抑制植物开花的方法

专利名称：：抑制植物开花的方法发明的领域本发明部分涉及一种减少或基本防止植物开花的方法，这种方法包括在植物中表达一种新鉴定的开花抑制子的序列，从而产生一种抑制上述植物开花的多肽。更具体地，本发明涉及包含上述序列或相关序列的载体、细胞或转基因植株及其用途；以及在长日照条件下可以上调基因在植物顶尖和叶子中表达的启动子。在本发明的特定方面，这种植物可能是多年生或二年生植物，在更特定的方面，这种植物可能是单子叶植物。发明的背景开花植物的生命周期总体上可以分为三个生长期营养期、花序期和开花期(Poethig，1990)。在营养期，茎尖分生组织(SAM)产生叶片，进而保证得到足够的养分去产生可育的后代。当接受到适当的环境和发育信号，植物转入开花或生殖、生长，SAM进入花序期(I1)，产生有花原基的花序。在这个时期，SAM和叶腋上的次生茎的命运是由一系列分生组织特性(identity)基因决定的，其中一些基因抑制、一些基因促进花分生组织的发育。在植物中已发现两种基本的花序类型有限花序和无限花序(Weberling，1989)。在有限花序的植物中，如黑麦草，SAM最终产生花器官，分生组织的产生以花而告终。在无限花序的植物的SAM不被转化为花特征，从而仅仅在其四周产生花分生组织，进而导致持续性生长方式。分生组织的特征和开花转变调控的研究已经在许多双子叶植物包括拟南芥属(Arabidopsis)、金鱼草属(Antirrhinum)番茄、烟草中进行。但是，在一些农业重要的种子植物中，如小麦、大麦、水稻、牧草和其他一些单子叶植物中，关于花转变的调控的信息还很匮乏。本发明者对多年生黑麦草(Loliumperenne)的分生组织特性以及开花转变的调控进行了分子研究，多年生黑麦草是一种冷季型的、生长在欧洲、温带亚洲和北非的多年生牧草。开展此研究的原因有几个。第一，杆(茎)和种穗(seedhead)(花序)的形成降低了牧草的营养价值。叶片与鞘、杆相比更容易消化，并含较多粗蛋白，较低的细胞壁组分(Deinum和Dirvan，1975；Wilman等，1976)。随着牧草的衰老，其木质化增高，可消化性降低，茎消化性的降低更是显著比叶子高(Delagardeetal.，2000)。奶牛的饲养试验已经证明，牧草消化性的增高导致奶牛日食量和产奶量的提高(Oba和Allen，1999)。第二，为了保持有营养的牧草，需要经常的机械脱叶体系，这既耗费物力也很耗费人力。过于频繁的脱叶也会严重的减少植物的光合作用能力，在最坏的情况下，还可破坏植物再生能力。第三，在许多植物中，开花还与通过花粉传播的、从栽培品种流向野生种的不可控制的基因流动相关。第四，很多多年生植物的开花还与牧草花粉过敏原释放相关。所以，具有延长的营养生长期，并减少或甚至消除花序产生的牧草的栽培品种将具有非常重要的农业意义。就植物发育而言，黑麦草的气生部分是由位于高于地面几毫米并被正在发育的叶片包围的基冠(basecrown)上的顶端发育而来的(图1A)。在植物的营养生长期，顶端分生组织产生两侧分生组织，两侧分生组织最初表现为沿着主轴的半圆形突起。两侧分生组织再分化成叶原基。这种形态发生方式，直到由于温度的升高、日照的增长，顶尖被诱导向花分化时才发生变化。12到14个星期的低于5℃的春化(vernalization)以及随后的长日照(总体上说，白天时间长于黑夜，具体说，16小时光照，8小时黑暗)和高于15℃-20℃的温度可以诱导多年生黑麦草开花。当转入生殖生长时，顶端分生组织和随后的两侧分生组织开始扩展，最终变成一组组花序(小穗)，每个花序由3-10个花分生组织组成。黑麦草的花序以聚伞状排列，总是以顶生花来结束顶端生长。就此而言，黑麦草具有有限花序的植物结构，这种结构也在双子叶植物如烟草(Amaya等，1999)和番茄(Pnueli等，1998)中存在，并以分子水平描述。与拟南芥属以及金鱼草属植物不同的是，多年生黑麦草是有限(聚伞状)花序。拟南芥的顶生花1(TERMINALFLOWER1)(TEL1)基因以及其在金鱼草中的同源基因CENTRORADIALIS(CEN)已被证明是一组控制花序分生组织无限特性的基因。TFL1/CEN的突变导致花序变为顶生花(Shannon和Meeks-Wagner，1991；Alvarez等，1992)。除了影响分生组织的命运，TFL1也延长拟南芥的营养期(Shanon和Meeks-Wagner，1991；Ratcliff等，1998)，但是CEN似乎并不影响金鱼草的花期(Bradley等，1996)。CEN和TFL1蛋白和哺乳动物磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEPBs)具有序列相似性。FLOWERINGLOCUST(FT)基因也属于植物PEBP基因家族，但是在介导拟南芥开花诱导的信号时起着和TFL1相反的作用(Kardailsky等，1999；Kobayashi等，1999)。因此，植物PEBP基因家族包含具有与开花控制相关的不同作用的许多同源蛋白。通过组成型启动子操纵的不同植物PEBP在不同植物中的表达，它的这些差异被进一步揭示。如35SCaMV组成型启动子操纵的TFL1基因在烟草中表达，不影响开花期，也不影响烟草的植物结构(Amaya等，1999)。植物PEBP基因功能的不同也表现在不同基因表达方式。在拟南芥和金鱼草中，TFL1/CEN在SAM的中央表达。当从营养期向生殖生长期转变时，这些基因的表达增加(Bradley等，1996，1997)。此时，花分生组织决定基因如LFY、AP1和CAL的表达在SAM中也增加，但它们的表达还仅限于发育中的花(Mandel等，1992；Bradley等，1997；Ratcliffe等，1999)，在烟草中，CET2/CET4基因主要在腋分生组织而不在SAM中表达(Amaya等，1999)。本发明概况本发明是基于对广泛分布的重要的农业单子叶作物的开花控制和植物结构的机理的研究。发明者先前已从多年生黑麦草中分离了一个基因LpTFL1，这个基因与植物PEBP基因有同源性，还发现此基因具有决定植物结构和有效抑制植物从营养期向生殖期转变的功能。发明者现用LpTFL1转化了拟南芥、紫羊茅(FestucarubraL.)和多年生黑麦草(LoliumperenneL.)，结果表明LpTFL1是一个开花的抑制因子，其独特的表型作用还从未被报导过。LpTFL1在拟南芥、紫羊茅、黑麦草中过量表达可导致显著的营养-花序期的延长，在拟南芥中LpTFL1过量表达可导致比TFL1过量表达更多的侧枝的形成。此外，结果显示，LpTFL1能抑制多年生植物在第一年和随后的几年内的开花。能抑制开花并在随后年份起作用的此类抑制子以前尚未发现。本发明者还分离到LpTFL1的启动子，发现它具有在长日照花诱导过程中上调基因表达的潜在用途。因此，本发明的目标是提供从植物中分离的开花抑制子基因、其编码蛋白，及其与开花相关的启动子。因此，第一方面，本发明提供了可以显著减少或基本防止多年生或两年生植物开花的方法，本方法包括从分离的具有图2所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、衍生物或同源物在多年生或两年生植物中表达多肽。这个核苷酸序列代表从多年生黑麦草中分离的基因序列，从此以后称为“LpTFL1”。优选的所述植物是多年生植物。第二方面，本发明提供了显著减少或基本防止多年生或两年生的植物开花的方法，本方法包括表达具有图4所示氨基酸序列的分离的多肽或其功能活性片段、衍生物或同源物。这个分离的多肽是由图2所示的分离的多核苷酸或其片段、衍生物或同源物编码的。优选该生物是多年生植物。用在这里的“多核苷酸片段”这个术语是指核苷酸链如脱氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸和它们的转录产物，如RNA、mRNA等。这个术语可以和多核苷酸、DNA编码序列、基因、遗传材料、基因序列和遗传序列在这里互用。这个多核苷酸片段可以是在某种意义上分离的，即基本不包含在体内整个基因组通常所结合的生物材料中。这个分离的多核苷酸片段可以被克隆而产生包含这个多核苷酸片段的重组分子。因此，多核苷酸片段包括双链和单链DNA、RNA、寡核苷酸，以及由此衍生的任何所希望长度的多核苷酸序列，譬如，所述片段的亚序列(在这里也被称为亚片段)。当核酸是单链时，所述的链和其互补序列都包括在本发明之范围内。这个多核苷酸片段可以被表达从而产生表达产物。总体而言，“表达产物”这个术语是指所述多核苷酸的转录和翻译产物。当表达产物是“多肽”(也就是，表现出的生物学活性基本相似于必需蛋白的生物学活性的氨基酸的链或序列，不是指该产物等的特定长度。因此，本领域技术人员应当理解多肽包括特别肽、多肽和蛋白。如果需要，多肽可以离体和/或在活体内被修饰，譬如，糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化，和/或翻译后切割。本领域众所周知，遗传密码的简并性可以允许密码子的碱基置换而产生不同的密码子，但仍然能编码同一氨基酸。譬如，对应于谷氨酸的密码子是GAT和GAA。因此，显然表达如图4所示的氨基酸的多肽或其片段可以用具有不同于图2所示的核酸序列的、替换的密码子组成的其它核酸序列。这些序列在这里被称为“衍生物”。术语“同源性”或“同源的”，在这里是指本发明的多核苷酸片段的核苷酸序列和这里公开的序列具有65％或以上的相同性，如66％、68％、70％、75％、80％、83％、86％、88％、90％、92％、95％、97％、99％的相同性。这些多核苷酸片段可能包括，但不限于已知的从前已被发现为开花抑制子的序列，如水稻FDR1(85％相同)，烟草的CET1(66％相同)，CET2(72％相同)、CET4(71％相同)，番茄的SP(70％相同)和油菜的BnTFL1-1(68％相同)、BnTFL1-3(68％相同)；或可能包括，已知在某种程度上延缓开花的序列，如水稻的FDR2(87％相同)和RCN2。术语“相同性”就核苷酸序列而言，被定义为多核苷酸中多少百分比的核苷酸，在经过序列分析程序的序列对比后，和在这里公布的序列中的核苷酸相同。被用于数据库搜索和序列对比和比较的程序，譬如，来自WisconsinPackageVersion10.2的，如BLAST，FASTA，PILEUP，FINDPATTERNS等等(GCG，Madison，W1)，或为公众提供的序列数据库，如GenBank，EMBL，Swiss-prot和PIR或私有的数据库如Phytoseq(IncytePharmaceuticals，PaloAlto，CA)，都可被用于确定序列相同性。序列对比可以通过Smith和Waterman的局部同源算法(1981Adv.Appl.Math.，2482)、通过Needleman和Wunsch(1970J.Mol.Biol.，48443)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman(1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444)搜索相似性方法，通过这些算法的计算化实施进行。用本发明所提供的信息，可以从任何植物来源中用标准方法分离和在这里公布的用于本发明方法中的LpTFL1多核苷酸片段相似的多核苷酸片段，如用共有序列寡核苷酸和PCR。“相似”是指分离的多核苷酸片段含有能和本发明所申明的多核苷酸序列互补的序列杂交的核苷酸序列。杂交的严格性被用于决定两个序列之间的相似性程度。通常，严格的条件是在一定的离子强度和pH下低于特定序列热解链温度(Tm)5℃到20℃。Tm是指50％的目标序列(在特定的离子强度和pH下)杂交到一个完全匹配的序列(探针)的温度。在相似和发明的序列被混和在一起，然后同时变性的情况下，序列的Tm值优选相互相差10℃以内。更优选地，杂交应该是在严格条件下进行，相似或发明的DNA被支持。因此，例如变性的相似或发明的序列优选被首先结合于支持物，杂交可在下列条件进行特定的时间50℃-70℃，于含有0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)两倍浓度的SSC(2×氯化钠17.5g/L和柠檬酸钠(SC)8.8g/L)的缓冲盐中进行，然后，在同样的温度清洗该支持物，但是用含有降低浓度SSC的缓冲液。根据所需的严格程度，进而序列相似程度，该低浓度的缓冲液为通常为一倍浓度的含有0.1％SDS的SSC，半倍浓度的含有0.1％SDS的SSC，1/10浓度的含有0.1％SDS的SSC。具有最大相似性程度的序列是指其杂交受降低浓度的缓冲液洗涤的影响最小的序列。最优选，相似序列和发明的序列是如此相似，以至其杂交基本不受高严格条件下洗涤和温育的影响，譬如，在1/10浓度含有0.1％SDS的柠檬酸钠缓冲液中。这些来自除黑麦草以外的植物的相似的多核苷酸片段也被称为同源序列(homologues)。因此，本发明也提供了在多年生或二年生植物中显著减少或基本防止开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，这些多核苷酸片段包含从其他植物中得到的、与在此公布的多核苷酸或其片段的核苷酸序列在严格或中等严格条件下杂交的序列互补的、相似的核苷酸序列或其片段。包括在本发明所用的相似序列的分离的多核苷酸片段可能是分离自任何植物包括单子叶和双子叶植物，特别是农业重要的植物种类，包括但不限于那些属于禾本科的作物，也包括大豆、马铃薯、油菜(oilseedrape)、向日葵、苜蓿、甘蔗和棉花；或草本植物，如茴芥、罗勒、月桂、马槟榔(caper)、蒿(caraway)、辣椒(cayennepepper)、芹菜、山萝卜、细香葱、芫荽、莳萝、茴香、大蒜、山葵(horseradish)、韭葱、蜜蜂花、甘草、马珠草(marjoram)、薄荷、牛至、欧芹、迷迭香、芝麻、龙蒿(tarragon)、百里香；或水果和蔬菜，如香蕉、黑莓、蓝莓、草莓和悬钩子、胡萝卜、咖啡、茄子、葡萄、蜜瓜、芒果、洋葱、木瓜、豌豆、胡椒、菠萝；蔷薇科水果(如苹果、桃子、梨、樱桃、李子)，和十字花科(brassicas)蔬菜(如芽甘蓝(brusselsprent))。