专利名称：含有冰结构蛋白的冷冻糖食产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及冷冻乳制糖食产品，其含有多个单个的糖食，并且含有冰结构蛋白。
背景技术：
冷冻糖食业一直在寻求设计满足消费者需求的新产品。然而冷冻的糖食产品，诸如冰淇淋和水冰倾向于要么装在容器中如冰淇淋盆或筒状分配器中销售，要么以独立包装物品形式如冰淇淋棒/冰棒销售，相对来说近来的产品创新在于装满了多个冰淇淋珠的单个分装容器的形式。冰淇淋珠是通过将统一尺寸的液体组合物液滴投入到典型的充满液态氮的冷冻室中来制备的。
部分消费者期望冰珠产品能够具有自由流动的特性，换句话说，也就是一部分冰珠能够从容器中流出。然而，所存在的问题是除非冰珠在很低温度下贮存，典型地是在低于-29℃下，否则冰珠将变得粘稠和溶结，并且不再自由流动。此外，如果冰珠不在此温度下贮存，它们将变软和变形，尤其是在容器底部的那些冰珠。在整个冷冻链中保持如此的低温是不可能的，尤其在零售点，因此会导致产品货架期缩短以及销售时产品外观不令人满意。
发明概述我们现在发现，向冷冻的乳制糖食产品中加入冰结构蛋白，可减小产品变粘的趋势，并使得自由流动的冷冻糖食产品的制作得以进行，其制作可使产品比现有产品较长时间地保持自由流动的特性，并且在较高的贮藏温度下，与现有产品相比，这样的产品外观明显得到了改善，即使在-20℃以上的温度下贮存数周后。
因此，本发明提供了一种冷冻糖食产品，其含有多个分立的、未充气的乳制冷冻糖食，该产品中每个分立的冷冻糖食能够直接与其余分立的冷冻糖食接触，该冷冻糖食含有冰结构蛋白(ISP)并且平均体积小于1ml。
优选地，该产品含有至少10个分立的冷冻糖食，例如至少20、50或100个分立的冷冻糖食。
在一个优选的实施方案中，分立的冷冻糖食的平均体积小于0.5ml。冷冻糖食可以是，例如冰珠状。
优选地，该乳制产品含有至少约3wt％的非脂的乳固形物(MSNF)。例如，该产品可选自冰淇淋、冻酸奶或奶冰。优选地，该产品含有至少约15wt％的固形物。典型地，该产品含有约2wt％-15wt％的脂肪。
在相关的方面中，本发明提供了一种产品，其含有一个装满了本发明的冷冻糖食产品的容器。优选地，该容器的容积为从约100ml到1000ml。
本发明还提供了一个包含多个容器的零售单位，每个容器含有本发明的产品，其中每个容器中的产品是不同的。
发明详述除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科技术语，对于本领域普通技术人员来说(如冷冻糖食制造业，分子生物学及生物化学)都具有相同的含义。各种术语的定义和解释，以及冷冻糖食制造业中使用的技术都可在IceCream，4thEdition，Arbuckle(1986)，Van Nostrand Reinhold公司，纽约，NY中找到。分子和生化方法中使用的是常规技术(总体参见，Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3nded.(2001)Cold Spring Harbor，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Molecular Biology(1999) 4thEd，John Wiley&Sons，Inc.-and the full version entitled CurrentProtocols in Molecular Biology)。
冰结构蛋白质冰结构蛋白质(ISPs)是当冷冻发生时，能够影响所形成的冰晶粒形状和大小并且能够抑制冰的再结晶的蛋白质(Clarke等.，2002，Cryoletters 2389-92)。最初这些蛋白大都是在0℃以下的环境中存活的生物体中发现的，并且认为保护生物体免受生物体的细胞内冰晶形成的伤害。出于此原因，许多冰结构蛋白质也被称作抗冷冻蛋白(AFPs)。在本发明的上下中，ISP被定义为一种具有抑制冰再结晶活性的蛋白质。
抑制冰再结晶活性的属性通常可通过WO00/53029所公开的改性木条试验方法来测定。
