专利名称：对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物的制作方法
对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物导言本发明涉及编码从属于亚科聚球藻亚科(Synechococcoideae)的细菌获得的轻苯基丙酮酸双加氧酶(EC I. 13. 11. 27，本文中缩写为HPH))的核酸序列，以及由其编码的蛋白质，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白质或嵌合基因用于获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。发明背景 HPPD是催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸(本文中缩写为HPP)转化为尿黑酸(本文中缩写为HG)的反应的酶，尿黑酸是植物中生育酚和质体醌的前体(Crouch N. P.等人(1997) Tetrahedron, 53, 20,6993-7010, Fritze 等人,(2004), Plant Physiology 134 1388-1400)。生育酚作为膜连结的抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合体之间的电子载体发挥作用，其次，其是八氢番茄红素不饱和酶(参与类胡萝卜素的生物合成)的氧化还原辅因子。迄今为止，NCBI数据库中存在的超过700条来自多种生物的核酸序列被注释为编码具有HPI3D结构域的推定蛋白质，包括UniProtKB/TrEMBL数据库中给出的Q2JX04或Q2JPN8检录号下以及NCBI蛋白质数据库中分别给出的YP_473959和ΥΡ_476507检录号下公开的序列。但对那些中的大多数(包括对应于检录号Q2JX04/YP_473959或Q2JPN8/YP476507的序列)而言，尚未在体外检验或植物内手段中证明源自此类序列的蛋白质具有HPro酶促活性，也没有证明此类HPro蛋白在植物中表达时可赋予针对HPro抑制剂型除草剂的除草剂耐受性。在本领域范畴内已经描述了若干HPro蛋白及其一级序列，特别是细菌(例如假单胞菌属(Riletschi等人，Eur. J. Biochem. , 205,459-466,1992, WO 96/38567))、植物(例如拟南芥属(W0 96/38567，Genebank AF047834)、胡萝卜(W0 96/38567， Genebank 87257)、燕麦(Avena sativa)(TO 02/046387)、小麦(W0
02/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla) (W0 02/046387)、蔡藜草(Cenchrusechinatus) (W002/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、苇叶羊茅(Festuca arundinacea) (W0 02/046387)、狗尾草(Setaria faberi) (W0 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)、高梁属(Sorghum) (W0 02/046387)、球抱子菌属(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)、日本黄连(Coptis japonica) (W0 06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES 2275365))或哺乳动物(例如小鼠或猪)的 HPPD 蛋白。指出的参考文献中公开的相应序列通过引用并入本文。大多数植物通过arrogenate 合成酪氨酸(Abou-Zeid 等人(1995), Applied EnvMicrob 41 :1298-1302 ;Bonner 等人，(1995)，Plant Cells Physiol. 36,1013-1022 ；Byng等人，(1981), Phytochemistry 6 :1289-1292 ；Connely and Conn (1986), Z. Naturforsch41c :69-78 ；Gaines 等人，(1982)，Plants 156 :233-240)。在这些植物中，HPP 仅源于酪氨酸的降解。另一方面，在例如酿酒酵母的酵母或大肠杆菌的细菌等的生物中，HPP是酪氨酸前体，并且通过预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase,下文中称为F1DH)的作用(将预苯酸转化为 HPP)来合成(Lingens 等人，(1967)European J. Biochem 1:363-374;Sampathkumar and Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701:204-211)。在这些生物中，HPP的生产因此直接与芳香族氨基酸生物合成途径(莽草酸途径)相关联，而不与酪氨酸降解途径相关联。对HPro的抑制导致光合作用的解偶联，缺乏辅助捕光色素(accessorylight-harvesting pigments),以及最重要地，由于缺少正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护导致的UV照射和活性氧类别对叶绿体的破坏(褪色)(Norris等人(1995), PlantCell 7:2139-2149)。光合活性组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。已证明，抑制HPro并且与该酶特异性结合以抑制HPP向尿黑酸的转化的一些分子是非常有效的选择性除草剂。目前，大多数可商业获得的HPro抑制剂型除草剂属于这四个化学家族之一I)三酮类，例如，磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)苯甲酰基]-1，3-环己二酮]，甲基磺草酮[即2-[4-(甲基磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-I，3-环己二酮];环磺酮 (忱1^0^^01^)[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)-3-[(2，2，2，_三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-I, 3-环-己二酮];庄无忌(tefuryltrione)[即2-[2-氯-4_(甲基磺酰基)_3_[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]-I, 3-环己二酮]];bicyclopyrone [即4-轻基_3_[ [2_[ (2-甲氧基乙氧基)甲基]-6_ (二氟甲基)-3-卩比唳基]擬基]二环[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮];双环磺草酮(Benzobicyclon)[即3- (2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰基)-2-苯基硫代二环[3. 2. I]羊-2-烯-4-酮]2) 二酮腈类，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-I，3- 二酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1，3- 二酮；3)异T恶唑类，例如异5恶氟草[即(5-环丙基-4-异W恶唑基)[2_(甲基磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，异Pii氟草被快速代谢为DKN(展示出HPro抑制剂性质的二酮腈类化合物)；和4)pyrazolinate,例如苯批唑草丽(topramezone)[即[3_(4, 5_ 二氧 _3_ 异鳴·唑基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)苯基](5-羟基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]和pyrasulfotole [ (5_轻基-I, 3_ 二甲基卩比唑-4-基(2-甲横酸基-4-三氣甲基苯基(trifIuaromethylphenyl))甲酮]；pyrazofen[2_[4_(2,4- 二氯苯甲酰基)-I, 3- 二甲基吡唑-5-基氧]苯乙酮]。这些抑制HPro的除草剂可在展现出代谢耐受性的作物植物(例如玉米(Zeamays),它们在其中被迅速降解)中使用以抵挡草(grass)和/或阔叶杂草(Schulz等人，(1993). FEBS letters, 318,162-166 ;Mitchell 等人，(2001)Pest Management Science,Vol 57,120-128 ;Garcia 等人，(2000)Biochem.，39，7501-7507 ;Pallett 等人，(2001)PestManagement Science, Vol 57，133_142)。为拓展这些抑制HPH)的除草剂的范围，进行了若干努力，以向植物(特别是没有代谢耐受性或代谢耐受性运作欠佳的植物)赋予在农艺学田间条件下可接受的耐受性水平。除了分流HPro介导的尿黑酸生产(US 6,812,010)的尝试之外，还已过表达敏感型(sensitive)酶，以在植物中以相对除草剂来说足够的量生产靶标酶(W096/38567)。HPH)的过表达导致对异％氟草(IFT)的二酮腈类衍生物(DKN)的更好的出苗前(pre-emergence)耐受性，但是就针对出苗后处理的耐受性而言，耐受性是不足的(Matringe 等人，(2005), Pest Management Science 61 :269-276)。第三种策略是突变HPro，以获得下述靶标酶，其保留有其催化HPP转化为尿黑酸的性质，同时对HPro抑制剂不如突变前的天然HPro敏感。该策略已成功应用于生产对2-氰基-3-环丙基-I-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-I，3- 二酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1，3-二酮(属于二酮腈类 家族的两种抑制HPH)的除草剂(W0 99/24585))耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile 和更特别地 Gly336Trp (突变的氨基酸的位置是参照假单胞菌属HPH)示出的)被鉴定为负责于针对用这些二酮腈类除草剂进行的出苗前处理的增加的耐受性的突变，并且它们不造成酶活性的变化。更近来地，将假单胞菌属HPro基因引入烟草和大豆的质体基因组已显示出比核转化更为有效，其甚至赋予了针对异5恶氟草的出苗后应用的耐受性(Dufourmantel等人，2007, Plant Biotechnol J. 5(I) :118-33)。在WO 04/024928中，发明人已寻求通过增加HPP前体进入这些植物的细胞的通量来增加异戍二烯基醌(prenylquinone)在植物细胞中的生物合成(例如质体醌、生物酹的合成)。这已经通过PDH酶的过表达将所述前体的合成与“莽草酸”途径关联来进行了。他们还提到，用编码I3DH酶的基因转化植物使得增加所述植物对HPH)抑制剂的耐受性成为可倉泛。在专利申请WO 2009/144079中，公开了编码在荧光假单胞菌的HPH)蛋白的第336位突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列及其用于获得对HPro抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。在WO 2002/046387中，已经鉴定来自植物的HPH)蛋白的若干结构域与赋予对多种HPro抑制剂型除草剂的耐受性相关，但是既没有显示植物内数据也没有显示生物化学数据来验证所描述的结构域功能的影响。在WO 2008/150473中，示例了两种不同的耐受性机制——经修饰的编码突变体HPro酶的燕麦基因和CYP450玉蜀黍单加氧酶(nsfl基因)的组合，以获得改进的针对HPTO抑制剂型除草剂的耐受性，但是没有公开证实基于两种蛋白质的组合的协同效果的数据。尽管开发显示出针对上文所述的若干HPro抑制剂型除草剂耐受的植物获得了成功，但仍需要开发和/或改进植物对较新的或对若干不同的HPro抑制剂的耐受性，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、双环磺草酮和bicyclopyrone)和pyrazolinate (例如，苯卩比唑草酮和pyrasulfotole)的类别的HPF1D抑制剂的耐受性。发明描述本发明因此涉及转基因植物的生产，所述转基因植物含有编码可从或从属于聚球藻亚科的生物获得的HPro蛋白质的基因及其变体或突变体，更尤其涉及来自属于聚球藻属(Synechococcus)的生物的编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPH)酶的基因，以及其变体或突变体，并且所述植物较之含此类HPH)编码转基因的植物而言对HPro抑制剂更不敏感。更具体地，本发明因此涉及对下述转基因植物的生产，所述转基因植物含有可从或从属于聚球藻亚科的生物(尤其是聚球藻属(Synechococcus)，更尤其是从聚球藻属物种，甚至更尤其从如(i)JA-3-3Ab ；Cyanobacteria bacterium Yellowstone A-Prime 或(ii) JA-2~3B/ a(2-13), Cyanobacteria bacterium Yellowstone B-Prime 给出的任何菌株获得的)获得的、编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPro酶的基因，其变体或突变体，并且所述植物较之不含任何此类HPro转基因的植物而言对HPro抑制剂更不敏感。来自聚球藻亚科的编码HPro蛋白质的基因被选为优秀的HPro抑制剂耐受的候选者，这是因为它们较之敏感的拟南芥属HPro蛋白质(被用作为对HPro抑制剂敏感的参照分子)而言在与HPro抑制剂耐受性相关的位置上的氨基酸组成上具有高分歧性，这是在HPro蛋白质中以实验和结构方式测定的。在一种实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPI3D蛋白质。在另一种实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球 藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其中SEQ ID No. 4的第145位至第350位的任何氨基酸可改为任何天然存在的氨基酸，优选地，其可以是任何保守取代。在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且其在括号给出的其编号(相对于SEQ ID No. 4的编号)所定义的位置上具有下述氨基酸中的一个或多个，即，His (143)、Ser (183)、Asn (198)、Gln (220)、His (221)、Tyr (250)、Gln (299)、Phe (312)、Glu (314)、Gly (326)和 Asn (329)。在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且在表(i)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表(i)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。表⑴在SEQ
