专利名称：结合态孕马混合雌激素提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从妊娠牝马的尿液中(简称孕马尿)提取一种天然结合态混合雌激素的方法雌激素在医学上应用于激素替代疗法，结合态混合雌激素用于治疗和预防女性生理或人工绝经期后出现的更年期综合症，能预防和治疗骨质疏松症与冠心病。天然的结合态混合雌激素以其好的疗效和耐受性得到了长久的应用。
妊娠期牝马尿中含有天然的结合态雌激素混合物，是以多种雌激素的硫酸单酯盐的形式溶解在孕马尿中，通常孕马尿每升中含有干物质40-90克，除尿素、马尿酸与其它常见的无机盐，有机物及粘状物外，一般结合态混合雌激素的含以钠盐计为80-300毫克/升。
早期报道的结合态雌激素提取方法的专利有美国专利US2429398、US2519516、US2696265、US2711988、US2834712，其提取方法为先用低碳醇、酯，如正己醇、环己醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯等，或低碳氯代烃如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷等有机溶剂萃取，再用五至十步以上的纯化除杂得到结合态孕马雌激素。由于液-液萃取过程中出现的诸多问题，如乳化层形成、沉淀等现象，导致萃取工作困难，特别是相分离困难导致收率降低，多步骤的萃取纯化除杂也导致雌激素损失，使总收率很低。另外废弃物中溶解的萃取剂易造成环境污染。
自美国专利US2551205报道活性炭吸附工艺开始，先后有US3769401、US5723454、US5814624报道了离子交换树脂、聚丙烯酸酯吸附树脂、反相硅胶应用于结合态雌激素的提取，其中离子交换树脂由于有效组分难于从树脂中洗脱及树脂很难再生，因此应用很困难。反相硅胶因存在再生困难和材料昂贵，导致工业成本高。中极性聚丙烯酸酯类吸附树脂虽能避免上述问题，但存在化学稳定性不高，对洗脱、再生的酸、碱强度有要求，若条件不当可导致酯基水解，另外该树脂在应用中易于结团成块，因而在应用中存在树脂吸附性能下降，导致收率降低。本发明针对目前所存在的问题，并经过大量的实验研究，研制出一种利用含有氰基的极性大孔网状吸附树脂用于从孕马尿中直接或从含孕马雌激素的富集液中提取结合态孕马雌激素的方法。
本发明目的在于，研制出的结合态孕马混合雌激素提取方法，是利用含有氰基的极性大孔网状吸附树脂用于从孕马尿中直接或从含孕马雌激素的富集液中提取结合态孕马雌激素。该大孔网状吸附树脂是由二乙烯苯、丙烯氰等聚合而来的极性吸附树脂，具有较好的酸碱稳定性，不易结团成块，对有效成分孕马结合态雌激素吸附量高，树脂对酸碱的耐受程度高，易于再生等特点。该方法工艺简单、成本低廉、收率高、易于工业化生产。
本发明所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，按下列步骤进行a、将孕马尿液与含有氰基的极性吸附树脂接触，动态或静态吸附均可，然后与负载有结合态混合雌激素的树脂分离；孕马尿液为不含或轻度含有粘液物质和固态物质的澄清尿液或半悬浊液；b、用经过调节PH为12.0-14.0的水或含有0-15％水溶性低碳醇或酮有机水溶液洗涤负载树脂；c、将洗涤过的极性吸附树脂与能解析吸附在树脂上的结合态混合雌激素的洗脱液接触，动态或静态解析；该洗脱液为一种可与水混溶的低级醇、酮等极性有机溶剂水溶液组成，其水溶液为PH9-13的碱性溶媒，解吸温度60℃以下；d、洗脱液经酸调节PH至6-8.5后浓缩、干燥即得结合态孕马雌激素混合物。