这些同源序列也可能来自木本植物，如桉树、橡树、松树和杨树。本发明提供了一种显著减少和基本防止多年生或二年生植物开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，这种多核苷酸片段包含合成的或人工的，并可在严格或中等严格条件下与上面公布的核苷酸序列或其片段杂交的序列互补的相似核苷酸序列。本发明者已经鉴定了对应于图2的cDNA序列的基因组序列，如图3所示。LpTFL1的编码序列，包括内含子或外显子，是从碱基1到912。因此，本发明进一步提供了包含如图3所示的从碱基1到912或从碱基-78到1242的核苷酸序列的分离多核苷酸片段。虽然碱基1242对应于cDNA序列结束，但认为从碱基1243到碱基1624的序列可能含有多聚腺苷酸化信号。因此，本发明的分离多核苷酸片段可能进一步含有与碱基1到1242相连的碱基1243到1624。此外，本发明提供显著减少或基本防止多年生或二年生植物开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，这个多核苷酸片段包含选自如图3所示的所有碱基、碱基1到912、碱基1至1624、碱基-78至912、碱基-78到1242，-78到1624的核苷酸序列。本发明者也分离一个起始密码子的上游区域，这区域包含黑麦草LpTFL1基因的天然启动子(碱基-3600到-1)。因此，本发明也提供了包含启动子的多核苷酸的片段，所述启动子具有如图3所示的从碱基-3600到-1的核苷酸序列。本发明者通过检测黑麦草中LpTFL1mRNA的表达确定了LpTFL1启动子的功能。结果表明，LpTFL1在营养期的黑麦草的顶尖中表达。与拟南芥的TFL1相反，当向生殖生长转变时，LpTFL1mRNA的表达不仅在顶尖增加，而且在叶片中增加(大于25倍)。在叶片中LpTFL1mRNA表达的增加似乎是被开花诱导如长日照、升高的温度所刺激。因此，在另一方面，本发明提供了具有如图3所示的从碱基-3600到-1的核苷酸序列的分离的多核苷酸片段，以及这个片段的衍生物或片段，这些片段可在导致开花条件下，上调在多年生或二年生植物顶尖和叶片中的基因表达。开花诱导和导致开花的条件在这里是指一个在5℃以下，8到18周的时期，具体如10到16周和12到14周，接着是长日照期的再诱导，也就是通常白天时间长于黑暗时间，具体如，13小时光照和11小时黑暗，14小时光照和10小时黑暗，15小时光照和9小时黑暗，或16小时光照和8小时黑暗，和/或温度高于15℃，如16℃，17℃，18℃，19℃，20℃或更高。可以理解的是，对于包含在此的具体的多肽，在基本不改变其功能的基础上，可以改变该多肽。这些变化可以是在总体序列上氨基酸的不同或所述序列中氨基酸的缺失、替换、插入、倒位或添加，这些都被称为所述的多肽的衍生物。所有这些多肽的衍生物具有所述生理功能，包括在本发明的范围之内。譬如，为本发明目的，保守性氨基酸置换可以在下述各组中的氨基酸之间进行(1)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(2)谷氨酸和天冬氨酸(3)精氨酸和亮氨酸(4)谷氨酰胺和天冬酰胺(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸(6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸也包括通过添加或置换现有氨基酸的方法把合成的氨基酸掺入本发明所述多肽中。多肽，或其片段或衍生物，如通过如上所述修饰后还保持原初的全长多肽的生理学活性，这里被称为“功能性变体”或“具功能活性变体”。而且，重组DNA技术可被用来获得编码上述不同衍生物的核酸序列。本发明的氨基酸序列或序列基序(motif)可被用于在蛋白数据库进行同源性搜索，从发现其他植物中与LpTFL1相关的蛋白。因此，本发明提供了可显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括表达从其他植物中来的和本发明所述的多肽序列同源的多肽。就多肽而言，术语“同源物”是指与本发明所述序列具有69％或以上的相同性的多肽序列，如70％、72％、75％、80％、83％、87％、90％、92％、95％、97％或99％的相同性。该多肽序列可分离自单子叶或双子叶植物。该植物可能是一年生，二年生或多年生的。这些多肽序列可能包括，但不限于先前已确定的开花抑制子的已知序列，如水稻FDR1(86％相同)，烟草的CET1(68％相同)、CET2(72％相同)、CET4(72％相同)，番茄的SP(71％相同)和油菜的BnTFL1-1(70％相同)、BnTFL1-3(70％相同)；或一些已知部分有效抑制开花的序列，如水稻的FDR2(91％相同)和RCN2。术语“相同性”就多肽而言，被定义为当用序列分析程序进行序列对比后，一个多肽序列中和这里所公布的多肽序列的氨基酸相同的氨基酸的百分比。被用于数据库搜索和序列对比和比较的程序，譬如，来自WisconsinPackageVersion10.2的，如BLAST，FASTA，PILEUP，FINDPATTERNS等等(GCG/Madison，W1)，或为公众提供的序列数据库，如GenBank，EMBL，Swiss-prot和PIR或私有的数据库如Phytoseq(IncytePharmaceuticals，PaloAlto，CA)，都可被用于确定序列相同性。序列对比可以通过Smith和Waterman的局部同源算法(1981Adv.Appl.Math.，2482)、通过Needleman和Wunsch(1970J.Mol.Biol.，48443)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman(1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444)搜索相似性方法，通过这些算法的计算化实施进行。名词“同源物”或“同源的”也指这样的多肽序列，其是通过运用对多个序列进行对比的分析程序确定的两个或多个同源多肽序列的分支分类分析后，从而发现和这里所公布的多肽群集的(clustered)多肽序列，这种分析程序比如ClustalW(Tompson等，1994；NacleicAcidRes.，224673)或WisconsinPackagVersion10.2内的PILEUP(GCG，Madison，WI)等等。用于比较的序列的分支分类(clasdistic)分析可通过使用ClustalW程序各种参数的不同值来完成，如缺口开放罚分(gapopenpenalty)、缺口延伸罚分、缺口分离罚分以及蛋白重量矩阵(matrix)。这些参数的值可以是缺口开放罚分(1、2、5、10、25、50、100)、缺口延伸罚分(0.05、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0)、缺口距离罚分(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、蛋白重量矩阵(Dayhoff等1978建立的PAMAtlasofProteinSequenceandstructure；Dayhoff，MO编著的NBRF，Wahsington345；Henikoff和Henikoff1992建立的BLOSUM，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915；Dayhoff等1978更新的矩阵GONNETAtlasofProteinSequenceandstructure；Dayhoff，MO编的NBRF，washington345)。当用ClustalW时，最优选用GONNET矩阵将同源的多肽序列和本发明所述的多肽序列聚在一起，和缺口开放罚分高于5、缺口延伸罚分高于或等于0.2，缺口距离罚分高于3。可以通过Clustalw比对与本发明所述的多肽序列聚在一起的同源多肽序列的数量依赖于所分析序列的相似性。如分析具高百分比序列相同性的多肽序列，将得到较多的可于本发明所述多肽序列聚在一起的同源序列；如分析有较低百分比序列相同性的多肽序列，就将得到较少的可与本发明所述序列聚在一起的同源序列。最优选地用于ClustalW或PILEUP以及其他多序列对比的多肽序列有与本发明所述多肽序列60％或以上相同性。到目前为止，在植物PEBP序列中，有11个氨基酸残基通过结晶学(Banfield和Brady，2000)和突变(Bradley等，1997；Ohshima等，1997；Pnueli等，1998)已被鉴定为对功能蛋白至关重要。在这些残基中，LpTFL1只有一个位点(110)与共有序列不同，这个位点也是在不同种之间氨基酸变异程度最大的。可以设想，位点110的丝氨酸残基可能赋予了本发明所述的较高的开花抑制子活性。因此，从本发明的多核苷酸片段所表达的多肽可包括位于从氨基端残基100到120之间的YESP(K/R)序列。本发明进一步提供了可显著减少或基本防止多年生或二年生植物开花的方法，这个方法包括在植物宿主细胞中插入一个表达组件，这个表达组件含有启动子和如图2所示的核苷酸序列及其片段或衍生物，转化了的宿主细胞在适当的培养基上生长，表达所述的DNA序列而产生所述的蛋白，其中所述表达的蛋白基本减少和/或防止所述植物的开花。该启动子可能是，例如，单子叶和双子叶植物的肌动蛋白和遍在蛋白的启动子，单子叶和双子叶植物甘油醛脱氢酶(GAPDH)的启动子，椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)和19S(CaMV19S)启动子，含有翻译增强子(TMVω元件)的35SCaMV启动子、胭脂氨酸合酶(NOS)启动子、章鱼氨酸合酶(OCS)启动子。开花抑制子蛋白的表达可能只在一定的时间，如有限的几个季节需要。因此，本发明所述的多核苷酸可包含于一个可控的表达组件，其中相关多核苷酸的表达是可通过可控的信号来诱导或减少。做到了这一点，开花可以被抑制或可解除抑制，植物从而开花。更进一步，本发明提供核苷酸序列，这个序列包含转录调控序列，在此转录调控序列转录控制下的编码RNA序列的序列，特征在于该RNA序列是和编码LpTFL1或其功能同源物的mRNA反义的。这个编码反义RNA分子的核苷酸序列可以是任何长度，只要在由其转录的反义RNA分子的长度足以使之与编码LpTFL1的有义mRNA分子形成复合体。因此，不受理论束缚，反义RNA分子与编码蛋白的mRNA复合，从而阻止或基本抑制功能性LpTFL1或其功能同源物的合成。由于反义RNA干扰，LpTFL1或其同源物的开花抑制子活性被基本降低或消除。编码反义RNA的DNA长度可以从大约20个核苷酸到细胞所产生的相关mRNA的对应长度。优选地，编码反义RNA的DNA长度是从50到1500个核苷酸。优选的转录自本发明所述的DNA构建体的反义RNA的来源是和LpTFL1具有基本相同性或相似性的DNA。抑制内源LpTFL1的表达可以通过核酶来完成。核酶是合成的具有高度特异性的核酸内切酶活性的RNA分子。核酶的制备和使用已被授予Cech的美国专利No.4,987,071和授予Haselhoff的美国专利No.5,543,508所描述。在反义RNA之内包含核酶序列可使反义RNA具有RNA切割活性，因此，结合于反义RNA的内源mRNA就被切割，从而导致对内源基因表达的增强的反义抑制作用。可以过量表达LpTFL1cDNA(或其变体)编码的RNA的载体也可被用来获得对内源LpTFL1基因的共抑制，其方式如授予Jorgensen的美国专利No.5,231,020所述。这种共抑制(也叫有义抑制)不需要全长的LpTFL1cDNA被导入植物细胞，也不需要被导入的序列完全和内源的LpTFL1基因相同。然而，与反义抑制一样，这种抑制效率也可被增强，通过(1)被导入的序列长度增加，(2)导入的序列和内源LpTFL1基因的序列相似性增加。表达不翻译形式的LpTFL1mRNA的载体也可被用于抑制内源LpTFL1活性表达而诱导开花。用于产生这种构建体的方法已被授予Dougherty等的美国专利No.5,583,021所描述。这种构建体优选通过引进一个早熟密码子到LpTFL1基因中而制备。此外，诱导开花也可通过用双链RNA的基因沉默而获得(Sharp，1999)。这种手段是通过制备一个载体，在此载体上cDNA或基因被重复排列，当被表达时可产生一个带发夹结构的双链RNA分子。该方法已被用于修饰植物中的基因活性(Chuang和Meyerowitz，2000)。另一种可以消除LpTFL1表达的方法是通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的插入突变。产生插入突变体后，可筛选突变体而鉴定那些在LpTFL1基因中含有插入的突变体。在LpTFL1基因上有单个突变的突变体可杂交产生该突变的纯合植物(Koncz等1992，拟南芥研究方法，WorldScientific)。植物开花也可通过如Cre-lox系统(如美国专利No.5,658,772所述)的重组系统来控制。一个植物基因组可以被改变而含有第一个和第二lox位点，这些位点与Cre重组酶接触。如果该lox位点是同一方向，介于它们之间的干涉DNA序列就被切除。如果该lox位点方向相反，则干涉DNA序列就被倒置。本发明的多核苷酸和多肽也可在没有表达组件条件下，通过其他手段操作内源基因的活性或表达水平在植物中表达。例如，通过T-DNA激活标签(T-DNAactivationtagging)来异位表达一个基因(Ichikama等1997，Nature390698-701；Kakimoto等1996，Science，274982-985)。