一种基于盐蚀的在钛基种植体表面原位构建多级纳米拓扑结构的方法与流程

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种基于盐蚀的在钛基种植体表面原位构建多级纳米拓扑结构的方法。

背景技术：

钛及其合金材料以其优良的生物相容性和优良力学性能，被广泛应用于骨科和牙种植体领域，但是钛合金是生物惰性材料，植入人体后无法主动诱导植入体周围新骨生长，导致植入体和自然骨的界面结合强度不足，增大植入体松动的风险。

表面改性技术能够在保留钛合金材料优良力学性能的同时，通过改变植入体表面化学和物理性质达到对植入体骨整合能力的提高，在钛合金植入体表面构建纳米尺度结构，有望提高植入体的骨整合能力。有鉴于此，研究者们开始尝试在植入体表面制备人工纳米拓扑结构，并且发现此类纳米结构能够促进和细胞粘附相关蛋白的选择性吸附，从而提高植入体的骨整合能力。对钛及其合金植入体表面改性，完成表面特殊微纳米拓扑结构空间构建，从而增强骨相关细胞的成骨响应，加快植入体周围新骨的生长。

目前研究较多的纳米形貌改性技术包括阳极氧化、微弧氧化、化学处理和激光处理等。例如CN102586786A公开了一种钛表面形成分级多孔形貌的方法，包括钛试样抛光清洗-喷丸处理-酸蚀处理-阳极氧化-超声清洗，在纯钛表面形成具有生物活性的分级多孔形貌，并具有较厚的由离了键结合的高生物化学稳定性的离了化合物TiO₂层。CN102921037A公开了一种钛种植体表面制备多级微米结构的方法，将钛打磨，除油处理清洗，再氢氟酸、硝酸、过氧化氢混合溶液酸蚀清洗，然后进行喷砂处理，将喷砂处理后的钛置于酸蚀液中进一步酸蚀处理，再热处理得到多级微米结构表面的钛种植体。CN103981523A公开了一种超亲水性Ti₆Ai₇Ni表面喷砂酸蚀处理方法，通过对Ti₆Ai₇Ni进行预处理、喷砂、酸蚀、清洗的表面处理工艺方法，制备出微米级粗糙多孔钛合金表面，表面具备超强的亲水性。CN105925949A公开了一种钛或钛合金表面微纳米多孔结构的制备方法，包括下述步骤：钛或钛合金的表面清洁处理；钛或钛合金的表面电镀或磁控溅射一层铜涂层；热处理将铜原子扩散入钛或钛合金的表面；采用固相法镁粉或者液相法熔融态镁来脱合金处理；最后用酸与水清洗与干燥；即得到表面微纳米多孔的钛或钛合金。

阳极氧化、微弧氧化以及激光处理等技术需要特殊设备，操作过程较为复杂，且由于制备过程中使用较多的化学试剂，容易残留于最终产品中，因此，此类技术目前还未在临床上得到使用。相对而言，化学方法具有简单、易操作且成本低等优点，已经在牙科种植体表面改性方面得到了商业化。然而，目前大部分化学处理方法均涉及到强酸强碱，为了避免残留酸碱对细胞和组织造成危害，化学法制备的种植体都需要经过长时间的淋洗，处理过程繁琐，生产效率低，容易造成氢脆，处理成本较高。另外，此类方法更擅长于调控微米级别的形貌，对纳米结构调控能力极其有限。

技术实现要素：
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针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种简单易行的钛合金植入体表面纳米化的方法。该方法采用以盐溶液作为介质进行腐蚀，处理过程条件温和，不会有强酸强碱残留，所形成的多级纳米结构具有良好的生物相容性，能够促进骨相关细胞的粘附和生长，有望很大程度地提高植入体的骨整合能力，并且可与其它表面微米化方法结合使用，在植入体表面构建微纳米杂化拓扑结构。本发明有望衍生出新型高效的骨科植入体和种植牙。

第一方面，本发明提供了一种基于盐蚀的在钛基种植体表面原位构建多级纳米拓扑结构的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将酸洗后的钛或钛合金浸入磷酸盐溶液中，进行低温加热处理；

(2)将经步骤(1)处理后的钛或钛合金进行热处理，经水洗干燥后得到表面形成多级纳米拓扑结构的钛基种植体。

本发明中，所述酸洗后的钛或钛合金必须浸入所述磷酸盐溶液，优选在密闭容器中密封后进行低温加热处理，目的是防止磷酸盐的挥发对溶液浓度产生影响。

本发明中，步骤(1)所述低温加热处理后，还包括水洗和干燥步骤，所述水洗优选为超纯水超声清洗，水洗时间优选为5-30min。

本发明中，所有干燥步骤均选用本领域技术人员公知的常规干燥方法，对此不再赘述。

根据本发明，步骤(1)所述磷酸盐的浓度为0.05-4mol/L，例如可以是0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L或4mol/L，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，步骤(1)所述磷酸盐的浓度优选为0.05-2mol/L。

