用于治疗mcp-1/ccr2相关疾病的分子及其使用方法

专利名称：：用于治疗mcp-1/ccr2相关疾病的分子及其使用方法用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病的分子及其使用方法本发明的领域和背景本发明涉及新的分子，更具体地，涉及治疗MCP-1/CCR2相关疾病，例如炎症性疾病和癌症的方法。在过去的几年，描述了越来越多的白细胞化学吸引剂/活化因子(趋化因子)[Oppenheim，J.J."Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);SchallandBacon,Curr.Opm.Immunol.,6:865-873(1994);Baggiolmi,M.,""/.,Adv.Im腸l.,55:97-1-79(1994)]。应答早期炎症性介导物例如IL-1卩或TNF-a，各种各样的细胞类型产生和分泌了趋化因子。趋化因子超家族包括两个主要的分支a-趋化因子(也称为CXC趋化因子)和(3-趋化因子(也称为CC趋化因子)。这种分类基于氨基酸序列中的前两个半胱氨酸是被单个氨基分隔(CXC)还是相邻的(CC)。a-趋化因子分支包括蛋白质例如IL-8、嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)、黑素瘤生长刺激活性(MGSA/gro或GROa)和ENA-78,它们每一种都主要对嗜中性粒细胞和T、淋巴细胞具有吸引和活化效应。P-趋化因子分支的成员影响其他血细胞类型，例如单核细胞、淋巴纟田月包、p耆石咸'(i细月包禾口p耆曙纟工细月包[Oppenheim,J.J.a/"Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);Baggiolmi,M.,e/1a/.,Adv.Imunol.,55:97-179(1994);MillerandK腦gel,CntRev.Immunol.,12:17-46(1992);Jose,P.J.,"a/.,J.Exp.Med.,179:881-118(1994);Ponath,P.D.,""/.,J.Clm.Invest,97:604-612(1996)]，包括蛋白质例如单核细胞趋化性蛋白1-4(MCP-l、MCP-2、MCP-3和MCP-4)、RANTES和巨噬细胞炎症性蛋白(MlP-la和MIP-l卩)。趋化因子超家族的第三个较小的分支包括膜结合趋化因子。这种类型的成员被称为CX3C趋化因子[Bazan,J.F.，""/.,Nature385:640-644(1997)]。趋化因子可以介导针对白细胞的一系列前炎症性影响，例如趋化性的触发、脱粒作用、脂质介导物的合成以及整联蛋白活化[Oppenheim，J.J.e/1a/.,Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);Baggiolini,M,a/.,Adv.Imunol.,55:97-179(1994);Miller,M.D.andKrangel,M.S.,Cnt.Rev.Immunol.,12:17-46(1992)]。趋化因子结合属于G-蛋白偶联七跨膜结构域蛋白质家族的特定的纟田月包表面受体[Murphy,P.M.,Annu.Rev.Immunol.,12:593-633(1994)],其被称为"趋化因子受体"。在结合它们的同源配体时，趋化因子受体通过相关的三聚G蛋白来转导细胞内信号，引起细胞内钙浓度的快速提高、细胞形状的改变、细胞粘附分子表达的提高、脱粒作用和细胞迁移的促进，等等。已经暗示趋化因子是过敏性、炎症性和自体免疫性失调和疾病，如。孝喘、动脉粥样硬化、血管球性肾炎、胰腺炎、再狭窄、类风湿性关节炎、糖尿病性肾病、肺纤维化和移植排斥的重要的介导物。特别地，作用于其受体CC趋化因子受体2(CCR-2)的单核细胞化学吸引物-l(MCP-1)在各种症候中起作用。在与它的受体结合时，MCP-1诱导细胞内4丐浓度的快速提高，其引起细胞粘附分子表达提通过使用遗传修饰的小鼠的实验已经提供了MCP-l/CCR-2相互作用的重要性的证明。MCP-1-A小鼠具有正常数量的白细胞和巨噬细胞，但是在几种不同类型的免疫激发之后不能将单核细胞征募到炎症的位点内[BaoLu,e/J.Exp.Med.1998,187,601]。同样地，当用各种外源试剂激发时，CCR-2-A小鼠不能征募单核细胞或产生干扰素此外，无CCR-2小鼠的白细胞不应答MCP-1而迁移[LandinBormg,"a/.,J.Clin.Invest.1997,100,2552],从而证实了MCP-1/CCR-2相互作用的特异性。两个其他的小组已经独立地报道了使用CCR-2V-小鼠不同才朱系的相同结果[WillmmA.Kuziel,〃"/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，94，12053,和TakaoKurihara,"a/.，J.Exp.Med.1997,186,1757]。