将所研究的30％(w/w)蔗糖溶液，取2.5μl移入一个干净的、适当标记过的16mm圆形盖玻片上。将第二个盖玻片置于溶液滴的上端，并且手指与拇指间受挤压而成三明治结构。将该三明治放入被保持在-80℃下的干冰盒中的己烷浴中。当所有的三明治被制备好后，利用镊子将三明治从-80℃的己烷浴移入到观察室中，该观察室含有在干冰中预冷到-6℃的己烷。在转移到-6℃后，能看到三明治从透明的变为不透明的外观。图像被视频相机记录下来并且被转入到使用了20倍放大倍数的图像分析系统(LUCIA，Nikon)中。在时间＝0时记录每条图像，并在60分钟后再次进行记录。试验中的冰晶大小是通过将载玻片置于一个温度控制的低温保持器中(Bright Instrument Co Ltd，Huntington，UK)来进行比较。样品的图像凭借Sony单色CCD视频相机被转移到Quantimet 520MC图像分析系统(Leica，Cambridge UK)中。
冰晶大小测定可通过围绕冰晶手工绘制来完成。典型地，对于每个样品至少要测定100-400个晶体尺寸。冰晶的尺寸被取为每个晶体的2D投影的最长尺寸，平均晶体尺寸被测定为单个晶体尺寸的个数平均。冰晶的大小在两次试验中得到对比。如果在30-60分钟时的尺寸与开始时(t＝0)的尺寸相类似或增大了一点(低于10％)，和/或晶体尺寸小于20微米，优选地5-15微米，那么这是具有好的冰晶重结晶特性的指示。
明显的冰重结晶抑制活性可被定义为当30wt％的蔗糖溶液中含有0.01wt％的ISP溶液时，将其迅速冷却(至少Δ50℃每分钟)到-40℃，迅速加热(至少Δ50℃每分钟)到-6℃，然后保护在此温度，则导致冰晶体的平均尺寸在一小时内增加小于5μm。
ISP的类型用于本发明的ISP可来源于任何来源，只要它们在食品中适宜作内含物就行。目前在鱼类、植物、地衣，真菌，微生物和昆虫中鉴定了ISPs，此外，许多合成的ISP已被记载。
鱼类ISP原料的例子是AFGP(例如可从大西洋的鳕、格陵兰的鳕和太平洋小鳕中获得)、I型的ISP(例如从冬性比目鱼、石首鱼、短角鱼和污秽的鱼Grubby sculpin中获得)、II型的ISP(例如从海洋乌鸦、胡瓜鱼和大西洋青鱼中获得)、III型的ISP(例如从海洋大头鱼、大西洋狼鱼、辐射状的线鳚、摇摆状的锦鳚和熔岩状的粘鱼中获得)。
特别优选III型的ISP。III型的ISP典型地具有大约6.5-14kDa的分子量、β-三明治的二级结构和球状的三级结构。许多编码III型ISP的基因已经被克隆(Davies和Hew，1990，FASEB J.42460-2468)。特别优选的III型的ISP是III型HPLC-12(Swiss-Prot蛋白资料库中的序号为P19614)。
WO99/37673和WO01/83534记载了地衣AFPs。
从中获得ISP的植物实例公开在WO98/04699和WO98/4148中，并且包括大蒜-芥菜、蓝木紫苑、春燕麦、冬芹、冬油菜、抱子甘蓝、胡萝卜(GenBank登录号CAB69453)、Dutchman’s breeches、大戟、萱草、冬麦、维吉尼亚水迹叶、浅叶车前草、车前草、茅草、肯塔基州蓝草、东方木棉、白像树、冬季黑麦(Sidebottom等，2000，自然406256)、又苦又甜的茄属植物、马铃薯、繁缕、蒲公英、春麦和冬麦、黑小麦、长春花类植物、紫罗兰和草。
ISP可通过任何适宜的方法，例如WO98/04699和WO98/4148中公开的分离方法从自然界物质中提取而获得。
或者，ISP可通过使用重组技术而获得。例如宿主细胞，典型地，微生物或植物细胞可以被改性以表达ISP，然后，ISP被分离且被用于本发明。将编码ISP的核酸构建物引入宿主细胞中的技术在现有技术中是众所周知的。
典型地，一种适宜的宿主细胞或生物体可通过编码所期望的ISP的核酸构建物来进行转化。编码多肽的核酸序列被插入到合适的表达载体中，该表达载体编码转录和翻译的必需元件，并且以这样一种方式被插入使得该核酸序列在合适的条件下被表达(如没适当的方向和正确的读框结构以及适宜的靶向和表达序列)。对于本领域技术人员来说，构造这些表达载体所需的方法是公知的。
许多表达系统可以被用来表达编码序列的多肽。这些系统包括但不限于细菌、真菌(包括酵母)、昆虫细胞体系、植物细胞培养体系以及用适宜的表达载体转化的植物。优选考虑那些食品级的宿主——‘通常被认为是安全的’(GRAS)。
适宜的真菌种包括酵母，例如(包括但不限于)糖酵母菌属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、假丝酵母属、裂殖酵母菌属中的那些菌种，丝状真菌种如(不限于)曲霉属、木霉属、丢霉属、脉孢菌属、镰刀霉属中的那些菌种。优选菌种选自酵母，最优选地是糖酵母菌属的菌种，如啤酒糖酵母。其中ISP的糖基化导致了活性降低，因此优选宿主表现出降低的异源蛋白的糖基化。