根据本发明，步骤(1)所述磷酸盐为正磷酸盐或偏磷酸盐，例如可以是，NaH₂PO₄、KH₂PO₄、Ca(H₂PO₄)₂、Mg(H₂PO₄)₂、NH4H₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、(NH₄)₂HPO₄、K₃PO₄、Na₃PO₄或(NH₄)₃PO₄中的任意一种，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所有其他适用于本发明的磷酸盐。

本发明中，所述磷酸盐优选为正磷酸盐，进一步优选为磷酸氢盐。

根据本发明，步骤(1)所述低温加热处理的温度为40-100℃，例如可以是，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，所述低温加热处理的温度优选为40-80℃。

根据本发明，步骤(1)所述低温加热处理的时间为0.5-24h，例如可以是，0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，所述低温加热处理的时间优选为2-10h。

本发明中，所述低温加热处理选用本领域常规的加热方法进行，对此不再赘述。示例性的，所述低温加热处理可以在烘箱和水浴锅中进行。

选用上述优选的磷酸盐、磷酸盐浓度、低温加热处理的温度及时间，能够在温和的盐浴条件下对钛或钛合金表面进行腐蚀，进而更好的在钛或钛合金基体表面构建纳米尺度拓扑结构，形成多级纳米结构，有利于提高植入体的骨整合能力。

根据本发明，步骤(2)所述热处理的温度为300-600℃，例如可以是300℃、320℃、350℃、370℃、400℃、420℃、440℃、450℃、480℃、500℃、520℃、530℃、550℃、580℃或600℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，所述热处理的温度优选为400-600℃。

根据本发明，步骤(2)所述热处理的时间为0.5-6h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，所述热处理的时间优选为0.5-2h。

本发明中，所述热处理选用本领域常规的加热方法进行，对此不再赘述。示例性的，所述热处理可以在马弗炉中进行。

值得注意的是，本发明中对酸洗后的钛或钛合金用磷酸盐溶液在低温加热的条件下处理，在温和的盐蚀条件下对钛或钛合金表面进行了改性，再经过后续热处理获得了具有多级纳米结构的钛基种植体。所述盐蚀与热处理一起作用，制备得到安全性高、具有良好的生物相容性的钛基种植体，二者具有协同作用，缺一不可。

根据本发明，步骤(1)所述酸洗包括以下步骤：

(a)配制酸洗液；

(b)用步骤(a)所述酸洗液对钛或钛合金进行酸洗，得到酸洗后的钛或钛合金。

本发明中，步骤(b)所述酸洗之后还包括清洗步骤，示例性的，所述清洗步骤为超纯水超声清洗，将样品上残留的酸洗液洗净为止。

本发明中，步骤(a)所述酸洗液可以选用本领域常规的组合、配比及方法进行，在此不做赘述。

本发明中，步骤(a)所述酸洗液可以由纯水、HF和HNO₃的混合液稀释后得到，优选地，所述混合液中纯水、HF和HNO₃的体积比为10:3:2。

根据本发明，所述混合液稀释的倍数为5-30倍，例如可以是5倍、7倍、10倍、12倍、14倍、15倍、17倍、19倍、20倍、23倍、25倍、27倍、29倍或30倍，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中所述混合液稀释的倍数优选为10-15倍。

根据本发明，步骤(b)所述酸洗的时间为0.5-5min，例如可以是0.5min、0.7min、0.9min、1min、1.2min、1.5min、1.8min、2min、2.5min、2.7min、3min、3.5min、3.8min、4min、4.5min、4.8min或5min。

本发明中所述酸洗的时间优选为0.5-3min。

选用上述纯水、HF和HNO₃的混合液作为酸洗液以及选用优选的体积比、稀释倍数和酸洗时间能够使钛或钛合金在酸洗后表面得到有效的清洁，提高表面活性，为后续处理提供更适宜的条件。

示例性的，本发明所述一种基于盐蚀的在钛基种植体表面原位构建多级纳米拓扑结构的方法包括以下步骤：

(1)将体积分数为66.7％纯水、20％的HF、13.3％的HNO₃混合，将混合液稀释5-30倍得到预酸洗液。利用酸洗液对钛合金进行清洗0.5-5min，然后用超纯水超声清洗多遍。

(2)配制0.05-4mol/L的磷酸盐溶液，将酸洗后的钛或钛合金置于可密封的容器中，加入磷酸盐溶液，密封后在40-100℃下加热0.5-24h。处理完毕后，利用纯水超声清洗5-30min，然后干燥。