MCP-1-/-和CCR-2-Z-动物的生存力和一般的正常健康状态是值得注意的，因为破坏MCP-l/CCR-2相互作用不引起生理学的危机。结合起来，这些数据表明阻断MCP-1的作用的分子将在治疗一系列炎症性和自体免疫性失调中有用。已知的是，MCP-1在患有类风湿性关节炎的患者中被上调[AlisaKoch,da/,,J.Clm.Invest.1992,90,772-779]。此外，几项研究已经证实了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治疗类风湿性关节炎中的潜在治疗价值。编码MCP-1的DNA疫苗近来显示了在大鼠中改善慢性的多佐剂i秀导的关节炎[SawsanYoussef，"a/.,J.Clm.Invest.2000,106,361]。类似地，通过向患有胶原诱导的关节炎[HiroomiOgata,Wa/.,J.Pathol.1997,182,106]或链球菌细胞壁诱导的关节炎[RalphC.Schimmer,"《J.Immunol.1998,160,1466]的大鼠直接施用MCP陽l的抗体可以控制炎性疾病症状。或许最显著地，MCP-1的肽拮抗剂，MCP-1(9-76)在关节炎的MRL-lpr小鼠模型中显示了预防疾病发作和卩争j氐疾病症习夫(取决于施用的时间)[Jiang-HongGong,"a/.,J.Exp.Med.1997,186,131]。MCP-1也在动脉粥样石更化病变中被上调，已经证实了MCP-1的循环水平在疾病发展中起作用[AbdolrezaRezaie-Majd,W"/.,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.2002,22,1194-1199]。如通过富含巨噬细胞的动脉壁的免疫组织化学[Yla-Herttuala"c//.,ProcNatlAcadSciUSA88:5252-5256(1991);NelkenWJClmInvest88:1121-1127(1991)]和抗MCP-1抗体冲佥测[TakeyaWa/.,HumanPathol24:534-539(1993)]所显示的，MCP-1负责征募单核细胞进入动脉粥样硬化区域。与野生型MCP-1抹系相比，LDL-受体/MCP-]缺陷和叩oB转基因/MCP-1缺陷小鼠显示了在它们的整个主动脉中显著较低的脂质沉积和巨p藍细月包积累[Alcami"a/.,JImmunol160:624-633(1998);Gosling"a/.,JClinInvest103:773-778(1999);GuWa/.,Mol.Cell.2:275-281(1998);Boringe^/.，Nature394:894-897(1998)]。已知的是，MCP-1在人类多发性硬化中被上调，已经显示了使用干扰素卩-l卩的有效治疗降低了外周血单核细胞中的MCP-1表达，表明MCP-1在疾病发展中起作用[CarlaIarlon,""/,J.Neuroimmunol.2002,123,170-179]。其他研究已经表明MCP-l/CCR-2相互作用的拮抗在治疗多发性硬化中的潜在治疗价值；所有这些研究已经在多发性硬化的常规动物模型实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)中被证明。向患有EAE的动物施用MCP-1的抗体显著地减小了疾病复发[K.J.Kennedy,"a/.,J.Neuroimmunol.1998,92,98]。jt匕夕卜，两项更谇斤近的报道现在已经显示了CCR-2-A小鼠对EAE有抗性[BrianT.Fife,""/.,丄Exp.Med.2000,192,899;LeonidIzikson，a/.,J.Exp.Med.2000,192,1075]。已知的是，MCP-1在肺移值之后出现了闭塞性细支气管炎综合症的患者中被上调[MartineReynaud-Gaubert,W，J.ofHeartandLungTransplant.,2002,21,721-730;JohnBelperio,"《J.Clin.Invest.2001,108,547-556]。在闭塞性细支气管炎综合症的鼠模型中，施用MCP-1的抗体引起气道闭塞的减弱；类似地，CCR2-A小鼠在这个相同模型中对气道闭塞有抗性[JohnBelperio,""/.,J.Clin.Invest2001,108,547-556]。这些数据表明，MCP-1/CCR2的拮抗可能在治疗移植后的器官排斥中是有益的。其他研究已经表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治疗哮喘中的潜在治疗价值。在卵清蛋白激发的小鼠中中和抗体对MCP-1的隔离引起了支气管超反应性和炎症的显著降低[Jose-AngelGonzalo,""/.,J.Exp.Med.1998,188,157]。证明了通过施用MCP-1的抗体有可能在曼氏裂头吸虫(Schistosomamansoni)卵激发的小鼠中降低过敏性气道炎症[NicholasW.Lukacs,""/，J.Immunol.1997,158,4398]。