本发明涉及材料科学领域和分析化学领域，具体为一种鱼精蛋白金纳米簇的制备及在模拟酶比色和荧光检测中的应用。
背景技术：
金属纳米簇材料近年来引起了广泛的研究兴趣。这是因为：一方面荧光金属纳米簇具有传统有机染料不可比拟的优点，诸如毒性低、光稳定性好、斯托克斯位移大、量子产率高和生物相容性好；另一方面,金属纳米簇模拟酶亦受到人们的亲睐，与天然酶比较，人工模拟酶具有容易修饰、制备、价格低廉和特异性强、灵敏度高等优势，可克服天然酶来源有限、易受环境影响失活和价格昂贵等缺点。虽然金属纳米簇材料研究取得了重要进展，但报道的纳米簇材料在种类、数量和灵敏度、特异性方面仍不能满足化学(生物)传感、环境和生物医学领域的需求，尤其是既能用作荧光染料，又具有模拟酶活性的纳米簇材料鲜见报道。
本发明提供了一种鱼精蛋白金纳米簇的制备方法，该纳米簇既具有辣根过氧化物酶和氧化酶活性，可用于比色检测重金属离子；又可作为荧光试剂，用荧光光度法检测重金属离子。据我们所知，这是首次发现的鱼精蛋白金纳米簇既具有辣根过氧化物酶和氧化酶活性，又可取代现行的有机荧光染料，用于荧光检测重金属等污染物，可望用于其他生物标志物如疾病标志物的检测，具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鱼精蛋白金纳米簇的制备方法；同时，利用制备的鱼精蛋白金纳米簇的模拟酶活性和荧光特性，分别应用于鱼精蛋白金纳米簇模拟酶比色传感和荧光测定重金属离子。
本发明的目的可通过如下技术措施来实现：
所述的鱼精蛋白金纳米簇的制备方法，包括以下步骤：
(1)移取10～50mL 10mM氯金酸溶液，置于10～50mL 0.625～2.5mg/mL硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate,PS)溶液中，25～50℃水浴、剧烈搅拌2分钟；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入1M NaOH溶液调整pH至12，于25～50℃持续搅拌8～24小时；
(3)制备得到的鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)于4℃避光保存。
本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇模拟酶比色法检测汞离子的方法，包括以下步骤:
(1)移取25～50μL鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs),适量3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2,置于NaAc-HAc缓冲液(pH5.5)中,然后加入不同浓度的Hg2+标准溶液，灭菌超纯水定容至500μL，室温下充分混匀放置反应30min；
(2)移取在步骤(1)得到的溶液适量，用UV-2550紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描，以λ＝450nm的吸光度(A450)进行定量。
本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇模拟酶比色法检测汞离子的线性范围为：4.0×10-9～1.0×10-6mol/L，检出限为1.16×10-9mol/L。
本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇荧光测定重金属离子的方法，可通过如下技术措施来实现：
(1)移取30～70μL鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs),适量铅或铀酰离子标准溶液，超纯水定容至总体积500μL，25～35℃孵育20～35分钟；
(2)移取在步骤(1)得到的溶液适量，在F-4500荧光分光光度计上，于550～650nm波长范围内扫描(λex＝300nm，激发狭缝5cm,发射狭缝10cm，光电倍增管负电压为700V)，于λem＝599nm测定体系的荧光变化值,绘制标准曲线；
(3)通过调整实验条件(主要是pH值和温度)，可用以测定重金属离子如铅和铀酰离子的浓度；
(4)上述步骤(3)中，用于测定铅离子(Pb2+)的实验条件为：柠檬酸三钠-HCl缓冲溶液(pH＝6.5)；PS-AuCNs:30～70μL；实验温度：35℃；反应时间：20min；
(5)上述步骤(3)中，用于测定铀酰离子(UO22+)的实验条件为：NaAc-HAc缓冲溶液(pH5.5)；PS-AuCNs:30～70μL；实验温度：25℃；反应时间：35min。
本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇荧光法检测重金属离子的方法，可用于测定铅离子的浓度范围为：8.0×10-8～2.0×10-6mol/L；检出限为2.4×10–8mol/L。可用于测定铀酰离子(UO22+)的浓度范围为2.0×10-8mol/L～1.0×10-5mol/L；检出限为6.1×10-9mol/L。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)所发现鱼精蛋白金纳米簇材料制备简单，成本低廉；由于其尺寸接近电子的费米波长，这些金属纳米簇具有尺寸可调的电子跃迁，从而表现出较强的发光性能，具有优越的荧光和化学稳定性，可克服传统有机染料荧光寿命短，易光漂白等缺点；又可作为辣根过氧化物模拟酶和氧化酶，用于催化比色分析；
(2)基于鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)催化比色测定汞离子，催化活性高，催化条件更加环保绿色，可通过裸眼即可进行可视化检测，检出限达到1.16×10–9mol/L，可用于现场实时监测；