(3)将经步骤(2)处理后的钛合金于300℃-600℃条件下进行热处理，保温时间为0.5-6h。处理完毕后，取出样品，超声清洗后干燥备用。

示例性的，本发明所述一种基于盐蚀的在钛基种植体表面原位构建多级纳米拓扑结构的方法包括以下步骤：

(1)将体积分数为66.7％纯水、20％的HF、13.3％的HNO₃混合，将混合液稀释10-15倍得到预酸洗液。利用酸洗液对钛合金进行清洗0.5-3min，然后用超纯水超声清洗多遍。

(2)配制0.05-2mol/L的磷酸盐溶液，将酸洗后的钛或钛合金置于可密封的容器中，加入磷酸盐溶液，密封后在40-80℃下加热2-10h。处理完毕后，利用纯水超声清洗5-30min，然后干燥。

(3)将经步骤(2)处理后的钛合金于400℃-600℃条件下进行热处理，保温时间为0.5-2h。处理完毕后，取出样品，超声清洗后干燥备用。

第二方面，本发明提供一种采用第一方面所述方法制备得到的钛基种植体。

由于在制备过程中采用盐溶液作为介质对酸洗后的钛或钛合金进行腐蚀，腐蚀过程条件温和，不会有强酸强碱残留，故本发明中所述钛基种植体不需要反复的清洗除酸碱步骤，应用更为安全。且所述钛基种植体表面形成了多级纳米结构，具有良好的生物相容性，能够更好的促进和细胞粘附相关蛋白的选择性吸附，促进细胞在其表面生长，从而提高植入体的骨整合能力。

第三方面，本发明提供上述钛基种植体在医用植入人体材料中的应用。

本发明提供一种简单易行的钛或钛合金植入体表面纳米化的方法，所述钛基种植体表面形成的多级纳米结构能够促进骨相关细胞的粘附和生长，增强骨相关细胞的成骨响应，加快植入体周围新骨的生长，有望很大程度地提高植入体的骨整合能力。该方法可与其它表面微米化方法结合使用，在植入体表面构建微纳米杂化拓扑结构。本发明有望衍生出新型高效的骨科植入体和种植牙。

与现有技术相比，本发明至少具有以下技术效果：

(1)本发明所采用的方法能够更好的在钛合金基体表面构建多级纳米拓扑结构，使其具有良好的生物相容性，进而促进细胞在其表面生长，很大程度地提高植入体的骨整合能力。

(2)和目前常用的酸蚀方法比，本发明采用盐溶液作为介质对钛或钛合金的腐蚀过程条件温和，应用更为安全。

(3)本发明提供的方法可以和其它表面微米形貌改性方法联合使用，在钛合金基体表面构建微纳米杂化结构，有望衍生出新型高效的骨科植入体和种植牙。

(4)本方法廉价可行，操作简单，方法通用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1经0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和500℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图2为实施例2经2mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和500℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图3为实施例3经4mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和500℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图4为实施例5经0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和300℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图

图5为实施例6经0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和400℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图6为实施例7经0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄处理和600℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图7为实施例8经0.05mol/L K₂HPO₄处理和500℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图8(A)为人原代成骨细胞在由实施例1制备的钛合金表面培养2h的扫描电镜形貌图。

图8(B)为人原代成骨细胞在由实施例1制备的钛合金表面培养24h的扫描电镜形貌图。

图8(C)为人原代成骨细胞在由实施例2制备的钛合金表面培养2h的扫描电镜形貌图。

图8(D)为人原代成骨细胞在由实施例2制备的钛合金表面培养24h的扫描电镜形貌图。

图9为对比例1经500℃热处理的钛合金样品的扫描电镜图。

图10为对比例2经0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄处理的钛合金样品的扫描电镜图。

具体实施方式

为便于理解，本发明列举实施例如下。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，仅用于帮助理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

实施例1

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释5倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛合金放入其中清洗30s，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)称取0.663g的(NH₄)₂HPO₄溶于10ml去离子水中，稀释10倍得到0.05mol/L的(NH₄)₂HPO₄溶液，盛于密闭烧杯中，将清洗好的钛合金浸入其中，密封后放入烘箱，在60℃条件保温4h。将得到的钛合金用超纯水超声清洗10min。

(3)将样品置于马弗炉中500℃均热处理1h，自然冷却后用超纯水超声清洗3min。

图1为本实施例处理后的钛合金表面形貌，从图中可看出，合金表面形成了由纳米背脊和纳米颗粒组成的双级纳米结构(脊道-粒子结构)。脊的宽度大约为20nm，脊之间的间隔大约为174nm，脊之间嵌着的纳米粒子大小为20nm左右。

