一种基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法

本发明属于土壤理化性质改良技术领域，具体涉及一种基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法。

背景技术：

土壤作为植物磷素的供给源，其速效磷含量的高低直接影响着植物的生长发育。据报道，我国约74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％以上的磷为无效态磷，不能被植物有效吸收和利用。因此，提高土壤磷素的利用效率和合理施用磷肥是现阶段提高速效磷的重要途径。

茶园土壤由于受茶树生长过程和其它外界环境的影响，茶园土壤酸化程度和速度较其他农用地更为严重，因此茶园土壤缺磷情况更为普遍。酸性茶园土壤的增磷措施主要有：施加含磷化肥、有机肥和微生物等。由于微生物肥综合利用了土壤物理、化学和生物的协同作用效果，因此作用效果较好。然而，土壤介质不同于其它环境要素，解磷菌剂很难在土壤中均匀地分散，成为制约解磷菌提高土壤速效磷的主要限制因子。

而采用无机磷肥调节茶园土壤速效磷含量见效快，但易造成土壤酸碱失衡、土壤板结、地表径流引起的水体富营养化等缺点。而且，含磷化肥的长期、大量施入增加伴生重金属（如cd）的含量，势必增加茶园土壤重金属含量超标的潜在风险。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对背景技术中的问题，提供一种基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法，基于生物技术，解决了土壤磷肥有效性低的瓶颈问题。

为达到发明目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法，其特征在于，方法步骤如下：

（1）获取专性解磷菌：以缺磷土壤为基质，筛选专性解磷菌，依据无机磷培养方法经分离、驯化、富集获取，采用16srdna方法鉴定专性解磷菌菌株。

（2）制备功能性调理剂：将3g蒙脱石置于50mllb培养基中，121℃灭菌30min，以3%的接种量接入步骤（1）分离的解磷菌，35℃、150r/min条件下固定18h后取出，以5000r/min离心10min后，倒掉上清液，用质量分数为1%的生理盐水洗涤下层沉淀部分，离心并重复洗涤3次至中性，离心所得固体即为蒙脱石@解磷菌；蒙脱石@解磷菌与过磷酸钙以质量比12:1的配比制得功能性调理剂。

（3）功能性调理剂的应用：向缺磷土壤中均匀喷洒步骤（2）制备的功能性调理剂，缺磷土壤与功能性调理剂的质量配比为30:1。

进一步地，上述步骤（1）中筛选专性解磷菌的具体步骤为：取5-10cm土培的缺磷土壤10g，放入90ml无菌水中震荡制成土壤悬浊液，稀释10^-3、10^-4和10^-5倍接种到无机磷固体培养基：5g·l^-1ca3(po4)2、10g·l^-1葡萄糖、0.3g·l^-1nacl、0.3g·l^-1mgso4、0.3g·l^-1kcl，0.5g·l^-1(nh4)2so4、0.03g·l^-1mnso4、0.03g·l^-1feso4、20g·l^-1琼脂；恒温30°c培养7天，若在菌落周围形成清晰的晕圈，证明该菌具有解磷能力。

进一步地，上述步骤（1）中采用16srdna方法鉴定的具体方法为：选用细菌16srdna通用引27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3),1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3)建立pcr扩增体系进行扩增；pcr反应体系50μl，其中灭菌水20μl，1×kodone^tmpcrmaster25μl，模板2μl，1×引物（10μmeach）1.5μl；扩增程序为98°c预变性10min，98°c变性10s，55°c退火8s，68°c延伸2s，共35个循环；产物经纯化后测定基因序列，利用blast将菌株的基因序列与genbank数据库中的序列进行比较，选取相似性较高的模式菌株序列，用mega5.1中neighbor-joining法比较同源性，构建系统发育树。