ID NO; 4在SEQ
中的氨ID NO: 4
墓酸中的位置取代
Val145 Thr，Cys, Ala, Gly
Phe, Tyr, He, Val, Ala, Gin, Glu1 Asp, Giy, Thr1 Ser1 Met,
Leu169 Arg, Lys
Ala, Trp, He, Leu, Ser, Arg, Lys, His, Asp, Glu, Pro, Gly1
Tyr170 Asn
Tyr172 Phe1 Val, lie, Ala, Leu, Trp1 Met, Gin, His
Leu181 Met, Val
Val184 Ala, Leu, Met, He, Lys, Arg, Gin, Tyr
Val186 Leu, Met, lie, Aia
Gly187 Ala, Ser, Thr, Val, Arg, Lys, Glu, Leu, He, Met, His
Ala332 Glu, Gin, Ser, Val, Phe, Thr
Leu333 Arg在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6、7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且在表(ii)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表( )第三列中列出的氨基酸中的任何取代。表(ii)
在SEQ
ID NO; 4 在SEQ
中的氨ID NO: 4
酸中的位置取代
Glu, Ser1 Thr, Tyr, Phe, His, Gin, Asn, Gly, Leu, Met,
Arg171Val, He
Val185Ala, Thr
Ala196Pro, Val, Thr, Asn1 lie,
Leu244Met, He, Asn
Leu281Met
Glu327Any except Pro
Ala328Gly, Pro, Val, Thr, Met在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPro蛋白质”或“聚球藻属HPro蛋白质”的HPro蛋白质，其是与SEQ ID No. 4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos. 4、5、6、7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白质，并且在表(iii)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表(iii)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。
表(iii)
在SEQ
ID NO; 4在SEQ
中的氨ID NO: 4
I酸中的位置取代
Arg171 Glu, Thr, Ser, Tyr
Va丨185 Ala
Ala196 Pro, Val, Thr
Leu244 Met
Leu281 Met
Glu327 He, Ala, Val, Leu1 Lys
Ala328 Gly这包括具有较之SEQ ID No. 4在第2位氨基酸至第350位氨基酸的序列具有取代、缺失或添加的氨基酸的蛋白质，例如转运肽融合蛋白，或者在SEQ ID No. 4的序列中具有氨基酸改变的蛋白质，所述蛋白质保留了 HPH)蛋白的酶活性，并且当在植物中表达时仍赋予HPro耐受性，优选是与SEQ ID No. 4的蛋白质所赋予的范围相当的HPro耐受性。这包括源于SEQ ID No. 4的蛋白质的变体或突变体蛋白，例如SEQ ID NOs :5、6或7的蛋白质中的任何，特别是较之宿主植物内源HPF1D而言对异％卩坐类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPH)抑制剂型除草剂较不敏感的突变体或变体，优选是下述突变体或变体，当向表达其的宿主植物应用异嗔唑类、二酮腈类、三酮类和/或pyrazolinate的类别的HPF1D抑制剂型除草剂(特别是甲基磺草酮、环磺酮、异W恶氟草或bicyclopyrone中的任何一种)时，更特别是当出苗后应用时，其向所述宿主植物赋予农艺学相关的除草剂耐受性。这还包括包含SEQ ID NO 4的序列的活性部分的蛋白质，当在植物中表达时所述部分赋予HPH)抑制剂耐受:性。这包括与SEQ ID NO :4的序列具有基本相同的氣基酸序列的蛋白质,例如具有SEQ ID NO. 4至7中任一的氨基酸序列的蛋白质。这包括下文定义的经分离的蛋白质，以及还有下述蛋白质，例如SEQ ID NO :4的蛋白质，其中某些氨基酸已经被下文定义的相似氨基酸替代，优选地，被保守氨基酸取代。本文还包括下述HPH)蛋白作为本发明的HPH)蛋白，所述蛋白质包含SEQ ID No. 4的从2至350位的氨基酸序列，但是其中1-20、1-15、1-10或1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸已被缺失，或者已被其它氨基酸取代，特别是保留了 HPH)酶促活性并且当在宿主植物中表达时赋予针对HPH)抑制剂型除草剂的耐受性的此类蛋白质。本文包括与下文描述的本发明的DNA序列同源的DNA序列编码的HPH)蛋白，或与SEQID NO 1的DNA的至少一部分(至少20-30个核苷酸)杂交的DNA序列编码的HPTO蛋白或能使用基于SEQ ID NO :1的引物获得的DNA序列编码的HPH)蛋白，或与SEQ ID No:4具有至少75%序列同一性的HPH)蛋白，所述蛋白质由在微生物(例如细菌，例如亚科聚球藻属的微生物)的基因组中发现的DNA序列编码。本文包括下述聚球藻属HPH)蛋白作为本发明的HPH)蛋白，所述蛋白质当在植物中表达时向此类植物赋予除草剂耐受性，其中此类 耐受性是针对HPF1D抑制剂(例如甲基磺草酮、环磺酮、异K恶氟草或bicyclopyrone)的,特别地，此类HPH)蛋白是聚球藻属物种HPH)蛋白，例如包含SEQ ID NO 4的从2至350位氨基酸的序列的蛋白质。这包括如下文详述的突变体或变体HPI3D蛋白。本发明包括并提供了能与下述基本经纯化的蛋白质特异性结合的抗体，所述蛋白质包含选自SEQ ID NOs :4、5、6或7构成的组的氨基酸序列，或其根据上表(i)、(ii)或
(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列。本发明的另一方面涉及与本发明的蛋白质或肽分子中的一种或多种以及它们的同源物、融合体或片段特异性结合的抗体、单链抗原结合分子或其它蛋白质。在一种特别优选的实施方式中，抗体与具有SEQ ID NOs :4-7中示出的氨基酸序列的蛋白质或其片段或其根据上表或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列特异性结合。在另一实施方式中，抗体与包含选自SEQ ID NOs :4_7中示出的氨基酸序列或其片段或其根据上表U)、(ii)或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列的氨基酸序列的融合蛋白特异性结合。在另一实施方式中，抗体与包含选自SEQ ID NOs :4_7中示出的氨基酸序列或其片 段、或其根据上表或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列的氨基酸序列的融合蛋白特异性结合。本发明的抗体可用于定量或定性检测本发明的蛋白质或肽分子，或用于检测蛋白质的翻译后修饰。在本文中使用时，如果抗体或肽与本发明的蛋白质或肽分子的结合不被存在的无关分子竞争性抑制，则说该抗体或肽与本发明的蛋白质或肽分子“特异性结合”。在另一实施方式中，本发明涉及在本文中被命名为“本发明的HPro核酸/DNA”的HPPD核酸或DNA，其是编码上文定义的本发明的HPH)的核酸或DNA。这包括下述DNA，所述DNA包含选自SEQ ID No. I从第4位核苷酸至第1050位核苷酸的序列、SEQ ID No. 2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列或SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列构成的组的核苷酸序列，或者所述DNA包含编码HPF1D的DNA区域,或者这包括下述DNA，所述DNA与另一 DNA足够互补，使得当在60至65°C之间的温度在含有O. 1% SDS的5xSSC(lxSSC(单-强度柠檬酸钠)表示=0. 15M NaCl、0. 015M柠檬酸三钠、50mM磷酸钠pH 7.6)中孵育之后接着在相同温度下用含有O. 1%305的5“5(洗涤时，其仍与选自由SEQ ID Nos. 1、2和3构成的组的序列杂交。当测试序列和本发明序列是双链时，构成测试序列的核酸优选具有相对选自由SEQ ID Nos. 1、2和3构成的组的序列的TM而言10°C之内的TM。当测试序列和选自由SEQ ID Nos. 1、2和3构成的组的序列被混合到一起并被同时变性时，序列的TM值优选在互相的5°C之内。更优选地，杂交在下文定义的相对严格的杂交条件下进行。在一种实施方式中，变性的测试或本发明序列优选首先与支持物结合，并在60至65°C之间的温度下在含有O. 1% SDS的5xSSC中进行指定时间的杂交，之后在相同的温度下但用O. IxSSC来洗涤支持物。当杂交涉及选自由SEQ ID Nos. 1、2和3构成的组的序列时，杂交条件可较不严格，这将是技术人员显而易见的。本文还包括编码本发明HPro蛋白质的下述DNA序列作为本发明的HPTO DNA,所述DNA序列已被改造以适于在微生物或植物中表达，这例如通过用宿主细胞中更优选的密码子替代天然密码子来进行，或者其中为了易于克隆已添加或除去了某些限制性位点，或是具有一定数量的添加、替代或缺失的核苷酸的DNA序列。这还包括经分离的DNA序列和变体、突变体或合成DNA或核酸，如下文所进一步描述的。在一种特殊的实施方式中，本发明的聚球藻属HPro DNA在允许外源基因在植物中表达的启动子的控制下表达于植物中。在另一特别的实施方式中，在由此表达的HPro酶的N-末端定位有信号肽，例如转运肽，优选是质体转运肽，例如大约120个氨基酸(大约30至大约120个氨基酸)的叶绿体转运肽，更优选是双转运肽，例如下述经优化的转运肽，其第一个部分来自向日葵(Helianthus annuus),第二个部分来自玉米(美国专利5，188, 642中描述的)，或者植物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)的质体转运肽，如果合适的话，包括成熟RuBisCO ssu的N-末端部分的数个氨基酸(EP 189 707)。在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPro蛋白的DNA，其源于SEQID No. I或可从SEQ ID No. I获得，并且已针对在大肠杆菌中的表达对其进行了优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No. 2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列的DNA (包括作为边界的位置)。在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPro蛋白质的DNA，其源于SEQID No. 1，并且已针对在植物中的表达对其进行了优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含 SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列的DNA (包括作为边界的位置)。在另一特别的实施方式中，本发明的HPH)，例如包含SEQ ID No. 4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列的HPPD，或包含SEQ ID Nos. 4至7中任一的氨基酸序列的HPH)，较之宿主植物内源HPH)而言对异5恶唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPF1D抑制剂型除草剂或选自异5恶氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙-1，3- 二酮和2-氰基-3-环丙基-l-(2-S02CH3-4_2, 3 Cl2苯基)丙-I, 3- 二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌和节草唑(pyrazoxyfen)的HPF1D抑制剂型除草剂较不敏感。在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPro蛋白的DNA，其来自SEQID NO 1并且已针对在大肠杆菌中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQID No. 2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列的DNA(包括作为边界的位置)，所述DNA编码较之宿主植物内源HPH)对异5恶唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的至少一种HPF1D抑制剂型除草剂(优选对环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、异13S氟草、二酮腈类、pyrasulfotole、苯批唑草酮、磺草酮、批唑特(pyrazolate)和批草酮(benzofenap))较不敏感的 HPH)。在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPro蛋白的DNA，其已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列的DNA (包括作为边界的位置)，所述DNA编码较之宿主植物内源HPF1D对异嗔唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的至少一种HPF1D抑制剂型除草剂(优选对环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、异^恶氟草、二酮腈类、pyrasulfotole、苯批唑草酮、磺草酮、批唑特和批草酮)较不敏感的HPH)。在另一特别的实施方式中，本发明涉及包含编码本发明的HPro蛋白的DNA的植物，这些植物的植物部分、植物细胞和后代，所述DNA已针对在大肠杆菌中的表达被优化或已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No. 2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列或包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列的DNA，所述DNA编码较之宿主植物内源HPH)较不敏感的HPH)。此类植物包括但不限于田间作物、水果和蔬菜，例如卡诺拉油菜(canola)、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉蜀黍、小麦、大麦、稻、高粱、西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡萝卜、生菜、卷心菜、洋葱、豆类物种(soya spp)、甘鹿、豌豆、芸豆(field bean)、杨、葡萄、柑桔、苜猜、黑麦、燕麦、草皮草(turf)和饲料牧草、亚麻和油菜籽油菜(oilseed rape)以及产生坚果的植物。在一种更特别的实施方式中，本发明涉及包含任何编码本发明的HPro的DNA的植物，这些植物的植物部分、植物细胞或后代，所述DNA已针对在大肠杆菌中的表达被优化或已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No. 2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸(包括作为边界的位置)或包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列的DNA，所述DNA编码较之宿主植物内源HPH)较不敏感的HPH)，并且其中所述植物选自卡诺拉油菜、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉蜀黍、小麦、大麦、稻、马铃薯、豆类物种、甘蔗、豌豆、芸豆、杨、葡萄、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮草(turf)和饲料牧草、亚麻和油菜籽油菜以及产生坚果的植物构成的组，进一步更优选地，此类植物选自豆类物种、稻、甜菜、小麦、棉花、卡诺拉油菜、油菜籽油菜或玉蜀黍构成的组。
