专利名称：小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂，其含有白细胞介素-6(IL-6)的拮抗剂作为有效成分。小儿慢性关节炎相关疾病包括小儿慢性关节炎，斯提尔氏病等。
背景技术：
IL-6是被称为B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与B淋巴细胞系细胞的活化相关的分化因子被发现(Hirano，T.etal.，Nature(1986)324，73-76)，之后，已明确IL-6为对各种细胞的功能有影响的多功能细胞因子(Akira，S.et al.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78)。有报告指出，IL-6是诱导T淋巴细胞系细胞的成熟化的因子(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在细胞上通过两种蛋白质传递其生物学活性。其一是，IL-6结合的分子量约80kD的配体结合性蛋白质的IL-6受体(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825-828)。IL-6受体除了跨细胞膜在细胞膜上表达的膜结合型外，主要也作为从其细胞外区域形成的可溶性IL-6受体存在。
另一个是与非配体结合性的信号传递有关的分子量约130kD的膜蛋白质gp130。IL-6和IL-6受体通过形成IL-6/IL-6受体复合体、然后和gp130结合，使IL-6的生物学活性被传递入细胞内(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗剂为阻碍IL-6的生物学活性传递的物质。到目前为止，已知对于IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、对于IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、对于gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。
关于抗IL-6受体抗体，有很多报告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621-630、国际专利申请公开号WO 95-09873、法国专利申请公开号FR2694767、美国专利号US 521628)。已知其中之一是通过将小鼠抗体PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互补决定区(CDR)向人抗体移植得到的人源化PM-1抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)。
小儿慢性关节炎(Chronic Arthritides Diseases of Childhood)是以未满16岁发生的慢性关节炎疾病为主的疾病，且是在小儿中发生的胶原性疾病中最多的疾病。由于与成人的慢性风湿关节病(Rheumatoid Arthritis(RA))有区别，不能说是类似的疾病，有各种各样的病型，因此有将其作为与成人的慢性风湿关节病不同的疾病进行处理的倾向。
作为小儿慢性关节炎的名称，在日本是按照美国的诊断基准使用“幼儿型类风湿关节炎Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA))”，但在欧洲则主要使用幼儿慢性关节炎Juvenile Chronic Arthritis(JCA)。最近也使用自发性慢性关节炎Idiopathic Chronic Arthritis(ICA)或是幼儿自发性关节炎Juvenile Idiopathic Arthritis(JIA)等。
小儿慢性关节炎的类型被分成几类，美国风湿病学协会(AmericanCollege of Rheumatology(ACR))将在未满16岁的小儿中发生的持续6周或以上的关节炎疾病的分为1)全身型(Systemic onset JRA)、2)多关节炎型(Polyarticular)、3)少关节炎型(Pauciarticular)三种(ARA分类)(JRA Criteria Subcommittee of the Diagnostic andTherapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism AssociationArthritis Rheum 20(Suppl)195，1977)。另外在欧洲，European LeagueAgainst Rheumatism(EULAR)虽然在关节炎的持续时间在三个月或以上这一点，或由于牛皮藓、强直性脊椎炎等原因引起的关节炎除外这一点等与上述ARA分类不同，但进行了同样三种病型的分类。(Bulletin 4，Nomenclature and classification of Arthritis in Children.Basel，NationalZeitung AG，1977)。
最近，有重新认识这种分类的倾向，International League of Associationfor Rheumatolagy(ILAR)在1995年提出小儿自发性关节炎(IdiopathicArthritides of Childhood)的分类提案(Fink CW，Proposal for thedevelopment of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood.J.Rheumatol.，vol.22 1566(1995))，进一步在1997年将对其的修改作为ILAR案提案(Southwood TR，Classifying childhood arthritis.Ann.Rheum.Dis.Vol.56，79(1997))。这种分类中分为1)全身型关节炎(SystemicArthritides)、2)多关节炎型(RF阳性型)(Polyarthritis RF positive)、3)多关节炎型(RF阴性型)(Polyarthritis RF negative)、4)少关节炎型(Oligoarthritis)、5)发展型少关节炎型(Extended oligoarthritis)、6)附着部炎症相关关节炎(Enthesitis related Arthritis)、7)牛皮癣相关关节炎(Psoriatic Arthritis)、8)其他。
进一步本发明者们提案将小儿慢性关节炎分为1)小儿原发性慢性关节炎(Primary Chronic Arthritides ofChildhood)(1)PARASH综合征(SPRASH syndrome)(SPRASH高热(spikingfever)，心包炎(pericarditis)，皮疹(rash)，关节炎(arthritis)，脾(肿)大(splenomegaly)，肝肿大(hepatomegaly))。
首先出现弛张热和皮疹症状、诊断有浆膜炎、肝脾肿大症状，同时或延迟并发关节炎，但有时未诊断是关节炎。
(2)小儿自发性慢性关节炎(Idiopathic Chronic Arthritides ofChildhood)没有基础病患，关节炎即是病患的中心。
a)类风湿病因子(RF)阳性型b)抗核抗体(ANA)阳性型
c)RF/ANA阴性型2)小儿继发性慢性关节炎(Secondary Chronic Arthritides ofChildhood)伴随遗传性，非遗传性的原疾病表现的关节炎(横田俊平、“小児慢性関節炎の最近の治療法の進步”、リウマ于、39卷、860、(1999))。
有报道指出小儿慢性关节炎与各种细胞因子有关。特别是，认为炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α与抗炎症细胞因子IL-1 ra(IL-1受体-拮抗剂)、IL-10、IL-13、sTNFR(可溶性TN F受体)的不平衡与疾病相关。
作为小儿慢性关节炎的治疗，以往使用非甾体抗炎药、肾上腺皮质甾体药、抗风湿药(金剂等)、免疫抑制剂、氨甲蝶呤(MTX等)治疗。但是不同患者其治疗效果不一定，所以希望开发出更有效的治疗方法。
斯提尔氏病(Stilldisease)，是1897年英国的小儿科医生斯提尔报道的，该疾病是作为与成人的慢性风湿关节病具有明显不同的临床症状的疾病被报道的在小儿到成人(成人主要是青年期)中发病的疾病，主要症状为发热、红斑、关节炎、浆膜炎等。其中将成人病例称为成人斯提尔氏病(Adult onset Still’s disease)，在斯提尔氏病中，类风湿病因子通常是阴性的。
斯提尔氏病，在小儿中，是在未满16岁的小儿中发生的慢性关节炎的幼儿性风湿疾病(Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA)，JCA(JuvenileChronic Arthritis)，Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA))中的全身发症型(Systemic Type)的别名。斯提尔氏病的病因，虽然有关于病毒等的环境要因或HLA等的宿主要因或免疫异常等的报道，但是现在还不十分清楚。