与此一致，MCP-1-/-小鼠显示了对曼氏裂头吸虫卵攻击的减弱的应答[BaoLu,Wa/.,J.Exp.Med.1998,187,601]。其他研究已经表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治疗肾病中的潜在治疗价值。在血管球性肾炎的鼠模型中施用MCP-1的抗体引起了肾小球新月体形成和I型胶原沉积的显著降低[ClareM.Lloyd，"a/.,J.Exp.Med.1997,185,1371]。此外，与它们的MCP誦l十/+对应小鼠相比，患有诱导的肾中毒血清肾炎的MCP-l-A小鼠显示了显著更低的肾管损伤[GregoryH.Tesch,""/.,J.Clin.Invest.1999,103,73]。一项研究已经表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治疗系统性红斑狼疮中的潜在治疗价值。MCP-lV-小鼠与MRL-FAS.sup.lpr小鼠杂交(后者具有类似于人类系统性红斑狼疮的致死性自体免疫疾病)导致比野生型MRL-FAS.sup.lpr小鼠更少的疾病和更久的存活[GregoryH.Tesch,Wa/.,J.Exp.Med.1999,190,1813]。MCP-1/CCR2相互作用在结肠炎的病变中也是相关的，因为。01-2-/-小鼠免于葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的影响[^1"0G.Andres,""/"J.Immunol.2000,164,6303]。一项研究已经表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治疗牙槽炎中的潜在治疗价值。当使用针对大鼠MCP-1(JE)产生的抗体静脉内地治疗患有IgA免疫复合物肺损伤的大鼠时，牙槽炎的症状被部分地减轻了[MichaelL.Jones，W"/.,J.Immunol.1992,149,2147]。MCP-1/CCR2在癌症中也是相关的。当带有人类乳腺癌细胞的免疫缺陷小鼠用抗MCP-l抗体治疗时，观察到了肺部微转移的抑制和存活的提高[RosalbaSalcedo,a/.,Blood2000,96,34-40]。特别地，如本发明人在PCTWO2004/080273中详细描述的，MCP-l被指明在前列腺癌症中。Restmosis是涉及MCP-l的又一种症候。CCR2缺陷的小鼠显示了股动脉损伤后内膜面积和内膜/中膜比例的降低(相对于野生型同窝)[MerceRoque,"a/.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.2002,22,554-559)。其他研究已经提供了证据，MCP-l在以上未才是及的各种疾病状态中被过量表达。这些报道提供了相关的证明，MCP-1拮抗剂可能是这些疾病的有用的治疗剂。MCP-l已经被证明在患有炎症性肠病的患者的肠上皮细胞和肠粘膜中过表达[H.C.Remecker,W"/.，Gastroenterology1995,108,40;MichaelC.Grimm,da/.，J.Leukoc.Biol.1996,59,804]。两项报道描述了患有诱导的脑外伤的大鼠MCP-l的量表达[丄S.Kmg,"a/.,J.Neuroimtmmol.1994，56,127;JoanW.Berman,""/.,J.Immunol.1996,156,3017]。MCP-l还显示了在啮齿动物心脏同种异体移植中的过量表达，暗示了MCP-l在移植动脉^^化的发病中的作用[MaryE.Russell，"a/.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993，90，6086]。已经在患有特发性肺纤维化的患者的肺内皮细月包中注意到MCP-l的过表达[HarryN.Antomades,e/1/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992,89,5371]。类似地，在患有银屑病的患者的皮肤中注意到MCP-1的过量表达[M.Deleuran,""/,J.Dermatol.Sci.1996,13,228,andR.Gillitzer,Wfl/"J.Invest.Dermatol.1993,101,127]。最后，新近的才艮道已经显示了，在患有HIV-1相关性痴呆的患者的脑和脑脊液中MCP-l被过量表达[AlfredoGarzmo-Demo,WO99/46991]。迄今报道的大多数趋化因子拮抗剂不是针对特定趋化因子的中和#元体才尤是小分子4吉#元剂[Howard""/.，TrendBiotechnol14:46-51(1996)]。抗MCP-l抗体已经在如上所述的许多小鼠疾病模型中被有效地使用。然而，与使用抗体来拮抗趋化因子功能相关的主要难题是它们在慢性人类疾病中使用之前必需被人源化。此外，多种趋化因子结合和活化单个受体的能力促使了多种抗体策略的开发或使用交叉反应性抗体以完全阻断或防止病理状况。