效果检验实验：在100g茶园缺磷土壤中加入步骤（2）制备的功能性调理剂，土壤与功能性调理剂的配比为30:1（m:m），进行45天培养实验，利用功能调理剂施用前后土壤速效磷含量的变化情况表征其作用效果，发现蒙脱石@解磷菌联合过磷酸钙处理后的土壤速效磷含量相比对照提高了62.5%、相比单施加过磷酸钙的土壤提高了37.9%。

本发明的有益效果是：1、本发明的方法综合了专性解磷菌的微生物技术、蒙脱石大比表面积载体和配施磷肥的优势，科学有效地解决了缺磷土壤磷肥有效性低的瓶颈问题；2、相比单加磷肥，土壤速效磷显著增加，土壤速效磷等级提升。3、本发明生物技术支撑的功能性调理剂的原材料易于获取，价格适宜。4、本发明方法操作简便，易于实际操作。

附图说明

图1为本发明实施例的解磷菌解磷曲线图；

图2为本发明实施例的解磷菌系统发育树；

图3为本发明实施例的蒙脱石@解磷菌的扫描电镜(sem)图片；

图4为本发明实施例的解磷菌联合磷肥对土壤ph影响的柱状图；

图5为本发明实施例的解磷菌联合磷肥对土壤速效磷含量影响的柱状图。

具体实施方式

本发明实施例选用江西省某云雾茶园缺磷土壤检验本方法对茶园土壤磷含量的提标改善效果。

一种基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法，具体方法步骤如下：

1、专性解磷菌的分离、驯化及富集

取5-10cm土培的茶园土壤10g，放入90ml无菌水中震荡制成土壤悬浊液（150rpm30min），稀释10^-3、10^-4和10^-5倍接种到无机磷固体培养基：5g·l^-1ca3(po4)2、10g·l^-1葡萄糖、0.3g·l^-1nacl、0.3g·l^-1mgso4、0.3g·l^-1kcl，0.5g·l^-1(nh4)2so4、0.03g·l^-1mnso4、0.03g·l^-1feso4、20g·l^-1琼脂。恒温30°c培养7天，在菌落周围形成清晰的晕圈，证明该菌具有解磷能力。将此专性解磷菌的菌落放入冰箱保存备用。

将专性解磷菌放入液体培养基（除琼脂）中摇床150转、30°c恒温培养。1-7天每24小时取样，8000r/min离心15min，测定上清液中可溶性磷含量，测定ph，如图1所示。专性解磷菌的溶磷量由第一天的14.19mg/kg提高至第六天的284.18mg/l达到最大溶磷量，ph降至4.57。说明本专性解磷菌具有较好的解磷能力且ph符合茶园土壤要求。zedongteng等人的研究中，解磷菌可溶磷含量范围在4.04-430.4mg/l，与本实验专性解磷菌相同，所以此专性解磷菌进一步应用于茶园土壤，提高速效磷含量。

2、菌株的鉴定

选用细菌16srdna通用引27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3),1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3)建立pcr扩增体系进行扩增。pcr反应体系(50μl)为灭菌水20μl，1×kodone^tmpcrmaster25μl，模板2μl，1×引物(10μmeach)1.5μl。扩增程序为98°c预变性10min，98°c变性10s，55°c退火8s，68°c延伸2s，共35个循环。产物经纯化后测定基因序列，利用blast将菌株的基因序列与genbank数据库中的序列进行比较，选取相似性较高的模式菌株序列，用mega5.1中neighbor-joining法比较同源性，构建系统发育树。

结果如图2表明，专性解磷菌与葡萄球菌属同源性很高，从16srdna序列相似性比较结果看，解磷菌与staphylococcuscohnii相似性达到100%；选取19株同源性较高的葡萄球菌菌株序列与待测菌株序列构建系统发育树。从系统发育树可以看出，解磷菌与staphylococcuscohniisubsp.urealyticusstrainck27相似度最高，去除首尾多余序列后同源性为100%。

