本发明涉及一种具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架及其制备方法，属于骨支架制备技术领域。
背景技术：
骨组织工程支架不仅为细胞提供支撑，更要为细胞生长提供合适的外环境，以有利于骨细胞的黏附、增殖和分化，这就要求支架拥有可模拟人体骨骼的孔隙结构。选择性激光烧结技术能够克服传统支架制备方法中微孔分布、形状、空间走向、连通性等不可控的缺点，实现对支架内部微孔结构的控制。除了高孔隙率、相互连通的微孔结构之外，孔壁上的微纳结构表面也是影响骨组织再生的重要因素之一，微纳结构表面具有高比表面积，能为吸附生物活性分子提供多种吸附位点，促进细胞组织与支架之间的相互作用。
硅酸钙(CaSiO3)生物陶瓷因其生物降解性，生物活性和可吸收性被认为是一种有前景的支架材料。然而，动物植入实验和体外降解性实验表明硅酸钙陶瓷材的降解性过快，难以调控硅酸钙陶瓷的降解速率。
而羟基磷灰石(HAp)，化学式Ca10(PO4)6(OH)2在生物学特性方面具有良好的生物相容性，在成分和结构上与人体硬组织如骨骼、牙齿等一致，故当它作为植入材料植入人体时可引导新骨的生长，并能与骨组织形成紧密的骨性结合。纯HAp陶瓷材料的力学性能并不令人满意，例如脆性高，抗弯强度和断裂韧性指标均低于人工致密骨，因而限制了它在人体负重较大部位的应用。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架，包括具有三维多孔结构的CaSiO3骨支架和包覆于所述的CaSiO3骨支架表面的具有微纳结构的HAp纳米层。
优选的方案，所述HAp纳米层的厚度为1～8μm。
作为进一步的优选，所述HAp纳米层的厚度为2～5μm。
优选的方案，所述HAp为纳米片结构或纳米棒结构。
优选的方案，所述三维多孔结构的CaSiO3骨支架由选择性激光烧结制备获得。
本发明技术方案中，采用选择性激光烧结技术获得CaSiO3骨支架，选择性激光烧结技术能够克服传统支架制备方法中微孔分布、形状、空间走向、连通性等不可控的缺点，实现对支架内部微孔结构的控制。
优选的方案，所述CaSiO3骨支架表面的具有微纳结构的HAp纳米层由CaSiO3骨支架利用水热反应在液相中原位生成。
本发明利用CaSiO3骨支架可降解形成富硅层，吸附钙离子和磷酸根离子沉积，从而在支架表面诱导生物活性的羟基磷灰石(HAp)特点，通过水热反应,液相中快速原位形成的HAp纳米层包覆于CaSiO3骨支架表面，所形成的具有纳米结构的HAp晶粒均一可控。
一种具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架的制备方法，将通过选择性激光烧结制备的CaSiO3骨支架浸入磷酸盐溶液中；通过水热反应，即获得具有微纳结构表面的CaSiO3骨支架。
优选的方案，所述磷酸盐选自磷酸钠或磷酸二氢钠。
发明人发现，磷酸盐的类型对所形成的HAp纳米结构很大的影响，在磷酸钠溶液中，所形成的为纳米棒状HAp，在磷酸二氢钠溶液中生成纳米片状HAp，而在其他的磷酸盐溶液中无法诱导出规则可控的纳米结构。
优选的方案，所述磷酸盐溶液中，磷酸盐的浓度为0.15～0.25mol/L。
发明人发现，磷酸盐的浓度对材料具有一定的影响，浓度低于0.15mol/L时制得的HAp颗粒粒度分布范围宽，粒径分布不均匀，浓度高于0.25mol/L后，HAp晶粒的生长几乎没有变化。
优选的方案，所述CaSiO3骨支架与磷酸盐溶液的固液质量体积比为
1:70～100(g：ml)。固液质量体积比过低时制得的HAp颗粒粒度分布范围宽，粒径分布不均匀。
优选的方案，所述水热反应的温度为180～200℃。
发明人发现，水热反应的温度对微纳结构的HAp纳米层的形貌具有一定的影响，反应温度过低，不利于HAp晶体的晶胞发育和粒子长大，生成HAp的结晶性能不够，而反应温度过高时，HAp晶体过度生长，力学性能下降。
优选的方案，所述水热反应的时间为3～24h。