这个方法是用含有多个转录增强子的基因标签转化植物，一旦这个标签插入基因组，两侧面的基因编码序列的表达就会失去调控。另一个例子，植物的转录机制被改变从而增加本发明的多核苷酸的转录水平(见PCT出版物，WO9606166和WO9853057，其中描述了通过改变DNA结合基序的特定氨基酸而修饰锌指蛋白的DNA结合特异性。转基因植物也可含有表达或改变内源基因编码的多肽活性必需的机制。如，通过改变多肽的磷酸化状态而维持其处于激活状态。因此，另一方面，本发明提供了转基因的多年生或二年生植物，这些植物细胞中的由于LpTFL1的开花抑制子的活性已被显著减少或基本防止。这些植物，可以是例如双子叶或单子叶植物。转录起始序列通常位于转录起始位点的上游，包含转录所需的所有调控区域。如此转录起始序列的例子(也叫启动子)上面已提及。应当理解所用的启动子应该能以足够抑制植物细胞中LpTFL1的活性的速率产生足够量的反义RNA分子的转录。不同植物所需的转录的反义RNA量可能不同。本发明的DNA构建体和核苷酸序列可以本领域已知的不同方式用于转化单子叶和双子叶植物细胞。例如，胚胎发生性的愈伤组织的微粒轰击(particlebombardment)是产生转基因单子叶植物的可选的方法(Vasil(1994)，PlantMol.Biol.25925-937)。在许多情况下，转化的植物细胞可以被培养再生为完整的植株，随后繁殖而产生遗传修饰的植物后代。本发明也提供了含有本发明的DNA构建质粒的生物载体。这个生物载体可以是病毒或细菌，如根瘤农杆菌，而且，这个构建体有利地还编码一个标记蛋白，如含有除草剂抗性或抗菌性的标记蛋白。本发明另一方面是包含所述构建体的重组生物载体，该载体能转化宿生细胞。还包含被所述载体稳定转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞优选是以选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞并能由本发明的多核苷酸表达多肽的细胞。本发明进而提供了含有所述核苷酸序列、DNA构建体或载体的真核细胞，如植物的细胞(包括原生质体)。本发明也进而提供了基因剔除的植物细胞，其中编码LpTFL1及其功能片段、衍生物或同源物的基因被突变或去除，从而消除表达。不愿受任何理论束缚，这将导致植物提前开花。本发明进一步提供了含如此植物细胞的转基因植物，这些植物的后代，其含有按孟德尔规律遗传的、稳定插入基因组的序列，和/或所述植物或后代的种子。这些转基因植物后代也可通过传统的营养繁殖或微繁殖(micropropagation)来获得。本发明也提供了发明所涉及的序列的应用，不管是“裸”DNA或存在于DNA构建体或生物载体中，用于产生真核细胞，特别是含有修饰的LpTFL1活性的植物细胞。其他植物LpTLF1相关编码序列可基于它们与图2所示的序列及其片段或同源物的序列同源性，用已知的技术分离出。这些技术中，部分或全部已知的LpTFL1的编码序列可作为探针选择性杂交存在于所选的有机体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(如基因组或cDNA文库)中的其它LpTFL1编码序列。这些技术包括杂交筛选铺在平板上的DNA文库(既可是噬菌斑，也可是菌落，参考如Sambrook等编的“分子克隆”ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))，和用寡核苷酸引物进行PCR扩增，例如对应于LpTFL1基因序列的序列结构域。因此，本发明的另一个实施方案是分离一个多核苷酸片段的方法，所述的多核苷酸片段包含具有和本发明所公布的序列至少65％相同性的序列，如68％、70％、75％、80％、83％、86％、88％、90％、92％、95％、97％、99％相同性。所述的方法包含(a)制备可与植物LpTFL1相关基因或mRNA特异杂交的核苷酸探针，其中里所述探针包含至少10个核苷酸长的黑麦草LpTFL1编码序列的连续的部分；(b)用(a)中所制备的核苷酸探针从所选定的植物得到的基因组DNA片段或cDNA片段群中探测其它LpTFL1相关编码序列；(c)分离包含编码具有LpTFL1样活性的蛋白的部分的多核苷酸片段。本发明的分离的植物LpTFL1和其相关序列可根据标准遗传工程技术进行操作，满足各种用途。如完整LpTFL1编码序列或其部分可被用作探针，去特异地与编码序列和信使RNA杂交。为了获得在不同条件下的特异杂交，这些探针含有LpTFL1编码序列中特异的序列，长度最少10个核苷酸，优选20个核苷酸，最优选至少50个核苷酸。通过众所周知的聚合酶链式反应(PCR)的方法，这些探针可用作扩增和/或分析所选有机体中的LpTFL1的编码序列。这个技术可如前所述被用于从其他植物中分离另外的LpTFL1相关编码序列，或可作筛选分析，从而确定植物中是否存在LpTFL1相关编码序列。杂交探针也可通过标准技术，如Northern印迹分析去定量植物中LpTFL1mRNA的水平。LpTFL1特异的杂交探针，通过基于探针与基因组LpTFL1序列的选择性杂交的标准技术，也可用于例如，绘制天然的LpTFL1相关基因在黑麦草基因组中的位置。这些技术包括，但不限于用在LpTFL1探针序列内包含的或识别的DNA多态性鉴定，用这些多态性去跟踪LpTFL1基因相对于其他已知位点的分子标记，在两个多态性亲本杂合子自交来源的作图种群的分离规律(参考Helentjaris等，PlantMol.Biol.5109(1985)；Sommer等，Biotechniques，1282(1992)；D’Ovidio等PlantMol.Biol.15169(1990))。LpTFL1基因此种方式的作图可能对育种有重要意义。例如，已知可影响开花的突变LpTFL1相关基因的遗传图谱位置，其侧面DNA标记可从参考遗传图谱中获得(参考Heletjaris，TrendsGenet.3217(1987))。当突变的LpTFL1相关基因性状被渐渗入一个新的育种品系，这些分子标记则可被用于监测LpTFL1相关的侧接染色体DNA在每轮回交后还存在于回归亲本的程度。为在宿主有机体中重组产生这个开花抑制子蛋白，可将LpTFL1DNA编码序列插入表达组件中形成DNA构建体，其为特定的宿主设计，当导入宿主时，就可被重组生产。特定宿主所适合的特异性调控序列如启动子，信号序列，5’和3’非翻译序列、增强子和终止子的选择是本领域技术人员所熟知的。最终的分子，含有与恰当读框连接的各个元件，可被导入选定的细胞，通过本领域公知的技术，如电穿孔、biolisticintroduction、Ti质粒导入等等。对于宿主有机体，如E.Coli(参考如Studier和Moffatt，J.Mol.Biol.189113(1986)；Brosius，DNA8759(1989))、酵母(参考Schneider和Guarente，Meth.Enzymol.194373(1991))和昆虫细胞(参考如Luckow和Summers，Bio/Technol.647(1988))的合适的表达组件和载体以及用于产生重组蛋白的方法已众所周知。适合于本发明的DNA构建体的启动子的例子，包括病毒、真菌、细菌、动物和植物来源的可在植物细胞起作用的启动子。该启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。适当的诱导型或发育调控型启动子和组成型的启动子的实例，包括glutocorticoid诱导转录系统，napin贮藏蛋白基因(在种子发育时被诱导)，苹果酸合酶基因(在幼苗发芽时被诱导)、小亚基RUBISCO基因(在光合作用组织对光反应时被诱导)、马铃薯块茎中高表达的Patatin基因、单子叶和双子叶植物的肌动蛋白和遍在蛋白基因的启动子，单子叶和双子叶植物的甘油醛脱氢酶(GAPDH)的启动子、椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)和19S(CaMV19S)启动子，含有翻译增强子(TMVω元件)的35SCaMV启动子、胭脂氨酸合酶(NOS)启动子，章鱼氨酸合酶(OCS)启动子、热休克蛋白80(hsp80)启动子、玉米的遍在蛋白启动子等等。此外，本发明人还发现了位于LpTFL1DNA编码序列上游的3.6kb长的LpTFL1启动子片段，它可被用在表达组件中作用启动子。因此，本发明的植物和植物细胞中，组成型、诱导型或发育调控型的启动子将被囊括。终止子定义为在转录单位的末端标志转录结束的DNA序列。该元件是含有聚腺苷化信号的3’非翻译序列，这个信号将引起原初转录本的3’端多腺苷酸加尾。上述序列可以从，如真菌、细菌、动物或植物中获得。特别适合用于本发明的核苷酸序列和DNA构建体的终止子的实例包括，如根瘤农杆菌的胭脂氨酸合酶聚腺苷酸化信号、CaMV的35s聚腺苷酸化信号、章鱼氨酸合酶聚腺苷酸化信号、玉米的玉米醇溶蛋白的聚腺苷酸化信号和那些可在质粒中发现的，如pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies，Inc.，NewHaven，CT)、pTricHis(Invitrogen，LaJolla，CA)，和杆状病毒表达载体，如从AcMNPV(Autographicacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)基因组来源的载体。一个杆状病毒/昆虫细胞系统的例子是pVI11392/sf21细胞(Invitrogen，LaJolla，CA)。因而，本发明进一步提供了表达组件，含有与编码LpTFL1或其功能活性变体的DNA编码序列可操作连接的启动子和终止子。重组产生的植物LpTFL1蛋白或其功能活性片段能被用多种标准技术所分离和纯化。具体的技术的应用将决定于所用的生物体，是否LpTFL1蛋白或其功能片段是设计为分泌的，和其他一些本领域所熟知的因素(参考如Ausubel，F等编著的“CurrentProtocolsinMolecularBiology”的第十六章，JohnWiley和Sons，Inc.1994)。因此，本发明还提供了重组生产LpTFL1或其功能活性片段。具体地，本发明涉及在宿主生物体中产生有LpTFL1活性蛋白的方法，包括(a)插入编码有LpTFL1活性的蛋白的DNA序列到宿主细胞中；(b)在适当的培养基中培养所转化的宿主细胞；(c)表达所述的DNA序列而产生所述蛋白；和(d)从所转化的细胞或培养基或两者，分离并纯化蛋白产物。克隆和表达重组的LpTFL1多肽片段或其功能活性片段有助于生产抗LpTFL1的抗体和其他片段(特别是单克隆抗体)，进而有助于评估重组LpTFL1多肽或其功能活性片段的体外和体内的生物学活性。这些抗体也可用于天然LpTFL1多肽的诊断测试。本发明另一方面涉及减少或防止单子叶植物开花的方法和材料。因此，一方面，本发明提供了显著减少或基本防止单子叶植物开花的方法，这个方法包括在单子叶植物中从包含如图2所示的核苷酸序列或其片段、衍生物或同源序列的分离多核苷酸片段表达多肽。本发明另一方面提供了显著减少或基本防止单子叶植物开花的方法，这个方法包括表达分离的具有如图4所示的氨基酸序列的多肽或其功能活性片段、衍生物和同源物。本发明也提供了显著减少或基本防止单子叶植物开花的方法，这个方法包括从分离自其它植物的多核苷酸片段或其片段表达多肽，所述多核苷酸片段包含能在严格或中等严格条件下与本发明的分离的多核苷酸片段或其片段的核苷酸序列杂交的多核苷酸互补的相似核苷酸序列。本发明还提供了显著减少或基本防止单子叶植物开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，这个多核苷酸片段包含合成的或人工的并与在严格或中等严格条件下与以上公开的核苷酸序列或其片段杂交的核苷酸序列互补的相似的核苷酸序列。另外，本发明提供了减少或基本防止单子叶植物干花的方法，该方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，所述的多核苷酸片段包含选自图3所示的碱基1到912、碱基1到1624、碱基-78到1242、碱基-78到1624及所有碱基的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了具有如图3所示的碱基-3600到-1的核苷酸序列或其片段或衍生物的多核苷酸片段，该多核苷酸片段可在诱导开花的条件下上调基因在单子叶植物顶尖和叶片中的表达。本发明还提供了显著减少或基本防止单子叶植物开花的方法，这个方法包括在植物宿主细胞中插入表达元件，这个表达组件包含启动子和图2所述的核苷酸序列或其片段或衍生物，上述转化了的宿主细胞在合适的培养基上生长，表达所述DNA序列而产生所述蛋白，这里所述的表达蛋白基本减少和/或防止所述植物开花。在其他方面，本发明涉及减少或防止植物开花的方法和材料。因而，在一方面，本发明提供了显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括在植物中从包含图2所示的核苷酸序列或其片段、衍生物或同源物的分离的多核苷酸片段表达多肽。这个核苷酸序列代表了从多年生黑麦草中分离的基因序列，在这里称为“LpTFL1”。另一方面，本发明提供了一个显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括表达具有如图4所示氨基酸序列的分离的多肽或其功能活性片段、衍生物或同源物。这个分离的多肽是由图2所示分离的多核苷酸片段或其片段、衍生物或同源物所编码。本发明也提供了显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，这些多核苷酸包含来自其他植物的、可以与在此公布的分离的多核苷酸片段或其片段的核苷酸序列在严格或中等严格的条件下杂交的序列互补的、相似的核苷酸序列或其片段。