成人斯提尔氏病与小儿斯提尔氏病虽然除了发病年龄不同外还有某些临床症状不同，但基本可认为是同种疾病。小儿斯提尔氏病指的是上述的全身发病型的JRA，但由于JRA在临床上与成人的风湿关节疾病(Rheumatoid Arthritis，(RA))有很多地方不同，因此作为别的疾病治疗，也由于同样原因，成人的斯提尔氏病大多作为风湿性疾病中独立的疾病单位被处理。
作为斯提尔氏病的诊断标准，已知有Yamaguchi(Journal ofRheumatology.19(3)424-30，1992)、Reginato(Seminars in Arthritis&Rheumatism.17(1)39-57，1987)、Cush(Rheumatology Grand Rounds，University of Pittsburgh Medical CenterJan.30，1984)、Goldman(Southern Medical Journal 73555-563，1980)等标准。
关于斯提尔氏病与细胞因子的关系，曾报道了IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子与斯提尔氏病的关系，认为其中的IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎症性细胞因子与斯提尔氏病的病态有某些关联。
关于IL-6，de Benedetti等人报告指出在小儿斯提尔氏病中，血清中IL-6值上升(Arthritis Rheum.Vol.34，1158，1991)，同样据de Benedetti等人报道，小儿斯提尔氏病患者的血清中存在大量IL-6/可溶性IL-6受体(sIL-6R)复合体，可看到这种复合体的水平与CRP值有相关关系(J.Clin.Invest.Vol.93，2114，1994)。另外Rooney等人也作了在小儿斯提尔氏患者的血浆中IL-6与TNF-α的水平上升的报道(Br J Rheumatol.Vol.34 454，1995)。
作为斯提尔氏病的治疗，以往用非甾体抗炎药、肾上腺皮质甾体药、抗风湿药(金剂等)、免疫抑制剂、γ球蛋白制剂、氨甲蝶呤(MTX等)。但是由于患者不同其治疗效果不一定，因此希望开发出更有效的治疗方法。
发明的公开因此本发明是要提供一种与以往的小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂不同形式的新的小儿慢性关节炎相关疾病的治疗剂。在本发明中，小儿慢性关节炎相关疾病包括小儿慢性关节炎以及斯提尔氏病。
本发明者们为了解决上述课题，进行了各种研究，结果发现白细胞介素-6(IL-6)的拮抗剂对小儿慢性关节炎相关疾病有治疗效果，并完成了发明。
因此本发明提供一种含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分构成的小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂。
更具体地说，本发明提供一种含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分的小儿慢性关节炎治疗剂。
本发明进一步提供一种含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分的斯提尔氏病治疗剂。
发明的实施方案上述IL-6拮抗剂优选是对于IL-6受体的抗体，也优选是对于人IL-6受体的单克隆抗体或对于小鼠IL-6受体的单克隆抗体。作为上述对于人IL-6受体的单克隆抗体可以列举PM-1抗体，另外，作为对于小鼠IL-6受体的单克隆抗体可以列举MR16-1抗体。
上述的抗体优选嵌合抗体，人源化抗体或是人抗体，例如有人源化PM-1抗体。
作为本发明治疗剂治疗对象的小儿慢性关节炎，包括前所述的ARA、EULAR、ILAR以及发明者们所分类的所有疾病。随着血清学诊断法和治疗方法的进步，现在关于小儿慢性关节炎的疾病类型分类在世界范围内已被重新认识，可以说正处于“病型分类的混乱期”，但是作为本发明治疗剂的优选治疗对象，有ARA分类中的全身型、多关节炎型、少关节炎型，EULAR分类中的全身型、多关节炎型、少关节炎型，ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性)、多关节炎型(RF阴性)、少关节炎型、发展型少关节炎型，在本发明者们的分类中的小儿原发性慢性关节炎(SPRASH综合征、小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型，b.抗核抗体(ANA)阳性型，c.RF/ANA阴性型))；作为特别优选的治疗对象，是ARA分类中的全身型、多关节炎型，EULAR分类中的全身型、多关节炎型，ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性)、多关节炎型(RF阴性)、发展型少关节炎型，本发明者们的分类中的小儿原发性慢性关节炎(SPRASH综合征、小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型、b.抗核抗体(ANA)阳性型))。进一步，作为最优选的治疗对象，可列举ARA分类中的全身型、多关节炎型，EULAR分类中的全身型、多关节炎型，ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性)、发展型少关节炎型，本发明者们的分类中的小儿原发性慢性关节炎(S PRASH综合征、小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型)。
在本发明使用的IL-6拮抗剂，若为对小儿慢性关节炎相关疾病显示出治疗效果，则不论其由来、种类和形状。
IL-6拮抗剂为隔断IL-6产生的信号传递、阻碍IL-6的生物学活性的物质。IL-6拮抗剂优选为对IL-6、IL-6受体及gp130的任一个的结合具有阻碍作用的物质。作为IL-6拮抗剂，可以列举例如抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体或者IL-6或IL-6受体的部分肽、以及和它们显示相同活性的低分子物质。
本发明中使用的抗IL-6抗体，可以使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗IL-6抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的抗体、以及通过基因工程的手段产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的抗体。该抗体通过与IL-6结合，阻碍IL-6与IL-6受体结合、阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗体(Sato，K.et al.，第21次日本免疫学会总会、学术纪录(1991)21，166)等。
产生抗IL-6抗体的杂交瘤，基本可以使用公知技术、如下所述进行制备。即，使用IL-6作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞按照通常的细胞融合法和已知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆的抗体产生细胞来制备。
具体地，制备抗IL-6抗体可按下面的方法进行。例如，作为取得抗体的致敏抗原被使用的人IL-6可以通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列得到。
在公知的表达型载体系中插入IL-6的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用公知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的IL-6蛋白质，可将该纯化IL-6蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将IL-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体，可以使用公知的手段作为多克隆抗体或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗IL-6受体抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的物质、和通过基因工程的手段，产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的物质。该抗体通过与IL-6受体结合，阻碍IL-6与IL-6受体结合、阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举MR16-1抗体(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中，作为特别优选的抗体可以列举PM-1抗体。