在另一实施方式中，本发明的HPro蛋白包含SEQ ID No. 7的序列，并且较之植物(特别是宿主植物，其中本发明的此类HPro被表达或将被表达)内源未经突变的HPro而言对三酮类(命名为三酮类HPF1D抑制剂,例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌，特别是环磺酮)的类别、二酮腈类的类别(异5恶氟草)或pyrazolinate的类别(命名为pyrazolinate HPPD抑制剂,例如pyrasulfotole、卩比唑特、苯卩比唑草酮、卩比草酮)的HPH)抑制剂较不敏感。HPPD蛋白的酶活性可通过下述任何方法来测量，所述方法使得能测量HPP或O2底物的量的减少，或者测量源于酶促反应的任何产物(即尿黑酸或CO2)的积累。特别地，HPro活性可通过 Garcia 等人(1997)，Biochem. J. 325, 761-769 或 Garcia 等人(1999)，PlantPhysiol. 119,1507-1516中描述的方法来测量，所述参考文献通过引用并入本文。根据本发明，三酮类的类别的HPro抑制剂(或三酮HPro抑制剂)表示具有三酮骨架的HPro抑制剂。作为此类三酮HPro抑制剂的例子，可举出下述分子，磺草酮[即2-[2_氯-4-(甲基磺酰基)苯甲酰基]-1，3-环己二酮]，甲基磺草酮[即2-[4-(甲基磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1，3-环己二酮]和环磺酮[即2-[2_氯-4-(甲基磺酰基)_3_[ (2,2,2, - 二-氟乙氧基)甲基]苯甲酸基]-I，3-环-己二酮],庄无忌[即2-{2-氯-4-甲磺酰基-3-[(RS)-四氢-2-呋喃基甲氧基甲基]苯甲酰基}环己-I，3-二酮],bicyclopyrone [即4_轻基_3-{2_[ (2_甲氧基乙氧基)甲基]_6_(三氟甲基)_3_批啶基羰基} 二环[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮]，双环磺草酮[即3- (2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰基)-2-苯基硫代二环[3. 2. I]羊-2-稀-4-丽]。根据本发明，pyrazolinate的类别的HPF1D(或pyrazolinate HPPD抑制剂)表示具有吡唑基团的HPH)抑制剂。作为此类pyrazolinate HPPD抑制剂的例子，可以举出苯吡唑草酮[即[3-(4，5-二氢-3-异吃唑基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)苯基](5-羟基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]和pyrasulfotole [(5-羟基-I，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)甲酮]。本发明还涉及编码本发明的聚球藻属HPro以及经改造的序列的核酸序列，特别是经分离的DNA，优选是可在植物中表达的嵌合基因。
本发明还涉及编码本发明的HPro酶的核酸序列，所述HPro酶保留了其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质，并且较之内源未经突变的植物HPro对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)，或pyrazolinate的类别(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮、庄无忌、bicyclopyrone、双环磺草酮)的HPF1D抑制剂较不敏感,并且其中，被编码的氨基酸序列显示出与SEQ ID No. 4至少75%，80%，特别是至少85%，优选至少90%，更优选至少95%,进一步更优选至少98%,以及最优选至少99%的序列同一'丨生。在一种更特别的实施方式中，本发明的核酸编码较之宿主植物内源HPro而言对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone和庄无忌)、pyrazolinate 的类别(命名为 pyrazolinate HPF1D 抑制剂，例如 pyrasulfotole、卩比唑特、苯吡唑草酮、吡草酮)、异吃唑类的类别(例如异吃氟草)、或二酮类的类别(例如二酮腈)的HPH)抑制剂较不敏感的HPH)酶。根据本发明，“核酸序列”被理解为核苷酸序列，其可以是DNA或RNA类型，优选是DNA类型的，并且其特别是双链的，无论是天然或合成来源的，特别是下述DNA序列，其中编码根据本发明的HPH)的密码子已经根据其将表达于的宿主生物经过优化(例如，通过用较 之原来的或来源生物而言、在此类宿主生物或此类宿主生物属于的组的密码子使用表中更优选或最优选的那些密码子替代其密码子实现的)。“经分离的核酸/DNA/蛋白质”在本文中使用时指并非天然存在的核酸/DNA/蛋白质(例如，具有与天然存在的DNA不同的核苷酸序列的人工或合成DNA，或经修饰的蛋白质)或者不再存在于其原来存在的天然环境中的核酸/DNA/蛋白质，例如，在嵌合基因中与异源调控元件连结的DNA编码序列(例如与可在植物中表达的启动子有效相连的细菌编码序列)、转入另外的宿主细胞(例如转基因植物细胞)的DNA。考虑到本发明的一种特别的实施方式和受欢迎的解决方案，即，对三酮或pyrazolinate HPH)抑制剂较不敏感的HPH)，使用WO 2009/14407中详细描述的方法，按照下文所述，使用三酮、异5恶唑或pyrazolinate HPPD抑制剂,特别是选自环磺酮、甲基磺草酮、pyrasulfotole、苯批唑草酮、磺草酮、bicyclopyrone、二酮腈、批草酮、批唑特、庄无忌(tefuryltrione)的HPF1D抑制剂,来对耐受性水平测量加以分析。“包含”某序列“X”的术语DNA或蛋白质在本文通篇中使用时表示至少包括或含有序列“X”的DNA或蛋白质，这使得其它核苷酸或氨基酸序列可被包括于5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)端，例如，可选择标志物蛋白质(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)和/或5’前导序列或3’尾随序列。相似地，在本文通篇中以及本申请的权利要求中术语“包含”及其各种词性应当被理解为暗示了包括所指出的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。在本发明的一种实施方式中，编码HPro的编码区域包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQ ID Nos 4、5、6、7和16示出的氨基酸序列，例如SEQ ID Nos 1、2、3和15的核苷酸序列。但是，应当清楚，还可使用这些核苷酸序列的变体，包括其插入、缺失和取代，达到相同的效果。等同地，提到的核苷酸序列的来自不同于聚球藻属的物种的同源体也可使用。描述的核苷酸序列的变体将与鉴定出的编码HPro酶的核苷酸序列(例如序列表中鉴定出的那些)具有优选至少大约70 %、80 %或85 %或90 %或95 %的序列同一性。
与本发明所述的蛋白质具有“基本相同的氨基酸序列”的蛋白质指与根据本发明的蛋白质具有至少90%，特别至少95%，优选至少97%序列同一性的蛋白质，其中百分比序列同一性是通过使用在GCG (Madison, Wisconsin, USA)的Wisconsin软件包版本10. O的GAP程序中blosum62计分矩阵来测定的(使用GCG默认参数)。在本申请中通篇使用时，当“序列同一性”与蛋白质相关时，指使用该特定的分析时相同氨基酸的百分比。在本文中使用时，当“序列同一性”与DNA序列相关时，是通过使用GCG (Madison，Wisconsin，USA)的Wisconsin软件包版本10. O的GAP程序中nwsgapdna计分矩阵来测定的(使用GCG默认参数)。就本发明的目的而言，表示为百分比的两条相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”指两条被最优比对的序列中具有相同残基的位置数(xlOO)除以被比较的位置数。缺口，即，比对中在一条序列中存在残基而在另一条中不存在残基的位置，被视为具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch 1970)来进行两条序列间的比对。可使用标准软件程序，例如，是Wisconsin软件包版本10. I (GeneticsComputer Group, Madision, Wisconsin, USA) 一部分的 GAP,使用默认计分矩阵，以及缺口 制造罚分50和缺口延伸罚分3，来方便地进行计算机辅助的上述序列比对。可通过对基因组序列数据进行计算机分析，来鉴定与编码根据本发明的HPH)酶的核苷酸序列同源的核苷酸序列。还可使用鉴定出的编码根据本发明的HPH)酶的核苷酸序列或其部分作为探针，通过在严格条件下杂交，来鉴定和分离同源核苷酸序列。此类部分应当优选具有下述核苷酸序列，所述序列包含来自根据本发明的HPro编码基因序列编码区域的至少40个连续核苷酸，优选地，来自 SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 15 的编码区域。但是，探针也可包含源于HPH)编码核酸的核苷酸序列的更长的区域，例如来自任何提到的即^)基因的大约50、60、75、100、200或500个连续核苷酸。优选地，探针应当包含编码高度保守区域的核苷酸序列，所述高度保守区域可通过比对不同HPH)蛋白而鉴定到。在本文中使用时，“严格杂交条件”表示如果在探针和靶序列之间存在至少95%(以及优选至少97%)的序列同一性，通常将发生的杂交。严格杂交条件的例子是在包含5xSSC(150mM NaCl、15mM 柠檬酸三钠)、50mM 磷酸钠(pH 7·6)、5χ Denhardt ’ s 溶液、10% 硫酸葡聚糖和20 μ g/ml变性的剪切载体DNA (例如鲑鱼精DNA)的溶液中孵育过夜，接着在大约65°C在0. Ix SSC中洗涤杂交支持物，优选进行两次大约10分钟。其它杂交和洗涤条件是公知的，并且不例于 Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor, NY(1989),特别是第 11 章中。还可使用特异于编码酶的HPro基因的寡核苷酸(例如但不限于，包含选自SEQ IDNos 1、2、3、15的核苷酸序列或它们的互补序列的大约20至大约50个连续核苷酸的寡核苷酸)作为引物，通过DNA扩增来获得此类变体序列。本发明还包括下述变体HPPD酶，它们是与SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 16的HPPD氨基酸序列相似的氨基酸序列，其中，一个或多个氨基酸已被插入、缺失或取代。在本发明上下文中，氨基酸序列的变体指尽管对其有任何氨基酸取代、添加或缺失，但具有与本文所述的氨基酸序列相似的催化活性的那些多肽、酶或蛋白质。优选地，变体氨基酸序列与SEQID No. 4或SEQ ID No. 16的氨基酸序列具有至少大约80%或85%或90%或95%的序列同一性。还优选地，包含变体氨基酸序列的多肽具有HPro酶活性。用于测定HPro酶活性的方法是本领域公知的，其包括WO 2009/144079中或WO 2002/046387中被详细描述的检验。取代包括下述氨基酸变化，其中氨基酸被不同的天然存在的或非传统的氨基酸残基替代。此类取代可被分类为“保守的”，其中，在本发明的HPro蛋白中含有的氨基酸残基被具有相似特征的另一天然存在的氨基酸替代，例如Gly^Ala、Val<~>Ile^ Leu、Asp^Glu > LyseArg、Asn—>Gln或 Phe^Trp^Tyr。本发明包括的取代还可以是“非保守的”，其中在本发明的HPro蛋白中存在的氨基酸残基被具有不同性质的氨基酸取代，例如，来自不同组的天然存在的氨基酸(例如，用丙氨酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)。氨基酸取代典型地是单残基的，但是也可以是多个残基的，成串的或分散的。氨基酸缺失将通常是ι- ο个氨基酸残基数量级上的，而插入可以是任何长度的。缺失和插入可以对N-末端、C-末端进行或者是内部缺失或插入。通常，在氨基酸序列内的插入将比氨基或羧基末端融合小，其在I至4个氨基酸残基的数量级上。“相似氨基酸”在本文中使用时指具有相似氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或特别是中性的侧链的氨基酸。“非相似氨基酸”在本文中使用时指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如，具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸是不相似的。极性侧链通常倾向于存在于蛋白质的表面，它们在那里可以和细胞中发现的水性环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸倾向于驻留于蛋白质的中心内，它们在那里可以与相似的非极性邻居相互作用(“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的例子是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(除了疏水性的半胱氨酸之外，全部都是亲水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的例子是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸(除了中性的甘氨酸之外，全部都是疏水性的)。本发明还包括特异性识别根据本发明的HPro酶的抗体。本发明还涉及编码根据本发明的HPro的核酸作为标志物基因或作为编码序列在转化植物的方法中的用途，使得可向植物赋予对是HPro抑制剂的除草剂的抗性，本发明还涉及HPro抑制剂在包含编码根据本发明的HPro的核酸序列的植物上的用途。