用于本发明包含相似核苷酸序列的分离多核苷酸片段可分离自任何植物，包括单子叶和双子叶植物，特别是农业重要的植物种类，包括但不限于那些属于禾本科的作物，也包括大豆、马铃薯、油菜、向日葵、苜蓿、甘蔗和棉花；或草本植物，如茴芹、罗勒、月桂、马槟榔、蒿、辣椒、芹菜、山萝卜、细香葱、芫荽、枯茗、莳萝、茴香、大蒜、山葵、韭葱、蜜蜂花、甘草、马珠草、薄荷、牛至、欧芹、迷迭香、芝麻、龙蒿和百里香，或水果和蔬菜，如香蕉、黑莓、蓝莓、草莓和悬钩子、香瓜、胡萝卜、花椰菜、咖啡、黄瓜、茄子、葡萄、蜜瓜、莴苣、芒果、洋葱、木瓜、豌豆、胡椒、菠萝、菠菜、南瓜、甜玉米、烟草、番茄、西瓜；蔷薇科水果(如苹果、桃子、梨、樱桃、李子)，和十字花科蔬菜(如椰菜、甘蓝、花椰菜、芽甘蓝、甜菜、大头菜)。这些同源序列也可能来自木本植物，如桉树、橡树、松树和杨树。这些植物也可进一步是一年生、二年生或多年生的。本发明还提供了明显减少或基本防止植物开花的方法，其包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，所述多核苷酸片段包含合成的或人工的、并与在严格或中度严格条件下与上面公开的核苷酸序列或其片段杂交的核苷酸序列互补的相似的核苷酸序列。此外，本发明提供了一个显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括从分离的多核苷酸片段表达多肽，该多核苷酸片段包含选自如图3所示的碱基1到912、碱基1到1624、碱基-78到912、碱基-78到1242、碱基-78到1624及所有碱基的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了具有如图3所示的碱基-3600到-1的核苷酸序列或其片段或衍生物的多核苷酸片段，用于在导致开花的条件下上调基因在植物顶尖和叶片中的表达。本发明还提供了显著减少或基本防止植物开花的方法，这个方法包括在植物宿主细胞中插入一个表达组件，这个表达组件包含启动子和如图2所示的核苷酸序列或其片段或其衍生物，在适合的培养基中培养所述转化的宿主细胞，表达所述的DNA序列而产生所述的蛋白，并且其中所述表达的蛋白基本减少和/或防止所述植物开花。启动子可能是，譬如，单子叶和双子叶植物的肌动蛋白和遍在蛋白的启动子、单子叶和双子叶植物的甘油醛脱氢酶(GAPBH)的启动子、椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)和19S(CaMV19S)启动子，35S启动子含有翻译增强因子(TMVω元件)、胭脂氨酸合酶(NOS)启动子、章鱼氨酸合酶(OCS)启动子。开花抑制子蛋白的表达可能仅在一个特定的时期，如有限的几个季节需要。因此，本发明的多核苷酸可包含于一个可控的表达组件中，其中这个相关多核苷酸的表达可被可控的信号诱导或减低。如做到这一点，开花将能被抑制，或被解除抑制，植物进而开花。本发明的另一方面提供了转基因植物，其中在这些植物细胞中，LpTFL1的开花抑制子活性已被显著降低或基本防止。这些植物可能是例如单子叶或双子叶植物，并可能是一年生、二年生或多年生植物。本发明所的DNA构建体和核苷酸序列可通过本领域已知的多种方式转化单子叶和双子叶植物细胞。如微粒轰击和农杆菌介导的胚性愈伤组织的转化是产生该转基因单子叶植物的可选方法(Vasil(1994)；Tingay等(1997)；Hiei等(1994))。在许多情况下，转化的植物细胞被培养而再生完整的植株，其随后繁殖产生遗传修饰的植物的后代。本发明的详细描述本发明这些和其它方面将只通过实例，并结合所附的图加以描述。其中图1展示了多年生黑麦草和拟南芥的形态比较。(a)黑麦草的营养期的顶尖拥有紧密的SAM和半圆形的突起，其随后将发展成叶子和分蘖。它位于基冠上，被正在发育的叶片所包围。所示比例线条＝1.0毫米。(b)黑麦草的花序由交互附着在主轴上(花序轴)的小穗组成。每个小穗有3到10朵花。所示比例线条＝1.0毫米。(c)黑麦草和拟南芥的示意图。在营养生长过程中，黑麦草和拟南芥的SAM产生间距非常小的丛生叶。在转向花期后，这两种植物的SAM都伸长(抽苔(bolt))，花器官(圆圈)沿着主轴产生。在两种植物中，次生茎都从苞叶的叶腋产生。在野生型拟南芥中，花按向顶的顺序成熟，SAM无限生长(箭头)，然而在tfl1突变体中，SAM和次生茎在花中终止。与tfl1突变体相似，黑麦草SAM和次生茎也在花中终止。黑麦草花序的花成熟是向基的，所有在顶尖以下形成的次生茎也能长出聚伞状的一系列花。颈圈(collar)是叶片上的叶片与茎相接处一个特殊的分生组织区(黑圈)。图示一个放大了的小花(重绘自K.Esau，种子植物解剖学(第二版)，Wiley和Sons，NewYork，1977)。每个小花由四轮器官组成。最外一轮是内稃和外稃，包围着浆片(第二轮)，三个雄蕊(第三轮)和子房(第四轮)，子房可被看作合心皮的，由两个或三个形成子房的心皮组成(C)。图2展示了LpTFL1基因的cDNA序列。图3展示了LpTFL1基因的基因组序列(碱基-78到1624，和其上游启动子区(碱基-3600到-1))。图4展示了来自图2的多核苷酸序列的多肽序列。图5展示了LpTFL1基因组结构，及推导蛋白与其他植物PEBP的相似性。(A)上面的线条说明这个基因的基因组结构，包括非翻译区(黑方框)和翻译区(白方框)。用RT-PCR的方法，从黑麦草分离了一个180碱基的DNA片段。(B)LpTFL1(索引号AF316419)的推导蛋白序列与TFL1的(Bradley等，1997；Ohshima等，1997)、CEN(Bradley等，1996)、SP(Pnueli等，1998)、BNTFL1-1和BNTFL1-3(Mimida等，1999)、CET1、CET2和CET4(Amaya等，1999)、FDR1和FDR2(索引号分别是AAD42896和AAD42895)，和FT(Kardailsky等，1999；Kobayashi等，1999)的比较。CLUSTALW程序被用来完成这个序列对比和推定的距离树。相同残基被涂黑。虚线代表这个程序为获得最大的对比而引入的缺口。黑色箭头表示在所有的种类中相同的内含子的位置。白色的箭头所示的氨基酸是在结晶学研究中发现的配体结合位点(Banfield和Brady，2000)。星号所示在拟南芥(Bradley等，1997；Ohshima等，1997)和番茄(Pnueli等，1998)中发现点突变的氨基酸。(C)不同植物PEBP的距离树。水平线的长度和两个预测蛋白序列之间的相似性成比例的。图6展示了实时定量RT-PCR所检测的LpTFL1mRNA在不同组织中的表达水平。来自11种不同组织样品的每种的5微克RNA被用于分析，这11种样品是非诱导(对照)的、12个星期春化和5星期长日照(LD)诱导的植物的根、茎、叶、花以及来自对照植物6和12星期春化处理的植物，5周长日照诱导的植物的顶尖。组成型表达的甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)mRNA的水平也被同时测量，LpTFL1mRNA在每个样品种的量通过GAPDH的量来标准化。图7展示了UBI-LpTFL1显著地改变了拟南芥的营养生长期的持续时间。(A)，原动转化子(1-30道)和野生型植物(WT)RNA凝胶印迹分析。来自丛生叶的15微克RNA被用于印迹，用LpTFL1cDNA探针探测。根据DNA凝胶印迹分析，转基因植株品系5、16、29和30具有单拷贝插入(结果未示)；品系2、7、9和11不开花。(B)，tfl11-14突变体、野生型和UBI::LpTFL1(品系17)植株的AP1和ACTIN的表达水平，通过对每种植株来的5微克RNA进行RT-PCR检测。(C)，tfl突变体、互补的突变体(tfl1*)、野生型(WT)和UBI::LpTFL1原初转化子(A-D组)在主茎上产生的茎生叶片数。每个柱代表在特定组内的植株的平均值。在柱上方的数字表明从发芽到开第一朵花的天数。这些植物按开花时间分组A≥75天；B≥100天；C≥150天；D不开花(NF)。各组植株的数量是tfl，6；tf1*，6；WT，6；A，6；B，13；C，5和D，5。图8展示了UBI::LpTFL1对拟南芥形态的影响。(A)UBI::LpTFL1的原初转化子、品系1和品系2(右手侧)显示了与一个月开花的野生型植株(左侧)相比在发芽后4个月后延长的营养生长以及至少第四级的(fourthorder)分枝。品系2(中间)在生长7个月后还不开花。(B)在大多数UBI::LpTFL1的拟南芥的SAM是紧密的、充满了叶原基并被表皮毛状体覆盖。(C)和(D)表示UBI::LpTFL1的主茎最上层茎生叶近轴表面的表皮毛状体分布(C)，与相似年龄的野生型茎生叶比较(D)。(E)在UBI:LpTFL1中布满表皮毛状体的叶状茎，在通常是上层合生花序的花的位置出现。图9展示通过PCR，分析了未被转化(CON)和basta抗性品系(见数字)的基因组DNA中LpTFL1转基因的整合情况。引物LPO与引物MS8组合使用，从而扩增一个560碱基的片段。大约0.3微克基因组DNA被用于每个反应。图10展示了非转化(CON)和转基因的UBI::LpTFL1的黑麦草品系的花序数目，并与LpTFL1mRNA的相对水平相比较(黑柱，第二Y轴)。所有LpTFL1mRNA的水平都相对于LpACTIN的水平，最高的检测到的值被设定为100(品系36)。在图下的水平柱代表被检测到的LpTFL1已稳定整合到基因组中的阳性品系。图11展示了非转基因和转基因的紫羊茅的基因组DNA的DNA印迹杂交分析。10-30微克的DNA样品用HinDIII(A)或EcoRI(B)酶切，用0.4kb的含有遍在蛋白的内含子的3’端和LpTFL15’端编码区的片段(MS56-LP4REV，见表1)探测。HinDIII可以从pLpTFL1切出一个2.8kb含有整个LpTFL1组件(箭头)的片段。在pLpTFL1上只有一个EcoRI切点，这是一个5.5kb的质粒(箭头)。图12展示了所转基因的水平和转基因UBI::LpTFL1紫羊茅品系的表型。A.品系(A-N)非转化的(CON)和转化的对照在第一季(灰色柱)和第二季(带格子柱)每个克隆所产生的穗状花序的数量，并与LpTFL1mRNA的相对水平(黑色柱，第二Y轴)相比较。白色柱代表相应于截短的LpTEL1mRNA的转录本的水平。B.在第一季测量的平均基长(灰色柱)，并与LpTFL1mRNA水平比较(黑色柱，第二Y轴)。误差线条代表每个品系平均值的标准方差。所有LpTFL1mRNA的水平都是相对于LpACTIN的水平，所检测到最高水平被设定为100(品系J)。图13展示了不同UBI::LpTFL1品系原初转化子的RNA凝胶印迹分析。每个品系的2.5微克polyA+mRNA被印迹，并用200bp的LpTFL1或450bp的LpACTINcDNA探针探测。所有这些品系已被PCR证实为转基因的阳性(最下一列)，PCR用可扩增遍在蛋白的3’端最后75个碱基和LpTFL1cDNA350碱基的425碱基的片段的引物MS56和Lp4REV。图14展示了四百天的紫羊茅野生型(CON)、转基因对照(BAR)和UBI:LpTFL1品系(A-M)的开花和未开花植株。每个品系代表一个单独的转基因事件。每个图片下的黑色柱代表相对于未转化的对照植株(其转录水平被设定为1.0)的LpTFL1的转录水平。白色的柱代表相应于过量表达的截短的LpTFL1的转录水平的水平。图15展示了野生型(CON1)和UBI::LpTFL1转基因品系A和C的羊茅的圆锥花序表型，品系A和C分别过表达一个截短的和完整的LpTFL1转录本。比例尺线条＝1cm。图16是一个表，表明许多转化LpTFL1的黑麦草转基因品系的转化效率和开花活性。图17展示了PCR分析UBI::LpTFL1转基因紫羊茅品系的转基因整合。实施例部分1，在拟南芥中表达LpTFL1材料和方法植物生长条件多年生黑麦草(Loliumperenne)植株(克隆F6，DLF-TRIFOLIUM)在日温21℃，夜温18℃光照温室土壤中生长。当原初诱导(春化)时，植物置于温度为或低于5℃生长箱中生长至少12个星期。在春化过程中，光照减少到8小时/天。春化后，植物在16小时光照，日温22℃，夜温18℃的条件下生长，进行第二次诱导。做RNA分析时，野生型的植株在春化前或6个星期后，以及第二次诱导14和28天后被采集，分生组织被切下。从来自其它组织如叶、茎、种子和根的样品也被收集用于表达分析。拟南芥的种子在4℃下分层(stratified)2到3天，然后于日温22℃，夜温18℃的生长箱的土壤中生长。最初2个星期植物在SD条件下生长(8小时光照/天)，然后转移到LD条件(每天16小时光照)。在拟南芥的生长进程(timecourse)试验中，在植物开始抽苔时，丛生叶被计数，叶节数目是从最基部的茎生叶一直到最上部临近花序的叶之间计数。从发芽到产生第一个花形结构的天数也被记录。筛选cDNA和基因组文库为了从黑麦草中分离植物PEBP基因，设计了一系列和拟南芥TFL1、金鱼草CEN和水稻EST(RICR2918A，登录号428842)部分同源的引物。引物RY2N(5’-GGTTATGACAGACCCAGATGTG-3’)和RY4V(5’-CGAACCTGTGGATACCAATG-3’)被用来通过RT-PCR的方法扩增一个180bp的片段。用于RT-PCR的RNA用FastRNA，GREENKitRNA分离系统(Biol01，Calsbad，CA)制备。这180bp的片段被用来筛选黑麦草花序来源的cDNA文库(Stratagene，LaJolla，CA)以获得全长cDNA。在60℃的中等严格条件下筛选了大约800,000个重组子，即在60℃，2×SSC(0.3M氯化钠和0.1M柠檬酸钠，pH7.4)和0.1％SDS(w/v)中清洗。