作为进一步的优选，所述水热反应的时间为6～24h。
作为更进一步的优选，所述水热反应的时间为16～24h。
优选的方案，以CaSiO3生物陶瓷粉末为原料，通过选择性激光烧结制备CaSiO3骨支架，所述CaSiO3生物陶瓷粉末的粒径为0.5～2μm，纯度≥99％。
作为进一步的优选，所述CaSiO3生物陶瓷粉末先经干燥处理，所述干燥的温度为60～80℃，干燥的时间为6～12h。
优选的方案，所述选择性激光烧结的工艺参数为：激光功率为10～15W，扫描速度为1.5～2.5mm/s，扫描间距为1.0～3.0mm，光斑直径为0.3～1mm。
在本发明中，通过选择性激光烧结可控的制备出具有三维多孔硅酸钙骨架，可以克服现有技术中所得骨支架微孔分布、形状、空间走向、连通性等不可控的缺点。
本发明一种具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架的制备方法，包括以下主要步骤：
(1)根据骨缺损部位的骨支架结构，设计三维模型。
(2)将CaSiO3生物陶瓷粉末在60～80℃下干燥6～12h，然后将粉末置于激光快速成形系统中根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，获得三维多孔CaSiO3骨支架，主要工艺参数为：激光功率为10～15W，扫描速度为1.5～2.5mm/s，扫描间距为1.0～3.0mm，光斑直径为0.3～1mm。
(3)将三维多孔CaSiO3骨支架进行清洗后于50～80℃干燥6～12h，然后将干燥后的三维多孔CaSiO3骨支架以1：70～100g/mL的固液比置于0.15～0.25mol/L磷酸盐溶液中，然后置于水热反应釜中在180℃～200℃下反应3～24h，即在CaSiO3骨支架表面形成HAp纳米层；经水热反应处理的CaSiO3骨支架取出后用蒸馏水洗涤3～6次，50～80℃下干燥6～12h，即获得具有微纳结构表面的三维多孔硅酸钙骨支架。
本发明的原理和优势：
本发明利用硅酸钙生物陶瓷(CaSiO3)可降解形成富硅层，吸附钙离子和磷酸根离子沉积，从而在支架表面诱导生物活性的羟基磷灰石(HAp)形成的原理，利用水热的高温高压，可促进硅酸钙陶瓷表面与反应媒介快速地进行离子交换释放钙离子提供钙源，并在支架表面形成负电性硅醇基为钙磷沉积提供形核点，从而在整个支架上快速原位生成由纳米结构羟基磷灰石构成的微纳结构，并通过控制反应媒介化学组成及水热反应的条件调控纳米羟基磷灰石的结构，从而获得所需的特定的微米结构表面。
本发明优选出磷酸钠或磷酸二氢钠两种磷酸盐，在这两种溶液体系下，以及水热反应条件的控制下调控诱导出所生成HAp的晶粒结构，从而获有特定纳米结构的HAp纳米层。
本发明先采用选择性激光烧结获得具有三维多孔硅酸钙骨支架，然后基于仿生学原理，通过晶体生长，在三维多孔CaSiO3支架孔壁表面原位生长纳米HAp，形成类似自然骨的孔隙空间结构。依据本发明所述方法制备的具有微纳结构表面的三维多孔CaSiO3骨支架提供了一个三维的宏微结构及大的比表面积和许多同细胞蛋白尺寸相当的吸附位点，为细胞组织在支架上的粘附和生长提供了理想的界面环境。经MG-63细胞培养测定，所制备的具有微纳结构表面的多孔支架能有效促进细胞的粘附、扩展、增殖及分化，在骨修复及骨组织再生领域有着重要的应用价值。
本发明利用选择性激光烧结工艺实现对CaSiO3骨支架内部多孔结构的可控制备；本发明在水热反应处理过程，通过控制反应媒介及反应时间有效地控制支架孔壁表面HAp的形核生长，从而获得可控的微纳结构表面。
本发明的制备方法简单，工艺可控，利用表面微纳结构有效的提高了支架的生物活性并减慢降解速率。
附图说明
图1的支架为对比例1中未经水热反应处理的多孔支架的整体形貌图。
图2为支架的微纳结构表面形貌图，其中图2(a)为激光烧结后未经水热反应处理的多孔支架表面形貌图，图2(b)为实施例1中所得多孔支架表面形貌图，图2(c)为实施例2中所得多孔支架的表面形貌图.