在科学和专利文献中已经报道了几种趋化因子受体功能的小分子拮抗剂[White,JBiolChem273:10095-10098(1998);Hesseigesser,JBiolChem273:15687-15692(1998);Bright""/.,BioorgMedChemLett8:771-774(1998);Lapierre,26thNatlMedChemSymposium,June14-18，Richmond(Va.)5USA(1998);Forbes《B画rgMedChemLett10:1803-18064(2000);Kato"a/.,WO97/24325;Shiotaa/.,WO97/44329;NayaWa/.,WO98/04554;TakedaIndustries,JP09-55572(1998);Schwender"a/.,WO98/02151;Hagmann"a/.,WO98/27815;Connor"a/.,WO98/06703;Wellington""/.，U.S.Pat.No.6,288,103]。然而，趋化因子受体拮抗剂的特异性意味着，以多种或冗余的趋化因子表达谱为特征的炎症性失调将相对更难以通过这些试剂治疗。因而，克服了上述局限性的用于治疗CCR-2相关疾病的组合物及其使用方法，是广泛公认亟需的，并且将是高度有益的。发明概述根据本发明的一个方面，提供了一种包含异源氨基酸序列的分子，所述异源氨基酸序列结合到缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-],并且其中所述分子是无免疫原性的。根据本发明的另一个方面，提供了一种分子，其包含附着于非蛋白质部分的CCR2氨基酸序列，其中所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1,而且所述分子在受试者中是无免疫原性的。根据本发明的再一个方面，提供了一种分子，其包含至少两种CCR2氨基酸序列，每种都能够结合MCP-l。根据本发明的又一个方面，提供了一种包含标签的分子，所述标签附着于缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1。根据本发明的其他方面，4是供了一种如SEQIDNO:14或15所列的分子。根据本发明的其他方面，提供了包含所述分子和药学上可接受的载体的药物组合物。根据本发明的其他的方面，提供了包含特定分子和药学上可接受的载体的药物组合物，所述特定分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述药物组合物是无免疫原性的。根据本发明的其它方面，提供了在有需要的受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的所述分子，从而治疗所述受试者中MCP-1/CCR2相关疾病。根据本发明的其它方面，提供了所述分子在制备药物中的用途，所述药物被鉴定为治疗MCP-1/CCR2相关疾病。根据本发明的其它方面，提供了从生物样品分离MCP-1的方法，所述方法包括(a)使所述生物样品与权利要求4的分子接触，从而MCP-1和权利要求4的分子形成复合物；和(b)分离所述复合物从而从所述生物样品中分离MCP-1。根据本发明的其它方面，提供了在有需要的受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的分子，所述分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，从而在所述受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病。根据本发明的其它方面，提供了特定分子在制备药物中的用途，所述特定分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述药物被鉴定为用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病。根据如下所述的本发明的优选实施方式中进一步的特征，所述异源氨基酸序列包含免疫球蛋白氨基酸序列。根据所描迷的优选实施方式中进一步的特征，所述缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列是如SEQIDNO:2中所示的。根据所描述的优选实施方式中再进一步的特征，所述MCP-1/CCR2相疾病选自由炎症性疾病、坏死、动"永粥才羊石更化、癌症、多发性石更化、斗分瘤、单核细胞性白血病、肾脏疾病(例如，血管球性肾炎)、hamman-rich综合症、子宫内膜异位、类风湿性关节炎、细支气管炎、译喘、系统性红斑狼掩、炎症性肠病(例如，结肠炎)、牙槽炎、再狭窄、脑外伤、银屑病、特发性肺纤维化和移植动脉硬化构成的组。根据所描述的优选实施方式中又进一步的特征，所述标签是表位标签。根据所描述的优选实施方式中又进一步的特征，所述分子附着于固相支持物。根据所描述的优选实施方式中又进一步的特征，所述分子附着于非蛋白质部分。