得到三个阳性克隆，通过在体切除的方法，从单个噬菌斑中分离质粒。所有cDNA克隆都被测序，都含有相同的与TFL1和CEN相似的序列，这些序列被称为黑麦草TFL1样序列，LpTFL1(GenBank登录号AF316419)。一个从部分Sau3A降解的黑麦草DNA制备的λEMBL35P6/T7基因组文库(Clontech，PaloAlto.CA)被用来筛选TFL1样基因。用全长LpTFL1cDNA克隆，在中等严格的条件下(如上所述)筛选了大约1,000,000个重组子。九个阳性克隆被分离，用BamHI、SalI、XbaI和SacI去酶切这些λDNA克隆，发现了三种不同的克隆。这些被部分测序，所有三种克隆都含有相同的LpTFL1序列上游4.0kb和下游2.0kb的序列。这些基因组克隆的外显子以及5’和3’非翻译区的序列与LpTFL1相同。DNA测序是用ABIPrismsystem(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)完成的，序列分析和对比是用GeneCodesSequencer软件，version4.02完成的。RNA/DNA分析为了检测黑麦草在不同阶段、不同器官中LpTFL1mRNA水平，从每个组织样品中的5微克总RNA中分离poly-(A)+mRNA，所有的这些mRNA被用于反转录。两个内部引物，INS5(5’-CACATTGGTTATGACGGACC-3’)和INS3(5’-CTCCCCCCCAAATGAAGC-3’)，在随后的实时定量PCR反应中被用来从第一链cDNA模板扩增一个200bp的LpTFL1片段。PCR产物的扩增和监控使用LightCyclerTM系统进行的。在这个系统中，添加荧光颜料SYBRgreen1颜料到反应混合液，从而便于在每个PCR循环后直接测量双链DNA。在本试验中，在十一个不同组织样品(包括未诱导(对照)植物、12星期春化和5个星期长日照(LD)诱导的植物的花、茎、根、叶，和来自6和12个星期春化以及5星期LD诱导的植物的顶尖)中分析LpTFL1表达水平。1微升每个RT反应被用作PCR反应的模板，同时还包括一系列稀释的含LpTFL1和LpGAPDH的质粒(100、10、1和0.1pg)。为了相对于每个样品原初模板量标准化PCR结果，以同样样品进行一个引物为GAP5(5’-CAAGGACTGGAGAGGTGG-3’)和GAP3(5’-TTGACTCGTTGTCGTACC-3’)的平行PCR反应。这两个引物可扩增一个380bp的LpGAPDH片段。用标准的RNA凝胶印迹分析检测转化的拟南芥中LpTFL1RNA的水平。UBI:LpTFL1的构建和拟南芥野生型和tfl1突变体的转化用引物B0(5’-GGATCCCCATGTCTAGGTCTGTGGAG-3’)和B550(5’-GGGATCCCACAACTGGGATAGCCA-3’)以及重组pfu聚合酶扩增LpTFL1cDNA的编码区。这个片段被平端连接到含有玉米遍在蛋白的启动子，一个外显子内含子区，和NOS终止子的载体pAHC27(Christensen和Quail，1996)中。整个组件(UBI::EXintron::LpTFL1::NOS)从质粒中用HindII和EcoRI切割下来，再连接到具BASTA抗性的双元载体pCAMBIA3300(Jefferson，Australia)的EcoRI-HindII位点而产生pCAMLpTFL1。用如Clough和Bent(1998)所述的蘸花法(Floraldip)，用含有pCAMLpTFL1的根瘤农杆菌菌株GV3101(Koncz和Schell，1986)转化拟南芥(Columbia和tfl1-14突变体)。结果从多年生黑麦草中分离植物PEBP基因用根据拟南芥TFL1、金鱼草CEN、番茄SP和相关的水稻表达性序列标签(EST；图5A)的序列对比设计的引物，通过反转录PCR(RT-PCR)从黑麦草花序的mRNA中扩增了LpTFL1。这个片段被用来在中等严格性的条件下，从黑麦草花的cDNA文库中筛选植物PEBP基因(LpTFL1基因)。得到一个全长的cDNA。这个cDNA的编码区表现出和两个水稻基因FDR2和FDR1有87％和85％的序列相同性，分别与TFL1和CEN有67％和64％的相同性。被用于设计LpTFL1特异引物的水稻EST区和LpTFL1有86％相同性。在蛋白水平上，LpTFL1与相应的FDR2和FDR1蛋白分别有91％和86％相同性，与TFL1和CEN1则有71％和68％相同性(图5B)。LpTFL1cDNA编码区与FT序列有60％相同性，蛋白则有56％相同性。和在数据库中其他的植物PEBP相比较，发现LpTFL1与那两个水稻蛋白和烟草的CET1分在一组(图5C)。Banfield和Brady(2000)已确定了CEN蛋白的三维结构，发现了功能性配体结合位点必需的氨基酸。通过突变也发现了一些其它对蛋白功能重要的氨基酸(Bradley等，1997；Ohishima等，1997；Pnueli等，1998)(图5B)。在这些11个对功能起重要作用的氨基酸中，LpTFL1只在一个位点(110)与CEN不同，以丝氨酸代替了甲硫氨酸。在中等严格性条件下，用全长LpTFL1cDNA片段作为探针的DNA印迹分析被用来分析植物PEBP基因在多年生黑麦草中的数量。结果表明，在黑麦草中有两个植物PEBP基因(结果未示)。为了得到更多有关LpTFL1基因的信息，我们用全长LpTFL1cDNA克隆筛选了黑麦草的基因组文库。三个独立的基因组克隆被获得和测序。它们都有相同的编码同一开放读框的DNA序列，该序列与LpTFL1cDNA完全相符。LpTFL1基因组序列含有三个分别为100、208和82kb的内含子，在转录起始位点上游大约3.6kb的区域没有发现可能的基因编码的开放读框，这是LpTFL1的启动子。LpTFL1基因在多年生黑麦草与TFL1在拟南芥中表达方式的不同为了检测LpTFL1信使在黑麦草中的表达方式，我们用LightCyclerTM实时定量PCR测定了不同组织中的mRNA水平。为了比较不同样品，PCR中算得的LpTFL1模板浓度必须为LpGAPDH模板浓度所标准化(表1)。我们认为LpGAPDH在任何时期任何细胞中都组成型的表达。LpTFL1信使能在所有供试组织中检测到(图6)。在营养期的黑麦草中，不论在顶尖还是叶子中，LpTFL1都以低水平表达。在春化过程中，顶尖的LpTFL1mRNA的表达被微微上调，但在叶子还保持很低的水平。然而，在随后的LD处理的过程中，LpTFL1mRNA的表达水平在顶尖显著增加(12.6倍)，在叶子中增加的更多(27.8倍)。最多的表达在根中。LD诱导的黑麦草中的LpTFL1表达的上调还没在任何已经鉴定的植物PEBP上报道过，在分生组织区以外的植物PEBP的表达也只在烟草中，用RT-PCR检测到过(Bradley等，1996；Amaya等，1999)。LpTFL1延缓或阻止拟南芥的开花黑麦草中两个植物PEBP基因之一的LpTFL1，与拟南芥TFL1具有相似的功能，但LpTFL1的功能显著增强。我们用玉米遍在蛋白的启动子(Christensen和Quail，1996)去驱动LpTFL1编码区在拟南芥中的过量表达。在转化UBI::LpTFL1后，获得了33个具有BASTA抗性的拟南芥植株。所有这些转化子都具有显著的营养生长特性，与野生型相比开花大大延缓(图4和图5)。当野生型植物在被从SD移到LD光照条件下后10天抽苔，最早开花的UBI::LpTFL1植株还需要另外一个月再抽苔。三个月后，超过一半的植株不产生任何花(图7C)。LpTFL1的过量表达影响拟南芥的营养期和花序早期，表现在抽苔前后产生增多的节数。在营养期，野生型拟南芥植株产生16±1.9个丛生叶，而UBI::LpTFL1植株在同样的条件下生长产生33.9±8.9个丛生叶(数据未示)。在植物抽苔后，UBI::LpTFL1植株开花之前在主茎上产生26±14.3个茎生叶，相对而言，野生型植株只产生4.8±0.4个茎生叶(图7C)。因此，就开花之前的时间和产生节数而言，大多数UBI::LpTFL1植株香起来在花序早期被抑制。椰菜花叶病毒35S(CaMV)启动子驱动的TFL1在拟南芥中的过量表达已被报道(Ratcliffe等，1998)。然而，当在连续光照下生长，35S::LpTFL1转化植株与UBI::LpTFL1转化植株相比，只产生后者三分之二数量的丛生叶和其一半的茎生叶(Ratcliffe等，1998)。五个UBI::LpTFL1植株(品系2、7、9、11和13)在其整个生命周期维持花序早期，在衰老和死亡之前(七个月后)不能产生花。这是一个非常特殊的发现，因为在LD诱导条件下生长的35S::TFL1转化的拟南芥没有发现不开花的个体。只有当35S::TFL1拟南芥植株在SD非诱导的条件下，有少数品系，能维持不开花(Ratcliffe等，1998)。除了主要的SAM外，转化了UBI::LpTFL1的拟南芥植株还表现出不正常的腋生的分生组织的发育。在茎生叶叶腋、带有发育中的花的同生花序的发育，常在野生型拟南芥中见到，可很少在UBI::LpTFL1植株上见到。然而在花器官形成的位置产生一个叶状茎，从而导致多分枝的丛生的极端表现型(图8A)。三轮分支(third-orderbranching)是UBI::LpTFL1植株一个共同的特性，四轮分支也可在个别植株上见到(图8A，右边植物)。UBI::LpTFL1植株的SAM持续产生一系列重复的叶子，大多数这些叶子都有高密度的表皮毛状体(图8B)。在茎生叶上表皮毛状体的分布总体上远比野生型的植株多(图8C和8D)。在拟南芥上与TFL1过量表达相关的表皮毛状体产生的增加先前没有报道过。近轴面表皮毛状体的消失被认为是幼嫩消失的标记(Chian和Sussex，1996；Telfer等，1997)，持续的表皮毛状体的产生因而必然反映UBI::LpTFL1植株营养生长本质。和野生型相比，大多数UBI::LpTFL1植株在主茎上，也在同生花序上产生显著增多的和增长的节间。和野生型相反，UBI::LpTFL1植株的最上一层没有外包茎生叶的同生花序不是由通常的单生花组成，而代之以叶状的茎(图8E)。根据开花所需时间，这些转化子可以分为四类(A-D)，它们的表型从延迟开花(图7C，A组)到不开花(图7C，D组)。RNA凝胶印迹分析显示大多数UBI::LpTFL1植株有很强的LpTFL1的表达(图7A，1-31道)，总之，UBI::LpTFL1植株表型的强弱与相应植株中LpTFL1的表达水平正相关，不开花品系2、7、9、11和13中LpTFL1的表达水平是所测试的所有品系中最高的，LpTFL1的表达水平反过来又与根据DNA凝胶分析确定的插入到基因组中基因拷贝数正相关(数据未示)。在单拷贝插入的植株中(图7A，品系5、16、29和30)，LpTFL1RNA的水平比其他品系低，结果它们的表型也较弱，但是开花所需的时间还是显著长于野生型(图7C，A组)。三个具BASTA抗性的植株，通过凝胶印迹分析不能检测到LpTFL1的表达，表型与野生型看起来相似，但比野生型晚10天开花(结果未示)。在tfl1-14突变体中过量表达LpTFL1为了进一步确定LpTFL1的功能特性，我们想了解LpTFL1是否能对拟南芥的tfl1-14强突变位点进行功能互补。在这个突变体内，一个C到T的突变导致69位的苏氨酸变为异亮氨酸(图5B)。tfl1-14突变体有一个短的营养生长期和较少节的较低植株，从丛生叶的叶腋分生组织产生的较多的花序和一个有限型生长方式(Bradley等，1997；Ohshima等，1997)。用于转化拟南芥野生型的构建体也被用于转化tfl1-14突变体。经过选择双元质粒从每个突变品系中获得了100多个独立的UBI::LpTFL1-tfl1-14原初转化子。这些植株表现出各种表型从野生型到如UBI::LpTFL1转化的野生型植株上所见的营养生长的表型。平均(只就最早开花的六个植株)这些UBI::LpTFL1-tfl1-14植株在主茎上产生15.2±3.5个茎生叶，开花晚于tfl1-1433天，晚于野生型23天(图7C)。所有UBI::LpTFL1-tfl1-14植株都无限生长，在tfl1-14突变体上总见的顶生花和丛生花序在转化子上从未见到。因此。LpTFL1在形态上而言拯救了拟南芥tfl1-14突变体，并且进一步延长了营养期表现。讨论多年生黑麦草是具有很高农业价值的牧草，因为它是低投入、多年生，广泛用于牛的饲养。一个作物改良的主要目标是控制生殖生长和花的发育。在这个物种上相关的分子水平的信息还非常有限。我们从多年生黑麦草分离了一个植物PEBP基因。这个基因表明是一个开花的抑制子，并参与了控制叶腋分生组织特性。黑麦草的LpTFL1是植物PEBP家族的一个新成员多年生黑麦草PEBP基因，LpTFL1编码一个蛋白，该蛋白与一组结构类似哺乳动物PEBP的植物蛋白高度同源。根据这些相似性，植物的PEBP也可能类似哺乳动物PEBP，参与调节信号传导(Yeung等，1999；Banfield和Brady，2000)。两个和LpTFL1最相似的蛋白是水稻的FDR2和FDR1，分别是91％和86％相同性。通过与来自多种植物的PEBP以及拟南芥的FT的多元比较，LpTFL1与这两个水稻蛋白以及一个烟草类CEN蛋白CET1分在一组。没有FDR2/FDR1在水稻中表达方式和功能的报道，对CET1来说，其表达虽被报道可在营养生长期和花序期茎干中检测到，但只能通过RT-PCR的方法(Amaya等，1999)。与拟南芥的PEBP序列比较，LpTFL1与TFL1有71％相同性，与FT有56％相同性与TFL1有56％相同性的FT也属于植物PEBP家族。然而，与TFL1相反，FT已被表明可在拟南芥中介导开花诱导信号(Kardailsky等，199；Kobayashi等，1999)。在这个过程中，FT和介导LD诱导途径的CONSTANS(CO)平行并在其影响下起作用(Samach等，2000)。