在本发明的一种实施方式中，在此类用途中，HPPD抑制剂是三酮类或pyrazolinate,优选是环磺酮、甲基磺草酮或磺草酮、bicyclopyrone和庄无忌。当然应当理解，该序列还可与其它基因标志物和/或编码具有有用的农业性质的一种或多种蛋白质的序列组合使用。在作物的商业生产中，想要在可靠的杀虫剂管理下从作物植物的田间除掉不想要的植物(即，“杂草”)。理想的处理将是这样的，其可应用至整块田间，但是将仅除掉不想要的植物，同时使得作物植物未受影响。一种此类的处理系统将涉及使用对除草剂耐受的作物植物，使得当在除草剂耐受的作物植物田间喷雾除草剂时，作物植物将继续茂盛生长同时非除草剂耐受性的杂交被杀死或被严重损害。理想地，此类处理系统利用了变动的除草剂性质的优点，使得杂草控制能提供灵活度和经济性的可能的组合中最好的。例如，各除草剂在田间具有不同寿命，一些除草剂在应用到田间之后能在相对长的时间内保持下来并有效，而另一些除草剂则迅速被破坏为其它和/或非活性化合物。理想的处理系统将允许使用不同的除草剂，使得种植者可定制针对特定情况的除草剂选择。虽然目前可商业获得大量的除草剂耐受性作物植物，但针对很多商业除草剂和除草剂/作物组合已提出了下述议题各除草剂典型地具有针对常见杂草物种的不完全活性谱。对于已使用了一段时间的大多数各个除草剂来说，除草剂抗性杂草物种和生物型的种群已更为普遍(见例如 Tranel and Wright (2002) Weed Science 50 :700-712 ；Owen andZelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61 :301-311)。对超过一种除草剂有抗性的转基因植物已被描述过(见例如W02005/012515)。但是，在作物生产、杂草控制选择、残余杂草控制的延伸以及作物产量改进的每个方面，都持续需要改进。本发明的HPro蛋白质或基因有利地在植物中与编码向此类植物赋予有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的其它基因组合。在编码在经转化的植物上赋予有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的基因中，可提到的是编码赋予对化学结构不同于HPH)抑制剂型除草剂的一种或多种除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列，赋予对某些昆虫的耐受性的蛋白质的DNA序列、赋予对某些疾病的耐受性的蛋白质的DNA序列，编码提供线虫或昆虫控制的RNA的DNA等等。此类基因被特别描述于公开的PCT专利申请WO 91/02071和W095/06128中。 在编码在经转化的植物细胞和植物上赋予对某些除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列中，可以提到bar或PAT基因或W02009/152359中描述的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)基因(其赋予对草铵膦除草剂的耐受性)，编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂(草甘膦及其盐)的耐受性的合适的EPSPS的基因(US 4, 535, 060,US 4，769，061、US5, 094，945、US 4，940，835、US 5，188，642、US 4，971，908、US 5，145，783、US5, 310，667、US 5,312,910, US 5,627,061, US 5，633，435)，或编码草甘膦氧化还原酶的基因(US5，463，175)。在编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂的耐受性的合适的EPSPS的DNA序列中，将特别提到编码植物EPSPS (特别是玉蜀黍EPSPS)的基因，特别是其包含两处突变的玉米EPSPS，特别是在第102位氨基酸处和第106位氨基酸处的突变(W0 2004/074443)，其被描述于专利申请US 6566587中，在下文中被称为双突变体玉蜀黍EPSPS或2mEPSPS ;或者编码分离自农杆菌属的EPSPS的基因，其被美国专利5，633，435的SEQ ID No. 2和SEQ IDNo. 3描述，也被命名为CP4。在编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂的耐受性的合适的EPSPS的DNA序列中，将特别提到编码来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的EPSPS GRG23以及突变体 GRG23 ACEUGRG23 ACE2 或 GRG23 ACE3 (特别是 W02008/100353 中描述的 GRG23 的突变体或变体，例如 W02008/100353 中的 SEQ ID No. 29 的 GRG23 (ace3) R173K)的基因。在编码EPSPS(以及更特别地，上述编码基因)的DNA序列的情况下，编码这些酶的序列有利地在之前存在编码转运肽的序列，特别是美国专利5，510，471或5，633，448中描述的“经优化的转运肽”。在WO 2007/024782中，公开了对草甘膦和至少一种ALS (乙酰乳酸合酶)抑制剂耐受的植物。更具体地，公开了含有编码GAT (草甘膦-N-乙酰转移酶)多肽和赋予对ALS抑制剂的抗性的多肽的基因的植物。在US专利6，855，533中，公开了转基因烟草植物，其含有突变的拟南芥属ALS/AHAS基因。在US专利6，153,401中，公开了含有编码通过代谢赋予对2，4_D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)的耐受性的2，4-D-单加氧酶的基因的植物。在US 2008/0119361和US 2008/0120739中，公开了含有编码通过代谢赋予对麦草畏(3，6_ 二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因的植物。上述所有除草剂耐受性均可与表现出是本发明主题的HPro耐受性的那些组合。在编码关于对昆虫的耐受性的性质的蛋白质的DNA序列中，将特别提到文献中广为描述并且本领域技术人员公知的Bt蛋白。还将提到从细菌(例如发光杆菌属)提取的蛋白质(W0 97/17432 和 WO 98/08932)。在编码赋予对昆虫的耐受性的新颖性质的目的蛋白质的此类DNA序列中，将特别提到在文献中被广为描述并且本领域技术人员公知的Bt Cry或VIP蛋白。它们包括CrylF蛋白或源于CrylF蛋白的杂交体(例如US 6，326，169、US 6，281，016、US6，218，188中描述的杂交体CrylA-CrylF蛋白或其毒性片段)，CrylA型的蛋白质或其毒性片段，优选是CryIAc蛋白或源于CryIAc蛋白的杂交体(例如，US 5，880，275中描述的 杂交体CrylAb-CrylAc蛋白)或CrylAb或Bt2蛋白或其杀昆虫片段(如EP451878中描述的)，Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白(如W002/057664中描述的)或其毒性片段，WO2007/140256中描述的CrylA. 105蛋白(SEQ ID No. 7)或其毒性片段，NCBI检录号ABG20428的 VIP3Aal9 蛋白，NCBI 检录号 ABG20429 的 VIP3Aa20 蛋白(W0 2007/142840 中的 SEQ IDNo. 2)，C0T202或C0T203棉花事件中产生的VIP3A蛋白(分别见WO 2005/054479和WO2005/054480) ,W001/47952 中描述的 Cry 蛋白，Estruch 等人(1996) ,Proc Natl Acad SciU S A. 28 ；93(11) :5389-94和US 6，291，156中描述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段，来自致病杆菌属(Xenorhabdus)(如W098/50427中描述的)、沙雷氏菌属(特别是来自嗜虫沙雷氏菌(S. entomophila))或发光杆菌属(Photorhabdus)的物种的菌株的杀昆虫蛋白，例如TO98/08932中所述的来自发光杆菌属的Tc-蛋白(例如，Waterfield等人，2001，ApplEnviron Microbiol. 67(11) :5017-24 ；Ffrench-Constant and Bowen,2000,Cell Mol LifeSci. ；57(5) :828-33)。此外这些蛋白质中任何一种的下述任何变体或突变体也包括在本文中在一些(1-10，优选1-5)个氨基酸上与上述任何序列(特别是它们的毒性片段的序列)不同的变体或突变体，或者与转运肽(例如质体转运肽)或其它蛋白质或肽融合的变体或突变体。本发明还涉及嵌合基因(或表达盒)，其包含编码序列以及位于5’和/或3’位置(至少位于5’位置)的异源调控元件，它们能在宿主生物(特别是植物细胞或植物)中与含有编码前文定义的HPro的至少一种核酸序列的编码序列一起发挥功能。在一种特别的实施方式中，本发明涉及前文描述的嵌合基因，其中宿主细胞选自细菌、酵母、毕赤酵母属、真菌、杆状病毒、体外细胞、原生质体、植物细胞、植物、植物部分及其植物种子。在另一特别的实施方式中，本发明涉及前文描述的嵌合基因，其中所述嵌合基因含有位于编码根据本发明的HPro的核酸序列的5’位置处编码植物转运肽的核酸序列，该序列被安排于启动子区域和编码根据本发明的HPro的序列之间，以允许转运肽/HPro融合蛋白的表达。在另一特别的实施方式中，本发明涉及HPro抑制剂型除草剂在包含根据本发明的HPro耐受基因的植物、植物部分或植物种子上的用途，或者HPro抑制剂型除草剂在其中将种植或播种此类植物、植物部分或种子的土壤上的用途，所述HPro抑制剂型除草剂单独使用或与一种或多种作用方式不同于HPro抑制剂的其它已知除草剂组合使用。在一种更特别的实施方式中，利用的HPro抑制剂型除草剂选自三酮类(被命名为三酮HPro抑制剂)(例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌，特别是环磺酮)、二酮类的类别(例如二酮腈)、异K恶唑类的类别(例如异5恶氟草)或pyrazolinate的类别(被命名为pyrazolinate HPPD抑制剂)(例如pyrasulfotole、批唑特、苯批唑草酮、批草酮)构成的组，进一步更具体地，本发明涉及环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈、bicyclopyrone、庄无忌、批草酮、pyrasulfotole、批唑特和磺草酮对此类HPF1D抑制剂耐受性植物、植物部分或植物种子的应用。作为在植物细胞和植物中作为启动子发挥功能的调控序列，可使用天然表达于植物中的基因的任何启动子序列，特别是尤其表达于植物叶中的启动子，例如细菌、病毒或植 物来源的“组成型”启动子，或者“光依赖性”启动子，例如植物核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，或者任何合适的可表达可使用的已知启动子。在植物来源的启动子中，将提到EP O 507 698 Al中描述的组蛋白启动子、稻肌动蛋白启动子(US 5，641，876)或植物泛素启动子(US 5，510，474)。在植物病毒基因的启动子中，将提到花椰菜花叶病毒(CaMV 19S 或 35S，Sanders 等人(1987)，Nucleic Acids Res. 15(4)1543-58.)、圆环病毒(AU 689 311)或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV, US 7,053, 205)的启动子。在本发明的一种实施方式中，可使用特异于植物的特别的区域或组织的启动子，以表达本发明的HPF1D,例如特异于种子的启动子(Datla, R.等人，1997, BiotechnologyAnn. Rev. 3，269-296)，尤其是油菜籽油菜蛋白启动子(EP 255 378 Al)、菜豆蛋白启动子、麦谷蛋白启动子、向日葵蛋白启动子(W0 92/17580)、白蛋白启动子(W0 98/45460)、油质蛋白启动子(W0 98/45461)、SATl 启动子或 SAT3 启动子(PCT/US98/06978)。还可使用可诱导启动子，其有利地选自苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PRl家族基因、胭脂氨酸合成酶(nos)和vspB启动子(US 5 670 349，表3)、HMG2启动子(US 5 670 349)、苹果β -半乳糖苷酶(ABGl)启动子和苹果氨基环丙烷羧酸合酶(ACC合酶)启动子(W0 98/45445)。根据本发明，还可与启动子组合使用其它调控序列，所述序列定位于启动子和编码序列之间，例如转录活化因子(“增强子”)，例如申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)的或 Carrington & Freedl990, J. Virol. 64 :1590-1597 描述的烟草蚀刻病毒(TEV)的转录活化因子，例如，或内含子，例如玉蜀黍的adhl内含子或稻肌动蛋白的内含子
Io在另一特别的实施方式中，本发明的基因以多个(优选两个)拷贝存在于植物中，它们每个被不同的可在植物中表达的启动子控制。在另一特别的实施方式中，本发明的嵌合基因可与编码HPro蛋白的任何其它嵌合基因组合，优选地，这些不同基因被在植物中具有活性的不同调控元件控制。在另一特别的实施方式中，本发明的嵌合基因可与处于相同或不同可在植物中表达的启动子控制下的CYP450玉蜀黍单加氧酶(nsfl基因)基因组合。作为调控终止子或聚腺苷化序列，可使用细菌来源(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子)、病毒来源(例如CaMV 35S终止子)或植物来源(例如，公开的专利申请EP O 633 317 Al中描述的组蛋白终止子)的任何相应序列。术语“基因”在本文中使用时指侧翼有5’和/或3’调控序列的允许RNA被转录的DNA编码区域，所述RNA可被翻译为蛋白质，典型地，至少包含启动子区域。当提到本发明的编码HPH)的DNA时，“嵌合基因”指下述HPH)编码DNA序列，其具有不同于驱动HPTO蛋白在其天然宿主细胞中表达的天然存在的细菌5’和/或3’调控序列的5’和/或3’调控序列(也被称为“异源启动子”或“异源调控序列”)。术语“包含序列X的DNA/蛋白质”和“具有包含序列X的序列的DNA/蛋白质”在本文中使用时指下述DNA或蛋白质，它们在其核苷酸或氨基酸序列中至少包括或含有序列X，这使得在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端可包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如，N-末端转运或信号肽。术语“包含”在本文中使用时是表示“包括”的开放式语
言，其表示除了具体列举的那些之外还可存在其它元件。术语“由......构成”在本文中