(3)基于鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)荧光法检测重金属离子方法简便，稳定性好，不需要昂贵的仪器，检出限可分别达到6.1×10-9mol·L-1(UO22+)和2.4×10–8mol·L-1(Pb2+)；
(4)上述(2)和(3)所述方法具有良好的选择性；
(5)本发明展现了良好的潜能，可望拓展应用到环境和生物医学领域相关物质和疾病标志物的检测分析。
附图说明
图1是合成的鱼精蛋白金纳米簇形貌表征透射电镜照片，
图2是合成的鱼精蛋白金纳米簇的荧光光谱图，
图3是H2O2-TMB-PS-AuCNs-Hg2+体系的动力学-时间曲线，
图4是测得的PS-AuCNs在一个月内其荧光值衰减情况，以第一天荧光相对活性为100％，可见PS-AuCNs在一个月内其荧光性质相对稳定，
图5为基于鱼精蛋白金纳米簇模拟酶比色法检测汞离子的紫外可见吸收光谱图，图中a:TMB；b:TMB+H2O2；c:TMB+H2O2+PS-AuCNs；d～f:TMB+H2O2+PS-AuCNs+Hg2+,cHg2+(d～f)/nmol/L＝8.0；80.0；800，
图6为基于鱼精蛋白金纳米簇模拟酶比色测定汞离子的照片，cTMB＝0.4mM；cH2O2＝12mM；NaAc-HAc缓冲液(pH 5.5)；cHg2+(1～9):0.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,800.0,1000.0nmol/L；
图7为鱼精蛋白金纳米簇分光光度法测定汞离子的标准曲线，
图8为基于鱼精蛋白金纳米簇检测铀酰离子的荧光光度图，NaAc-HAc缓冲液(pH5.5),cUO22+(μmol/L)/(a～g):0.00,0.05,1.00,2.00,4.00,6.00,10.00，
图9为基于鱼精蛋白金纳米簇检测铅离子的荧光光度图。柠檬酸钠-HCl缓冲溶液(pH6.5)，cPb2+(μmol/L)/(a～h):0.00,0.10,1.00,2.00,4.00,8.00,10.00,12.00。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1：合成多功能鱼精蛋白金纳米簇，具体包括以下步骤：
(1)实验中所用玻璃器皿均事先用HCl:HNO3配制的王水浸泡过夜，然后用超纯水彻底清洗；
(2)配制0.02g/mL的HAuCl4储备溶液和0.625～2.5mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液(PS)；HAuCl4溶液用时稀释至10mmol/L；
(3)移取10～50mL 10mmol/L HAuCl4溶液于10～50mL 0.625～2.5mg/mL的PS溶液中，在37℃水浴条件下剧烈搅拌2分钟后，加入1mol/L的NaOH溶液调pH至12，混合溶液在25～50℃持续搅拌8～24小时；
(4)制备得到的PS-AuCNs在4℃下避光保存。
本发明获得的多功能鱼精蛋白金纳米簇的表征和性能考察。样品选取实施例1制备的多功能鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs),
(1)通过透射电子显微镜表征，本实施例中制备得到的多功能鱼精蛋白金纳米簇粒径均一，大约2nm左右,如图1所示；
(2)合成的PS-AuCNs在365nm的紫外灯照射下发出绿光荧光；通过扫描荧光光谱，激发波长为300nm，发射波长为599nm有最大荧光值，如图2所示。证明本发明的鱼精蛋白金纳米簇具有荧光特性。
(3)图3是H2O2-TMB-PS-AuCNs-Hg2+体系的动力学-时间曲线。由图可见，只有H2O2和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)存在时(曲线c)，溶液在652nm波长处的吸光度值随时间变化很小；在溶液中加入PS-AuCNs，溶液的吸光度值随时间线性增加(曲线b)，证明PS-AuCNs具有过氧化物模拟酶活性，能够催化H2O2氧化TMB的反应；在PS-AuCNs-H2O2-TMB溶液中加入Hg2+，溶液的吸光度随时间急剧增大(曲线a)，证明了Hg2+能增强PS-AuCNs模拟酶活性；
(4)制备得到的PS-AuCNs的荧光值随时间衰减情况如图4所示。由图可见，制备的PS-AuCNs在一个月内其荧光性质相对稳定。
实施例2：基于鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)催化比色法测定汞离子，
(1)移取制备的鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)溶液25～50μL于2mL洗净灭菌处理的EP管中；
(2)在(1)中依次加入适量的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB),H2O2和NaAc-HAc缓冲液(pH5.5)；
(3)在(2)获得的溶液中加入不同浓度的Hg2+标准溶液，灭菌超纯水定容至500μL，室温下充分混匀放置反应30min；然后加入适量0.2mol/L H2SO4溶液终止反应；
(4)移取在步骤(3)得到的溶液适量，用UV-2550紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描，测定λ＝450nm的吸光度(A450)，标准曲线法定量。如图5，随着汞离子浓度的增加，系统的吸光度值依次增加(图5，d-f)；，
