光纤激光器1出射的光束经过第一透镜2后，光束被扩束准直，激光束直径变大，发 散角较小，在垂直于光轴方向的横截面内光强分布更均匀，更接近于平行光，有利于光束会 聚形成更小的光斑。
[0043] 经过扩束准直的激光入射到第一偏振分束镜3后，光束中的垂直偏振分量继续沿 原方向传输，入射到第二偏振分束镜4后出射；出射后被第一二色镜5反射进入上显微镜头 6,被上显微镜头的C聚到样品面;从样品下表面出射后，被下显微镜头8收集，之后被第二二 色镜9反射，经过第=透镜10、柱面镜11后被第一 CMOS相机12收集并成像。
[0044] 本实施例中，第一偏振分束镜3、第二偏振分束镜4均是对垂直偏振分量透射、对水 平偏振分量进行反射的偏振分束镜。
[0045] 由于柱面镜11会产生像散，当上显微镜头6、下显微镜头8处于共焦点的位置时，第 一 CMOS相机12收集的光斑非完美轴对称，记录此时的光斑位置和形状，记为锁定位置聚焦 光斑。上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在沿着光束传输方向发生相对位置的变化，会造 成第一 CMOS相机12收集的光斑单一方向的压缩或者拉伸。通过第一 CMOS相机收集的光斑的 拉伸或压缩，计算出上显微镜头6和下显微镜头8在沿光束传播方向的相对位移，从而进行 该方向的反馈锁定。
[0046] 上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在垂直光束传输方向发生相对位置的变化， 会造成第一 CMOS相机12收集的聚焦光斑位置的移动。根据对聚焦光斑位置的移动的判断， 可实现在垂直于光束传输方向上，显微镜头6、下显微镜头8之间相对位置的锁定。
[0047] 入射到第一偏振分束镜3后光束中的水平偏振分量被反射，经过偏屯、孔径光阔13 后，形成细光束，并被第一反射镜14反射，经第=透镜15会聚到第二反射镜16表面，并被第 二反射镜16反射，进入第二偏振分束镜4后再次被反射到第一二色镜表面5;经过第一二色 镜5反射后，进入上显微镜头6。由于第=透镜15的聚焦位置为上显微镜头6的后焦平面的位 置，因此光束会聚在样品表面；由于是细光束，因此在样品表面的入射角较大，被样品表面 反射回上显微镜头6,再次经过第一二色镜5后，被第二偏振分束镜4反射到第二反射镜16表 面;之后通过第=透镜15，形成平行细光束，平行细光束的光斑被第二CMOS相机17收集并成 像。
[0048] 沿光束传播方向，当上显微镜头6与样品的相对位置发生变化时，会造成细光束在 样品表面入射角发生变化，因此经过样品表面反射的细光束角度也会发生变化，经过第= 透镜15后形成的平行细光束在第二CMOS相机的像面的相对位置会随之发生变化。通过对第 二CMOS相机像面上光斑位置的移动，可W判断上显微镜头6与样品的相对位置的变化，从而 进行锁定。
[0049] 本实施例中，上显微镜头6和下显微镜头8可选用奥林己斯公司的UPLSAP0100XS超 级复消色差物镜，放大倍率100倍，数值孔径1.35,可W全面补偿近红外区域的球差和色差。 本实施例中第一 CMOS相机12和第二CMOS相机17可选用化orlabs公司的DCC1545M型高分辨 率黑白CMOS相机，像素为1280 X 1024。
[0050] 实施例
[0051] 下面结合实施例来对本发明所提出一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁 定系统进行进一步说明，但本发明并不限于此。
[0052] 波长为980纳米的光束从光纤激光器1出射，经过第一透镜2后被扩束准直，扩束准 直后的光束直径为5毫米。
[0053] 经过扩束准直的激光入射到第一偏振分束镜3后，占光束总能量50%的垂直偏振 分量继续沿原方向传输，入射到第二偏振分束镜4后沿着原方向出射；出射后被第一二色镜 5反射进入上显微镜头6,被上显微镜头的C聚到样品面;从样品下表面出射后，被下显微镜 头8收集，之后被束^^色镜9反射，经过束二透镜10、柱面镜11后被束一CMOS相机12收集并 成像。
[0054] 本实施例中上显微镜头6和下显微镜头8的数值孔径为1.35,焦距为1.8毫米，柱面 镜11焦距大于500毫米，优选1000毫米;柱面镜11通光口径大于12.5毫米，柱面镜11会产生 像散。
[0055] 当上显微镜头6和下显微镜头8共焦时，由于柱面镜11产生的像散，第一 CMOS相机 12收集的光斑如图2所示，此时的光斑定义为锁定位置聚焦光斑。当上显微镜头6和下显微 镜头8沿着光束传播方向远离时，第一 CMOS相机12收集的光斑形状沿横向拉伸，如图3所示； 当上显微镜头6和下显微镜头8沿着光束传播方向靠近时，第一 CMOS相机12收集的光斑形状 沿纵向拉伸，如图4所示。通过比较实时聚焦光斑与锁定位置聚焦光斑的形状差异，建立闭 环负反馈控制回路(PID控制器），实时反向补偿上显微镜头6和下显微镜头8之间轴向位置 漂移。
[0056] 根据控制理论，实时输出控制信号u(t)可W表述为：
[0化7]
[0058]其中e(t)为实时聚焦光斑形状与锁定位置聚焦光斑形状差异，有多种评价函数， 较简单的方式是直接计算二者形状的互相关函数值。由于在本实施例中仅使用单一输入控 制并且仅有一个控制信号，因此上述公式可W通过拉普拉斯变换进一步简化为：
[0化9]
[0060] 则过量补偿参数K(t)可W直接通过忽略系统架构而通过试误法直接得到。在本实 施例中，闭环负反馈控制过量补偿参数K(t)根据实测数据优选设置为1.05。
[0061] 上显微镜头6、下显微镜头8之间如果在垂直光束传输方向发生相对位置的变化， 会造成第一 CMOS相机12收集的聚焦光斑位置的移动，如图5所示。可W判断出在垂直于光束 传输方向上，上显微镜头6、下显微镜头8产生了相对移动。通过实时比较聚焦光斑与锁定位 置聚焦光斑的位置差异，建立闭环负反馈控制回路，实时反向补偿上显微镜头6、下显微镜 头8之间径向位置漂移。闭环负反馈控制过量补偿参数优选设置为1.05。