LpTFL1与一个水稻克隆(nbxb0035E07r)上的部分FT样区域有50％相同性，虽然DNA印迹分析表明存在另一个LpTFL1样基因，但是还没有与这个水稻部分FT样序列更高度同源的黑麦草FT样DNA被发现。LpTFL1在拟南芥中的过量表达导致显著延迟的开花和非常显著的大的和丛生表型，说明LpTFL1更类似TFL1而不是FT。尽管不同植物PEBP之间具很高的同源程度，不同植物中这些蛋白的组成型表达却往往产生不同的表型。LpTFL1过量表达对拟南芥的花期转变和植株结构的巨大影响远大于以前所报道的在拟南芥中的TFL1的过量表达(Ratcliff等，1998)。因此可能推测在我们的研究中观察到的这种更明显的表型是由于在我们研究中所用的玉米遍在蛋白的启动子在拟南芥中强于35SCaMV启动子。然而，这就需要单子叶植物的遍在蛋白的启动子在双子叶植物中有一个前所未见的非常强的活性。我们认为我们看到的现象是由于LpTFL1与TFL1在蛋白的序列和构象上的不同。据报道，在烟草中过量表达CEN，可显著延缓向花期转变，也改变植株的结构(Amaya等，1999)；相反，过量表达TFL1对烟草没有影响(Amaya等，1999)。这些结果和我们的结果结合在一起，表明植物PEBP蛋白之间蛋白序列的不同，可能是导致在过量表达的植株上所见的差异的原因。在植物PEBP序列中有11个氨基酸残基到目前为止，根据结晶学(Banfiled和Brady，2000)和突变(Brady等，1997；Ohshima等，1997；Pnueli等，1998)已被证明对蛋白功能至关重要(图5B)。在这些残基中，LpTFL1只与该共有序列在一个位点(110)不同，这个位点也是在不同物种中变化最大的氨基酸。有趣的是，在110位点上的氨基酸残基的变化与ClustalW序列对比所分的植物PEBP组相匹配(除了FT)。包含TFL1，BNTFL1-1和BNTFL1-3的一组，在这个位点上有亮氨酸，另一个包含CEN、CET2、CET4和SP的组有甲硫氨酸；第三个含LpTFL1、FDR2、FDR1和CET1的组在这个位点上有丝氨酸。非常明显的设想，这个位点上的氨基酸的不同，可能与过量表达不同植物PEBP基因的植株的表型强弱差异相关。从而建议，BNTFL1/BNTFL1-3与TFL1一样，过量表达时对植物像烟草没有影响，过量表达CET1、FDR2/FDR1和LpTFL1一样，可能对，如拟南芥的物种的开花和植株结构造成很大的影响。未来在不同物种过量表达植物PEBP所得的结果将进一步澄清蛋白序列和对形态作用的关系。总体而言，我们的结果表明不同PEBP的作用不能为遗传多样性所解释，因为黑麦草对任何双子叶植物都比较远源的，但LpTFL1却在拟南芥上有强的不可置疑的作用。控制开花的转变拟南芥植物过量表达LpTFL1时明显的表型暗示在黑麦草中，LpTFL1也可控制分生组织特性和从营养生长期向生殖生长期的转化。在黑麦草中，LpTFL1信使可在从发芽到成熟的所有阶段检测到。在顶尖、在花序、也在叶子、茎和根，以及成熟的花发现了LpTFL1信使。然而，LpTFL1在黑麦草顶尖中的表达不是组成型的。LpTFL1的信使水平在开花诱导过程中有变化，当被12星期春化处理过后，其在SAM中被轻微诱导，紧接在长日照(LD)诱导期被强烈上调，直到小穗状的结构出现。没有想到的是，在LD诱导下的LpTFL1mRNA的上调在叶子中更高(大于25倍)。植物PEBP在LD诱导下，在叶中的上调表达以前还未被报道过，从而强烈的暗示，LpTFL1可能在SAM外发挥另外的作用。一些过量表达LpTFL1的植物在衰老之前从不开花。营养生长的，不开花的拟南芥植物可通过三个MADS盒基因AP1、CAULIFLOWER(CAL)和FRUTIFUL(FUL)的一起突变而获得(Ferrandiz等，2000)。ap1、cal、ful三重突变体的SAM被滞留在营养生长期和I1期之间，这样仅产生带叶腋分生组织的茎生叶，这种模式不断重复就在主花序上形成了“叶状的”花椰菜状结构(Ferrandiz等，2000)。类似的花椰菜状结构在我们的UBI::LpTFL1植株上未见到，因为这种分生组织的重复形成比较慢。然而，UBI::LpTFL1植株具有另外表型特征，叶子和SAM为浓密的表皮毛状体所覆盖(图8)。在拟南芥中，茎生叶向轴面表皮毛状体的消失与花的诱导紧密相关。支持这个理论，已发现tfl1加快拟南芥近轴面的表皮毛状体的消失(Telfer等，1997)。和这个理论相符，我们发现，拟南芥中植物PEBP的表达阻止了近轴面表皮毛状体的消失。就此标准，和这个三重突变体相比，UBI::LpTFL1具有更低的开花能力。在一个延长的营养期后，开花的UBI::LpTFL1植株可产生正常的花。这个观察表明，有延缓的，但是正常的花器官特性基因的表达。因此，LpTFL1的活性水平能随着时间消退或其他的因子克服LpTFL1的影响，从而保证了分生组织和花器官特性基因的转录。一个可能的因子是FT，FT能上调花分生组织特性基因如AP1和LFY的表达(Kobayashi等，1999；Samach等，2000)。一个决定多年生黑麦草植株结构的可能的分子机理多年生黑麦草和拟南芥代表两种不同的植株结构有限花序和无限花序。有关拟南芥的无限花序型生长的分子基础已被提出(Bradley等，1996，1997；Ratcliffe等，1998、1999)，其中认为无限花序的植株结构是与TFL1在SAM中央的表达相对应的。在SAM中央区域以及最上一层，TFL1的活性能阻止AP1和LFY的表达，从而阻止形成顶生花。在黑麦草中，LpTFL1信息存在于营养期的顶尖。当LD诱导时LpTFL1的表达被显著上调，这和在拟南芥中所见的当植物进入I1期时观察到TFL1表达的上调(Ratcliffe等，1999)相似。然而，除先前报道的植物PEBP以外，LpTFL1在LD诱导下在叶子中的表达被强烈上调。LpTFL1在黑麦草顶尖表达的细胞位置有待确定，但现在的结果表明，黑麦草的植株结构是由于LpTFL1在SAM中央的表达被限制于黑麦草顶尖的分生组织凸起(叶腋分生组织)和叶子的结果。对过量表达LpTFL1的转基因黑麦草的分析还在进行中，根据这里所述的结果，我们可以推测到以下LpTFL1介导的花期转化的植株结构的控制的情形在发芽后不久，LpTFL1就在顶尖的分生组织凸起中表达，从而确保营养器官如叶和分蘖的产生。在营养生长期，LpTFL1和其他一些开花抑制子，可能类似于FLC(Michaels和Amasino，1999)的表达被维持在基础水平，从而避免在冬季之前的过早开花。在冬季春化期，在顶尖LpTFL1水平轻微升高，反映植株开花能力的提高。随着春季温度的上升和光照的延长，顶尖的LpTFL1的表达被上调，从而促进在主轴上产生侧枝。以这种方式，产生尽可能多的小穗。LpTFL1的表达随后逐渐变得局限于营养组织，如叶、茎和根，在顶穗上最上端的种子产生后，黑麦植株草完成了它的生命周期。2，在多年生黑麦草中过量表达LpTFL1材料和方法多年生黑麦草的生长条件，基因组筛选和RNA/DNA分析都按以上实例1中所述方法进行，除了转基因黑麦草品系的叶子样品在第二诱导28天后采集。植物转化过量表达LpTFL1的载体以如下述的方式构建pUC19载体被PstI和EcoRI酶切后，再连接。然后pAHC27(Christensen和Quail)的含有玉米遍在蛋白的启动子，它的第一个内含子(Ubi1)，UidA基因和NOS终止子的组件被连接到这个改变了的pUC19的HindIII位点。UidA基因用SmaI和SstI消化从组件上切除，再用pfu打平SstI产生的末端，这个载体再重新连接。最后，LpTFL1cDNA(Tensen等，2001)的编码区再连接到这个载体的BamHI位点而产生pLpTFL1。pLpTFL1质粒与pAHC20(Christensen和Quail，1996)一起被导入多年生黑麦草，pAHC20带有Bar基因，从而能产生对除草剂BASTA的抗性。在微粒轰击中，采用了成熟胚或分生组织来源的高度胚性的愈伤组织。两个不同的黑麦草栽培品种(ACTION和TELSTAR)和一个繁殖的克隆(F6)作为产生愈伤组织的来源。分离的胚和分生组织在含有3％蔗糖、4mg/L2，4-D(2.4-dichlorophenoxyaceticacid)、100mg/L酪蛋白水解物以及0.3％(W/V)的gelrite(Kelco)的基于MS培养基(Murashige和Skoog，1962)的愈伤诱导培养基(CM)上，于23℃黑暗培养12-26个星期。愈伤组织每3个星期转移到新的CM培养基上继代培养。在轰击之前，要进行渗透预处理4个小时，通过把小块的愈伤组织(2-4mm)转移到添加了3％蔗糖，3mg/L2，4-D、0.25M山梨醇、0.25M甘露醇和0.3％(W/V)Gelrite的基于MS的固体培养基上。轰击采用颗粒流入基因枪(ParticleInflowGun)(Finer等，1992)，根据优化的Spangenberg等(1995)所述的方法进行，并略作改进轰击压力是8巴，300微克的0.6μm的金颗粒(Biorad)被0.6微克质粒DNA(pLpTFL1和pAHC20，2∶1的摩尔浓度比)根据Vain等，(1993)包被。第二天，愈伤组织被转移到含有2毫克/升bialaphos(MeijiSeikaKaishaLTD，Tokyo)的CM培养基上，在23℃，16小时光照条件下生长。每隔三个星期进一步筛选，直到获得健壮生长的愈伤组织。通过转移这些愈伤组织到不含生长激素的RM培养基(含3％蔗糖和2毫克/升的bialaphos的MS培养基)上，就可再生推定的转基因植株。生根的小苗转移到土中，在温室中长至成熟。筛选稳定的转化子推定的转基因植株，用补充有0.1％Tween20的含0.5％的BASTA(HoechstScheringAgrEroA/S，Germany)溶液喷两次(连续两天)。除草剂抗性的植株在一个星期后计数。PCR分析从原初转化子(T0代)叶子，用DNeasy96PlantKit(Qiagen)分离基因组DNA，用可以扩增一个560bp片段的引物LPO(5’-ATGTCTAGGTCTGTGGAGCCTC-3’)和引物MS8(5’-ACCGGCAACAGGATTCAATCT-3’)的PCR来确定的LpTFL1转基因的存在。大约0.3微克基因组DNA被用于每个反应。实时RT-PCR分析为检测在转基因黑麦草品系中LpTFL1mRNA的水平，poly-(A)+mRNA被从每个品系的一个个体中的大约100毫克的叶片组织的粗裂解物中分离。叶片材料在春化处理前被采集。20微升dynabeads(DYNAL)被用于每个mRNA的分离，所有的mRNA被用于反转录。一个LpTFL1引物，INS5’和一个NOS终止子引物MS8一起被用于随后的实时定量PCR反应，从所得第一链cDNA模板去扩增一个320bp的LpTFL1片段。PCR产物的扩增由Rotor-Gene(CorbettResearch)系统来完成和检测，在这个系统中，荧光颜料SYBRgreenI(SigmaChemicals)被加到反应混合物中，从而便可直接测量每个PCR循环后双链DNA。一微升反转录反应产物和一系列稀释的含LpTFL1和LpGAPDH的质粒(100、10、1和0.1pg)作为模板用于PCR反应。为了规范相对于每个样品初始模板量的PCR结果，进行用同样的样品的平行PCR，所用引物为能扩增一个380bpLpGAPDH片段的GAP5(5’-CAAGGACTGGAGAGGTGG-3’)和GAP3(5’-TTGACTCGTTGTCGTACC-3’)。结果LpTFL1的过量表达抑制多年生黑麦草开花通过微注射轰击转化，共得到了36个转基因黑麦草品系。所有品系都抗BASTA。再生自单一转基因愈伤(T0代)的植株被定义为一个“转基因品系”。因此，每个转基因品系可溯源自不同的组织培养物，代表独立的转化事件。用引物LPO和MS8(图9)对转基因黑麦草叶片DNA的PCR分析表明，LpTFL1整个编码区和NOS终止子存在于22个品系中，共转化效率是61％。在品系24中，PCR反应还扩增到了另外一个750bp的产物。如转基因尾靠尾形式整合到基因组中时，每个单一引物都可扩增出这个产物。或者，这表明，片段化的转基因DNA已分布到黑麦草的基因组中。在三个月的春化后，所有的转基因品系(包括那些被检测到没有LpTFL1转基因存在的品系，以及没转化的对照)都被转移到LD条件下进行开花诱导。在不同转化的品系间，花序的数目是不同的，而在不同栽培品种之间这种差异是最大的。这种差异也可在共转化效率上体现出来(图16)，反映了栽培品种对转化事件的反应有很大不同。F6具有最大的共转化效率(78％)，接着是ACTION(75％)和TELSTAR(54％)。在被测定的不含有LpTFL1转基因的植物中，F6也比另两个栽培品系TELSTAR(6.0±4.2)和ACTION(1.4±1.2)产生比较多的花(12.3±5.1)。TELSTAR和F6总体上看上去比ACTION健壮。尽管花序的数目不同，所有开花的品系，在五个星期LD后，都与对照同时开花(结果未示)。然而，有几个品系从不开花。在22个经PCR检测含有LpTFL1转基因的品系中的十个品系在开花季节(6个月)仍不开花，而在14个LpTFL1PCR检测阴性的品系中，只有两个不开花。用实时RT-PCR，我们测试了花序产生的减少是否与源自UBI::LpTFL1转基因的LpTFL1的表达水平相关。我们在22个PCR检测的阳性品系中的16个检测到LpTFL1转基因的表达(图10)。为了区分转基因和内源LpTFL1，在实时RT-PCR中使用了一个NOS终止子的引物与一个LpTFL1内部引物的组合。随后的分析表明，在收获时，叶中内源LpTFL1mRNA的水平比最低的检测到的LpTFL1转基因的mRNA水平还要低100倍(结果未示)。在几个品系中，检测到了非常高的转基因表达水平，当LpTFL1高水平表达时，我们可见到显著的UBI::LpTFL1转基因的作用。