另外，产生PM-1抗体的杂交瘤细胞株作为PM-1，基于布达佩斯条约，在平成2年7月10日、作为FERM BP-2998被国际保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县つくば市东1丁目1番3号)。另外，产生MR16-1抗体的杂交瘤细胞株作为大鼠-小鼠杂交瘤MR16-1，基于布达佩斯条约，在平成3年3月13日、作为FERM BP-5875被国际保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县つくば市东1丁目1番3号)。
产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤，基本可以使用已知技术、如下进行制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞按照通常的细胞融合法和已知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆抗体的产生细胞来制备。
具体地说，制备抗IL-6受体抗体可按下面的方法进行。例如，作为引起抗体的致敏抗原被使用的人IL-6受体可以通过使用在欧洲专利申请公开号EP 325474中公开的、小鼠IL-6受体可以通过使用在日本专利申请公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列来得到。
IL-6受体蛋白质，有在细胞膜上表达的蛋白质和从细胞膜脱离的蛋白质(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673-676)两种。可溶性IL-6受体抗体是由与细胞膜结合的IL-6受体的实质性细胞外区域构成的，在缺损跨细胞膜区域或跨细胞膜区域和细胞内区域方面与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白质只要是在本发明中使用的抗IL-6受体抗体的制备中作为致敏抗原使用，就可以使用任一种IL-6受体。
在公知的表达型载体系中插入IL-6受体的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用已知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的IL-6受体蛋白质，可将该纯化IL-6受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
含有含编码人IL-6受体的cDNA的质粒pIBIBSF2R的大肠杆菌(E.coli)，基于布达佩斯条约，在1989年1月9日、作为HB101-pIBIBSF2R，保藏号FERM BP-2232被国际保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所。
本发明中使用的抗gp130抗体，可以使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗gp130抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的抗体、和通过基因工程的手段产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的抗体。该抗体通过和gp130结合，阻碍IL-6/IL-6受体复合体与gp130结合、并阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举AM64抗体(特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US 5571513)B-S12抗体以及B-P8抗体(特开平8-291199)等。
产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤，基本可以使用公知技术、如下所述进行制备。即，使用gp130作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞通过通常的细胞融合法和公知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆抗体的产生细胞来制备。
具体地，制备单克隆抗体可按下面的方法进行。例如，作为引起抗体的致敏抗原被使用的gp130可以使用在欧洲专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列来得到。
在已知的表达型载体系中插入gp130的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用已知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的gp130蛋白质，可将该纯化gp130受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将表达gp130的细胞或gp130蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
作为用致敏抗原免疫的哺乳动物，虽没有特别的限制，但是优选考虑与在细胞融合中使用的亲代细胞的相容性来进行选择，一般地可以使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
用致敏抗原免疫动物时可以按已知的方法进行。例如，作为一般的方法，通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原进行。具体地说，用适量的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)或生理盐水等稀释致敏抗原、悬浊液根据需要混合通常的佐剂，例如弗氏完全佐剂，乳化后，优选每4-21日向哺乳动物给药数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用适当的载体。
这样进行免疫、确认血清中所期望的抗体水平上升后，从哺乳动物中取出免疫细胞、进行细胞融合。作为进行细胞融合的优选的免疫细胞，特别可以列举脾细胞。
作为和上述免疫细胞融合的另一亲代细胞的哺乳动物骨髓瘤细胞，适宜使用以前、已知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immnnol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本可以按照已知的方法、例如Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等进行。
更具体地说，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂存在下，在通常的营养培养液中进行。作为融合促进剂，可使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血细胞凝集病毒(HVJ)等，进一步，根据需要，为了提高融合效率、也可以添加二甲基亚砜等的辅助溶剂来使用。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，例如，相对于骨髓瘤细胞、免疫细胞优选为1-10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，例如，可以使用在上述骨髓瘤细胞株的增殖中适合的RPMI1640培养液、MEM培养液，除此之外，还可使用在该种细胞培养中可使用的通常的培养液，进一步，也可能并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。
细胞融合是将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，通常在30-60％(w/v)的浓度下添加预先加热至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量为1000-6000左右的PEG溶液，通过混合形成目的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过反复进行依次添加适当的培养液，离心除去上清液的操作、可以除去杂交瘤的繁殖中不优选的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)中培养来进行选择。在该HAT培养液中的培养，持续使目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)灭绝所需的充分的时间、通常要持续数日-数周。然后，实施通常的极限稀释法、进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