根据所描述的优选实施方式中又进一步的特征，所述非蛋白质部分选自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、笨乙烯马来酐共聚物(SMA)以及二乙烯基醚与顺丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)构成的组。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体被配制为用于肠胃外施用。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体基本上是无免疫原性的。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体包含脂氨基酸(lipoammeacid)。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体包括碳水化物。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体包括微球体。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体包括脂质体。才艮据所描述的优选实施方式中又进受的载体包括聚合物微球体。通过提供用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病的新的分子及其使用方法，本发明成功地克服了当前已知的配置的缺点。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以被用于本发明的实践和测试，^f旦以下描述了适合的方法和材料。在矛盾的情况下，以本专利说明书(包步的特征，所述药学上可接括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而无意限制。附图的简要说明参考附图，在此仅以举例的方式描述本发明。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所显示的细节是通过实例的方式，目的仅是说明本发明的优选实施方式的说明性论述，为了提供被认为是最有用的和易于理解本发明的原则和概念观点的内容而存在。对此来说，不进行尝试来显示比基本理解本发明所必需的更详细的本发明结构细节，附图的说明使得本领域技术人员明白本发明的几种形式可以如何在实践中体现。图la-b是显示前列腺癌症患者选择性地发展针对MCP-1的高度显著的自身抗体滴度的图表。图la——来自23位前列腺癌症患者、患有良性前列腺肥大(BPH)的患者和10名对照受试者的人类血清，所有年龄匹配的对象(mails),被监视针对以下13种趋化因子的自身抗体的可能的出现SDF-1(CXCL12,GenBankAccessionNo.NM199168)、M1F(GenBankAccessionNo.LI9686)、MIP-la(CCL3,GenBankAccessionNo.NM002983)、MEP-l卩(CCL4,GenBankAccessionNo.NM002984)、IL-8(CXCL8，GenBankAccessionNo.M2813)、IP-IO(CXCL10,GenBankAccessionNo.NM001565)、MIP-3a(CCL20,GenBankAccessionNo.BC020698)、MIP-3卩(CCL-19，GenBankAccessionNo.BC027968)、Lymphotactm(XCLl，GenBankAccessionNo.NM002995)、MIG(CXCL9,GenBankAccessionNo.NM002416)、RANTES(CCL5,GenBankAccessionNo.NM002985)、MCP-3(CCL7,GenBankAccessionNo.NM006273)和MCP-1(CCL2，GenBankAccessionNo.NM002982)。在大多数前列腺癌症患者中观察到针对仅一种上述趋化因子，MCP-1，的显著的抗体滴度(p<0.01)。图lb——在上述图la中描述的每个临床样品中对MCP-1的Log2Ab滴度。约82%的前列腺癌症患者(19/23)和仅约4.7%(1/21)患有BPH的患者显示了对MCP-1的显著(p<0.01)反应(1og2Ab滴度〉10)。图2是描绘编码本发明的Ig-CCR2肽(Ig-E3)的表达构建体的产生的示意图。图3是描绘CCR2的E3结构域与MCP-1的特异性结合的柱形图。图4是描述人类CCR2(E3)-IgG抑制MCP-1诱导的THP-1细胞(ATCCAccessionNO.TIB-202)的迁移的能力的柱形图。进行了体外穿孔迁移分析。简言之，将THP-1细胞(106个细胞/孔)添加到转移孔平板的上室，CCL2(重组人类MCP-1,RHMCP-1;(20ng/ml)添加到下孔，其也补充有如图所示的不同浓度的CCR2(E3)-IgG。在37。C孵育2小时之后，通过FACS对迁移的THP-1细胞计数。结构显示为三个副本的平均数土SE。