各种各样的植物和植物细胞体系也能够用所需的多肽的核酸构建物进行转化。植物品种的例子包括玉米、西红柿、烟草、胡萝卜、草莓、油菜籽和甜菜。
编码ISP的序列优选地与自然界中鉴定的ISP在氨基酸水平上至少有80％的同一性，更优选至少有95％或100％的同一性。然而，本领域技术人员可进行不降低ISP的RI活性的保守替代或其余氨基酸的改变。为了本发明的目的，与天然存在的ISP具有高水平同一性的ISP也包含在术语“ISP”中。
冷冻糖食产品冷冻的乳制糖食是典型地含有乳或乳固形物的糖食，如冰淇淋、奶冰、冻酸奶和冻果露。术语“乳”包括乳替代物如豆乳，尽管优选的乳来源于雌性哺乳动物。优选冷冻的乳制糖食是冰淇淋或奶冰。
本发明的冷冻糖食产品含有多个分立的冷冻糖食。冷冻糖食是通过使用包装纸或其它的非食用性包装材料，或通过区室化而使得相互之间没有分离的。相反，单个冷冻糖食被包装后能够直接与其它单个冷冻糖食接触。然而，单个冷冻糖食能够相对移动，换句话说它们在基质例如包衣中不是固定不动的。
在一个高度优选的实施方案中，本发明的冷冻糖食产品是自由流动的。优选地，本发明的冷冻糖食产品在-10℃下贮存至少10天，更优选地贮存至少15或20天后仍保持自由流动性。
冷冻糖食相对较小，如平均体积小于1ml，更优选小于0.5ml，例如，直径在0.5-1.0mm的冰珠，其体积为大约0.065ml-0.5ml。典型地，分立的冷冻糖食具有最小的平均体积，使得消费者能够容易区分每种糖食。例如，优选分立的冷冻糖食所具有的最小平均体积大约至少为0.02ml。
分立的冷冻糖食可以被制作成任何形状，如立方体或球形。优选地，冷冻糖食是坚固的球体。
冷冻糖食可以是复合产品的形式，其中至少产品的一部分或一块，如核或覆层，不含有ISP。此情形的一个实例是一种产品，其含有缺少ISP的冰淇淋核心，用含有ISP的冰淇淋或奶冰的覆层包裹。优选地，组合物糖食的外层基本上含有ISP，即将与其它分立的冷冻糖食相接触的区域。将会认识到，在组合物产品的情况下，所添加的ISP数量的wt％的计算只与含有ISP糖食的那些组分有关，而与整个产品无关。
冷冻糖食是未充气的。未充气的意味着冷冻糖食具有小于20％，优选小于10％的膨胀量。未充气的冷冻糖食没有经历预先准备的步骤，如搅拌以增加气体含量。虽然如此，在制备未充气的冷冻糖食期间，低含量的气体是受欢迎的，如空气，可以被掺入到产品中。
含乳的冷冻糖食优选地含有至少约3wt％非脂乳固体(MSNF)，更优选含有约5-25wt％的MSNF。奶冰通常含有至少约10或11wt％的MSNF。冰淇淋通常含有至少18或20wt％的MSNF。含乳的冷冻糖食也典型地含有至少2wt％的脂肪。奶冰通常含有小于7wt％的脂肪，而冰淇淋通常含有至少8或10wt％的脂肪。在一些技术方案中，优选总脂肪含量低于8wt％，更优选低于6wt％。
本发明的冷冻糖食典型地含有一种或多种稳定剂，如一种或多种选自树胶、琼脂、海藻胶及其衍生物、凝胶、果胶、卵磷脂、羧甲基纤维素钠、角叉胶和丹麦琼脂的稳定剂。优选使用稳定剂的混合物，如树胶和角叉胶的混合物。在一个优选的实施方案中，冷冻糖食含有约0.1-1wt％的稳定剂。
本发明的冷冻糖食典型地含有至少约0.0005wt％的ISP。ISP可以以很低的浓度使用，因此优选地，糖果含有小于0.05wt％的ISP。优选范围为大约0.001-0.01wt％，更优选为0.005-0.01wt％。
本发明的冷冻糖食可使用许多本领域公知的技术进行制作。例如，通过将液体混合物液滴分散到液态氮的冷冻室中(参见WO96/29896)，可制作自由流动的冰珠。其它形状可通过模制技术制作出来，例如将液体预混料置于冷却模具中。或者，可以在最初冷冻后且冰淇淋仍旧软时将冰淇淋及类似物引于模具中，然后在模具中硬化。模制的产品可具备复杂的形状和高度的表面清晰度。
冰淇淋产品及类似物不需要经历-20℃--25℃以下的冷硬化步骤，尽管如果需要的话可以使用，尤其是若产品是具有不含ISP的覆层或核心的复合产品。