另外，除了在人以外的动物中免疫抗原得到上述杂交瘤以外、将人淋巴细胞在体外被所期望的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏、使致敏B淋巴细胞和人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可以得到对期望的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所期望的人抗体(参照特公平1-59878)。进一步，也可以对具有人抗体基因储藏库的转基因动物给与抗原或抗原表达细胞，按上述方法得到所期望的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
产生这样制备的单克隆抗体的杂交瘤，可在通常的培养液中传代培养，另外，也可在液氮中长期保存。
从该杂交瘤取得单克隆抗体时，可以采用将该杂交瘤用通常的方法培养、得到其培养上清液的方法，或将杂交瘤投入与其有相容性的哺乳动物中使其增殖、得到其腹水的方法等。前者的方法适于得到高纯度的抗体，另一方面，后者的方法适于抗体的大量生产。
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备，可以按照特开平3-139293中公开的方法进行。可以进行将基于布达佩斯条约，在平成2年年7月10日、作为FERM BP-2998被国际保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县つくば市东1丁目1番3号)的产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔内、得到腹水，从该腹水纯化PM-1抗体的方法，或将该杂交瘤在适当的培养基中、例如10％胎牛血清、含有5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等中培养，由该培养上清液纯化PM-1抗体的方法。
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用基因重组技术，由杂交瘤克隆抗体基因，将其整合入适当的载体，然后将载体导入宿主中而产生的重组型抗体(例如，参照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体地，产生目的抗体的细胞，例如由杂交瘤分离编码抗体的可变(V)区域的mRNA。mRNA的分离可以按照公知的方法，例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)直接制备mRNA。
由得到的mRNA使用逆转录酶合成抗体V区域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒等进行。另外，进行cDNA的合成及扩增中也可以使用用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制)及PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)。由得到的PCR产物纯化目的DNA片断，与载体DNA连结。进一步，由此制备重组载体、导入大肠杆菌等中、选择集落制备所期望的重组载体。目的DNA的碱基序列可通过已知的方法、例如脱氧法确认。
若得到编码目的抗体的V区域的DNA、将其和编码期望的抗体恒定区域(C区域)的DNA连结，整合入表达型载体中。另外，也可以将含有编码抗体的V区域的DNA整合入含有抗体C区域的DNA的表达型载体中。
制备本发明中使用的抗体，是将下述的抗体基因整合入表达型载体，以使其在表达控制区域、例如在增强子、启动子的控制下表达。然后，通过该表达型载体转化宿主细胞、可以使抗体表达。
本发明中，以降低对人的异种抗原性等作为目的、可以使用人为地改变了的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。这些修饰抗体可以用已知的方法制备。
嵌合抗体可通过将编码上述得到的抗体V区域的DNA与编码人抗体C区域的DNA连结，通过将其整合入表达型载体中、导入宿主产生得到(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO92-19759)。使用该已知方法，可以得到本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合PM-1抗体的L链及H链的V区域的DNA的质粒，分别被命名为pPM-k3和pPM-h1，具有该质粒的大肠杆菌基于布达佩斯条约，在1991年2月11日分别作为NCIMB 40366和NCIMB 40362被国际保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司(National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Limited)。
人源化抗体也被称为重构人抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植入人抗体的互补决定区得到的抗体，也知道其一般的基因重组方法(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
具体地说，将设计为连结小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区域(FR)的DNA序列，通过PCR法由在制造成末端部分具有重叠部分的多个寡核苷酸合成。将得到的DNA与编码人抗体C区域的DNA连结，然后通过整合入表达型载体中，将其导入宿主产生可得到(参照欧洲专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
通过CDR连结的人抗体的FR，可选择互补决定区域形成良好的抗原结合部位的物质。根据需要，也可以置换抗体可变区域的构架区域的氨基酸以使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗体、人源化抗体中也可以使用人抗体C区域。作为人抗体C区域，可以列举Cγ，例如，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，为了改善抗体及其产生的稳定性，也可以修饰人抗体C区域。
嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区域和来自人的抗体C区域构成，人源化抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区域和来自人抗体的构架区域和C区域构成，为了降低人体内的抗原性，它们作为本发明中使用的抗体是有用的。
作为本发明中使用的人源化抗体的优选具体实例，可以列举人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。
另外，作为人抗体的取得方法，除上述方法以外，已知还有使用人抗体的基因库，通过淘选取得人抗体的技术。例如，将人抗体的可变区域作为单链抗体(scFv)用噬菌体显示方法使其在嗜菌体表面表达，可选择与抗原结合的嗜菌体。如果解析选择的嗜菌体基因，可以决定与抗原结合的编码人抗体的可变区域的DNA的序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可使用该序列制作适当的表达载体，从而可以取得人抗体。这种方法已是众所周知的，可以参考WO 92/01047，WO 92/20791，WO93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
如上所述构建的抗体基因，可以通过公知的方法使之表达、取得。在哺乳类细胞的情况下，可通过功能性结合了经常使用的有用的启动子、被表达的抗体基因、在其3′侧下游的poly A信号的DNA或含有该DNA的载体使之表达。例如作为启动子/增强子，可以列举人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
另外，作为其它在本发明中使用的可用于抗体表达时的启动子/增强子，也可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等的病毒启动子/增强子或人促进因子-1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如，使用SV 40启动子/增强子时，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)，或者，在使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地实施。
在大肠杆菌的情况下，可以功能性结合被经常使用的有用的启动子、为了抗体分泌的信号序列、被表达的抗体基因并使之表达。例如作为启动子，可以列举1acZ启动子、arab启动子。在使用1acZ启动子时，可以按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用arab启动子时，可以按照Better等的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041-1043)。
