专利名称：蛋白质二硫键色谱在线对接技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程。
目前，人们利用基因重组技术表达的蛋白质已达4000种以上，但真正用于临床的蛋白质却只有1％左右，其主要的原因是目前表达的蛋白质大部分是利用原核尤其是大肠杆菌(E.coli)作为表达系统，表达的蛋白质极易形成二硫键错接和形成没有生物学活性的包涵体而沉淀于细胞内。为了获得有生物学活性的蛋白质，必须对其进行正确地折叠复性。因此，折叠复性是绝大多数原核表达蛋白质必须的步骤。折叠的通常办法是先使用变性剂将包涵体溶解，再使用二硫键还原剂将二硫键还原。因此，进行折叠时最关键的一步也是最重要的第一步，就是将二硫键进行正确的对接，使之形成具有生物学活性的蛋白质。否则，蛋白质活性难以恢复。然而，在目前表达的4000多种蛋白质中能够自发地形成二硫键正确对接的蛋白质加上不含二硫键的蛋白质合计不足5％，其余95％的蛋白质在折叠过程中二硫键极易形成错接。由于目前还没有一个很好的技术能够解决二硫键正确对接的技术难题，直接制约了基因重组蛋白质利用率的进一步提高，造成了上游工程的巨大浪费。
目前，研究蛋白质二硫键对接的方法有以下两类①在溶液中加入一定比例的氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽或通空气以及加入一些可以促进氧化和还原反应的试剂如Cu2+等，它存在三个最大的缺点一是蛋白质二硫键在分子内以及分子间都容易错接，实验随意性较大，条件不易控制；二是在对接过程中，大部分蛋白质产生沉淀，只有一小部分进行对接；三是为了避免沉淀产生，需要100倍左右的稀释，造成体积大，后处理困难。②二硫键异构酶法，在蛋白质的复性溶液中加入二硫键异构酶，帮助错误对接的蛋白质改正，但该方法在溶液中重新引入了杂蛋白，而且二硫键异构酶的价格昂贵，只能作为理论研究，不能在实际生产中使用。本发明建立的二硫键色谱在线对接新技术则可以克服上述的缺陷。
本发明的目的是利用色谱在线对接技术解决多年来基因重组蛋白质表达后二硫键无法进行对接的技术难题，使基因工程表达的蛋白质在折叠时二硫键能够进行正确的对接。提高基因重组表达蛋白质的临床使用率，降低整个生物技术上游产业的成本，产生巨大的经济效益。为基因重组蛋白质尽快地从实验室走向临床提供技术上的支撑。
本发明的优点为1．有高的正确对接效率和质量回收率；2．二硫键在色谱上进行二硫键对接的浓度高，体积比较小，后处理比较方便；3．色谱法将二硫键对接、蛋白质复性和纯化三者集为一身，使原来需要几步操作才能完成的工作，在色谱上一步就可以完成，大大简化了生产工艺。4．色谱方法很容易实现自动化，二硫键的对接程度可以实现人为的控制，容易进行工业化生产；5．成本低，色谱填料可循环使用100-1000次左右，大大将低了生产的成本。从以上可以看出，色谱法作为蛋白质二硫键对接的方法具有高效、快速、成本低、易控制、可实现自动化的优点。
本发明的技术方案所谓的“二硫键色谱在线对接技术”就是利用蛋白质在色谱填料上进行吸附-解析的过程(即分离纯化)的同时实现二硫键正确对接的技术。蛋白质二硫键在色谱上可以实现在线对接的理论依据是①蛋白质分子在色谱柱上进行吸附时是以单分子层分布在填料表面上，避免了蛋白质分子之间的相互作用，表现出两个最大的优点一是当加入的二硫键对接试剂时，由于分子之间的相互作用被避免，避免了分子之间二硫键错接，二硫键就只能在蛋白质分子内部进行对接，大大提高了二硫键正确对接的效率；二是由于分子间的相互作用被避免，蛋白质与蛋白质间就不会相互聚集产生沉淀，从根本上避免了传统折叠复性方法的大部分蛋白质产生沉淀的副反应，确保了表达的蛋白质都可以进行分子内的二硫键的对接，提高了二硫键对接蛋白质的数目。