图5a-d是描绘在施用CCR2(E3)-IgG的细胞和对照(施用IgG的或PBS处理的)细胞之间所比较的原发肺瘤的发展和它的转移性散布的图表。图5a-b是描绘当与PC-3细胞的施用一同开始(图5a)或在之后18天(图5b)施用CCR2(E3)-IgG时，CCR2(E3)-IgG随着时间降低肿瘤生长的能力的图表。在所标出的各个时间重复地测量来自施用CCR2(E3)-IgG(蓝色表示)、施用同种型匹配的对照IgG(绿色表示)或施用PBS(褐色或黄色表示)的小鼠的肿瘤体积(mm3)。图5c是显示在PC3细胞施用后8天注射的CCR2(E3)-IgG的抗肿瘤活性的图表。在所标出的各个时间重复地测量来自施用PC-3细胞和CCR2(E3)-IgG(蓝色表示)、施用同种型匹配的对照IgG(绿色表示)或PBS(粉色表示)的小鼠的肿瘤的体积(mm3)。这些结果证明了图5a-b所示CCR2(E3)-IgG的预防和治疗活性。图5d是描绘与对照细胞比较、通过所标明的CCR2(E3)-Ig对表达荧光素酶的PC-3细胞的骨和肺转移的抑制作用的图表。图6a-f是显示在肺瘤位点使用CCR2(E3)-Ig阻断CCL-2完全地抑制VEGF产生的照片。显示了使用CCR2(E3)-Ig(图6a、d)、同种型匹配的对照IgG(图6b、e)或PBS(对照细胞；图6c、f)的治疗。处死动物，取出肿瘤/组织。洗涤组织、固定并渗透化，通过免疫染色使用共焦显微镜检测VEGF。在x10(附图6a-c)或x40(附图6d-f)放大率下显示显微图。图7是描述通过光密度测定的CCL2处理的PC3细胞的细胞迁移的柱形图。用CCL2(MCP-1)、CCL2连同针对CCL2的抗体(MCP-l+抗MCP-1)、CCL2连同CCR2(E3)-IgG(MCP-1+CCR2(E3)-IgG)以及未被配体处理的对照细胞来处理PC3细胞。优选实施方式的说明本发明是用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病例如癌症的分子、包含所述分子的组合物以及使用所述分子的方法。参考附图和附随的说明可以更好地理解本发明的原理和操作。在详细地解释本发明的至少一个实施方式之前，要理解的是，本发明不将它的应用限于以下说明所阐述的或通过实施例所例示的细节。本发明能有其他的实施方式或者能以各种方式实践和进行。并且，要理解的是在此釆用的用语和术语是为了说明的目的而不应认为是限制性的。单核细胞化学吸引物剂蛋白(MCP)-l,也称为CCL2,特异性地吸引单核细胞和记忆T细胞。它的表达出现于以细胞迁移为特征的多种疾病中，对于它在癌症、心血管疾病和炎症性疾病中的关4建作用，存在着相当的生物学和遗传学证据。尽管有密集的篩选，至今还没有MCP-1/CCL2的受体CCR2的拮抗剂。当还原本发明至实践时，本发明人揭示了MCP-1对CCR2的结合是由CCR2的第三个细胞夕卜区域(E3)(GenBankAccessionNo.NP000639.1的氨基酸坐标273-292)专有地介导的。这与DattaMannan禾口Stone的早先的净艮告[Datta-MannanAndStone(2004)Biochemistry43:14602-11]形成鲜明对比，他们表明MCP-1与CCR2的结合取决于CCR2的N-末端结构域(N-ter)和第三个细^^卜环体(E3)两者。这些结果表明，通过大量地隔离MCP-1，包含CCR2的E3区域的肽可以用作抑制性试剂。因而，本发明设想包含CCR2E3结构域并优选缺少CCR2N-末端结构域的任何CCR2氨基酸序列，以及包含所述CCR2氨基酸序列的组合物在治疗MCP-1/CCR2相关疾病例如癌症中的用途。重要地，本发明的组合物是无免疫原性的以实现最大的疗效。因而，本发明设想，例如，在复合物中包含CCR2序列，其中所述CCR2序列附着于蛋白质(例如，异源氨基酸序列)或非蛋白质(例如，PEG)部分，它们每一种都能够延长所述组合物在循环中的半衰期。因而，根据本发明的一个方面，提供了包含与CCR2氨基酸序列结合的至少一种异源氨基酸序列的无免疫原性分子，所述CCR2氨基酸序列优选地缺少CCR2N-末端结构域(例如，翻译的GenBankAccessionNo.NM—000647/NP—000638的氨基酸坐标1-41,或GenBankAccessionNo.NM—000648/NP—000639的相应氨基酸坐标)，所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1。如接下来的实施例部分所显示的，包含新近揭示的MCP-1结合结构域(E3-IgG)的本发明这个方面的嵌合分子，即使在肿瘤细胞施用长达18天之后，还抑制肺瘤发展。令人惊讶地，相同的嵌合分子甚至显著地抑制了肺瘤向骨和肺组织的转移。总而言之，当前的发现支持了本发明的分子在治疗MCP-1/CCR2相关疾病例如癌症中的用途。应当注意到，本发明这个方面的嵌合分子显著地不同于WO97/31949中描述的那些，其教导了使用嵌合的E3(即，KLH-E3)肽来产生针对CCR2的E3区域的抗体，从而抑制CCR2受体的配体结合。本发明的无免疫原性肽被用于靶向CCR2的配体，MCP-l,从而抑制所述配体的受体结合。