作为为了抗体分泌的信号序列，在产生于大肠杆菌的周质间隙时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分离产生于周质间隙的抗体后，将抗体的结构适当地再折叠使用(例如，参照WO96/30394)。
作为复制起点，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的物质，进一步，为了增加宿主细胞系中的基因复制数量，表达型载体，可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
为了制备本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产系。对于为制造抗体的生产系，有体外和体内的生产系。作为体外的生产系，可以列举使用真核细胞的生产系或使用原核细胞的生产系。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞的生产系。作为动物细胞，已知(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero等，(2)两栖类细胞，例如爪蟾卵细胞，或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知酵母、例如酵母(Saccharomyces)属、例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，丝状真菌、例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系。作为细菌细胞，已知大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
通过转化将目的抗体基因导入这些细胞中，通过在体外培养被转化的细胞可得到抗体。培养按公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。另外，通过将导入了抗体基因的细胞移入动物的腹腔等，也可以在体内产生抗体。
另一方面，作为体内的生产系，可以列举使用动物的生产系或使用植物的生产系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产系等。
作为哺乳动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotech nology Applications，1993)。另外，作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。
在这些动物或植物中导入抗体基因，在动物或植物的体内使抗体产生，然后回收。例如，在编码山羊β酪蛋白那样的在乳汁中固有产生的蛋白质的基因中插入抗体基因作为融合基因进行制备。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片断注入山羊的胚胎中，将该胚胎导入母山羊体内。从容纳该胚胎的山羊生出的转基因山羊或其子孙产生的乳汁中可得到所期望的抗体。为了增加由转基因山羊产生的含有期望抗体的乳汁量，也可以对转基因山羊使用适宜的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外，使用蚕时，可使蚕感染插入了目的抗体基因的杆状病毒，通过该蚕的体液得到期望的抗体(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。另外，使用烟草时，在植物表达用载体、例如pMON 530中插入目的抗体基因，在根癌病菌样的细菌中导入该载体。使烟、例如烟草感染该细菌，通过该烟叶可得到期望的抗体(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述，在用体外或体内的生产系产生抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合入表达型载体中、同时转化宿主，或者也可以将编码H链和L链的DNA整合入单一的表达型载体中、使宿主转化(参照国际专利申请公开号WO 94-11523)。
本发明中使用的抗体，只要适于使用在本发明中，也可以是抗体的片断或其修饰物。例如，作为抗体的片断，可以列举Fab、F(ab′)2、Fv或H链和L链的Fv用适当的连接物连结而成的单链Fv(scFv)。
具体地说，抗体用酶、例如木瓜酶、胃蛋白酶处理生成抗体片段，或者，构建编码这些抗体片段的基因、将其导入表达型载体中后，在适当的宿主细胞中使之表达(例如，参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可以通过连结抗体的H链V区域和L链V区域得到。该scFv中，H链V区域和L链V区域通过连接物、优选通过肽连接物被连结(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H链V区域和L链V区域可以是来自上述记载的抗体的任一种。作为连结V区域的肽连接物，可以使用例如由12-19个氨基酸残基组成的任意的单链肽。
编码scFv的DNA，可以通过将编码上述抗体的H链或H链V区域的DNA、以及编码L链或L链V区域的DNA作为模板，使用规定其两端的引物对，通过PCR法将这些序列中编码期望的氨基酸序列的DNA部分扩增，然后，进一步组合引物对并扩增得到，该引物规定编码肽连接物部分的DNA并使其两端分别连结H链、L链。
另外，一旦制备编码scFv的DNA、则可以按照常规方法得到含有它们的表达型载体和该表达型载体转化的宿主，另外，使用该宿主按照常规方法，可以得到scFv。
这些抗体的片断，可以与上述相同，取得它的基因并使之表达、通过宿主产生。在本发明中所说的“抗体”中也包含这些抗体的片段。
作为抗体的修饰物，可以使用和聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明中所说的“抗体”中也包含这些抗体的修饰物。为了得到这种抗体修饰物，可通过对得到的抗体进行化学修饰得到。这些方法在该领域已经被确立。
如上所述生产、表达的抗体可以从细胞内外、宿主分离纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以用亲和层析进行。作为亲和层析中使用的层析柱，可以列举例如蛋白质A柱、蛋白质G柱。作为蛋白质A柱中使用的载体，可以列举例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用在通常的蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有什么限制。
例如，若适当选择、组合除上述亲和层析以外的色谱法、过滤、超滤、盐析、透析等，可以分离、纯化本发明中使用的抗体。作为色谱法，可以列举例如离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤等。这些色谱法适用于HPLC(高效液相色谱)。另外，也可以使用反相HPLC(反相HPLC)。
上述所得抗体的浓度测定可以通过吸光度的测定或ELISA等进行。即，用吸光度的测定时，用PBS(-)适当稀释后、测定280nm的吸光度、1mg/ml相当于1.35OD、算出浓度。另外，用ELISA时，可以如下进行测定。即，将用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)100μl加入96孔板(Nunc制)中，在4℃下温育1夜、固定化抗体。封闭后、添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPPEL制)100μl、室温下温育1小时。
洗涤后，加入稀释了5000倍的碱性磷酸酯酶标记的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，在室温下温育1小时。洗涤后，加入底物溶液温育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，算出目的抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变异体，具有和IL-6受体的结合活性、且为不传递IL-6的生物学活性的物质。即，虽然IL-6变异体相对于IL-6受体与IL-6竞争结合，但是由于不传递IL-6的生物学活性，故将阻断IL-6产生的信号传递。
IL-6变异体是通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基、引入变异而制备的。虽然不管作为IL-6变异体原料的IL-6的由来，但是若考虑到抗原性等、优选人IL-6。