图3为实施例1获得的微纳结构表面及断面形貌图，其中图3(a)，图3(b)为放大不同倍数的微纳结构表面，图3(c)为微纳结构断面。
图4为实施例2获得的微纳结构表面及断面形貌图，其中图4(a)，图4(b)为放大不同倍数的微纳结构表面，图4(c)为微纳结构断面。
图5为不同时间水热反应所得微纳结构表现形貌图。其中图5(a1)为以Na3PO4水溶液作为原料液水热处理6h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌；图5(b1)为以Na3PO4水溶液作为原料液水热处理16h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌；图5(c1)为实施例1所得多孔支架的微纳结构表面形貌；图5(d1)为以NaH2PO4水溶液作为原料液水热处理6h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，图5(e1)为以NaH2PO4水溶液作为原料液水热处理16h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，图5(f1)为实施例2所得多孔支架的微纳结构表面形貌。
图6为对比例1多孔支架表面形貌图，其中图6(a)，图6(b)为放大不同倍数的微纳结构表面，图6(c)为微纳结构断面。
图7为细胞在支架上的粘附、增殖和分化情况图。
图8为细胞在支架上的粘附、增殖和分化情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。
实施例1
1)利用SolidWorks三维设计软件对复合支架进行多孔结构和个体化外形设计，将设计好的三维数据模型导入计算机进行分层切片处理，得到每一层的截面轮廓信息。
2)利用电子天平分别称取颗粒尺寸为1μm，熔点为1540℃的硅酸钙粉末50g在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为80℃，保温时间为12h。
3)将干燥后的混合粉末置于选择性激光烧结系统中进行烧结实验，计算机根据界面轮廓信息对粉末材料进行有选择性的层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：主要工艺参数为：激光功率为12W，扫描速度为2.0mm/s，扫描间距为2.0mm，光斑直径为0.8mm。
4)用无水乙醇和蒸馏水对上述支架进行清洗3次，在干燥箱中以80℃干燥12h。
将干燥后的支架以1：85g/mL的固液比置于0.2M Na3PO4水溶液中，然后置于100mL的水热反应釜中在180℃下加热24小时，在支架表面生成纳米棒状的HAp。
5)水热处理后冷却至室温取出支架用蒸馏水洗涤4次，80℃下干燥12h，得到具有纳米棒状结构表面的多孔支架。
本实施例所得到的多孔支架的表面形貌图，如图2(b)所示。
所获得的微纳结构表面及断面形貌如图3所示：其中图3(a)，图3(b)为放大不同倍数的微纳结构表面，图3(c)为微纳结构断面。从图3中可以看出，支架被纳米棒状的HAp完全覆盖，这些HAp纳米棒平均直径为50nm、平均长度为1.5μm，纳米层的平均厚度为2μm。可以看出HAp的颗粒尺寸是微纳级的，所形成的表面为微纳结构表面。
6)经MG-63细胞培养实验发现，如图7、图8所示，相比于未经水热处理的复合支架，Na3PO4溶液中水热处理后的支架细胞粘附的更多，铺展得更广，细胞活性提高了0.5-1倍，ALP活性也更显著，其展现了更好的细胞粘附、扩展、增殖及分化性能。
7)经PBS浸泡测试发现，本实施例1中具有纳米棒状结构表面的支架降解速率为三周降解13％。
8)经力学性能测试发现，本实施例1中的支架的压缩强度为20.94Mpa、断裂韧性为1.23MPa·m1/2，表现出良好的力学性能。
实施例2