本发明的冷冻糖食产品可以被包装在在容器中，作为单个的单元被销售给消费者。这样的容器的容积典型地为100ml-1000ml，如为200ml-500ml。然而，为了零售，产品也可以被包装在更大的容器中，其中在更大的容器中产品被分散在较小的容器中以便零售，如在快速食品出口中或作为挑选的“n”混合模式，在那里消费者可以从本发明的具有不同形状、风味和/或色泽的冷冻糖食中选择。这些更大的容器可以，例如具有超过1000ml的容积，如至少2000ml或5000ml的容积。
现在参照以下提到的实施例将进一步描述本发明，但仅仅是阐述性的而不是限定性的。
实施例实施例1-6和比较实施例1-5-冰淇淋/奶冰珠原料和方法根据下述配方生产冰淇淋/奶冰预混物。
表1注释I乳蛋白源可以是任何典型地用于冰淇淋或奶冰的成分，如SMP(脱脂乳粉)。
II任何典型地用于冰淇淋或奶冰的脂肪源，如可可油、黄油或奶油。
III糖源可以是任何典型地用于冰淇淋或奶冰的成分，如蔗糖或以60/40比例混合的或以98/2混合的蔗糖/果糖共混物或以76/24比例的蔗糖/MD40的共混物。
IV LBG(槐豆胶)或槐豆胶/瓜尔胶/角叉胶的共混物，例如以90/0/10或61/30/9比例混合的共混物。
V任何典型使用的冰淇淋或奶冰的风味剂。
VI任何典型使用的冰淇淋或奶冰的乳化剂，如棕榈酸单甘油酯(MGP)或甘油单硬脂酸酯(GMS)。
TS表示以重量百分比计的总固形物含量。
TF表示以重量百分比计的总脂肪含量(包括乳化剂)。
MSNF表示以重量百分比计的非脂乳固体含量。
这些值的测定方法在现有技术中是常规的。
混合步骤将所有干组分加入到预先加热到80℃的热水中，接着搅拌5分钟。然后添加所有的液体组分和酸化剂，贮存1分钟，在82℃持续巴氏杀菌33秒，在150-170巴的压力下均质并且冷却到5℃，直至所需的。为了本研究的目的，ISP的添加是在巴氏杀菌后，巴氏杀菌前添加可能需要将同样重量的水分从配方中除去。
微粒形成将液体置于一个5升容积的、直接与内径为1mm的喷嘴相连的混合室中并在5℃下混合。依次将该液体滴落到液态氮中，在那里液体迅速被冷冻为接近球状。从这里从底部起将其注入到圆柱形杯(高95mm，底部外径63mm。顶部内径46mm)中，注满时重量为85g，底部用铁密封。然后将产品置于-25℃直至需要测试时。
自由流体试验将样品置于-25℃或-10℃的恒温下保持50天。在-25℃下将罐(六个复制品)中的样品手工挤压，然后将罐打开且进行翻转，根据下述5级评价内容物的流动性1＝微粒离开罐并且完全自由流动2＝如果微粒没有离开罐处在1，则罐再次被关闭并且翻转5次以分离微粒，当盖子被打开并进行翻转时，微粒离开3＝如同2，但在微粒离开前还需要轻轻挤压边缘两下。看小于包装的残余变形。
4＝如同3，但需要更用力地挤压两下而使包装变形，在微粒被去除后包装仍旧处于变形状态5＝不能使微粒离开根据能够接受的流动性，挤压级数3被认为是最大的。表2中所示的级数是由六个重复样品获得的平均值。相对于时间进行试验，每隔几天取样。
结果表2
比较实施例1是一种TS为17％的对照样本，不含有ISP。在-25℃下经过50天后，样本不可接受。在-10℃下2天后，样本就变得不可接受了。
实施例1在TS为17％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃实验时可自由流动。在-10℃下5天后，样本仍然保持自由流动，直到15天后才达到与实施例1a一样的不可接受的程度。
比较实施例2是一种TS为20％的对照样本，不含有ISP。在-25℃下50天后，样本仍保持自由流动。在-10℃下15天后，样本变得不可接受。
实施例2a在TS为20％时含有0.002％的ISP，样本在-25℃时在50天后仍然可自由流动。在-10℃下40天后，样本变得不可接受。
实施例2b在TS为20％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃时在50天后仍然保持自由流动，在-10℃时下在50天后，样本变得不可接受，与比较实施例2和实施例2a相比，表现出显著的改进。
实施例2c在TS为20％时含有0.007％的ISP，样本在-25℃下在50天后仍然保持自由流动，在-10℃时下在40天后，样本变得不可接受，与比较实施例2和实施例2a相比，表现出显著的改进。
比较实施例3是一种TS为30％的对照样本，不含有ISP。在-25℃下在50天后，样本仍保持自由流动。在-10℃下在3天后，样本变得不可接受。