具体地说，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)来预测其二次结构，通过进一步评价被置换的氨基酸残基对总体的影响来进行。决定适当的置换氨基酸残基后、以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，按照通常使用的PCR法引入变异使氨基酸被置换，可以得到编码IL-6变异体的基因。按照需要，将其整合入适当的表达型载体中、按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可以得到IL-6变异体。
作为IL-6变异体的具体实例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公开。
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，具有和各自IL-6受体或IL-6的结合活性，且为不传递IL-6生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合，通过捕捉它们可特异地阻碍IL-6与IL-6受体的结合。其结果，由于不传递IL-6的生物学活性，因此将阻断IL-6产生的信号传递。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是由在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关区域的一部分或全部的氨基酸序列组成的肽。这种肽通常由10～80、优选为20～50、更优选为20～40个氨基酸残基组成。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，可通过在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中特定与IL-6和IL-6受体的结合相关的区域，将其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法来制备。
通过基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可将编码期望的肽的DNA序列整合入表达型载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可以得到。
通过肽合成法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以使用在肽合成中通常用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体地说，也可以按照续药品的开发第14卷肽合成监修矢岛治明广川书店1991年中记载的方法进行。作为固相合成法，可以使用使与要合成的肽的C末端对应的氨基酸与例如在有机溶剂中不溶性的支撑体结合，通过交互重复进行将用适当的保护基团保护了α-氨基及侧链官能团的氨基酸按从C末端到N末端方向的顺序逐一缩合氨基酸的反应、和使树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基的保护基团脱离的反应，使肽链延长的方法。固相肽合成法根据使用的保护基团种类，可大致分为Boc法和Fmoc法。
这样合成目的肽后，进行脱保护反应以及将肽链从支撑体切断的反应。与肽链的切断反应中，在Boc法中可以通常使用氟化氢或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氢中，在苯甲醚存在的情况下处理上述保护肽树脂。然后，进行保护基团的脱离和从支撑体的切断、回收肽。通过将其冻结干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以进行与上述相同的操作，进行脱保护反应以及从支撑体切断肽链的反应。
得到的粗肽，由于适用于HPLC，因此可以进行分离、纯化。洗脱时，可以使用在蛋白质的纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂在最适条件下进行。分别取得相当于所得色谱法的曲线峰的馏分、将其冷冻干燥。对于这样纯化的肽馏分、通过根据质谱分析的分子量解析、氨基酸组成分析、或氨基酸序列解析等来鉴定。
IL-6部分肽及IL-6受体部分肽的具体实例，在特开平2-188600、特开平7-324097、特开平8-311098及美国专利公报US 5210075中公开。
本发明中使用的IL-6拮抗剂的IL-6信号传递阻碍活性，可以用通常使用的方法评价。具体地说，培养IL-6依赖性人骨髓瘤细胞株(S6B45，KPMM2)，人レンネルトT淋巴瘤细胞株KT3，IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同时使IL-6拮抗剂共存，由此可以测定IL-6依赖性细胞的3H-胸苷的摄取。另外，培养IL-6受体表达细胞U266、加入125I标记的IL-6，同时加入IL-6拮抗剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记的IL-6。在上述分析体系中，如果除了使IL-6拮抗剂存在的组以外、还准备不含IL-6拮抗剂的阴性对照组，比较两者得到的结果，可以评价IL-6拮抗剂的IL-6抑制活性。
如下述实施例所示，由于通过给药抗IL-6受体抗体，在小儿慢性关节炎患者中能够看到治疗效果，因此表明抗IL-6受体抗体等IL-6拮抗剂作为小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂是有用的。
本发明的治疗对象是哺乳动物。治疗对象的哺乳动物优选为人。
本发明的小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂可以口服或非口服地全身或局部给药。例如，可以选择点滴等的静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，可以按照患者的年龄、症状来选择适宜的给药方法。有效给药量在每次1kg体重0.01mg～100mg的范围内选择。或者，也可以选择每个患者1～1000mg、优选为5～50mg的给药量。优选的给药量、给药方法是，例如，在抗IL-6受体抗体的情况下，血液中存在的游离抗体程度的量为有效给药量，作为具体的例子，1kg体重每月(4周)分1次到几次给药0.5mg～40mg、优选1mg～20mg，例如在2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给药日程表下，用点滴等静脉内注射、皮下注射等方法的给药方法等。给药日程表可以在观察病情和血液检查值的动向的同时将给药间隔由2次/周或1次/周调整为1次/2周、1次/3周、1次/4周那样延长给药间隔。
本发明的小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂，也可以同时含有在给药路径下药物所容许的载体或添加物。作为这种载体及添加物的例子，可以列举水、药物中容许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二丙二醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药品添加物容许的表面活性剂等。使用的添加物，按照剂型可以从上述中适宜选择或组合使用，但不限于这些。
实施例以下，通过实施例和参考例对本发明进行具体的说明，但本发明并不仅限于这些。
实施例1对有以下经过的全身型幼儿风湿性关节患者(5岁、男性)，实行MRA治疗。
治疗前的经过弛张热(连日～40℃的单峰性发热)、两膝关节痛、皮疹症状。白血球增多，抗核抗体阴性、类风湿因子阴性、血沉值亢进、CRP值高等诊断后，开始用阿司匹林给药，但是并未改善弛张热和关节炎，且全身状症状恶化。因此改为大量口服给药甾体药物(强的松龙30mg/日)，看到各种症状的改善。但是伴随着强的松龙的逐渐减少，在量为10mg/日时，又复发了，住院后，用甲基强的松龙(mPSL)脉冲疗法和血浆交换疗法，进一步同时并用环孢霉素A(Cs A)也无改善，炎症症状增强(白血球数25400/μL、CRP11.2mg/dL)，基于用血浆交换疗法+mPSL脉冲疗法+Cs A的见解，作为后疗法用强的松龙-氟联苯丙酸进行控制弛张热，临床上能看到退热，但是血液的炎症却仍然维持很高的值(CRP＞5mg/dL)，出院后由于有周期性的弛张热，实行外来中心的治疗观察。但是，患者诉说在发热时背部疼痛增强，MBI等的精查结果，确认在第4～5胸椎有破坏性伤，可认为是由于甾体导致的受压骨折。由于有必要向胸椎免负荷，在床上保持安静状态约一年，下肢肌肉显著衰退，成为完全不能步行的状态。虽然继续强的松龙+氟联苯丙酸+Cs A三者疗法，但CRP也未降低至5mg/dL或以下。
治疗结果由于开始以2mg/kg给药，没见到特别的副作用，因此增加至4mg/kg，每周给药一次。在那以前确认的发热很快消失，CRP约2周后阴性化，全身倦怠感也被去除，能见到患者有朝气。强的松龙可慢慢减量，减至1mg/日。
从以上结果可知，MRA对阿司匹林、氟联苯丙酸等非甾体抗炎药，长期大量的甾体药物(强的松龙(プレドニン)、甲基强的松龙(メドロ—ル)等)、环孢霉素A、甲氨蝶呤等免疫抑制药都不能抑制病状的小儿慢性关节炎的治疗是有效的。因此，IL-6拮抗剂，特别是抗IL-6受体抗体对小儿慢性关节炎，特别是作为ARA分类的全身型、EULAR分类的全身型、ILAR分类的全身型、本发明者们分类的SPRASH综合征的小儿慢性关节炎的治疗剂是有用的。