1)利用SolidWorks三维设计软件对复合支架进行多孔结构和个体化外形设计，将设计好的三维数据模型导入计算机进行分层切片处理，得到每一层的截面轮廓信息。
2)利用电子天平分别称取颗粒尺寸为1μm，熔点为1540℃的硅酸钙粉末50g在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为80℃，保温时间为12h。
3)将干燥后的混合粉末置于选择性激光烧结系统中进行烧结实验，计算机根据界面轮廓信息对粉末材料进行有选择性的层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为12W，扫描速度为2.0mm/s，扫描间距为2.0mm，光斑直径为0.8mm。
4)用无水乙醇和蒸馏水对上述支架进行清洗3次，在干燥箱中以80℃干燥12h。
将干燥后的支架以1：85g/mL的固液比置于0.2M NaH2PO4水溶液中，然后置于100mL的水热反应釜中在180℃下加热24小时，在支架表面生成纳米片状的HAp。
5)水热处理后冷却至室温取出支架用蒸馏水洗涤4次，80℃下干燥12h，得到具有纳米棒状结构表面的多孔支架。
本实施例2中所得到的多孔支架的表面形貌图如图2(c)所示。
所获得的微纳结构表面及断面形貌如图4所示：其中图4(a)，图4(b)为放大不同倍数的微纳结构表面，图4(c)为微纳结构断面。从图3中可以看出，实施例2中支架被纳米片状的HAp完全覆盖，HAp纳米片厚度100nm、宽度3μm、长度达20μm，纳米层的厚度约为5μm。由于这个HAP是的颗粒尺寸是微纳级的，所以形成的表面为微纳结构表面。
6)经MG-63细胞培养实验发现如图7、图8所示，相比于未经水热处理的复合支架，NaH2PO4溶液中水热处理后的支架细胞粘附的更多，铺展得更广，细胞活性提高了0.5-1倍，ALP活性也更显著，其展现了更好的细胞粘附、扩展、增殖及分化性能。
7)经PBS浸泡测试发现，本实施例2中具有纳米片状结构表面的支架降解速率三周降解11％。
8)经力学性能测试发现，本实施例2中的支架的压缩强度为21.11Mpa、断裂韧性为1.21MPa·m1/2，表现出良好的力学性能。
实施例3
1)利用SolidWorks三维设计软件对复合支架进行多孔结构和个体化外形设计，将设计好的三维数据模型导入计算机进行分层切片处理，得到每一层的截面轮廓信息。
2)利用电子天平分别称取颗粒尺寸为1μm，熔点为1540℃的硅酸钙粉末50g在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为80℃，保温时间为12h。
3)将干燥后的混合粉末置于选择性激光烧结系统中进行烧结实验，计算机根据界面轮廓信息对粉末材料进行有选择性的层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：主要工艺参数为：激光功率为12W，扫描速度为2.0mm/s，扫描间距为2.0mm，光斑直径为0.8mm。
4)用无水乙醇和蒸馏水对上述支架进行清洗3次，在干燥箱中以80℃干燥12h。
将干燥后的支架以1：85g/mL的固液比置于0.2M Na3PO4水溶液中，然后置于100mL的水热反应釜中在180℃下加热16小时，在支架表面生成纳米棒状的HAp。
5)水热处理后冷却至室温取出支架用蒸馏水洗涤4次，80℃下干燥12h，得到具有纳米棒状结构表面的多孔支架。
支架被纳米棒状的HAp完全覆盖，这些HAp纳米直径52nm，长径比13，可以看出HAp的颗粒尺寸是微纳级的，所形成的表面为微纳结构表面。
6)经PBS浸泡测试发现，本实施例3中具有纳米棒状结构表面的支架降解速率三周降解13.8％。
7)经力学性能测试发现，本实施例3中的支架的压缩强度为20.78Mpa、断裂韧性为1.20MPa·m1/2，表现出良好的力学性能。
实施例4
