是黑果枸杞益生菌，对黑果枸杞病理真菌有显著生物防治作用。
[0024] 堆肥过程在自然状态下进行，依靠微生态稳定的黑果枸杞植株天然菌群进行发 酵，而枯草芽孢杆菌（CICC10339)由于产beta葡聚糖酶，对黑果枸杞植株纤维有良好分解 作用，为堆肥发酵过程所必须，因此，枯草芽孢杆菌（CICC10339)能够充分融入到堆肥菌 群中稳定持久地增殖。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业 化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
【具体实施方式】[0025] 实施例1
[0026] 1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌（CICC10339)的高密度培养，枯草芽孢杆 菌（CICC10339)的出发密度为1. 13X106个/mL，接种至液体培养基（葡萄糖14g/L、牛肉 膏25g/L、磷酸二氢钾2. 45g/L、花生饼粉10g/L，pH= 7. 0,121°C灭菌20min)中，接种量为 2%，37°C振荡培养24h，菌液密度为1. 75X109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
[0027] 2)将黑果枸杞健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到 32°C时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液2L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43°C时堆肥 结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥， 即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
[0028] 3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有 beta葡聚糖酶活力，对黑果枸杞病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表1。
[0029]黑果病真菌（Colletotrichum)CICC2677、根腐病真菌（Fusarium)CICC2682 购 自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)。
[0030]beta葡聚糖酶活力测定：采用还原糖测定法，beta葡聚糖酶能够将beta葡聚糖降 解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色深 浅与还原糖生成量成正比，而还原糖生成量又与反应液beta葡聚酶糖活力成正比，从而利 用比色测定反应液的吸光值计算还原糖生成量，得到beta葡聚糖酶活力。beta葡聚酶活力 单位定义：在测定条件下，每分钟水解beta葡聚糖产生1ymol还原糖（以葡萄糖计）所需 的酶量，定义为一个酶活单位（IU)。
[0031] 平板抑制抑菌宽带：米用平板喷雾法，待测菌株点接在NA平板，每平板2株，各3 个重复，28°C培养24h，把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，重复一次， 杀死待测菌；将病原真菌配成1〇8菌悬液，用无菌喉头喷雾器迅速将其喷在接有待测菌的平 板上（0.lml/皿），28°C继续培养48-60h后，记录形成抑菌圈大小。
[0032] 平板拮抗：将NA培养基倒入平板，凝固后在培养基上成三角放置牛津杯，向牛津 杯内加入发酵液100yL，28°C温箱培养，待病原真菌生长后记录抑菌圈大小。
[0033]表1
【主权项】
1. ー种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，制成密度IO9~10ltlCfuAiL的高密度菌悬 液； 2) 将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬 液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
2. 根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC10339的出发密 度为IO6~107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1 %~5%，33°C~39°C振荡培养20~ 28h，至菌液密度为IO9~10ltlCfuAiL的高密度菌悬液。
3. 根据权利要求2所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC10339的出发密 度为IO6~107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2%~3%，36°C~37°C振荡培养22~ 26h，至菌液密度为IO9~10ltlCfuAiL的高密度菌悬液。
4. 根据权利要求2或3所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在子， 所述的液体培养基，以IL计，包括以下组分：
5. 根据权利要求4所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，所 述的液体培养基，以IL计，包括以下组分：
6. 根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30°C~ 34°C时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41 °C~45°C时堆 肥结束。
7. 根据权利要求6所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32°C时， 喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43°C时堆肥結束。
8. 根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤2)中，堆肥结束后，将堆肥撹拌摊凉。
9.根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步 骤2)中，所述的发酵采用自然状态下发酵。
【专利摘要】本发明公开了一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌高密度菌悬液，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。本发明中，产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌是对黑果枸杞起抗病促生作用的植物益生菌，将其加入堆肥中，显著加强对黑果枸杞病害真菌的生物防治作用，并提高黑果枸杞产量。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
【IPC分类】C05F17-00, C05G3-00
【公开号】CN104628434
【申请号】CN201510057945
【发明人】徐薇薇, 胡慧雯, 吴渊, 阮晖, 梁莹, 许丽珍, 吴孔华, 莫建平, 史金昕波, 缪丹, 俞雨, 吴盛彬, 徐腾洋
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月4日