实施例2
22岁女性。1998年4月，大腿、前胸部、手指处出现点状红斑，5月肩、肘、膝关节痛。出现38℃的发热。开始使用非甾体抗炎药抗炎剂(NSAIDs)，但发热还是持续，7月白血球数18100/μl，CRP 18.3mg/dl，血清铁蛋白440ng/ml。诊断为成人斯提尔氏病。2000年1月初出现39℃的发热以及出现关节痛，认为成人斯提尔氏病的复发(CRP 15.8mg/dl，铁蛋白205.8mg/ml)。
由于甾体减量困难，因此并用氨甲蝶呤MTX及环孢霉素(CsA)，但不能抑制病势。由于病势加重，呼吸状态恶化，需要人工呼吸管理。用甾体脉冲疗法改善了病势，但并发了重症骨质疏松症。开始用人源化的抗IL-6受体抗体(MRA)治疗。每2周通过点滴静脉注射MRA 200mg。给药6日后炎症反应阴性化，肾上腺皮质甾体药物能顺利的减量，也未见严重的副作用。
从以上结果可知，MRA对于联用MTX和CsA也不能抑制病状的成人斯提尔氏病有效。因此，IL-6的拮抗剂，特别是抗IL-6受体抗体作为斯提尔氏病特别是成人斯提尔氏病的治疗剂是有用的。
参考例1.人可溶性IL-6受体的制备使用含有编码按Yamasaki等的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)得到的IL-6受体的cDNA的质粒pBSF2R.236，通过PCR法制备可溶性IL-6受体。用限制酶Sph I消化质粒pBSF2R.236，得到IL-6受体cDNA、将其插入mp18(Amersham制)中。使用设计为以便在IL-6受体cDNA中导入终止密码子的合成寡引物，通过体外突变形成系统(Amersham制)、用PCR法在IL-6受体cDNA中导入变异。通过该操作终止密码子被导入氨基酸345的位置，得到编码可溶性IL-6受体的cDNA。
为了在CHO细胞中表达可溶性IL-6受体，使其与质粒pSV(Pharmacia制)连结，得到质粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的质粒pECEdhfr中插入用Hind III-Sal I切断的可溶性IL-6受体cDNA，得到CHO细胞表达质粒pECEdhfr344。
通过磷酸钙沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)向dhfr-CHO细胞株DXB-1l(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)转染10μg的质粒pECEdhfr344。将转染的CHO细胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μ/ml链霉素的不含核苷的αMEM选择培养液培养3周。
被选择的CHO细胞用极限稀释法筛选，得到单一的CHO细胞克隆。用20nM～200nM浓度的氨甲蝶呤扩增该CHO细胞克隆，得到产生人可溶性IL-6受体的CHO细胞株5E27。用含有5％FBS的伊斯考夫改良的杜尔贝科培养基(IMDM、Gibco制)培养CHO细胞株5E27。回收培养上清液，用ELISA测定培养上清液中的可溶性IL-6受体的浓度。其结果，可以确认在培养上清液中存在可溶性IL-6受体。
参考例2.抗人IL-6抗体的制备用10μg的重组型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐剂一起免疫BALB/c小鼠，每周连续进行免疫至血清中能检出抗IL-6抗体为止。从局部淋巴节中取出免疫细胞，用聚乙二醇1500使其与骨髓瘤细胞株P3U1融合。按照使用HAT培养液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，SanFrancisco，351，1980)选择杂交瘤，建立产生抗人IL-6抗体的杂交瘤。
产生抗人IL-6抗体的杂交瘤如下所示进行IL-6结合分析。即，将柔软的聚乙烯制的96孔微孔板(Dynatech Laboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氢盐碳酸盐缓冲溶液(pH 9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，将板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下处理2小时。
将其用PBS洗涤后，在各孔中加入100μl的杂交瘤培养上清液、在4℃下温育一夜。洗涤该板后、在各孔中加入125I标记的重组型IL-6使其达到2000cpm/0.5ng/孔，洗涤后用γ计数器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，Fullerton，CA)测定各孔的放射活性。通过IL-6结合分析，216杂交瘤克隆中32个杂交瘤克隆为阳性。在这些克隆中可得到最终稳定的MH166.BSF2。该杂交瘤产生的抗IL-6抗体MH166具有IgG1κ型的亚型。
然后，使用IL-6依赖性小鼠杂交瘤克隆MH60.BSF2研究与MH166抗体导致的杂交瘤增殖相关的中和活性。将MH60.BSF2细胞分别注入小孔中达到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗体的试样，培养48小时，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，进而连续培养6小时。将细胞放置在玻璃滤纸上，用自动采集机(LaboMash Science Co.，Tokyo，Japan)处理。作为对照使用兔抗IL-6抗体。
其结果，MH166抗体，剂量依赖性地阻碍被IL-6诱导的MH60.BSF2细胞的3H胸苷的摄取。由此可知，MH166抗体中和IL-6的活性。
参考例3.抗人IL-6受体抗体的制备使按Hirata等的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制备的抗IL-6受体抗体MT18与通过CNBr活化的琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)按照附上的配方结合，纯化IL-6受体(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)。将人骨髓瘤细胞株U266用含有1％毛地黄皂苷(Wako Chemicals制)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM对氨基苯基甲磺酰氟盐酸盐(Wako Chemicals制)(毛地黄皂苷缓冲液)裂解，和与琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合。然后，将该珠用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次、作为用于免疫的部分纯化IL-6受体。
用由3×109个U266细胞得到的上述部分纯化IL-6受体每10天免疫BALB/c小鼠4次，然后用常规方法制备杂交瘤。用下述方法调查来自成长阳性孔的杂交瘤培养上清液对IL-6受体的结合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)标记的5ラ107个U266细胞，用上述毛地黄皂苷缓冲液使之裂解。将裂解的U266细胞和0.04ml容量的与琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合，然后，用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次，使用0.25ml毛地黄皂苷缓冲液(pH3.4)使35S-蛋氨酸标记的IL-6受体洗脱，用0.025ml的1M Tris(pH 7.4)中和。
将0.05ml的杂交瘤培养上清液和0.01ml的蛋白G琼脂糖(Phramacia制)混合。洗涤后，将琼脂糖和上述制备的0.005ml35S标记的IL-6受体溶液一起温育。用SDS-PAGE分析免疫沉降物，研究与IL-6受体反应的杂交瘤培养上清液。其结果确立了反应阳性杂交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。产生于杂交瘤PM-1的抗体具有IgG1κ型的亚型。
用人骨髓瘤细胞株U266研究杂交瘤PM-1产生的抗体相对于人IL-6受体的IL-6的结合抑制活性。人重组型IL-6用大肠杆菌制备(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、用Bolton-Hunter试剂(NewEngl and Nuclear，Boston，MA)进行125I标记的(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
将4×105个U266细胞与70％(v/v)杂交瘤PM-1的培养上清液和14000cpm的125I标记的IL-6一起培养一小时。将70μl样品铺到400μl的微植菌聚乙烯管中的300μl的FCS上，离心后，测定细胞上的放射活性。