六个LpTFL1表达最高的品系中的五个不开花(31、32、34、35、36)，16个LpTFL1过量表达品系中的九个(23、26、27、29、31、32、34、35、36)在整个季节都不开花。LpTFL1的过量表达没有引起不同与野生型的任何其他形态变化。讨论在黑麦草中，LpTFL1信使可在从萌发到成熟所有时期检测到。也在顶尖、花序以及叶子、茎、根和成熟的花中发现。然而，LpTFL1在黑麦草顶尖的表达不是组成型的。LpTFL1信息在开花诱导过程中有所变化，LpTFL1的表达在12个星期春化后，在SAM中轻微上调，接着在长日照(LD)诱导期间被强烈的上调，直到小穗状的结构出现。意外的是，在长日照诱导期间，LpTFL1mRNA的上调在叶中更高(大于25倍)。长日照诱导期间，这种植物PEBP在叶中的大量上调先前未见报道，从而有力的暗示LpTFL1可能在SAM以外起着重要作用。开花转化(也就是，从营养生长向生殖生长转化)的控制已被广泛研究，特别是在拟南芥中，一系列关键的调节因子已被发现(见最近的综述，如Simpson等，1999)。关于这些调节因子的生物功能的知识主要来自突变体的研究，或来自在一年生植物如拟南芥、金鱼草或烟草中组成型表达这些基因的试验。前面的结果表明LpTFL1是一个一年生植物，如拟南芥的很强的开花抑制子(Jensen等，2001)。通过把在玉米遍在蛋白的启动子控制下的LpTFL1导入黑麦草，我们测试了是否LpTFL1的组成型表达能阻止或抑制植物开花。在36个得到的转基因品系中，22个被检测含有LpTFL1转基因。在这些PCR检测阳性的植株中，开花显著减少，10个品系(45％)在整个开花季节保持不开花。相对而言，在PCR检测阴性的14个品系中，只有2个品系(14％)是不开花的(图10)。LpTFL1的表达水平与从营养生长期向生殖生长期的控制紧密相连。然而，如在先前在拟南芥中见到的(Jensen等，2001)，转基因表达的水平与开花的时间(抽穗的时间(headingdate))不是线形相关的，这种开花控制多表现为花序的减少而表现出的抽穗时间的推迟。我们可以在22个PCR阳性的品系中的16个品系中检测到LpTFL1转基因的mRNA(图10)，其中的九个(56％)永不开花。和看家基因如GAPDH相比，高水平的LpTFL1的表达，在本研究中，可阻止六个品系中的五个抽穗(heading)(图10，品系31-36)。在不抽穗的品系中未见分生组织的增生和茎的伸长，这表明，这些植物停留在营养生长期。在转基因黑麦草中，从营养生长期向生殖生长期的转变可能是通过一个细胞内LpTFL1表达量的一个阀值来控制的，当高于这个阀值，植物就维持在营养生长状态。低于这个阀值水平植物就开花，LpTFL1就主要影响茎的长度和穗的分枝，其次影响抽穗的时间。和拟南芥不同，多年生黑麦草只在有足够的冷处理和适当的光照条件下才开花。因此，可以想象，在多年生植物，如黑麦草中开花控制子的水平比一年生植物，如拟南芥中高。先前还认为春化处理可以去除拟南芥中35S::TFL1的活性(Simpson等，1999)。我们发现，多年生黑麦草的LpTFL1既可被积极地转录起作用，而且在春化处理三个月后具有功能上的表现。LpTFL1的过量表达的作用不受基因型的影响。本试验使用了三种不同的基因型，即使它们就共转化效率而言对转化的反应不同(图16)，它们之间的LpTFL1过量表达品系中不开花品系的比率是相似的ACTION，55％；TELSTAR，50％和F6，60％。3，在紫羊茅中表达LpTFL1材料和方法植物转化质粒pLpTFL1与pAHC20(Christensen和Quail，1996)一起被导入紫羊茅，PAHC20含有Bar基因，可以产生对除草剂BASTA的抗性。切下的胚在基于MS(Murashige和Skoog，1962)培养基的愈伤组织诱导培养基(MS5)上，在25℃，黑暗培养10-12星期，而产生的易碎的胚性愈伤组织可用于微粒轰击。MS5培养基中添加了5毫克/升的2.4-D(dichlorphenoxyaceticacid)，500毫克/升酪蛋白水解物和3％(W/V)的蔗糖，并用0.3％Gelrite固化。在轰击之前，组织块(3-4mm)被转移到含30克/升蔗糖、3毫克/升2.4-D，0.25摩尔浓度甘露醇和0.25摩尔浓度山梨糖醇液体培养基中进行渗透处理30分钟，然后，再转移到同样的，但以0.3％Gelrite固化的固体培养基上，在黑暗中培养过夜。被12微克按1∶1摩尔混合的pLpTFL1和pAHC20混合物包裹的金颗粒(1.0微米)用于在1300psi下用Bio-RadPDS-100HeBiolisticDevice(Biorad，Hercules，California)微粒轰击。在轰击后，愈伤组织被放在含2毫克/升bialaphos(ShingoSangyoLtd，Japan)的MS5培养基上，于25℃±1℃和16小时光照条件下生长。在每三个星期一轮的，四到五轮的筛选后，通过在选择培养基中添加0.2毫克/升的激动素(kinetin)，就可以从这些愈伤组织再生推定的转基因植株。每块愈伤组织可产生1到4个外植物体，其被转移到土中，在温室中长至成熟。筛选稳定的转化所有的植株，包括两个未转化的品系和两个只用pAHC20转化的品系都用氯酚红分析法(CR)和它的能抵抗5000PPMBASTA对叶子的重复喷施的能力来筛选phosphinothricin乙酰转移酶的活性。至于CR分析，每个植株三到四个健康的叶尖放在含或不含8毫克/升bialaphos的含8毫克/升琼脂和25毫克/升氯酚红的1/2MS培养基中温育。来自非转基因植株的叶子不同于推定的转基因的植株，将产生严重枯萎并伴随着培养基的特征性红色。在生长六个月后，每个品系的植株都接受人工或者自然田间条件(2000-2001年冬季，丹麦)下的春化。人工春化就是植物存放在为或低于5℃的生长箱21个星期。春化过程中，光周期降到8小时/每天。春化后，所有植物被转移到长日照(LD)条件下(16小时光照，白天22℃，夜晚20℃)进行开花诱导。七个月后，这些品系被刈剪，进行第二轮的开花诱导，这包括自然田间条件下的(2000-2001冬季，丹麦)的春化和随后在夏季条件下的生长。每个单独品系的带种穗的杆数在两个花季都被记录，五个最长的花序的长度也在第一季被测量。PCR和DNA凝胶印迹分析用FastDNAORANGE试剂盒的DNA分离系统(Bio101)，从原初转化子(T0代)的叶子中分离基因组DNA，PCR检测转基因的存在。不同的引物组合被用于确定转基因DNA在基因组中整合和排列(图17)。正向引物是MS31(5’-CGTGGCGGAGCGGCAGAC-3’)、MS33(5’-TAGTACATCCATTTAGGGTTTAGG-3’)、MS56(5’-TATTTATTTGCTTGGTACTG-3’)和LPO(5’-ATGTCTAGGTCTGTGGAGCCTC-3’)，反向引物是LP4REV(5’-CGAACCTGTGGATACCAATG-3’)、LP575(5’-GGGATCCCACAACTGGGATAGCCAAGAACT-3’)和MS8(5’-ACCGGCAACAGGATTCAATCT-3’)。用于凝胶印迹分析的基因组DNA从不同转基因品系的一到三个个体的叶子中用Phytopure基因组DNA分离系统(Nucleon)分离。DNA(10-30微克)分别用限制性内切酶HindIII和EcoRI消化过夜，然后在0.8％琼脂糖凝胶中分离，在20×SSC缓冲液中，根据厂家介绍的方法印迹到AmershamHybondN膜上。从质粒DNA用引物组合MS56-LP4REV(图17)PCR扩增探针DNA，通过随机引物的方法(Megaprime，Amershaim)用γ-32P标记dCTP(3000ci/mmol)同位素标记探针。预杂交和随后的清洗步骤都按标准程序进行。RNA凝胶印迹分析根据Sambrook等(1989)的方法，从每个转基因品系中的1到4个克隆的叶中分离75微克总RNA、来自每个品系的一个个体的纯化的poly-A+mRNA(Dynabeads，DYNAL，挪威)被在变性的条件下分级分离，然后在20×SSC中转移到HybondN膜上。这个膜被LpTFL1cDNA180bp的片段和用于标准化的ACTINcDNA450bp的片段杂交。这些转基因品系的其它个体按同样的方式分析，但用总RNA。转基因品系的相对的LpTFL1的表达水平是根据放射自显影图片的密度扫描(QuantityOne软件，Biorad)的结果来计算，其中在表达最高的品系(J)的LpTFL1的表达水平被设为100。结果通过微粒轰击转化，共得到18个转基因紫羊茅品系。此外，获得两个仅转化质粒pAHC20的品系(BAR1和BAR2)。所有这些品系都抗BASTA，表现出phosphinothricin乙酰转移酶活性。从单个转基因愈伤组织(T0代)再生的植株被称为一个“转基因品系”。因而，每个转基因品系可溯源回一个不同组织培养物，代表一个独立的转化事件。用引物MS56和LP4REV(图17)对转基因紫羊茅叶DNA的PCR分析表明，LpTFL1存在于14个品系中，77％的共转化效率。这14个品系(A-N)与BAR1，BAR2和两个非转化品系被选来作进一步的分析。转基因的整合来自转基因植株的DNA用HindIII消化，释放一个2.8kb的含遍在蛋白的启动子和LpTFL1编码区的片段(图17)。在几个品系中转基因DNA的限制性酶切图谱很复杂(图11)。有预测大小的限制性酶切片段在四个品系发现(D，I，J和L，图11A和未列数据)。含有比预测大小大或小的片段的品系，表明转基因DNA的重新排列。没有同样大小重新排列的片段在不同品系被重复的观察到(图11A)，除了一个2.1kb的片段，这个片段也可在对照中见到，可能对应于内源紫羊茅TFL1样(FrTFL1)基因。弱的或弥散的信号也可在BAR1和BAR2的酶切DNA上见到(图11)，这可能代表质粒pAHC20含有相同的遍在蛋白的启动子外显子内含子构建体去驱动Bar基因表达。从转基因品系来的DNA也用EcoRI消化，载体中只在NOS终止的3’端有一个EcoRI切点，如果质粒串联发生，将产生一个与pALpTFL1串联体的重复序列大小相对应的片段。多个可与内含子::LpTFL1探针杂交的不同大小的EcoRI片段(图11B)表明全长质粒拷贝的串联不是转基因在植物基因组中主要的组织方式。两个品系(D和I)含有预测大小(5.5kb)的片段，然而随后在这些品系中PCR扩增转基因的启动子的尝试失败(见下)。很难确定准确的转基因拷贝数，特别因为几个品系含有截短的质粒拷贝。然而，我们估计拷贝数大约从2(品系G)到20(品系D)。用不同的的引物组合进行长PCR扩增遍在蛋白-外显子-内含子-LpTFL1-nos组件部分(图17)检测是否转基因品系含有完整的组件或是否转基因的重排在这个区域的内部发生。含有LpTFL1编码区和nos终止子的组件3’端在除品系A和F以外的所有品系中都是完整的(图17)。当用引物组合MS56和LP575进行PCR时，除了检测到预计的大小(0.6kb)的片段外，还在三个品系D、G和N中发现一个0.5kb的片段。当用引物LPO和MS8进行PCR时，在品系D、I和N中检测到长于预计大小的片段。这些片段可被每个单一引物所扩增，如果转基因以尾靠尾的形式整合到基因组中。另外，片段化的转基因DNA也可能分布于紫羊茅的基因组中。较小的片段必定反应DNA的缺失，而且因为这些片段只能用引物MS56-LP4REV而不能用LPO-MS8检测到，这个缺失似乎位于遍在蛋白内含子的3’端。用两个位于TATA盒上游500和100bp的引物MS33和MS31与LpTFL1编码区域相匹配的引物一起来PCR分析UBI::LpTFL1组件的启动子部分。这些结果如图17所示，表明两个品系(J和L)具有全长启动子，而六个品系只含有短的部分的遍在蛋白启动子(包括MS31引物位点)。在品系B，C，E，F，I和K中，启动子部分从LpTFL1的编码区或缺失或分散和/或重定向，在品系D和N中，一个1.5kb的DNA片段在MS33和LP4REV之间缺失(包括MS31和TATA盒)。一个100bp的缺失也在品系G的启动子区发现。虽然具体的位置还未确定，我们认为靠近UBI的内含子的3’端。这个内含子部份在品系A、D、G、H、J、L和M中发现是完整的，在品系B、C、E、F、I、K和N中是不完整的(MS31-LP4REV)。总体上，两个品系(J和L)发现含有至少一个完全的表达组件(Ubi-ex-intron-LpTFL1-nos)。LpTFL1的表达抑制开花所有转基因T0代植物都生长正常，在营养生长期，它们的形态与野生型对照没有差异(结果未示)。只有在植物被诱导开花之后，野生型和转基因植株之间的形态差异才显现出来。野生型和BAR1、BAR2转化植株大约比UBI::LpTFL1转化植株早开花两个星期。唯一的例外是品系A的植株，它们与野生型植株一起开花。人工春化的植物与田间自然春化(2000-2001冬季)之间在开花反应中出现明显的差异。在人工春化的条件下，只有两个UBI::LpTFL1品系开花，而有十个品系在自然春化的条件下开花(结果未示)。值得注意的是，除一株植物，所有对照和BAR1，BAR2植物在人工春化条件下都开花(结果未示)。这个结果表明，虽然人工春化的条件促进允许随后开花诱导的进行，UBI::LpTFL1品系需要更强的环境刺激，而这种刺激只在田间的条件下存在。在随后的对LpTFL1转基因作用的分析中，我们决定只采用从自然春化的品系中所收集的数据结果。在第一季，每个克隆所产生的花序数目在不同品系之间有明显的差异(从0到138，图12A)。在第二年，产生较少的花序，因为每个克隆被分为较小的单元。茎(杆)长度在不同品系之间也有差异(图10B)，但在第一个开花季节和在第二个开花季节没有显著的变化(结果未示)。四个UBI::LpTFL1品系(K，L，M，N，图12A和B)在第一次春化后的七个月内不开花，它们中的三个(K，L，M)在第二季还不开花。两个品系(I和J)分别在第一季只在3个单独的克隆上产生一朵花，在第二季只产生一和三朵花。