使用时是封闭式语言，即，仅存在具体列举的这些元件。术语“编码包含序列X的蛋白质的DNA”在本文中使用时指包含下述编码序列的DNA，所述编码序列在转录和翻译后产生至少含有氨基酸序列X的蛋白质。编码蛋白质的DNA无须是天然存在的DNA，其可以是半合成的、完全合成的或人工DNA，并且可包括内含子和5’和/或3’侧翼区域。术语“核苷酸序列”在本文中使用时指DNA或RNA分子的序列，其可以是单链或双链形式的。根据本发明的HPro蛋白可根据本领域已知的流程被装备有信号肽，见例如公开的PCT专利申请WO 96/10083，或者它们可被另外的肽，例如导致蛋白质被运送至叶绿体的叶绿体转运肽(例如，Van Den Broeck等人，1985, Nature 313, 358或US专利5,510,471的经修饰的叶绿体转运肽)替代，或被将蛋白质靶向至其它质体、线粒体、ER或另外的细胞器的肽或分泌性信号肽替代，或者其可被甲硫氨酸氨基酸或被甲硫氨酸-丙氨酸二肽替代。在天然被靶向或分泌的蛋白质中发现了用于靶向至细胞内细胞器或用于分泌出植物细胞或分泌至细胞壁的信号序列，优选地，Kliisgen等人(1989，Mol. Gen.Genet. 217,155-161) ,Klosgeil and Weil (1991, Mol. Gen. Genet. 225,297-304)、Neuhaus& Rogers(1998, Plant Mol. Biol. 38，127-144)、Bih 等人(1999，J.Biol. Chem.274，22884-22894)、Morris 等人(1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255,328-333)、Hesse等人(1989，EMBO J. 8 2453-2461)、Tavladoraki 等人(1998，FEBS Lett. 426，62-66)、Terashima 等人(1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523)、Park 等人(1997,J. Biol. Chem. 272,6876-6881)、Shcherban 等人(1995，Proc. Natl. Acad. Sci USA 92，9245-9249)描述的那些，所有这些都通过引用并入本文，特别是来自玉米、棉花、大豆或稻的被靶向或分泌的蛋白质的信号肽序列。编码此类植物信号肽的DNA序列可被插入编码用于在植物中表达HPH)蛋白的嵌合基因中。除非实施例中另有指明，用于制造和操纵重组DNA的所有流程都通过Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring HarborLaboratory Press, NY (1989)和 Ausubel 等人(1994) Current Protocols in MolecularBiology, Current Protocols, USA的第I卷和第2卷中描述的标准流程来进行。用于植物分子生物学工作的标准材料和方法被描述于R. R. D. Croy的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)(由 BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和 Blackwell ScientificPublications (UK)联合出版)中。用于PCR技术的流程可被发现于M. A. Innis,D. H. Gelfand, J. J. Sninsky和 T. J. White编辑的“PCR protocols a guide to methods andapplications，，(Academic Press, Inc. , 1990)中。术语“耐受性”、“耐受”或“较不敏感”可互换使用，它们表示根据用包含编码各HPPD蛋白的基因的核酸转化的菌株或植物的可视指标表型在不同浓度的多种HPro抑制剂存在时筛选的HPro内在耐受性的相对水平。与这些指标表型(棕色的形成、生长抑制、褪色、除草剂效果等等)相关的剂量应答和剂量应答的相对改变被方便地以例如在除草剂的不同浓度范围内基于植物损害、分生组织褪色症状等等以正常方式的GR50(生长降低50%的浓度)值或MIC(最小抑制浓度)值来表示，其中值的增加对应于表达的HPro的内在耐受性增加。这些数据可以以例如源于剂量/应答曲线的GR50值来表示，所述曲线具有绘制于X轴上的“剂量”和绘制于I轴上的“百分比杀死(percentage kill) ”、“除草剂效果”、“出苗绿色植物的数目”等等，其中增加的GR50值对应于表达的HPH)的内在耐受性水平增力口。除草剂可合适地在出苗前或出苗后应用。
类似地，编码根据本发明的HPro蛋白的核酸或基因或本发明的HPro蛋白的耐受性水平是通过对测试植物(例如烟草，或作物植物，例如大豆或棉花)进行转基因、再生、育种和喷雾测试来筛选的，根据这些结果，这些植物较之不含任何外源编码HPro蛋白的基因的植物或较之含有包含处于与本发明HPro DNA相同启动子控制下的拟南芥HPro编码DNA的基因的植物时，对HPro抑制剂(例如环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈类和/或bicyclopyrone)至少更耐受2-4倍。“宿主生物”或“宿主”被理解为其中为了产生根据本发明的HPro的目的可引入根据本发明的核酸或嵌合基因的任何单细胞或多细胞异源生物。这些生物特别是细菌，例如大肠杆菌，酵母，特别是酿酒酵母属或克鲁维酵母属的，毕赤酵母，真菌，特别是曲霉属，杆状病毒，或者优选地，植物细胞和植物。根据本发明，“植物细胞”被理解为源于植物或在植物中发现的任何细胞，其能形成未分化组织(例如愈伤组织)、分化组织(例如胚胎)、植物的部分、植物或种子，或是它们的一部分。这包括原生质体和花粉、培养的植物细胞或体外生长的原生质体以及能再生为完整植物的植物细胞。根据本发明，“植物”被理解为能光合作用的任何分化的多细胞生生物，特别是单子叶或双子叶生物，更尤其是意欲或不意欲用于动物或人类营养的栽培的植物，例如玉蜀黍或玉米，小麦、芸苔属物种的植物,例如油菜(Brassica napus)或芥菜(Brassicajuncea)，豆类物种，稻，甘蔗，甜菜，烟草，棉花、蔬菜植物，例如黄瓜、韭、胡萝卜、西红柿、生菜、胡椒、甜瓜、西瓜等等。转基因植物在本文中使用时指包含稳定插入进其基因组的外来或异源基因的植物。在一种实施方式中，本发明涉及对植物的转化。在植物中天然表达的基因的任何启动子序列，或天然表达于植物中的基因的启动子元件的任何杂交体或组合，包括农杆菌属或植物病毒启动子，或适于控制除草剂耐受性基因在植物中的转录的任何启动子，可在本发明的植物中用作为启动子序列(本文中命名为“可在植物中表达的启动子”)。此类合适的可在植物中表达的启动子的例子如上文所述。在本发明的一种实施方式中，此类可在植物中表达的启动子与编码本发明的HPro蛋白的编码序列有效地相连，形成本发明的嵌合HPro基因。根据本发明，还可与启动子调控序列组合使用位于启动子和编码序列之间的其它调控序列，例如内含子序列或转录活化因子(增强子)。此类合适的调控序列的例子如上文所述。细菌或病毒来源(例如来自根癌农杆菌的nos终止子)或植物来源(例如申请EPO 633 317 Al中描述的组蛋白终止子)的任何相应的序列，可用作为转录终止(和聚腺苷化)调控序列。在本发明的一种特别的实施方式中，在根据本发明的外源HPro的编码核酸序列的5’(上游)利用编码转运肽的核酸序列，该转运肽序列被安排于启动子区域和编码外源HPro的序列之间，以允许转运肽-HPro融合蛋白(例如SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7的蛋白质)的表达。转运肽使得可以指导HPro进入质体，更尤其是进入叶绿体，当本发明的HPro 蛋白进入质体时融合蛋白在转运肽和本发明的HPro蛋白之间被切割。转运肽可以是单条肽，例如EPSPS转运肽(美国专利5，188，642中描述的)或植物核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)的转运肽,如果合适的话,包括成熟RuBisCO ssu的N-末端部分的数个氨基酸(EP 189 707A1)，或者可以是若干转运肽的融合体，例如下述转运肽，其包含与具有质体定位的成熟蛋白的N-末端序列的部分融合的第一植物转运肽，所述部分又进而融合至如专利EP 508 909 Al中描述的第二植物转运肽，并且，更尤其是下述经优化的转运肽，其包含向日葵RuBisCO ssu的转运肽,该转运肽融合至玉蜀黍RuBisCO ssu的N-末端的22个氨基酸，这22个氨基酸进而融合至玉蜀黍RuBisCO ssu的转运肽，与其编码序列一起描述于EP 508 909 Al中。本发明还涉及转运肽-HPro融合蛋白和编码此类融合蛋白的核酸或可在植物中表达的嵌合基因，其中该融合蛋白的两种元件如上文定义。本发明还涉及克隆、转化和/表达载体，所述载体含有如上文定义的至少一种嵌合基因。除了上述嵌合基因之外，该载体可含有复制起点。该载体可以是质粒或质粒的部分、粘粒或噬菌体或病毒(已通过引入根据本发明的嵌合基因而经过了转化)。转化载体可以是技术人员公知的，并且被广为描述于文献中。可以使用的转化载体(特别是用于转化植物细胞或植物的)可以是可用于转化植物细胞或植物并且额外含有其自身复制和表达元件的病毒。根据本发明，用于转化植物细胞或植物的载体优选是质粒，例如卸甲农杆菌属Ti质粒。本发明还涉及下述宿主生物，特别是植物细胞、种子或植物，其包含含有编码本发明HPro蛋白(例如如上文定义的包含SEQ ID Nos 4、5、6或7的氨基酸序列的蛋白)的序列的嵌合基因，以及涉及本发明的植物或种子在田间的用途，以培养作物和收获植物产品，例如豆类物种、稻、小麦、大麦或玉米粒或棉桃，其中在一种实施方式中，所述用途涉及将HPH)抑制剂型除草剂应用于这些植物以控制杂草。在本发明的一种实施方式中，在此类用途中，HPro抑制剂是三酮类或pyrazolinate，优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、卩比唑特、卩比草酮和庄无忌，特别是环横酮(tembotrione)。因此，本发明涉及下述宿主生物，特别是植物细胞、种子或植物，其特征在于其含有上文所述的至少一种HPro嵌合基因，或者至少含有如前文所述的HPro核酸序列。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及植物细胞或植物，其特征在于其至少含有下述核酸序列，所述核酸序列编码本发明的HPro蛋白，所述蛋白质保留有其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质，并且使得该植物较之相同物种但是不包含本发明的此类HPF1D蛋白的植物而言更为耐受,特别是对三酮类或pyrazolinate (优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯批唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、批唑特、批草酮和庄无忌，特别是环磺酮)耐受，并且含有本发明的HPH)的此类植物对HPH)抑制剂型除草剂(特别是对三酮类或pyrazolinate，优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、批唑特、批草酮和庄无忌，特别是环磺酮)具有农艺学可接受的耐受性。在另一特别的实施方式中，本发明涉及下述植物细胞或植物，其特征在于，其至少含有编码本发明的HPro的核酸序列，所述HPro保留有其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质并且较之宿主植物内源HPro(例如来自拟南芥的HPH)，特别是包含SEQ IDNo. 11的氨基酸序列(从第126位氨基酸至第568位氨基酸)或包含SEQ ID No. 11或SEQID No. 12的氨基酸序列(从第134位氨基酸至第575位氨基酸)的HPPD)对HPTO抑制剂 较不敏感。在一种特别的实施方式中，本发明涉及下述宿主植物细胞、种子或宿主植物，其特征在于其至少含有编码如本文定义的本发明的HPro的核酸序列，其中本发明的HPro较之宿主植物内源HPH)对异吃唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPTO抑制剂型除草剂(更尤其地，来自异^恶氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、bicyclopyrone、庄无忌、苯批唑草酮、2-氰基_3_环丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙-I,3_ 二丽和2_氛基_3_环丙基-I-(2-S02CH3-4_2, 3 Cl2苯基)丙-1，3-二丽,甚至更特别地，环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈类(diketonitrile)、bicyclopyrone、苯卩比唑草酮、卩比唑特、批草酮、磺草酮、庄无忌和pyrasulfotole,最特别地,环磺酮、甲基磺草酮和bicyclopyrone)更不敏感。在另一特别的实施方式中，本发明涉及下述植物细胞或植物，其特征在于其至少含有编码前文所述的本发明的HPH)的核酸序列，以及还含有包含上文所述的可在植物中表达的启动子的嵌合基因，所述启动子与编码PHD (预苯酸脱氢酶)酶的核酸序列有效连接(US 2005/0257283) 本发明还涉及含有经转化的细胞的植物，特别是从经转化的细胞再生的植物，及其后代植物或种子，它们包含本发明的嵌合HPro基因。再生可通过任何合适的方法来获得，所述方法取决于物种的性质，如例如在上述参考文献中描述的。可引用下述专利和专利申请，特别是在转化植物细胞和再生植物的方法方面=US 4，459,355、US 4，536，475、US 5，464，763、US 5，177，010、US 5，187，073、EP 267,159 AU EP 604 662 AU EP 672752A1、US 4，945，050、US 5，036，006、US 5，100，792、US 5，371，014、US 5，478，744、US5, 179, 022,US 5, 565, 346,US 5, 484, 956,US 5, 508, 468,US 5, 538, 877,US 5, 554, 798,US5, 489, 520,US 5, 510, 318,US 5, 204, 253,US 5, 405, 765,EP 442 174 AUEP 486 233 Al、EP 486 234 AUEP 539 563 AUEP 674 725AUW0 91/02071 和 WO 95/06128。本发明还涉及通过栽培和/或杂交上述转基因植物获得的转基因植物或其部分，还涉及转基因植物的种子(包含本发明的HPro嵌合基因)。