因此，本发明的分子容许精巧的治疗控制和特异性，它们可以被容易地合成和施用，并且以高度的生物有效性为特征。在此使用时，与CCL2可互换使用的MCP-l,是指哺乳动物(例如，人类)MCP-1蛋白，例如在GenBankAccessionNos.NM—002982或NP一002973中列出的。在此使用时，术语"无免疫原性的"是指一种物质，其在被施用该物质的受试者中基本上不能产生免疫应答。例如，在人体内无免疫原性是指，在使本发明这方面的嵌合分子接触人的适合组织时，在适合的潜伏期(例如，8到14天)之后在第二次施用所述嵌合分子时，、。在此使用时，:'CCR2氨基酸^列""是指具有对MCP-1的亲和性结合的哺乳动物(例如，人类)趋化因子C-C受体2蛋白质的肽部分。应当注意到，单个的CCR2氨基酸序列可以被包括在本发明的分子中，但是包括至少两个CCR2氨基酸序列、每一个都能够结合CCR2(优选以高亲和性，例如SEQIDNO:9)可能是优选的。由于提高的亲合力，这些多肽可以被用作MCP-1活性的强力抑制物，可以使用更低的剂量。在此使用时，"亲和性结合"是指至少10-6M的最小KD值。在GenBankAccessionNos.NM—000647和NP—000639.1中提供了CCR2蛋白的实例。如所提及的，本发明这方面的CCR2优选缺少N-末端结构域，但是保留了E3结构域(即，GenBankAccessionNo.NM—000647的氨基酸坐标273-292，SEQIDNO:2)或其模拟物。在此使用时，术语"模拟物"当涉及肽时是指分子结构，其在与MCP-1的相互作用中充当了本发明的肽的替代物[关于肽模拟物的综述，参见Morgan"(1989)Ann.ReportsMed.Chem.24:243-252]。在此使用时，肽模拟物包括合成的结构(已知的和尚未知的)，其可以或可以不含有氨基酸和/或肽键，但保持了肽配体的结构和功能特征。以下进一步描述了可以利用来产生模拟物的氨基酸的种类。术语"肽模拟物"还包括类肽和寡类肽，其是N-取代的氨基酸的肽或寡fi体[SimonW/,(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367-9371]。进一步作为肽模拟物包括的是肽库，其是被设计以具有给定氨基酸长度并代表与之相应的所有可想像的氨基酸序列的肽的集合。以下描述了用于肽模拟物的产生的方法。包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，并且可以由SEQIDNO:1所歹'J的核酸序列编码。才艮据本发明的这个方面的另一个优选实施方式，本发明的这个方面的分子是如SEQIDNO:14或15中所示的。在此使用时，术语"肽"涵盖天然的肽(降解产物、合成性合成的肽或重组肽)以及如上文中提及的拟肽(一般地，合成性合成的肽)、以及是肽类似物的类肽和半类肽，其可能具有，例如，修饰，使得所述肽在体内更为稳定或更能透入细胞中。这种修饰包括，但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰，包括但不限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-SO、0=C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH，主干修饰以及残基修饰。制备肽模拟化合物的方法是本领域公知的，例如，在QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplmPergamonPress(]992)中详细i兌明了，通过引用将其合并在此，如同完全在此列出一样。以下提供了关于此方面的进一步的细节。肽中的肽键(-CO-NH-)可以被例如N-曱基化的键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O隱C(R)-N陽)、酮亚曱基键(-CO-CH2-)、a-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如曱基，carba键(-CH2-NH-)、鞋亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫胺键(画CS-NH-)、烯双键(-CH=CH-)、逆酰胺键(retroamide)(画NH-CO陽)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-),其中R是天然存在于碳原子上的"正常的"侧链。这些修饰可以出现在肽链上的任何键上，甚至同时在几个(2_3个)上。天然的芳香族氨基酸，Trp、Tyr和Phe可以被合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、TIC、naphthylelanme(Nol)、Phe的环甲基化的衍生物、Phe的卣化衍生物或邻曱基-Tyr。除了上述的之外，本发明的肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复杂的碳水化物等等)。