RNA凝胶印迹分析被用于测定花序产生的减少和推迟是否与源于UBI::LpTFL1转基因的LpTFL1的表达相关。LpTFL1信使水平从0到与ACTINmRNA水平相当(图13)。在四个被检测最高LpTFL1表达的品系中的三个(K，L，M)不开花，第四个品系(J)只在每个克隆上产生了0.3个花序(图12A和14)。具较低LpTFL1信使水平的品系开花。有一个随着LpTFL1mRNA水平增加，每个克隆花序数减少的趋势(虽然这些结果在统计上不显著)(图12A)。在品系D，F和N中没有检测到LpTFL1信使(图12和图13)。这个发现与这些品系或缺少UBI启动子(品系F)或只有缺少TATA盒的部分UBI启动子(品系D和N，图17)的结果非常相符。在品系A中LpTFL1信使比预想的小80到120bp(图13)。我们猜想，这个片段代表一个截短的在这个品系中过量表达的LpTFL1转录产物。这个推断被以下事实所支持，对于这个品系，我们不能用PCR扩增含有LpTFL1编码区和nos终止子的LP0-MS8片段(图17)。此外，我们发现品系A植株与野生型同时开花，并且时所有的UBI::LpTFL1品系中产生花序的平均数最高(图12A)。品系A植物也是所有本研究的植物中植株最高的(图12B)，它产生的穗比对照总体上要小(图15)。相反，高表达的品系J的单个开花植株是所有开花植株中最矮的(图12A)。然而，手头所有的数据并不能有显著统计学意义地证实LpTFL1表达水平和茎干长度的相关性。讨论微粒轰击得到了18个具BASTA抗性的紫羊茅品系。通过PCR检测，其中14个不同品系的植株为目的基因阳性。对不同品系的DNA凝胶印迹分析表明，转基因以复杂的方式整合到基因组中，发生了多种类型的重排。转基因重排包括LpTFL1基因上和启动子区的缺失(图17)。最高的LpTFL1的表达在含完整的UBI::LpTFL1组件的植株中检测到。启动子序列的缺失在大多数情况下导致相对于高表达品系的LpTFL1表达降低(图17和图12)。可以想见，如果缺失包含TATA盒，这个部分启动子是有缺陷的，不能在植株中检测到LpTFL1的转录产物。然而，在一个LpTFL1高水平表达的品系(K)中，我们不能在该品种PCR扩增对应于UBI启动子的任何片段。对此没有一个明显的解释，或是三个PCR反应都不工作，或是部分组件可能整合到一个转录活性区域。对转基因品系的分析表明，在紫羊茅上LpTFL1的表达与从营养期生长期向生殖生长转化的控制紧密相关。除了品系A(讨论见后)外的所有含LpTFL1转基因的品系开花都比野生型和BAR对照至少晚两个星期。但是，转基因的表达水平与开花时间(抽穗日期)之间，没有如先前在拟南芥上所见的(Jensen等，2001)线性对应关系。与看家基因如ACTIN相似的高水平LpTFL1的表达可以阻止四个品系中的三个开花，在第四个品系中也在三个克隆上只产生一个花序(图12A和14)。在中等表达水平，LpTFL1的表达总体上引起花序数目和茎干长度的减少，穗分枝的增加，尽管仍需要对第二代的植物进行更多研究而获得统计学显著的结论。Nakagawa等(2002)也在过量表达RCN1/2的转基因水稻上得到了类似的结果。他们发现，中等水平的的RCN1/2的组成型表达与次生枝和甚至在野生型水稻未见的三级枝的三倍的增多相关。RCN1/2的高水平表达引起茎的缩短和“永不抽穗”表型。然而“永不抽穗”植株还产生一个被叶包围的旗叶和不成熟的穗，表明最终发生了从营养生长期向生殖生长期的转化(Nakagawa等，2002)。这些结果与我们的观察相反，这里所述的“永不抽穗”紫羊茅被阻留在营养生长期，因为它们不产生茎或穗。在转基因紫羊茅对营养生长期到生殖生长期转化的控制可能是由一个胞内LpTFL1阀值水平来完成的。高于这个阀值，植物就保持营养生长；低于这个阀值，植物就开花，LpTFL1将主要影响茎的长度和穗的分枝，并只次要地影响抽穗日期。这种相关性与拟南芥中的结果相反，在拟南芥中，开花日期与LpTFL1表达水平呈线形关系(Jensen等，2001)。这可能反映了这两个物种之间对春化反应的不同。拟南芥和紫羊茅对春化都敏感，但是，不像拟南芥，紫羊茅只有经受长日照条件下足够长的冷处理才能开花。因此，可以想见，或者紫羊茅中开花抑制子的水平高于拟南芥，或者抑制开花的阀值较低。先前已经发现春化作用可消除35S:TFL1拟南芥中的活性(Simpson等，1999)。我们发现在紫羊茅中，经过两轮自然的春化处理后，LpTFL1还被有效地转录和保持功能。TFL1样蛋白分子功能还不清楚。虽然描述了TFL1上有一个推定核苷酸结合区(Ohshima等，1997)，但最近数据显示TFL1样蛋白更可能影响调节性蛋白激酶的级联(Banfiled和Brady，2000)。未来的分子研究应着重于分离那些在LpTFL1高表达的品系中被上调或下调的基因。尽管在品系N中没有检测到LpTFL1的表达，这些植物在第一季不开花。非常可能，这个与其他结果明显偏差的结果归因于来自组织培养残效(carry-evereffect)，因为这个品系在第二季开始产生花。从转基因品系A的表型一个推定弱的紫羊茅(Festucarubra)样tfl1的突变体(frtfl1)。在这个品系中，在叶子产生减少的情况下，茎干和穗状花序的产生增加(图14)，圆锥花序比野生型更紧凑和皱褶(图15)。相反，在品系C植株上产生的圆锥花序比野生型更大并具更多的含更多小穗的穗。在品系C中有较高的LpTFL1表达水平，显示增多的分枝是增高的LpTFL1水平的结果。与这个假设相一致，品系A中所见的减少的分枝是可解释为由于LpTFL1蛋白在羰基端的缺失。有趣的是，拟南芥中属于TFL1家族的蛋白的活性最近被发现依赖于蛋白的C-末端部分。FLOWERLOCUST(FT)与TFL1同源，但作用相反(Kardailsky等，1999)，其功能主要决定于蛋白的C-末端部分。通过交换FT和TFL1cDNA的外显子，Ahn和Wiegel(2000)发现最后一个外显子决定这个嵌合基因FT和TFL1样特征。与我们对有关品系A植物的数据的解释相符，He等(2000)最近报导，从35SCaMV启动子过量表达拟南芥LFY可导致水稻提前抽穗。然而，提前开花往往伴随着谷物产量的减少，由于只产生7-9个较少种子的比较小的穗。此外，He等(2000)发现转基因的35S::LFY植株平均比野生型植株少1-2个叶子。先前已表明35S::LFY拟南芥植株类似tfl1突变体(Mandel和Yanofsky，1995；Weigel和Nilsson，1995)，TFL1的突变导致茎尖LFY和其他花分生组织特征基因的异位表达(Bowman等，1993；Bradley等，1997)。根据这些结果，我们认为转基因紫羊茅品系A植物表型类似水稻的35S::LFY植物，因此可能是紫羊茅tfl样突变体。对T1代的穗分枝与UBI::LpTFL1转基因的共分离的分析将证明这个推测是否正确，从紫羊茅中分离LFY样(或AP1样)基因，将使我们可以确定这些花特性基因在UBI::LpTFL1品系A植物的表达水平是否上升。我们的结果表明在紫羊茅中高水平表达异源的LpTFL1可以阻止开花(图12A和14)。此外，也显示了在开花植物中LpTFL1的表达水平引起茎干长度的减少(图12B)和叶子宽度的降低(结果未示)，但是，这些都需要进一步检测。没有观察到转基因表达的其他形态效果。在商业育种中对LpTFL1介导的不开花表型的实施和使用将需要一个可以解除LpTFL1介导的开花抑制的机制。结合LpTFL1表达和表达一个可在任何时间通过适当配体激活的启动子操纵的开花激活基因，便可提供这样一个可能的机制。参考文献AhnJH，WeigelD(2001).Aputativeexternalloopdomaininthe4thexondeterminesfunctionalspecificityofFTandTFL1.AbstractInThe12thInternationalConferenceonArabidopsisResearch，UniversityofWisconsin，MadisonAlvarezJ，GuliCL，YuX，SmythDR(1992)TerminalflowerageneaffectinginflorescencedevelopmentinArabidopsisthaliana.PlantJ2103-116AmayaI，RatcliffeOJ，BradleyDJ(1999)ExpressionofCENTRORADIALIS(CEN)andCEN-likegenesintobaccorevealsaconservedmechanismcontrollingphasechangeindiversespecies.PlantCell111405-1417AukermannMj，AmasinoRM(1996).MoieculargeneticanalysisoffloweringtimeinArabidopsis.SeminCellDevBiol7480-487BanfieldMJ，BradyRL(2000)ThestructureofAntirrhinumCentroradialisprotein(CEN)suggestsaroleasakinaseregulator.JMolBiol2971159-1170BarnardC(1957)FloralhistogenesisinthemonocotyledonsI.TheGranineae.AustJBot5115-128BowmanJL，AlvarezJ，WeigelD，MeyrowitzEM，SmythD(1993)ControlofflowerdevelopmentinArabidopsistheliababyAPETALA1andinteractinggenes.Development119721-743BradleyD，CarpenterR，CopseyL，VincentC，RothsteinS，CoenE(1996)ControlofinflorescencearchitectureinAntirrhinum.Nature376791-797BradleyD，RatcliffeO，VincentC，CarpenterR，CoenE(1997)InflorescencecommitmentandarchitectureinArabidopsis.Science27580-83ChienJC，SussexIM(1996)DifferentialregulationoftrichomeformationontheadaxialandabaxialleafsurfacesbygibberellinsandphotoperiodinArabidopsisthaliana.PlantPhysiol1111321-1328ChristensenAH，QuailPH(1996)Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarke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的核苷酸序列。53.权利要求50的分离的多核苷酸片段，其中所述片段具有碱基1-1624的核苷酸序列。54.显著减少或基本阻止植物开花的方法，该方法包括由权利要求50-53中的分离的多核苷酸片段表达多肽。55.具有图3所示碱基-3600至-1的核苷酸序列、或其片段或衍生物的分离的多核苷酸片段，用于在引起开花的条件期间上调植物顶尖和叶子中的基因表达。56.显著减少或基本阻止植物开花的方法，该方法包括表达分离的多肽、或其功能性片段、衍生物或同源物，其中所述其多肽片段、衍生物或同源物包含氨基酸序列YESP(K/R)。57.显著减少或基本阻止植物开花的方法，该方法包括在所述植物中表达具有图4所示氨基酸序列的分离的多肽、或其功能活性片段、衍生物或同源物。58.权利要求59的方法，其中所述多肽的片段、衍生物或同源物包括位于N端约100-约120残基之间的序列YESP(K/R)。59.显著减少或基本阻止植物开花的方法，该方法包括将权利要求31的表达组件插入植物宿主细胞，使所述转化宿主细胞在合适的培养基中生长并表达所述DNA序列，以产生所述蛋白质，其中所述表达蛋白质显著减少或基本阻止所述植物开花。60.利用权利要求50的多核苷酸片段转化的转基因植物，其中所述植物的开花已被显著减少或基本阻止。61.权利要求60的转基因植物，其中所述植物选自单子叶或双子叶。62.权利要求60的转基因植物，其中所述植物选自一年生、二年生或多年生。63.权利要求60的转基因植物，其中所述植物选自那些属于禾本科的作物；大豆、马铃薯、油菜、向日葵、苜蓿、甘蔗和棉花；草本植物，如茴芹、罗勒、月桂、马槟榔、蒿、辣椒、芹菜、山萝卜、细香葱、芫荽、枯茗、莳萝、茴香、大蒜、山葵、韭葱、蜜蜂花、甘草、马珠草、薄荷、牛至、欧芹、迷迭香、芝麻、龙蒿和百里香；水果和蔬菜，如香蕉、黑莓、蓝莓、草莓和悬钩子、香瓜、胡萝卜、花椰菜、咖啡、黄瓜、茄子、葡萄、蜜瓜、莴苣、芒果、甜瓜、洋葱、木瓜、豌豆、胡椒、菠萝、菠菜、南瓜、甜玉米、烟草、西红柿、西瓜；蔷薇科水果，如苹果、桃子、梨、樱桃、李子；十字花科蔬菜，如椰菜、甘蓝、花椰菜、芽甘蓝、甜菜、大头菜；木本植物，如桉树、橡树、松树和杨树。64.诱导植物早期开花的方法，所述方法包括在植物中表达多核苷酸片段，所述片段包含与图2或3的任一序列、其片段、衍生物或同源物互补的序列。全文摘要本发明描述了从多年生黑麦草中植物LpTEL1的分离和功能。以及转基因拟南芥、黑麦草和紫羊茅的产生。所述基因防止或抑制转基因植物的开花。本发明还描述了使用该基因抑制或防止开花的方法。文档编号C07K14/415GK1643144SQ03806809公开日2005年7月20日申请日期2003年3月10日优先权日2002年3月11日发明者K·K·尼尔森,C·S·简森,高彩霞,K·萨尔查特申请人:Dlf－三叶草公司,里索国家实验室