本发明还涉及最终产物，例如从本发明的植物、其部分或种子获得的膳食或油。可根据本发明获得的经转化的植物可以是单子叶类型的，例如小麦、大麦、甘蔗、稻、洋葱和玉米或玉蜀黍，或者可以是双子叶类型的，例如烟草、豆类物种、苜蓿、芸苔属物种的植物(例如油菜籽油菜)、棉花、甜菜、三叶草、蔬菜等等。本发明涉及转化宿主生物(特别是植物细胞或植物)的方法，这通过在此类生物中整合上文定义的至少一种核酸序列或一种嵌合基因来进行，其中可通过任何合适的已知方式获得转化，所述方式被详细描述于专门的文献以及特别地，本申请提到的参考文献中，例如通过使用根据本发明的载体来进行。根据本发明的一种转化方法包括用其上联结有DNA或含有DNA的固体或液体颗粒轰击细胞、原生质体或组织。另一转化方法包括使用嵌合基因作为转入植物的手段，所述嵌合基因被插入进根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒。还可使用其它方法，例如显微注射或电穿孔或使用PEG的直接基因转移。技术人员可选择用于转化选择的宿主生物(特别是植物细胞或植物)的任何合适的方法。作为例子， 用于大豆转化的技术已被广泛描述于EP 1186666A1 (通过引用并入本文)中公开的实施例I至3中。对于稻，可进行农杆菌属介导的转化(Hiei等人，1994 Plant J 6 :271-282和Hiei 等人，1997 Plant Mol Biol. 35 :205_21，通过引用并入本文)、电穿孔(US 5, 641, 664和 US 5，679，558,通过引用并入本文)或轰击(Christou 等人，1991, Biotechnology 9 957，通过引用并入本文)。用于转化单子叶植物(特别是稻)的一种合适技术被描述于W092/09696 (通过引用并入本文)中。对于棉花，已经描述了农杆菌属介导的转化(GouldJ.H.和 Magallanes-Cedeno M. ,1998 Plant Molecular Biology reporter, 16 :1-10 和Zapata C. , 1999, Theoretical Applied Genetics, 98 (2) :1432-2242,通过引用并入本文)、聚凝胺和 / 或处理介导的转化(Sawahel ff. A. , 2001, -Plant Molecular Biologyreporter, 19 :377a_377f,通过引用并入本文)。在本发明的一种特别的实施方式中，本发明的HPro被靶向进叶绿体。这可通过下述方式来进行将编码转运肽的核酸序列融合至编码本发明的HPro蛋白的核酸序列，以获得编码上文所述的融合蛋白的核酸。或者，可使用对质体(例如叶绿体基因组)的转化，将本发明的HPro直接表达于质体(例如叶绿体)中。合适的方法包括通过用涂覆有DNA的固体颗粒或包含DNA的液体颗粒轰击植物细胞或组织，以及通过同源重组整合引入的编码本发明蛋白的基因。合适的载体和选择系统是本领域技术人员已知的。可用于向烟草植物的叶绿体基因组的此类整合的方式和方法的例子被给于WO 06/108830中，其内容通过引用并入本文。本发明还涉及用于获得针对HPro抑制剂的植物的方法，其特征在于用如前文所述的本发明的嵌合HPro基因转化植物。因此，本发明还涉及获得对HPro抑制剂耐受的植物的方法，其特征在于，所述植物含有本发明的嵌合HPro基因，所述基因包含编码序列以及位于5’以及任选在3’位置的能在宿主生物中发挥功能的异源调控元件，其特征在于，所述编码序列至少包含定义编码如前文所述的本发明的HPro的基因的核酸序列。在本发明的一种实施方式中，上述方法中的HPF1D抑制剂是三酮或pyrazolinate除草剂，优选为环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、pyrasulfotole、卩比唑特、二酮腈(diketonitrile)、卩比草酮或磺草酮,特别是环磺酮。根据本发明，还提供了用于获得如上文所述的对HPro抑制剂耐受的植物的方法，其特征在于获得下述植物，所述植物包含是本发明的嵌合HPro基因的第一转基因，以及是包含与编码roH(预苯酸脱氢酶)酶的核酸有效连接的可在植物中表达的启动子的嵌合基因的第二转基因。包含此类两种转基因的植物可这样获得通过用一种转基因转化植物，然后再用第二转基因重转化该转基因植物，或者通过两种转基因(在相同或两个不同的转化DNA或载体中)同时转化植物，或者通过将包含第一转基因的植物与包含第二转基因的植物杂交，这是本领域公知的。本发明还涉及在将栽种植物或将播种种子的田间、或在植物作物中选择性除去杂草或预防杂草发芽的方法，这通过向此类田间或植物作物应用HPro抑制剂，特别是如上文定义的HPro抑制剂型除草剂来实现，所述方法特征在于，将该HPro抑制剂型除草剂应用至已经根据本发明转化过的植物，这在播种作物之前(下文中命名为栽种前应用)、作物出苗 之前(下文中命名为出苗前应用)或作物出苗之后(下文中命名为出苗后应用)进行。本发明还涉及在含有如本发明前文所述经转化的种子的区域或田间进行控制的方法，所述方法包括向所述田间的区域应用对于所述杂草来说是毒性的剂量的HPro抑制剂型除草剂，但是对如本发明前文所述含有本发明的HPro核酸或嵌合HPro基因的种子或植物没有显著影响。本发明还涉及栽培已经经根据本发明的嵌合基因转化过的植物的方法，所述方法包括在适于栽种所述植物的田间区域栽种包含本发明的嵌合基因的种子，以及如果存在杂草的话，向所述田间的所述区域应用对杂草有毒的剂量的靶标为上文定义的HPro的除草齐U，而不显著影响所述经转化的种子或所述经转化的植物，以及然后当栽培的植物或植物部分达到想要的成熟阶段时收获它们，并且如果合适的话，从收获的植物分离种子。在上述方法中，其靶标是HPro酶的除草剂可以根据本发明，在播种作物之前、作物出苗之后或作物出苗之后应用。本发明还涉及获得油(特别是豆类物种、玉米或棉花油或膳食)的工艺，所述工艺包括种植表达本发明的HPro蛋白的作物，特别是豆类物种作物，任选地用HPro抑制剂型除草剂处理此类作物，收获种粒(grain)并碾磨种粒以制造膳食和提取油。此外，包含本发明的嵌合基因的种子或种粒(整个的、破裂的或压碎的)也是本发明的一部分。因此，本发明涉及获得油或膳食的方法，所述方法包括种植如上文所述的经转化的植物，任选地，用HPro抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒，并碾磨种粒，以制造膳食和提取油。本发明中还提供了涉及下述HPro抑制剂型除草剂的上述方法，所述除草剂选自异碼氟草、环磺酮、甲基磺草酮、pyrasulfotole、磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、苯卩比唑草酮、2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-1，3- 二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(I-甲基环丙基)丙-I，3-二酮。本文还提供了涉及下述HPH)抑制剂型除草剂的上述方法，所述除草剂是三酮类的类别的，例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮，或pyrazolinate的类别的，例如pyrasulfotole和苯批唑草酮，特别地选自环横酮、横草酮、苯批唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。
在本发明的含义内，“除草剂”被理解为是自身具有除草剂活性的物质，或者与改变其效力的添加剂(例如，增加其活性的物质(协同性物质)或限制其活性的物质(安全齐IJ))组合的物质。当然应当理解，就它们在实践中的应用而言，以本身已知的方式将上述除草剂与惯常用于农业化学中的配方佐剂组合。HPPD抑制剂型除草剂(例如三酮类的类别的那些，例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮，或pyrazolinate的类别的那些,例如pyrasulfotole和苯批唑草酮,特别地选自环磺酮、磺草酮、苯批唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮,更特别地,环磺酮)具有杰出的、针对广谱的经济上重要的单子叶和双子叶一年生有害植物的除草剂活性。活性物质还可高效作用于难以控制的从根莖、木料(wood stocks)或其它多年生器官产生枝条的多年生有害植物。本发明因此还涉及在包含根据本发明的HPro的植物作物中控制不想要的植物或用于调控植物生长的方法，其中向植物(例如，有害植物，例如单子叶或双子叶杂草或不想要的作物植物)、向种子(例如种粒、种子或营养繁殖体，例如块茎或具有蓓蕾的枝条部分)或向种植植物的区域(例如栽培下的区域)应用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的一种或多种HPF1D抑制剂型除草剂,特别地选自环磺酮、磺草酮、苯批唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。在该上下文中，三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯卩比唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，可例如栽种前(如果合适的话，还通过掺入土壤中来应用)、出苗前或出苗后应用。可用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)控制的单子叶和双子叶杂草的各代表由此被提及，但这种提及并不表示仅限某些物种下述属的单子叶有害植物山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agropyron)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、Apera、燕麦属(Avena)、臂形草属(Brachiaria)、雀麦属(Bromus)、蔡藜草属(Cenchrus)、鸭妬草属(Commelina)、狗牙根属(Cynodon)、莎草属(Cyperus)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、荸莽属(Eleocharis)、幡蜂草属(Eleusine)、画眉草属(Eragrostis)、野粟属(Eriochloa)、羊茅属(Festuca)、飘拂草属(Fimbristylis)、异蕊花属(Heteranthera)、白茅属(Imperata)、鸭嘴草属(Ischaemum)、千金子属(Leptochloa)、黑麦草属(Lolium)、雨久花属(Monochoria)、粟(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、薦草属(Phalaris)、牧梯草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、筒轴茅属(Rottboellia)、慈姑属(Sagittaria)、薦草属(Scirpus)、狗尾草属(Setaria)、高粱属(Sorghum)。下述属的双子叶杂草白麻属(Abutilon)、觅属(Amaranthus)、豚草属(Ambrosia)、Anoda> 春黄菊属(Anthemis)、Aphanes> 蒿属(Artemisia)、滨黎属(Atriplex)、雏菊属(Bellis)、鬼针草属(Bidens)、莽属(Capsella)、飞廉属(Carduus)、决明属(Cassia)、矢车菊属(Centaurea)、藜属(Chenopodium)、蓟属(Cirsium)、旋花属(Convolvulus)、曼陀罗属(Datura)、山蚂幢属(Desmodium)、Emex、糖芥属(Erysimum)、大戟属(Euphorbia)、 自瓣花属(Galeopsis)、牛膝菊属(Galinsoga)、拉拉藤属(Galium)、木槿属(Hibiscus)、蕃薯属(Ipomoea)、地肤属(Kochia)、宝盖草属(Lamium)、独行菜属(Lepidium)、母草属(Lindernia)、母菊属(Matricaria)、薄荷属(Mentha)、山靛属(Mercurialis)、粟米草属(Mullugo)、勿忘我属(Myosotis)、S 粟属(Papaver)、牵牛属(Pharbitis)、车前属(Plantago)、寥属(Polygonum)、马齿觅属(Portulaca)、毛莨属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、揮菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、酸模属(Rumex)、猪毛菜属(Salsola)、千里光属(Senecio)、田菁属(Sesbania)、黄花稳属(Sida)、白芥属(Sinapis)、爺属(Solanum)、苦苣菜属(Sonchus)、尖瓣花属(Sphenoclea)、繁缕属(Stellaria)、蒲公英属(Taraxacum)、遏蓝菜属(Thlaspi)、三叶草属(Trifolium)、荨麻属(Urtica)、婆婆纳属(Veronica)、堇菜属(Viola)、苍耳属(Xanthium)。在包含本发明的HPPD蛋白、DNA或嵌合基因并且还可显示出针对不同于HPH)抑制剂型除草剂的除草剂的一种其它除草剂抗性的根据本发明的转基因作物中，在有用的植物和观赏植物的经济上重要的转基因作物(例如谷物，例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱和粟、稻和玉蜀黍或者甜菜、棉花、豆类物种、油菜籽油菜、马铃薯、西红柿、豌豆的作物和其它蔬菜)中使用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类 别的(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂,特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，是优选的。因为其涉及与本发明所述的对HPro抑制剂型除草剂的耐受性不同的植物性质，产生较之现有植物具有经修饰的性质的新颖的植物的传统途径例如是传统育种方法和产生突变体。或者，具有经修饰的性质的新颖的植物可在重组方法协助下产生(见例如EP-A-0221044 Al、EP-A-0131624A1)。例如，下述已被描述于若干情况中-针对修饰在植物中合成的淀粉的目的，对作物植物进行重组修饰(例如WO92/11376, WO 92/14827, WO 91/19806)-对某些草铵膦类型(参见例如EP-A-0242236，EP-A-242246)或草甘膦类型(WO92/00377)或磺酰脲类型(EP-A-0257993，US-A-5013659)的除草剂具有抗性的转基因作物植物，-转基因作物植物，例如玉米、棉花或豆类物种，其能产生苏云金芽孢杆菌毒素(Bt毒素)，或其杂交体或突变体，这使得植物对某些害虫具有抗性(ΕΡ-Α-0193259)，-转基因作物植物，其具有经修饰的脂肪酸组成(WO91/13972)，-经遗传修饰的作物植物，其具有新颖的组成成分或次级代谢物，例如新颖的植物抗毒素(phytoalexins)，这带来了增加的疾病抗性(EPA309862，EPA0464461)，-经遗传修饰的植物，其具有降低的光呼吸，其特点为更高的产量和更高的胁迫耐受性(EPA 0305398)，-产生药学上重要或诊断上重要的蛋白的转基因作物植物(“分子制药”)，-因更高的产量和更高的品质而与众不同的转基因作物植物，-因新颖的性质的组合(例如上述新颖的性质的组合)(“基因堆叠”)而与众不同的转基因作物植物。可用来产生具有经修饰的性质的新颖的转基因植物的大量分子生物学技术原则上是已知的，例如 I. Potrykus 和 G. Spangenberg(编著)Gene Transfer toPlants, Springer Lab Manual (1995), Springer Verlag Berlin, Heidelberg, 或Christou, " Trends in Plant Science" 1(1996)423-431)。为进行此类重组操作，可将核酸分子引入质粒，这允许通过对DNA序列加以重组来进行诱变或序列修饰。例如，可在标准方法的协助下，进行碱基取代，除去部分-序列，或添加天然或合成的序列。为将DNA片段互相连接起来，可向片段添加连接物或接头；见，例如 Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY ；5 Winnacker;/ Gene und Klone",VCH Weinheim 2. ed.，1996。可例如通过下述方式来产生具有针对基因产物的降低的活性的植物细胞通过表达至少一种相应的反义RNA、用于获得共遏制效果的正义RNA或者形成双链沉默RNA分子(RNAi)的反义和正义RNA 二者的组合，或者通过表达至少一种相应构建的核酶(其特异性切割上述基因产物的转录本)来实现。