3、功能材料的制备及扫描电镜图

将3g蒙脱石置于50mllb培养基中，121℃灭菌30min，以3%的接种量接入解磷菌，35℃、150r/min条件下固定18h后取出，以5000r/min离心10min后，倒掉上清液，用1%（质量分数）的生理盐水洗涤下层沉淀部分，离心并重复洗涤3次至中性，离心所得固体即为蒙脱石@解磷菌。

扫描电镜sem可以观察供试的生物材料的表面形貌特征。如图3，蒙脱石颗粒呈薄厚不一的团状或絮状，边缘呈直角状或不规则状。蒙脱石负载解磷菌后可以看到解磷菌稳定地包裹在蒙脱石表面，并使得蒙脱石表面凹凸不平，增大了专性解磷菌与土壤的接触面积。所以蒙脱石@解磷菌可以使专性解磷菌稳定地吸附在负载材料上，不容易造成肥料流失的情况，稳定地存在于土壤中，且更有利于专性解磷菌对土壤磷素的作用。

4、生物技术的应用

在无菌土中设置五种处理：(1)对照组；(2)过磷酸钙处理（2.5g/kg）用p表示；(3)解磷菌处理（30ml/kg）用psb表示；(4)解磷菌+过磷酸钙处理（30ml/kg+2.5g/kg）用psb-p表示；(5)蒙脱石@解磷菌+过磷酸钙处理（30g/kg+2.5g/kg）用mt-psb-p表示。每种处理3个重复，每个重复100g无菌土，培养45天，取样间隔为15天。土壤水分一直保持田间持水量70%（采用称重法）。取的样品后测定其ph、速效磷含量、酸性磷酸酶活性。

由图4可知，15天后添加功能性调理剂的土壤ph显著低于对照组，降低了0.21-0.65个单位。psb-p的最低，ph为5.19。30天后土壤ph仍显著低于ck，psb-p的ph降低至5.11。45天后psb、mt-psb-p处理与对照组差异不显著，其他处理仍低于对照。试验茶园土壤ph本身属于茶树适宜生长范围，而单解磷菌联合磷肥或者单施加磷肥会造成土壤ph持续变酸的局面，不符合茶树生长要求，单施加解磷菌又无法达到材料均匀分散的要求。功能性调理剂施入土壤后虽然ph在15天、30天相比对照有所降低，但45天时ph与对照组差异不显著，正符合茶园ph要求，所以蒙脱石可以缓解因解磷菌联合磷肥的施入而造成的土壤ph降低的情况。

由图5可知，添加功能性调理剂后土壤速效磷含量均显著增高。15天时土壤速效磷含量除对照外，处理间差异不显著；培养30天后添加了解磷菌的土壤比单添加磷肥的土壤显著提高了0.236-1.199个单位，添加mt-psb-p的土壤速效磷含量达到3.95mg/kg；培养45天后，mt-psb-p的处理仍可保持较好的速效磷含量水平，相比ck提高了62.5%，相比p提高了37.9%，其他处理也远低于蒙脱石@解磷菌联合磷肥对土壤速效磷含量的提高。mt-psb-p和psb-p相比，蒙脱石吸附并固定解磷菌可以在土壤中稳定存在，并且蒙脱石的大比表面积可以增加解磷菌对土壤的接触，减小浇水及其他外界因素对解磷菌造成的影响，使得解磷菌在土壤中可以更加稳定地发挥效用。

蒙脱石@解磷菌联合少量磷肥即可达到有效提高速效磷含量的效果，此次试验45天后速效磷含量从2.43mg/kg提高至3.94mg/kg，提高了62.5%，而单施加磷肥的土壤提高至2.86mg/kg。依据全国第二次土壤普查相关标准，蒙脱石@解磷菌联合磷肥的土壤速效磷含量提升至ⅴ级，而对照组和单施加磷肥的土壤速效磷含量仍属于ⅵ级。说明，本发明基于生物技术提高土壤速效磷含量的方法可以有效提高茶园土壤速效磷含量，相比单施加磷肥的作用更好，在资源合理利用的情况下解决茶园土壤缺磷问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。