步骤a中所用的极性聚合吸附树脂是含有氰基基团的以二乙烯苯、丙烯氰等聚合而来的极性吸附树脂；吸附树脂为大孔网状结构；一个体积的树脂吸附孕马尿的体积倍数为20-100。
步骤b中洗脱剂为PH值为12.0-14.0的水或含有15％以下的稀乙醇或丙酮溶液。
步骤c中的洗脱液为一种能与水混溶的低级醇、酮等极性有机溶剂的溶液，该溶液PH为9-13，其有机溶剂与水的体积比为50∶50至20∶80。
本发明所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，该方法中孕马尿可用过滤或沉降的方法完全或部分除去悬浮粘状物和固体物的原尿或经浓缩的孕马尿提浓物。
在方法步骤a中应用含有氰基极性吸附树脂为大孔网状的有机非离子聚合物，具有亲水性结构，其表而积300-900m2/g，平均孔径在40-100埃之间。该树脂在室温下用100倍柱体积的孕期平均在8个月左右牝母的孕马尿进行静态柱吸附时，经薄层层析检测证明，未明显检出结合态雌激素泄漏。
在方法步骤b中洗涤负载树脂中的酚类物质洗涤液用量为树脂体积的2-7倍。
在方法步骤c中洗脱液为一种可与水混溶的低级醇、酮等极性有机溶剂的水溶液组成，该水溶液为无机碱溶液，如氢氧化钠或氢氧化钾，其PH值为9-13之间；洗脱液用量为树脂体积的3-8倍。
在方法步骤d中浓缩前用稀酸将洗脱液中和至6-8.5之间，酸可选择盐酸、硫酸、磷酸或醋酸；蒸发与干燥温度不超过60℃。
实施例1首先将50毫升含有氰基的极性大孔吸附树脂(市售，河北沧州化工厂出品的HPD-500树脂)装在柱径×柱高为2.0cm×25cm的柱中，将2升孕马尿(不含或轻度含有粘液物质和固态物质的澄清尿液或半悬浊液)在室温下以300毫升/小时的流速上柱，透过液经检测，其方法为将2升孕马尿的流出液最后50毫升用乙酸乙酯萃取后的浓缩样经薄层层析(TLC)检测，未见结合态雌激素泄漏；然后将负载柱用经过调节PH为12.0-14.0的水或含有0-15％水溶性低碳醇或酮稀碱液250毫升洗涤负载树脂，经检测，其方法为将洗涤液中和后用同等体积的乙酸乙酯萃取后的浓缩样经薄层层析(TLC)检测，未明显见结合态雌激素洗出；再将洗涤过的极性吸附树脂与能解析吸附在树脂上的结合态混合雌激素的洗脱液接触，静态解析；该洗脱液为一种可与水混溶的低级醇或酮等极性有机溶剂水溶液250毫升，PH9-13，解吸温度60℃以下，柱温下洗脱，先收集25毫升(半柱体积)为洗脱液第一段，然后再分别收集每份体积为50毫升的第二段、第三段、第四段、第五段；1-5段结合态雌酮经高效液相色谱(HPLC)检测的浓度见表的1-3实验 最后将2-5段的洗脱液合并，用稀酸将洗脱液中和至6-8.5之间(酸可选择盐酸、硫酸、磷酸或醋酸)，经浓缩、干燥即得结合态孕马雌激素混合物。该混合物可直接或经进一步纯化后用于药物复配。
实施例2首先将50毫升含有氰基的极性大孔吸附树脂(市售，河北沧州化工厂出品的HPD-500树脂)装在柱径×柱高为2.0cm×25cm的柱中，将2升含结合态雌酮为95.2mg/L的孕马尿粗提物水溶液，在室温下以300ml/小时(5倍柱体积/小时)的流速上柱，采用薄层层析(TLC)检测，未见结合态雌激素泄漏；然后将负载柱用经过调节PH为14.0的稀碱水250毫升洗涤负载树脂，采用薄层层析检测，未见结合态雌激素明显洗出；再将洗涤过的极性吸附树脂与能解析吸附在树脂上的结合态混合雌激素的洗脱液接触静态解析；该洗脱液为乙醇/水，其体积比为35∶65，PH为12.5的水溶液250毫升，解吸温度60℃，柱温下洗脱，先收集25毫升(半柱体积)为洗脱液第一段，然后再分别收集每份体积为50毫升的第二段、第三段、第四段、第五段，每段浓度见表实验4；最后将2-5段的洗脱液合并，用稀酸将洗脱液中和至8.0(酸可选择盐酸或硫酸或磷酸或醋酸)，经浓缩、干燥得结合态孕马雌激素混合物。该混合物可直接或经进一步纯化后用于药物复配。