实施例2

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释10倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛放入其中清洗2min，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)称取2.641g的(NH₄)₂HPO₄溶于10ml去离子水中，得到2mol/L的(NH₄)₂HPO₄溶液，盛于密闭烧杯中，将清洗好的钛浸入其中，密封后放入烘箱，在40℃条件保温24h。将得到的钛用超纯水超声清洗10min。

(3)将样品置于马弗炉中500℃均热处理6h，自然冷却后用超纯水超声清洗3min。

图2为本实施例处理后的钛表面形貌。从图中可看出，钛表面同样形成了由纳米背脊和纳米颗粒组成的双级纳米结构，纳米结构中背脊结构变少，但纳米粒子粒径变大。

实施例3

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释30倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛合金放入其中清洗5min，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)称取5.282g的(NH₄)₂HPO₄溶于10ml去离子水中，得到4mol/L的(NH₄)₂HPO₄溶液，盛于密闭烧杯中，将清洗好的钛合金浸入其中，密封后放入烘箱，在100℃条件保温0.5h。将得到的钛合金用超纯水超声清洗10min。

(3)将样品置于马弗炉中500℃均热处理0.5h，自然冷却后用超纯水超声清洗3min。

图3为本实施例处理后的钛合金表面形貌，从图中可看出，增加(NH₄)₂HPO₄浓度到4mol/L后，背脊结构之间的粒子明显更多，粒子颗粒均匀。

实施例4

除了将实施例1热处理步骤(3)中的“500℃”改为“300℃”，其他部分均与实施例1相同。

图4为本实施例处理后的钛合金表面形貌。300℃热处理后，钛合金表面形成纳米脊背结构，极少量的纳米粒子，而且粒子不明显。

实施例5

除了将实施例1热处理步骤(3)中的“500℃”改为“400℃”，其他部分均与实施例1相同。

图5为本实施例处理后的钛合金表面形貌。400℃热处理后，钛合金表面形成了由纳米背脊和纳米颗粒组成的双级纳米结构，其表面粒子均匀，尺寸20nm左右。

实施例6

除了将实施例1热处理步骤(3)中的“500℃”改为“600℃”，其他部分均与实施例1相同。

图6为本实施例处理后的钛合金表面形貌。600℃热处理后，钛合金表面形成了由纳米背脊和纳米颗粒组成的双级纳米结构，但是其表面形貌不规则，且有开裂现象。

实施例7

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释12倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛合金放入其中清洗3min，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)称取0.114g的磷酸氢二钾溶于10ml去离子水中，得到0.05mol/L的K₂HPO₄溶液，盛于密闭烧杯中，将清洗好的钛合金浸入其中，密封后放入烘箱，在80℃条件保温10h。将得到的钛合金用超纯水超声清洗10min。

(3)将样品置于马弗炉中500℃均热处理1h，自然冷却后用超纯水超声清洗3min。

图7为本实施例处理后的钛合金表面形貌。合金表面同样形成了由纳米背脊和纳米颗粒组成的双级纳米结构。

实施例8

将人成骨细胞种植于经实施例1处理后得到的钛合金材料，在37℃、5％CO₂条件下培养2和24小时。钛合金表面形貌经过固定和脱水干燥等步骤处理后，利用扫描电子显微镜观察细胞形貌。

如图8(A)、图8(B)、图8(C)和图8(D)所示，培养2h后，在不同浓度磷酸盐处理后的钛合金材料表面，细胞均已粘附；24h后细胞在材料表面开始铺展。

对比例1

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释5倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛合金放入其中清洗30s，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)将样品置于马弗炉中500℃均热处理1h，自然冷却后用超纯水超声清洗3min。

图9为本实施例处理后的钛合金表面形貌。从图中可以看出，未经盐溶液腐蚀而只经过热处理的钛合金材料，其表面并不能形成背脊和颗粒的双级纳米结构，而是大小不一的粒子。

对比例2

(1)量取20ml纯水、6ml的48％HF和4ml的48％HNO₃，混合后稀释5倍，制得酸洗液。取适量酸洗液置入烧杯中，将钛合金放入其中清洗30s，然后将得到的浅黄绿色液体弃掉，用超纯水超声清洗三遍。

(2)称取0.663g的(NH₄)₂HPO₄溶于10ml去离子水中，稀释10倍得到0.05mol/L的(NH₄)₂HPO₄溶液，盛于密闭烧杯中，将清洗好的钛合金浸入其中，密封后放入烘箱，在60℃条件保温4h。将得到的钛合金用超纯水超声清洗10min。

图10为本实施例处理后的钛合金表面形貌。从图中可以看出，只经过盐溶液腐蚀而未经过热处理的钛合金材料，其表面并不能形成背脊和颗粒的双级纳米结构，而是腐蚀并不明显的微坑状。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。