由于对接数目和正确对接比例的提高，使得色谱在线对接技术可以有一个高的对接效率。②从我们以前研究色谱热力学的结果提示，蛋白质在进行分子内二硫键对接时，色谱填料本身具有迫使蛋白质二硫键进行正确对接的趋势，蛋白质的复性就是利用该规律。③即使部分蛋白质二硫键不能形成分子内的正确对接，由于正确对接和不正确对接的蛋白质性质上的差异，利用色谱本身是用于分离蛋白质的特点，可在色谱上使两者得到完全的分离。不正确对接的蛋白质可通过设计一个自动回收装置使其在色谱上进行重新的对接，经过2-3次循环，不正确对接的蛋白质就可完全正确对接。另外，由于色谱是一个自动化程度很高的仪器，因此二硫键在色谱上实现对接时的对接效果可以通过改变色谱条件进行人为地控制。该技术是一个通用性的技术，适合于所有的蛋白质，能够使用该技术的色谱方法包括离子交换色谱、疏水作用色谱和亲和色谱。
1)填料的选择所用的填料必须能在高浓度变性剂存在的条件下使用，并能对处于变性和还原状态的蛋白质产生吸附作用。吸附的作用力包括亲和力、静电力和疏水作用力。离子交换、亲和、疏水作用的软胶和硬胶填料均可使用。
2)流动相的选择离子交换流动相、疏水色谱流动相、亲和色谱流动相。
3)氧化对接试剂的使用氧化对接试剂，包括氧化性谷胱苷肽、二硫键异构酶、氧气等氧化试剂和二硫键异构试剂。
4)方法选择合适的填料，将处于高浓度变性剂和还原状态的蛋白质吸附在填料的表面，利用流动相除去变性剂，或在部分变性剂存在条件下加入氧化对接试剂，在色谱填料上作用20分钟以上，在极低的流速或停留状态下进行充分的氧化对接，之后利用色谱本身具有复性和分离的特点使蛋白质复性和分离。
实施例例1溶菌酶的二硫键对接溶菌酶溶于8mol/L的盐酸胍和10mmol/L的DTT中，放置过夜，使蛋白质完全处于变性的二硫键还原状态，在疏水作用色谱柱上进行吸附，使用还原性谷胱苷肽和氧化性谷胱苷肽以极低的流速通过色谱柱，或停留一段时间，使用流动相进行洗脱。溶菌酶二硫键得到正确对接和完全的复性。
例2基因重组干扰素-α的对接将基因重组干扰素-α使用溶于8mol/L的盐酸胍和10mmol/L的DTT中，放置过夜，使蛋白质完全处于变性的二硫键还原状态，在离子交换色谱作用色谱柱上进行吸附，使用还原性谷胱苷肽和氧化性谷胱苷肽以极低的流速通过色谱柱，或停留一段时间，使用流动相进行洗脱。干扰素的二硫键得到正确对接和完全的复性。
权利要求
1．蛋白质二硫键色谱在线对接技术，其特征是选择合适的填料和流动相对蛋白质的二硫键在色谱上进行对接、复性和分离。
2．根据权利要求1所述的蛋白质二硫键色谱在线对接技术，其特征是所述的填料为离子交换、亲和、疏水作用的软胶和硬胶填料；所述的流动相可为离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱的流动相；所述的氧化对接试剂为氧化性谷胱苷肽、二硫键异构酶、氧气。
全文摘要
蛋白质二硫键色谱在线对接技术，涉及生物工程，其特征是利用亲和、疏水、离子交换色谱吸附蛋白质的特性，对处于还原状态蛋白质的二硫键进行在线对接，提高蛋白质二硫键对接效率和复性效果。
文档编号C07K1/00GK1316430SQ00113769
公开日2001年10月10日 申请日期2000年4月3日 优先权日2000年4月3日
发明者郭立安 申请人:中国人民解放军第四军医大学