结果表明，杂交瘤PM-1产生的抗体抑制IL-6与IL-6受体的结合。
参考例4.抗小鼠IL-6受体抗体的制备通过Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168-173记载的方法，制备对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
在含有10％FCS的IMDM培养液中培养产生小鼠可溶性IL-6受体的CHO细胞，从其培养上清液使用将抗小鼠IL-6受体抗体RS12(参照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝胶(Biorad制)的亲和性色谱柱纯化小鼠可溶性IL-6受体。
混合得到的小鼠可溶性IL-6受体50μg和弗氏完全佐剂，向ウイスタ—大鼠的腹部注射。2周后开始用弗氏不完全佐剂追加免疫。第45天采集大鼠脾脏细胞，使2×108个脾脏细胞按照常规方法与1×107个小鼠骨髓瘤细胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)细胞融合后，在HAT培养基中筛选杂交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗体(Cappel制)的板上加入杂交瘤培养上清液后，使小鼠可溶性IL-6受体反应。然后，通过使用兔抗小鼠IL-6受体抗体和碱性磷酸酯酶标记的的绵羊抗兔IgG的ELISA法筛选对于小鼠可溶性IL-6受体产生抗体的杂交瘤。对已确认产生抗体的杂交瘤克隆进行2次亚筛选，得到单一的杂交瘤克隆。此克隆被命名为MR16-1。
用MH60.BSF2细胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951-956)用3H胸苷的摄取研究该杂交瘤产生的抗体在小鼠IL-6的信息传递中的中和活性。在96孔板上制备MH60.BSF2细胞至1ラ104个/200μl/孔。在该板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗体或RS12抗体12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培养44小时后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小时后测定3H胸苷的摄取。结果表明，MR16-1抗体抑制MH60.BSF2细胞的3H胸苷摄取。
因此表明，杂交瘤MR16-1(FERM BP-5874)产生的抗体，阻碍IL-6与IL-6受体的结合。
权利要求
1.一种小儿慢性关节炎相关疾病治疗剂，含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分组成。
2.一种小儿慢性关节炎治疗剂，含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分。
3.如权利要求2中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，IL-6拮抗剂是对IL-6受体的抗体。
4.如权利要求3中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对IL-6受体的单克隆抗体。
5.如权利要求4中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对人IL-6受体的单克隆抗体。
6.如权利要求4中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
7.如权利要求3～6的任一项中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是重组抗体。
8.如权利要求5中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
9.如权利要求6中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
10.如权利要求3～5的任一项中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
11.如权利要求10中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的人源化抗体是人源化的PM-1抗体。
12.如权利要求2～11的任一项中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，上述小儿慢性关节炎是ARA分类中的全身型、多关节炎型、少关节炎型；EULAR分类中的全身型、多关节炎型、少关节炎型；ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性型)、多关节炎型(RF阴性型)、少关节炎型、发展型少关节炎型；本发明者们分类中的小儿原发性慢性关节炎(SPRASH综合征，小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型、b.抗核抗体(ANA)阳性型、c.RF/ANA阴性型))。
13.如权利要求2～11的任一项中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，上述小儿慢性关节炎是ARA分类中的全身型、多关节炎型；EULAR分类中的全身型、多关节炎型；ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性型)、多关节炎型(RF阴性型)、发展型少关节炎型；本发明者们分类中的小儿原发性慢性关节炎(SPRASH综合征，小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型、b.抗核抗体(ANA)阳性型))。
14.如权利要求2～11的任一项中记载的小儿慢性关节炎治疗剂，上述小儿慢性关节炎是ARA分类中的全身型、多关节炎型；EULAR分类中的全身型、多关节炎型；ILAR分类中的全身型、多关节炎型(RF阳性型)、发展型少关节炎型；本发明者们分类中的小儿原发性慢性关节炎(SPRASH综合征，小儿自发性慢性关节炎(a.类风湿病因子(RF)阳性型)。
15.一种斯提尔氏病治疗剂，含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分。
16.如权利要求15中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，IL-6拮抗剂是对于IL-6受体的抗体。
17.如权利要求16中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对于IL-6受体的抗体是对于IL-6受体的单克隆抗体。
18.如权利要求17中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对人IL-6受体的单克隆抗体。
19.如权利要求17中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
20.如权利要求16～19的任一项中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是重组抗体。
21.如权利要求18中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
22.如权利要求19中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
23.如权利要求16～18的任一项中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的抗体是对IL-6受体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
24.如权利要求23中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，对IL-6受体的人源化抗体是人源化的PM-1抗体。
25.如权利要求15～24的任一项中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，斯提尔氏病是成人斯提尔氏病。
26.如权利要求15～24的任一项中记载的斯提尔氏病治疗剂，其特征在于，斯提尔氏病是小儿的斯提尔氏病。
全文摘要
一种小儿慢性关节炎相关疾病，如小儿慢性关节炎，斯提尔氏病等的治疗剂，以白细胞介素－6(IL－6)拮抗剂为有效成分。
文档编号C07K16/28GK1499983SQ0280778
公开日2004年5月26日 申请日期2002年4月2日 优先权日2001年4月2日
发明者吉崎和幸, 弘, 西本宪弘, 岩本雅弘, 次, 簑田清次, 平, 横田俊平, 佳子, 宫前多佳子 申请人:中外制药株式会社