为实现此，可首先使用包含基因产物的全部编码序列(包括可能存在的任何侧翼序列)的DNA分子，或者仅包含编码序列中的部分的DNA分 子，其中这些部分必须要足够长到能在细胞中带来反义效果。还可使用具有与基因产物的编码序列具有高同源性程度但是并非完全相同的DNA序列。当在植物中表达核酸分子时，获得的蛋白可被定位于植物细胞的任何区室。但是，为了实现在特别的区室中的定位，可例如将编码区域与确保在特定区室中定位的DNA序列连接起来。此类序列是技术人员已知的(见例如Braun等人，EMBO J. 11(1992)，3219-3227 ；ffolter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988)，846-850 ；Sonnewald 等人，Plant J. I (1991)，95-106)。但是，核酸分子还可表达于植物细胞的细胞器中。可通过已知的技术来再生转基因植物细胞，以产生完整植物。原则上，转基因植物可以是任何植物物种的植物，包括单子叶或双子叶植物。因此，可获得下述转基因植物，除了具有本发明的嵌合HPro基因之外，所述植物还具有同源(=天然)基因或基因序列的过表达、遏制或抑制或异源(=外来)基因或基因序列的表达导致的经修饰的性质。在本发明的植物、植物细胞或种子上，优选在还对生长调控因子(例如2，4_D或麦草畏)或对抑制必要的植物酶(例如乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶或谷氨酰胺合酶(GS))的除草剂或对来自磺酰脲、草甘膦或草铵膦和类似活性物质的组的除草剂有抗性的转基因作物中使用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂,特别地选自环磺酮、磺草酮、苯批唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮,更特别地,环磺酮。本发明因此还涉及应用到根据本发明的HPro耐受性植物上的除草剂的用途，用于控制有害植物(即杂草)，其还延伸至除了包含对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)、异P恶唑类的类别(例如异5恶氟草)或pyrazolinate的类别(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂(特别地，选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)的抗性之外还包含第二或更多种除草剂抗性的转基因作物植物。三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯批唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂,特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，可用于可润湿粉末、可乳化浓缩物、可喷雾溶液、粉剂(dusts)或颗粒剂形式的惯常制剂。取决于主要生物和/或物理化学参数，可以以多种途径来配制三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPH)抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。可能的制剂的例子是可湿性粉(WP)、水溶性粉(SP)、水溶性浓缩物、可乳化浓缩物(EC)、乳剂(EW)(例如水包油或油包水的乳剂)、可喷雾溶液、悬浮浓缩物(SC)、基于油或水的分散液、混合油剂溶液、胶囊悬浮液(CS)、粉剂(DP)、拌种(seed dressing)产品、通过播种和在土壤上使用的颗粒剂、微颗粒形式的颗粒剂(GR)、喷雾颗粒体、包被的颗粒剂和吸附颗粒剂、水分散颗粒剂(WG)、水溶性颗粒剂(SG)、ULV制剂、微胶囊和蜡。上述各个制剂类型原则上是已知的，并在例如Winnacker-Kiichler, " ChemischeTechnologie" [Chemical technology],第 7卷,C. Hanser Verlag Munich,第 4版· 1986 ; Wade van Valkenburg, " Pesticide Formulations " , Marcel Dekker, N. Y. ,1973 ；K. Martens, " Spray Drying" Handbook,第 3 版· 1979, G. Goodwin Ltd. London 中描述。需要的制剂辅助剂，例如惰性材料、表面活性剂、溶剂和其他添加剂也是已知的并在例如 Watkins, " Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers"，第
2版，Darland Books, Caldwell N. J. , H. v. Olphen, " Introduction to Clay ColloidChemistry";第2 版，J.Wiley & Sons, N. Y. ；C. Marsden, " Solvents Guide";第 2 版，Interscience, Ν· Υ·1963 ;McCutcheon' s " Detergents and Emulsifiers Annual",MC PubI. Corp. , Ridgewood N. J. ;Sisley 和 Wood, " Encyclopedia of Surface ActiveAgents " ，Chem. Pub I. Co. inc.，N. Y. 1964 ； Schonfeldt, " GrenzflachenaktiveAthyIenoxidaddukte " [Interface-active ethylene oxide adducts],ffiss. Verlagsgesell. , Stuttgart 1976 ；ffinnacker-Kiichler, " ChemischeTechnologie" [Chemical technology],第7卷,C. Hanser Verlag Munich,第 4版 1986 中描述。基于这些制剂，可与其他杀虫活性物质比如，例如杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀真菌剂以及与安全剂、肥料和/或生长调控因子组合制备，例如以预混(ready mix)或罐混(tank mix)的形式。可湿性粉是在可在水中均匀分散的制剂，并且其除了活性物质，也包含离子和/或非离子表面活性剂(湿润剂、分散剂)，例如除了稀释剂或惰性物质，包含聚氧乙烯化的烷基酚、聚氧乙烯化的脂肪醇、聚氧乙烯化的脂肪胺、脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、烷烃磺酸盐、烷基苯磺酸盐、木质素磺酸钠、2，2’ - 二萘基甲烷_6，6’ - 二磺酸钠、二丁基萘磺酸钠或油酰基甲基牛磺酸钠。为了制备可润性粉，除草活性物质被精细碾磨，例如在惯常仪器如锤式粉碎机、鼓风粉碎机和喷射粉碎机中，并与制剂辅助剂同时或随后混合。可乳化浓缩物是通过将活性物质溶解在有机溶剂(例如丁醇、环己烷、二甲基甲酰胺、二甲苯或其他高沸点芳香族或烃，或者有机溶剂的混合物)中然后添加一种或多种离子和/或非离子表面活性剂(乳化剂)来制备的。可使用的乳化剂的实例是烷基芳基磺酸钙例如十二烷基苯磺酸钙，或非离子乳化剂例如脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、环氧丙烷/环氧乙烷缩合物、烷基聚醚、山梨聚糖酯比如，例如山梨聚糖脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨聚糖酯比如，例如聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。粉剂是通过用精细分割的固体材料(比如，例如滑石、天然粘土例如高岭土、皂土和叶蜡石或硅藻土)碾磨活性物质获得的。悬浮浓缩物可以是基于水或基于油的。它们可以通过例如市售球磨机的方法湿磨制备，如果适当，添加例如上文已经在其他制剂类型中列出的表面活性剂。乳剂，例如水包油的乳剂(EW)可以通过例如搅拌器、胶体磨和/或静态混合器的方法用水性有机溶剂制备，如果适当，添加例如上文已经在其他制剂类型中列出的表面活性剂。可以通过将活性物质喷雾到吸附性的、颗粒化的惰性材料上，或者在粘合剂(例 如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠或矿物油)的帮助下将活性物质浓缩物施用于载剂(例如沙、高岭土或颗粒化的惰性材料)表面来制备颗粒剂。适当的活性物质也能够以惯常用于生产肥料颗粒的方法颗粒化，如果需要，作为与肥料的混合物。水分散颗粒剂通常是通过惯常方法(例如喷雾干燥、流化床造粒、圆盘造粒、用高速搅拌器混合以及在没有固体惰性材料下挤压)制备的。为制备圆盘颗粒、流化床颗粒、挤压颗粒和喷雾颗粒，参见例如"Spray-DryingHandbook"第 3 版 1979, G.Goodwin Ltd. , London ；J.E.Browning, " Agglomeration",Chemical and Engineering 1967,第 147 页及以下等· ； " Perry ' s ChemicalEngineer' s Handbook",第 5 版，McGraw-Hill, New York 1973,第 8-57 页中的方法。关于作物保护产品制剂的进一步详情，参见例如G. C. Klingman, " Weed Controlas a Science " , John Wiley and Sons, Inc. , New York, 1961,第 81-96 页和 J. D. Freyer,S. A. Evans, " Weed Control Handbook",第 5 版,Blackwell Scientific Publications,Oxford, 1968，第 101-103 页。通常，农业化学制剂包含按重量计从O. I %至99 %，特别是按重量计从O. I %至95%的根据本发明的化合物。在可湿性粉中，活性物质浓度是，例如按重量计约10至90%，按重量计、到100%的其余部分由惯常制剂组分组成。在可乳化浓缩物的情况下，活性物质浓度按重量计可总计约I至90，优选地5至80%。粉剂形式的制剂包含按重量计从I至30%的活性物质，优选地在大多数情况下为按重量计从5至20%的活性物质，可喷雾溶液包含按重量计约从0. 05至80，优选地从2至50%的活性物质。在水分散颗粒剂的情况下，活性物质含量部分取决于活性化合物是液体或是固体形式，以及使用的造粒辅助剂、填充剂等。例如在水分散颗粒剂的情况下，活性物质含量在按重量计I至95%之间，优选地按重量计10至80%之间。此外，如果适当，所述活性物质制剂包含每种情况下常规的辅助剂，例如粘合剂、湿润剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、防腐剂、防冻剂、溶剂、填充剂、载剂、着色剂、消泡剂、蒸发抑制剂以及PH和粘度调节剂。基于这些制剂，还可制备三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinates的类别的(例如pyrasulfotole和苯卩比唑草酮)的HPF1D抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)与其它杀虫活性物质(例如杀昆虫剂、杀螨剂、除草剂、杀真菌剂)以及与安全齐U、肥料和/或生长调控因子的组合，例如以将应用到根据本发明的HPro耐受性植物上的预混剂或罐混剂的形式。在混合的制剂或者在罐混剂中，可与三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯卩比唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)组合应用至根据本发明的HPH)耐受性植物的活性物质是，例如，基于对乙酰乳酸核酶、乙酰-CoA羧化酶、纤维素合酶、烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、谷氨酰胺合成酶、对轻苯基丙酮酸双加氧酶、八氢番茄红素去饱和酶、光合体系I、光合体系II、原卟啉原氧化酶的抑制的已知活性物质，如例如 Weed Research 26 (1986) 441-445 或"The Pesticide Manual"，14 版，TheBritish Crop Protection Council and the Royal Soc. of Chemistry，2003 和其中引用 的文献中所述。可与根据本发明的化合物组合的已知除草剂或植物生长调控因子是，例如，下述活性物质(根据 International Organization for Standardization (ISO)通过通用名命名的或通过化学名命名的化合物，如果合适的话，与编号一起)，并且总是包含所有使用形式，例如酸、盐、酯和异构体，例如立体异构体和光学异构体。在本文上下文中，通过举例的方式提到了一种以及在某些情况下若干种使用形式乙草胺(acetochlor)、阿拉酸式苯(acibenzolar)、阿拉酸式苯-S-甲基、三氟羧草醚(acif Iuorfen)、三氟羧草醚钠(acifluorfen-sodium)、苯草醚(aclonifen)、甲草胺(alachlor)、二丙烯草胺(allidochlor)、禾草灭(alloxydim)、禾草灭钠(alloxydim-sodium)、莠灭净(ametryne)、氨唑草酮(amicarbazone)、先甲草胺(amidochlor)、酉先啼石黄隆(amidosulfuron)、aminocyclopyrachlor^ aminopyralid、杀草强(amitrole)、氨基横酸铵(ammonium sulfamate)、环丙啼卩定醇(ancymidol)、莎稗憐(anilofos)、黄草灵(asulam)、阿特拉津(atrazine)、唑卩定块草(azafenidin)、四唑啼横隆(azimsulfuron)、叠氮津(aziprotryne)、BAH-043、BAS-140H、BAS-693H、BAS-714H、BAS-762H、BAS-776H、BAS-800H、氟丁酸草胺(bef Iubutamid)、草除灵(benazolin)、乙基草除灵(benazolin-ethyl)、bencarbazone、氟草胺(benfluralin)、呋草黄(benfuresate)、地散憐(bensulide)、甲基节啼黄隆(bensulfuron-methyl)、苯达松(bentazone)、双苯啼草酮(benzfendizone)、双环横草酮(benzobicyclon)、卩比草酮(benzofenap)、氟横胺草(benzofluor)、benzoylprop、甲羧除草醚(bifenox)、双丙氨酰膦(bilanafos)、双丙氨酰膦钠盐(bilanafos-sodium)、双啼苯甲酸(bispyribac)、双啼苯甲酸钠盐(bispyribac-sodium)、除草定(bromacil)、溴丁 