(5)本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇催化比色法测定汞离子的浓度范围为：4.0×10-9～1.0×10-6mol/L，检出限1.16×10-9mol/L。分别取汞离子浓度为：8.0×10-7mol/L，8.0×10-8mol/L，8.0×10-9mol/L，进行11次平行测定，求得相对标准偏差分别为：3.82％、3.87％、4.57％；
(6)本发明可可视化测定汞离子，如图6所示；
(7)在最佳实验条件下，依据环境水样中可能共存的物质，试验了多种干扰物质对测定结果的影响，当相对误差控制在±5％时，1000倍的Ca2+，Mg2+；100倍的K+，Fe3+，Zn2+，Na+，UO22+，NH4+，Cd2+，Al3+，Mn2+，Cu2+；90倍的Ag+；5倍的Pb2+均不干扰测定；
(8)样品分析，分别取实验室自来水(样1)，南华大学池糖的水(样2)，湘江水(样3a,3b,3c)。先用定量滤纸分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，保持沸10min后取下，放置使其自然冷却、沉淀，用0.22μm滤膜过滤待测。样品测定结果如表1所示。
表1水样中汞离子测定结果及回收率测定
实施例3：基于鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)荧光法检测铀酰离子(UO22+)，
(1)移取30～70μL鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)于EP管中,加入适量NaAc-HAc缓冲液(pH5.5)和不同浓度的UO22+标准溶液，用灭菌水定容至500μL，充分混匀，反应35min；
(2)移取在步骤(1)得到的溶液适量，在F-4500荧光分光光度计上，设定激发和发射狭缝分别为5cm和10cm，光电倍增管负电压为700V，于550～650nm波长范围内扫描(λex＝300nm)，于λem＝599nm测定体系的荧光变化值,绘制标准曲线；
(3)本发明可用于测定铀酰离子(UO22+)的浓度范围为2.0×10-8mol/L～1.0×10-5mol/L；检出限为6.1×10-9mol·L-1。在最适反应条件下，分别平行配置11管、3种浓度工作液：4.0×10-8mol/L，4.0×10-7mol/L，4.0×10-6mol/L进行精密度实验，求得相对标准偏差分别为3.86％，1.41％，1.71％；
(4)在最适实验条件下，检测多种干扰物质对本实验测定的影响。当相对误差控制在±5％时，500倍的Mg2+、Ca2+，100倍的Na+、NH4+、Mg2+、Ag+、Mn2+、Ca2+，90倍的K+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Al3+，50倍的Hg2+，30倍的Fe3+、Pb2+不干扰铀酰离子测定；
(5)样品分析及回收率测定。分别采集实验室自来水、南华大学荷花池水、湘江上游水、湘江中游水、湘江下游水，先用定量滤纸分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，保持沸腾30min后取下，放置使其自然冷却、沉淀。用0.22μm滤头注射器吸取上清液，再次进行过滤，取下滤头，将注射器中处理后的水样置于2mL EP管中，按建立的方法进行测定，结果如表2。
表2水样中铀酰离子测定结果及回收率测定
实施例4：基于鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)荧光法检测铅离子(Pb2+)，
(1)移取30～70μL鱼精蛋白金纳米簇(PS-AuCNs)于适量柠檬酸三钠-HCl缓冲溶液(pH＝6.5)中,加入不同浓度的铅标准溶液，超纯水定容至总体积500μL，35℃孵育20分钟；
(2)移取在步骤(1)得到的溶液适量，在F-4500荧光分光光度计上，于550～650nm波长范围内扫描(λex＝300nm，激发狭缝5cm,发射狭缝10cm，光电倍增管负电压为700V)，于λem＝599nm测定体系的荧光变化值,绘制标准曲线；
(3)本发明所述的鱼精蛋白金纳米簇荧光法测定铅离子的浓度范围为：8.0×10-8～2.0×10-6mol/L；检出限为2.4×10–8mol/L。在优化的实验条件下，平行配制终浓度为1.0×10–7mol/L、4.0×10–6mol/L、1.5×10–5mol/L的Pb2+标准液，进行精密度实验(n＝11)，相对标准偏差分别为1.62％，2.53％和1.86％；
(4)本发明分别以1.0×10–6mol/L Pb2+的标准溶液对水样中可能存在的干扰物质进行了干扰测定。在相对误差不大于±5％时，100倍的Zn2+、Mg2+、K+、Cu2+、Mn2+、Na+、Cd2+、NH4+、80倍的Ag+，50倍的UO22+、Hg2+、Ca2+，20倍的Al3+、10倍的Fe3+对测定没有干扰；
(5)样品分析。用清洁水瓶采集实验室自来水，南华大学荷花池塘水，湘江排污口上中下游水，记录为1、2和3a、3b、3c。先用定量滤纸分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，保持沸腾10min后取下，放置使其自然冷却、沉淀。用0.22μm滤头过滤,按本发明方法测定，结果如表3所示。
表3水样中Pb的测定结果
以上仅仅是本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，根据本发明的上述构思，其他任何未背离本发明原理与精神实质下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。