实施例3在TS为30％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃下在50天后仍保持自由流动，在-10℃时下在15天后，样本变得不可接受，与比较实施例3相比，表现出显著的改进。
比较实施例4是一种TS为35％的对照样本，不含有ISP。在50天后，样本仍保持自由流动。在-10℃下在15天后，样本变得不可接受。
实施例4在TS为35％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃和-10℃下在50天后都可保持自由流动，与比较实施例4相比，表现出显著的改进。
比较实施例5是一种TS为35％的对照样本，不含有ISP。样本在-25℃下在50天后，仍保持自由流动。在-10℃下在1天后，样本就变得不可接受。
实施例5在TS为35％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃下在50天后仍然保持自由流动，在-10℃下在30天后，样本变得不可接受，与比较实施例5相比，表现出显著的改进。
实施例6在TS为25％时含有0.005％的ISP，样本在-25℃下在50天后仍保持自由流动，在-10℃下在10天后，样本变得不可接受。
总的来说，ISP的加入会显而易见地导致特性得到改进的产品，并且改善了贮存稳定性，正如在-10℃下贮存后，与缺乏ISP的相应产品相比，较好的流动性所证明的。
上述各个段落章节中，本发明的各种特征和实施方案，通过适当改变可应用到其它段落章节中。因此，在某一部分中详述的特征可与其余部分中详述的特征适当地组合。
以上说明书中提到的所有出版物在这里被引入作为参考。对发明所描述的方法和产品所做的各种改进和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，并不脱离本发明的范畴。尽管结合具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但是应理解本发明所要求保护的并不限于这些具体实施方案。确实，为了实施本发明而进行的各种改变对于相关领域技术人员来说是显而易见的，并且被包含在以下权利要求书的保护范围之内。
权利要求
1.一种冷冻糖食产品，含有多个分立的、未充气的乳制冷冻糖食，该产品中每个分立的冷冻糖食能够直接与其它分立的冷冻糖食接触，该冷冻糖食含有冰结构蛋白(ISP)并且平均体积小于1ml。
2.根据权利要求1所述的产品，它含有至少10个分立的冷冻糖食。
3.根据权利要求1所述的产品，它含有至少100个分立的冷冻糖食。
4.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中分立的冷冻糖食的平均体积小于0.5ml。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的产品，它是未充气的冰淇淋或奶冰。
6.根据权利要求5所述的产品，其含有至少约15wt％的固形物。
7.根据权利要求5所述的产品，其含有约2-15wt％的脂肪。
8.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中所述的ISP是鱼类的III型ISP。
9.根据权利要求8所述的产品，其中所述的ISP是III型AFP HPLC-12。
10.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中冷冻糖食含有至少0.0005wt％的ISP。
11.一种产品，其包括一个装满了根据权利要求1-10中任一项权利要求所述的冷冻糖食产品的容器。
12.根据权利要求11所述的产品，其中所述容器的容积为100ml-1000ml。
13.一个包含多个容器的零售单位，每个容器含有如权利要求1-10中任一项权利要求所述的产品，其中每个容器中的产品是不同的。
全文摘要
提供了一种含有多个分立的、未充气的乳制冷冻糖食的冷冻糖食产品，每个分立的冷冻糖食能够直接与该产品中的其它分立的冷冻糖食接触，该冷冻糖食含有冰结构蛋白(ISP)且平均体积小于1ml。
文档编号C07K14/415GK1889851SQ200480036578
公开日2007年1月3日 申请日期2004年9月20日 优先权日2003年12月10日
发明者N·M·林德纳, J·R·奥尔德罗伊德, A·肖特洛, D·J·托厄尔 申请人:荷兰联合利华有限公司