该实施例主要研究不同水热时间对微纳结构形貌的影响，本实施例中的其他条件与实施例1或实施例2中的相同，仅将水热反应的时间分别设定为6h和16h。所得多孔支架的微纳结构表面形貌SEM图如图5所示，其中图5(a1)为以Na3PO4水溶液作为原料液水热处理6h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，从图中可看出在Na3PO4溶液中水热处理6h后，支架表面生成了直径约20-70nm的纳米棒状HAp，这些HAp纳米棒的平均直径为43nm。
其中图5(b1)为以Na3PO4水溶液作为原料液水热处理16h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，从图中可看出延长反应时间到16h，这些纳米棒状HAp沿长轴方向显著地伸长，而在直径方向尺寸只有轻微的增加(直径52nm,长径比13)。
其中图5(d1)为以NaH2PO4水溶液作为原料液水热处理6h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，从图中可看出支架表面上生成了大量的不规则纳米薄片状的HAp，它们的平均直径达到了0.76μm。
其中图5(e1)为以NaH2PO4水溶液作为原料液水热处理16h所得的多孔支架的微纳结构表面形貌，从图中可看出这些薄片状的HAp进一步生长成为宽度达1.3μm长宽比达5的纳米片状结构。
对比例1
1)利用SolidWorks三维设计软件对复合支架进行多孔结构和个体化外形设计，将设计好的三维数据模型导入计算机进行分层切片处理，得到每一层的截面轮廓信息。
2)利用电子天平分别称取颗粒尺寸为1μm，熔点为1540℃的硅酸钙粉末50g在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为80℃，保温时间为12h。
3)将干燥后的混合粉末置于选择性激光烧结系统中进行烧结实验，计算机根据界面轮廓信息对粉末材料进行有选择性的层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为12W，扫描速度为2.0mm/s，扫描间距为2.0mm，光斑直径为0.8mm。
4)用无水乙醇和蒸馏水对上述支架进行清洗3次，在干燥箱中以80℃干燥12h。支架表面及断面形貌如下图6所示，其中图6(a)，图6(b)为放大不同倍数的表面形貌，图6(c)为结构断面。
5)经体外浸泡测试发现，支架在PBS溶液中快速降解。
6)经MG-63细胞培养实验发现如如图7、图8所示，细胞能在支架表面正常的粘附和增殖。
7)经力学性能测试发现，本对比例1中的支架的压缩强度为20.62Mpa、断裂韧性为1.16MPa·m1/2。
对比例2
其他条件与实施例1相同，仅Na3PO4水溶液的浓度为0.1mol/L，发现所制得的HAp颗粒粒度分布范围宽，粒径分布不均匀。
经MG-63细胞培养实验发现，对比例2中相对于实施例1，细胞粘附的少得多，细胞活性提高仅略高于未经水热处理的支架。
经PBS浸泡测试发现，本对比例2中具有纳米棒状结构表面的支架降解速率三周降解15.2％。
经力学性能测试发现，本对比例2中的支架的压缩强度为20.71Mpa、断裂韧性为1.19MPa·m1/2。
对比例3
其他条件与实施例2相同，仅将干燥后的支架以1：85g/mL的固液比置于0.2M NaH2PO4水溶液中，然后置于100mL的水热反应釜中在220℃下加热24小时，在支架表面生成纳米片状的HAp。
对比例3所形成HAp纳米片厚度750nm、宽度8.2μm、长度达76μm，纳米层的厚度约为8.6μm。发现由于反应温度过高时，HAP晶体快速生长，力学性能反而下降。
经MG-63细胞培养实验发现，对比例3中相对于实施例2，细胞粘附的少得多，细胞活性提高仅略高于未经水热处理的支架。
经PBS浸泡测试发现，本对比例3中具有纳米棒状结构表面的支架降解速率三周降解8.4％。
经力学性能测试发现，本对比例3中的支架的压缩强度为20.19Mpa、断裂韧性为1.14MPa·m1/2。