实施例3首先将50毫升含有氰基的极性大孔吸附树脂(市售，河北沧州化工厂出品的HPD-500树脂)放入装有2升结合态雌酮为37.5mg/L的孕马尿中动态吸附，搅拌30分钟后滤出负载树脂，该树脂用3×60ml PH13.0的稀碱液分次洗涤，最后负载树脂分别用60毫升PH12.5乙醇∶水的体积比为35∶65的稀乙醇于50℃下分别解析三次，每次搅拌20分钟，滤出洗脱液，将三次洗脱液合并，经调节PH值于7-8后浓缩得出1.043克的结合态混合雌激素提取物，经高效液相色谱(HPLC)测试结合态雌酮含量为6.1％，该混合物可直接或经进一步纯化后用于药物复配。
树脂再生将待再生50毫升吸附树脂先用250毫升PH13.0的70％乙醇洗脱，再用水洗至中性，该树脂可多次重复使用。
权利要求
1.一种结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于按下列步骤进行a、将孕马尿液与含有氰基的极性吸附树脂接触，动态或静态吸附均可，然后与负载有结合态混合雌激素的树脂分离；孕马尿液为不含或轻度含有粘液物质和固态物质的澄清尿液或半悬浊液；b、用经过调节PH为12.0-14.0的水或含有0-15％水溶性低碳醇或酮有机水溶液洗涤负载树脂；c、将洗涤过的极性吸附树脂与能解析吸附在树脂上的结合态混合雌激素的洗脱液接触，动态或静态解析；该洗脱液为一种可与水混溶的低级醇、酮等极性有机溶剂水溶液组成，其水溶液为PH9-13的碱性溶媒，解吸温度60℃以下；d、洗脱液经酸调节PH至6-8.5后浓缩、干燥即得结合态孕马雌激素混合物。
2.根据权利要求1所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于步骤a中所用的极性聚合吸附树脂是含有氰基基团的以二乙烯苯、丙烯氰等聚合而来的极性吸附树脂。
3.根据权利要求2所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于吸附树脂为大孔网状结构。
4.根据权利要求1所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于步骤a中一个体积的树脂吸附孕马尿的倍数为20-100。
5.根据权利要求1所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于步骤b中洗脱剂为PH值为12.0-14.0的水或15％以下的稀乙醇或丙酮溶液。
6.根据权利要求1所述的结合态孕马混合雌激素提取方法，其特征在于步骤c中的洗脱液为一种能与水混溶的低级醇、酮等极性有机溶剂的溶液，该溶液PH为9-13，其有机溶剂与水的体积比为50∶50至20∶80。
全文摘要
本发明涉及一种结合态孕马混合雌激素提取方法,是利用含有氰基的极性大孔网状吸附树脂用于从孕马尿中直接或从含孕马雌激素的富集液中提取结合态孕马雌激素。该大孔网状吸附树脂是由二乙烯苯、丙烯氰等聚合而来的极性吸附树脂,具有较好的酸碱稳定性,不易结团成块,对有效成分孕马结合态雌激素吸附量高,树脂对酸碱的耐受程度高,易于再生等特点。该方法工艺简单、成本低廉、收率高、易于工业化生产。
文档编号C07G15/00GK1308083SQ0110485
公开日2001年8月15日 申请日期2001年2月19日 优先权日2001年2月19日
发明者赵文军, 吴雪萍, 卡玛尔 申请人:中国科学院新疆化学研究所, 新疆特丰药业有限责任公司