[0062] 入射到第一偏振分束镜3后占光束中能量50%的水平偏振分量被反射，经过偏屯、 孔径光阔13后，形成细光束，光束直径为0.2~0.5毫米。并被第一反射镜14反射，经第=透 镜15会聚到第二反射镜16表面，并被第二反射镜16反射，进入第二偏振分束镜4后再次被反 射到第一二色镜5表面;经过第一二色镜5反射后，进入上显微镜头6。由于第=透镜15的聚 焦位置为上显微镜头6的后焦平面的位置，因此光束会聚在样品表面；由于是细光束，因此 在样品表面的入射角较大。当样品处于上显微镜头6的焦平面上时，细光束在样品表面的入 射角达到67度，大于玻片/样品界面全反射角，细光束发射全反射。
[0063] 之后细光束被样品表面反射回上显微镜头6,再次经过第一二色镜5后，被第二偏 振分束镜4反射到第二反射镜16表面;之后通过第=透镜15，形成平行细光束，平行细光束 的光斑被第二CMOS相机17收集并成像到CMOS传感面的中屯、位置，如图6所示。
[0064] 沿光束传播方向，样品下沉时，细光束经过样品表面反射后，在上显微镜头6后焦 平面上的聚焦点位置会发生改变。因此，经过第S透镜15后形成的平行细光束在第二CMOS 相机17的像面的相对位置会随之发生变化，如图7所示。样品上浮时，则上显微镜头6后焦平 面上的聚焦点位置发生反向的变化。通过对图5上两个光斑相对位置的计算，可W判断上显 微镜头6与样品的相对位置的变化，从而实现闭环控制锁定并进行反向补偿。
[0065] 最后需要说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制。尽管参 照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方 案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明 的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，包括激光器、第一透镜、第一 偏振分束镜、第二偏振分束镜、第一二色镜、上显微镜头、样品台、下显微镜头、第二二色镜、 第二透镜、柱面镜、第一 CMOS照相机、偏心孔径光阑、第一反射镜、第三透镜、第二反射镜、第 二CMOS照相机;待检测样品置于所述样品台上； 其特征在于： 所述激光器发射的光束经过第一透镜的扩束准直后，发射至第一偏振分束镜； 光束中垂直偏振分量继续沿原方向传输，经过第二偏振分束镜出射后被第一二色镜反 射进入上显微镜头，被上显微镜头汇聚到样品面；从样品下表面出射后，被下显微镜头收 集，之后被第二二色镜反射，经过第三透镜、柱面镜后被第一 CMOS相机收集并成像； 光束中水平偏振分量被反射，经过偏心孔径光阑后，形成细光束，之后被第一反射镜反 射，经第三透镜会聚到第二反射镜表面，第二反射镜反射后，进入第二偏振分束镜后再次被 反射至第一二色镜表面;经过第一二色镜反射后，进入上显微镜头，会聚入射在样品表面， 然后被样品表面反射回上显微镜头，再次经过第一二色镜后，被第二偏振分束镜反射到第 二反射镜表面;之后通过第三透镜形成平行光束，被第二CMOS相机收集并成像； 还包括控制单元，该控制单元实时读取第一CMOS相机和第二CMOS相机的成像信息，并 将该成像信息与预先确定的锁定位置图像信息进行对比计算，根据计算结果对双镜头相对 位置以及镜头与样品相对位置。2. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，控制单元通过实时读取第一 CMOS相机的成像信息，实现对对双镜头相对位置的补偿调 整;控制单元通过实时读取第二CMOS相机的成像信息，实现对镜头与样品相对位置进行补 偿调整。3. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，所述激光器为红外波段激光器，平均输出功率为150yW。4. 根据权利要求3所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，所述红外波段激光器的波长为980纳米。5. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，经过偏心孔径光阑后的细光束的光束直径为0.2~0.5毫米。6. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，所述控制单元采用闭环负反馈控制，其过量补偿参数设置为1.05。7. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，上显微镜头和下显微镜头选用UPLSAP0100XS超级复消色差物镜，放大倍率100倍，数值 孔径1.35。8. 根据权利要求1所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，第一CMOS相机和第二CMOS相机选用DCC1545M型高分辨率黑白CMOS相机，像素为1280 X 1024。9. 根据权利要求6所述的基于4Pi显微镜架构的显微镜头与样品锁定系统，其特征在 于，所述闭环负反馈控制公式为： u(t) =K(t) · e(t) 其中u(t)为实时输出控制信号;K(t)为所述的过量补偿参数;e(t)为实时聚焦光斑形 状与锁定位置聚焦光斑形状差异。
【文档编号】G02B21/00GK105954862SQ201610546464
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】李旸晖, 周辉, 来邻, 夏浩盛, 王乐
【申请人】中国计量大学