一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr)属于前科枸杞属，为多棘刺灌木，多分枝，枝 条坚硬，常呈之字形弯曲，白色，分布于中国西北和欧洲中亚。黑果枸杞味甘、性平，富含蛋 白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分，特别是含有丰富的黑 果色素--天然原花青素（OPC)，其OPC含量超过蓝莓（黑果枸杞含OPC3690mg/100g;蓝 莓含0PC330~3380mg/100g)，是迄今为止发现的OPC含量最高的天然野生植物。原花青素 OPC是最有效的天然水溶性自由基清除剂，其功效是VC的20倍、VE的50倍，属天然的水溶 性花色甙黄酮类。黑果枸杞被收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏药经典著作中，被誉为 "软黄金"。
[0003] 危害黑果枸杞主要病害有黑果病、根腐病等病理性真菌。植物病理真菌主要存在 于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损失。因此，要从生物防治的角 度消除植物真菌病害，杀灭或抑制土壤中的病理真菌至关重要，而使用具有生物防治功效 的生物肥是实现这一目的的有效途径。在各种生物肥中，长久以来我国应用的都是无芽孢 菌类。但是无芽孢菌抗逆性低，对于干燥高温的抵抗能力差，所以当制成液体或者吸附剂时 稳定性不高。生物肥发展的新趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。 特别是芽孢杆菌能够产生多种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无 害，也不会污染环境，将在防治植物真菌病害中起重要作用。
[0004] 芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环 境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安 全微生物（generallyregardedassafety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌， 产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶 等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，通过将产beta葡 聚糖酶的枯草芽孢杆菌（CICC10339)融入黑果枸杞天然菌群中，制成能够通过生物防治 途径有效抑制杀灭黑果枸杞病理真菌的生物肥（即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥）。
[0006] 一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，制成密度109~10 1(lCfu/mL的高密度 菌悬液；
[0008] 2)将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度 菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
[0009] 本发明中，将黑果枸杞健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健 康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群与黑果枸杞植株协同进化生长，形成了互益共生体 系，对病害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌 (CICC10339)加入堆肥中，显著加强对黑果枸杞病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌 (CICC10339)由于产beta葡聚糖酶，对黑果枸杞植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过 程所必须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作 用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草 芽孢杆菌（CICC10339)即是黑果枸杞益生菌，对黑果枸杞病理真菌有显著生物防治作用。
[0010] 步骤1)中，枯草芽孢杆菌（CICC10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌 种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007 年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌（CICC10339)可以向中国工业微生物菌种保藏 管理中心购买。
[0011] 将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌（CICC10339)的出 发密度为1〇6~1〇7个/mL，接种至液体培养基中接种量为1%~5%，33°C~39°C振荡培养 20~28h，至菌液密度为109~10 1(lcfu/mL的高密度菌悬液。
[0012] 进一步优选，将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌（CICC 10339)的出发密度为106~10 7个/mL，接种至液体培养基中接种量为2%~3%，36°C~ 37°C振荡培养22~26h，至菌液密度为109~10 1(lCfu/mL的高密度菌悬液。
[0013] 所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
[0014] 葡萄糖 11~17g; 牛肉膏 20~30g; 磷酸二氢钾 1.5~3.5g; 花生饼粉 7~13g; 调节pH=6.5~7.5〇
[0015] 进一步优选，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
[0016] 葡萄糖 14g; 牛肉膏 25g; 磷酸二氢钾 2.45g; 花生饼粉 l〇g; 调节pH=7.0。
[0017] 液体培养基在121°C灭菌20min。
[0018] 步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达 到30°C~34°C时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41°C~ 45 °C时堆肥结束。
[0019] 堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32°C时， 喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43°C时堆肥结束。
[0020] 步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。所述的发酵采用自然状态下发酵。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0022] 本发明中，将黑果枸杞健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健 康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群与黑果枸杞植株协同进化生长，形成了互益共生体 系，对病害真菌有一定生物防治作用。
[0023] 枯草芽孢杆菌（CICC10339)产beta葡聚糖酶，强力破坏病理真菌细胞壁，对病理 真菌有显著抑制杀灭作用。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微 生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中富含的枯草芽孢杆菌（CICC10339) 即