酸草胺(bromobutide)、溴酷月亏(bromofenoxim)、溴苯臆(bromoxynil)、bromuron、buminafos、轻草酮(busoxinone)、丁草胺(butachlor)、氟丙啼草酯(butafenacil)、抑草磷(butamifos)、丁烯草胺(butenachlor)、仲丁灵(butralin)、丁氧环酮(butroxydim)、丁草敌(butylate)、唑草胺(cafenstrole)、双酉先草胺(carbetamide)、唑草酮(carfentrazone)、唑酮草乙酯(carfentrazone-ethyl)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、草灭平(chloramben)、chlorazifop、chlorazifop-butyl、氯溴隆(chlorbromuron)、氯草灵(chlorbufam)、伐草克(chlorfenac)、伐草克钠(chlorfenac-sodium)、燕麦酯(chlorfenprop)、整形醇(chlorf Iurenol)、甲基整形醇(chlorf lurenol-methyl)、氯草敏(chloridazon)、氯啼横ft. V Wls bh C ft. V Wls XUl V ft. V Wls XUl V 上 Uu VT、V' tra ^s. il 卜厂^ISIrSH -HT-M-T _h-^t(^e-m-c)-s-9-m-tm-s-nS:TCCTH,PJUT3zuaqo+Ja, (UojnJJnSAXOl^ a)继懲眷 MN], (I^s-S^xol^ a)蓄掛MM, (uaJAXOH+Ja)蓄科MM,(fnT3saEnJ0l^a)氣科恶 MN],fiTgT^3匾科修N], (UOJneJPJl^a)继響懲,(§1|&亡3)蒔裝N], QAl^aE-UOJnJIns+JaEm^a)塑鹅掛鍇稍fr,fiTISnlJIm^a)赋滅裝XN], (qjssdsa)fflK ^,oxdB轺科 Ji, (TT3亡 op§)M^Ji,T^s-STSUJI3a,(8Na)Sn , (UamJP) M 科轺，(JAdOSJP)収科握滅，(ap JEOJqJP-Snb 13蓉 ^ 0 M 琪科轺，(sn^p)琪科轺，(UAJpadOJdJP)^E咪，(PPumIaHdJP)轺F^ , (qjfnoulp)麄崁#,(qasoulp)x^ ^,(auJET3SUJP)赋MM, (UOJnJInsT3J+JiJP)塑氣蓄，(UJdJl^iJP) 0栌響，(d-PTIg^iTP)d-鍇科響frH, (PIIgl^iIP)鍇科響frH, (UAJPIm^iIP)￠:陳，WSfrM, (JnSadJdIJP)电科喾，塑勃§T (EnJPOS-3T3Jsadp)傾科轺，(UamJiTP)Ms锥，(Enjpos-JAdozUaJnIJJP)赛塑習MH , (JAdoiJnsp)塑習mh ,(UsTUaJnIJJP)鍇科M蓄，(SnbOZUSP)踅 0^, (UoJnXOUSP)
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X T9/S < SS06ST Zo三氟硝草醚(fluorodifen)、氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(f luoroglycofen-ethyI)、氟胺草唑(f lupoxam)、flupropacil、四氟丙酸(f Iupropanate)、氟卩定啼磺隆(flupyrsulfuron)、氟卩定啼磺隆-甲基-钠、抑草丁(fIurenol)、丁基抑草丁(flureno 1-butyl)、氟卩定草酮(fluridone)、氟草卩比酮(fIurochloridone)、氟草烟(f Iuroxypyr)、氯氟卩比氧乙酸(f luroxypyr-meptyl)、呋啼醇(f Iurprimidol)、呋草酮(fIurtamone)、嗪草酸(fIuthiacet)、嗪草酸甲酯(fluthiacet-methyl)、氟唑草胺(fluthiamide)、氟磺胺草醚(fomesafen)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、调卩比脲(forchlorfenuron)、杀木勝(fosamine)、呋氧草醚(furyloxyfen)、赤霉烯酸(gibberellic acid)、草铵勝(glufosinate)、L-草铵勝(L-glufosinate)、L-固杀草(L-glufosinate-ammonium)、固杀草(glufosinate-ammonium)、草甘勝(glyphosate)、草甘勝异丙基铵(glyphosate-isopropylammonium)、H-9201、halosafen、卩比氯黄隆(halosulfuron)、批氯黄隆-甲基(halosulfuron-methyl)、批氟氯禾灵(haloxyfop)、批氟氯禾灵-P(haloxyfop-P)、卩比氟氯禾灵_乙氧乙基(haloxyfop-ethoxyethyl)、卩比氟氯禾灵-P-乙氧乙基(haloxyfop-P-ethoxyethyl)、批氟氯禾灵-甲基(haloxyfop-methyl)、批 氟氯禾灵-P-甲基(haloxyfop-P-methyl)、环嗪酮(hexazinone)、HNPC-9908、H0K-201、丽-02、咪草酸(imazamethabenz)、咪草甲酯(imazamethabenz-methyl)、甲氧咪(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、唑卩比啼横隆(imazosulfuron)、抗倒胺(inabenf ide)、節草酮(indanofan)、卩引哚基醋酸(indoleacetic acid) (IAA)、4_ 卩引哚-3-基丁酸(IBA)、碘横隆(iodosulfuron)、甲基碘横隆钠(iodosulfuron-methyl-sodium)、碘苯臆(ioxynil)、草特灵(isocarbamid)、异丙乐灵(isopropalin)、异丙隆(isoproturon)、异恶隆(isouron)、异恶酰草胺(isoxaben)、异恶氯草酮(isoxachlortole)、异恶氟草、恶草醚(isoxapyrifop)、KUH-043、KUH-071、隆草特(karbutilate)、ketospiradox、乳氟乐草灵(Iactofen)、环草定(Ienacil)、利谷隆(Iinuron)、马来酸餅(maleic hydrazide)、MCPA、MCPB、MCPB-甲基、MCPB-乙基和 MCPB-钠、mecoprop、mecoprop-sodium、mecoprop-butotyl、mecoprop-P-butotyl、mecoprop-P- 二甲基按、mecoprop-P-2-乙基己基、mecoprop-P-钟、苯噻草胺(mefenacet)、氟磺酰草胺(mefluidide)、缩节胺(mepiquat-chloride)、磺胺磺隆(mesosulfuron)、甲横胺横隆(mesosulfuron-methyl)、甲基苯噻隆(methabenzthiazuron)、威百亩(metam)、恶唑酸草胺(metamifop)、苯嗪草酮(metamitron)、卩比唑草胺(metazachlor)、灭草定(methazole)、去草酮(methoxyphenone)、甲基杀草隆(methyldymron)、1_甲基-环丙烯、甲基异硫氰酸盐(methylisothiocyanate)、卩比喃隆(metobenzuron)、卩比喃隆、溴谷隆(metobromuron)、异丙甲草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺(S-metolachlor)、横草唑胺(metosulam)、甲氧隆(metoxuron)、嗪草酮(metribuzin)、横隆(metsulfuron)、甲横隆(metsulfuron-methyl)、草达灭(molinate)、庚酸草胺(monalide) ^monocarbamide^monocarbamide 二氢硫酸盐、绿谷隆(monolinuron)、单啼横隆(monosulfuron)、灭草隆(monuron)、MT 128、MT-5950 即N-[3-氯-4-(1-甲基乙基)-苯基]-2-甲基戊酰胺、NGGC-011、萘丙胺(naproanilide)、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、NC_310 即 4_(2，4_二氯苯甲酰基)_1_ 甲基-5-节基氧卩比唑、草不隆(neburon)、烟啼磺隆(nicosulfuron)、氟氯草胺(nipyraclofen)、甲磺_ 挪(PrObeMZOle) > 麯展 猜(P3fluaz01) > Jfasllf(PrOCySine) > M 麯弟^(prodiaminerprif Iuralin ^裙 園(profoxydimrs^M(prohexadioners^Mld(ProhexadiOneICalCiUm) > Prohydrojasmone^4了(PrOmetOn) 了^^, (PrOmetryn)
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33(thifensulfuron-methyl)、禾草丹(thiobencarb)、仲草丹(tiocarbazil)、甲黄隆对(tralkoxydim)、里予麦畏(tri-allate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、三嗪氟草胺(triaziflam)、 triazofenamide、 苯石黄隆(tribenuron)、 苯石黄隆-甲基(tribenuron-methyl)、三氯乙酸(trichloroacetic acid) (TCA)、绿草定(triclopyr)、灭草环(tridiphane)、草达津(trietazine)、三氟卩定磺隆(trifloxysulfuron)、三氟卩定磺隆钠(trifloxysulfuron-sodium)、氟乐灵(trifluralin)、triflusulfuron、氟胺横隆-甲基(triflusulfuron-methyl)、 三甲隆(trimeturon)、 trinexapac、 抗倒 酉旨(trinexapac-ethyl)、三氟甲石黄隆(tritosulfuron)、tsitodef、烯效唑(uniconazole)、烯效唑-P (uniconazole-P)、灭草敌(vernolate)、ZJ-0166、ZJ-0270、ZJ-0543、ZJ-0862 和下
述化合物
权利要求
1.包含与可在植物中表达的启动子有效连接的编码序列的嵌合基因，其特征在于，所述编码序列包含编码聚球藻亚科羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白质或与聚球藻亚科HPPD蛋白质具有至少75%序列同一性的蛋白质的核酸序列。
2.根据权利要求I的嵌合基因，其特征在于，HPro蛋白质是聚球藻属物种HPro蛋白质或与聚球藻属物种HPro蛋白质具有至少75%序列同一性的蛋白质。
3.权利要求I或2的嵌合基因，其中编码所述蛋白质的DNA可通过使用至少20个核苷酸的引物或探针从聚球藻属DNA获得，所述引物或探针与SEQ ID No. I的DNA杂交。
4.根据权利要求I至3中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码包含SEQIDNo. 4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列的HPH)蛋白质，或者与SEQ ID No. 4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列具有至少75%序列同一性的蛋白质。
5.根据权利要求I至4中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码HPH)蛋白质序列，并且包含SEQ ID No. 3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的核苷酸序列，或者是在严格杂交条件下与此类序列杂交的DNA。
6.根据权利要求I至5中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其在HPH)编码序列的下游包含编码在植物中具有活性的转运肽的核酸序列，使得转运肽/HPro融合蛋白被所述嵌合基因编码。
7.包含根据权利要求I至6中任意一项所述的至少一种嵌合基因的载体。
8.植物细胞、植物部分、植物或种子，其特征在于其包含根据权利要求I至7中任意一项所述的嵌合基因。
9.权利要求8的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含编码PDH酶的嵌合基因。
10.权利要求8或9的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含赋予对生长调控因子，优选对2，4-D或麦草畏，和/或对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草剂的耐受性的一种或多种嵌合基因。
11.获得对HPH)抑制剂型除草剂耐受的植物的方法，其特征在于，将根据权利要求I至6之一的嵌合基因引入所述植物。
12.用于在区域或田间控制杂草的方法，所述区域或田间含有根据权利要求8、9或10的植物或种子，或者待栽种权利要求8、9或10的植物或种子，所述方法包括向所述区域或田间应用对所述杂草来说是毒性的并且不显著影响根据权利要求8、9或10的种子或植物的剂量的HPH)抑制剂型除草剂，。
13.根据权利要求12的用于控制杂草的方法，其特征在于，所述HPH)抑制剂选自异5恶氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙 _1，3_ _■丽和 2_ 氛基 _3_ 环丙基-I- (2_S02CH3_4_2，3C12苯基)丙-I，3- 二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和节草唑。
14.用于获得油或膳食的方法，所述方法包括种植根据权利要求8、9或10的植物，任选地，用HPH)抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒，以及碾磨种粒，以制造膳食，以及任选地，提取油。
15.聚球藻亚科HPro或者与聚球藻亚科HPro具有至少75%序列同一性的HPro用于使得植物对HPro抑制剂型除草剂耐受的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述HPro抑制剂型除草剂选自异5恶氟草、环磺酮、甲基横草丽、横草丽、pyrasulfotole、苯卩比唑草丽、2_氛基-3-环丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙-1，3- 二 丽和 2_ 氛基-3-环丙基-I-(2-S02CH3-4_2，3 Cl2 苯基)丙-1，3- 二丽、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和节草唑。
全文摘要
本发明涉及编码从属于亚科聚球藻亚科的细菌获得的编码羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC 1.13.11.27，本文中缩写为HPPD)的核酸序列以及由其编码的蛋白，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白或嵌合基因用于获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。
文档编号A01H5/00GK102906252SQ201080064637
公开日2013年1月30日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者F·波雷, B·拉博尔, N·克尼特尔-奥特勒本, G·朗格, A·舒尔茨, R·海因 申请人:拜尔知识产权有限公司