在说明书和以下的权利要求部分使用时，术语"氨基酸"被理解为包括20种天然产生的氨基酸；在体内常常翻译后修饰的那些氨基酸，包括，例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其他稀有的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"包括D-和L-氨基酸。1)和非常规的或修饰的氨基酸(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由于当前的肽优选在需要肽处于可溶形式的治疗或诊断中使用，本发明的肽优选包括一个或多个非天然的或天然的极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，由于它们的含羟基侧链能够提高肽的溶解度。本发明的肽优选以线性形式利用，然而要理解的是，在环化不严重地影响肽性质的情况下，也可以使用环状形式的肽。如上文描述的，肽模拟物的产生可以使用各种方法实现，包括，例如展示技术。因而，本发明关注包含多种展示载体(例如，噬菌体、病毒或细菌)的展示库，每一种展示了来自CCR2的E3(例如，SEQIDNO:2)的多肽序列的至少2个、至少3个、至少5个、至少7个、至少11个、至少15个连续氨基酸。构建这种展示库的方法是本领域7>知的。在例如YoungAC,"Thethree-dimensionalstructuresofapolysaccharidebindingantibodytoCryptococcusneoformansanditscomplexwithapeptidefromaphagedisplaylibrary:implicationsfortheidentificationofpeptidemimotopes"JMolBiol1997Dec12;274(4):622-34;GiebelLBe,a/."Screeningofcyclicpeptidephagelibrariesidentifiesligandsthatbindstreptavidmwithhighaffinities"Biochemistry1995Nov28;34(47):15430-5;DaviesELW/.,"Selectionofspecificphage-displayantibodiesusinglibrariesderivedfromchickenimmunoglobulingenes"JImmunolMethods1995Oct12;186(1):125-35;JonesCRTal."Currenttrendsinmolecularrecognitionandbioseparat薩"JChromatogrA1995Jul14;707(1):3-22;DengSJ"a/."Basisforselectionofimprovedcarbohydrate-bindingsingle-chainantibodiesfromsyntheticgenelibraries"ProcNatlAcadSciUSA1995May23;92(11):4992-6;以及DengSJ""Selectionofantibodysingle-chamvariablefragmentswithimprovedcarbohydratebindingbyphagedisplay"JBiolChem1994Apr1;269(13):9533-8中描述了这些方法，通过引用将它们合并在此。肽模拟物也可以使用计算生物学来揭示。可以利用对于显示三维结构才莫型有用的软件程序，例如RIBBONS(Carson,M.,1997.MethodsmEnzymology277,25)、〇(Jones,TA."a/.,1991.ActaCrystallogr.A47,110)、DINO(DINO:VisualizmgStructuralBiology(2001)http:〃www.dino3d.org);和QUANTA、INSIGHT、SYBYL、MACROMODE、ICM、MOLMOL、RASMOL以及GRASP(在Kraulis,J.,1991.ApplCrystallogr.24,946中综述)来模拟MCP-1和预期的肽模拟物之间的相互作用从而鉴定显示了结合特定的MCP-1区域的最高可能性的肽。蛋白质-肽相互作用的计算机建模已经被成功地用于合理药物设计，对于进一步的细节，参见Lam"1994.Science263,380;WlodawerWa/"1993.AnnRevBiochem.62,543;Appelt,1993.PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign1，23;Erickson,1993.PerspectivesmDrugDiscoveryandDesign1,109和MauroMJ.2002.JClmOncol.20,325-34。如所提及的，本发明的这个方面的嵌合分子包括异源的氨基酸序列。在此使用时，用语"异源氨基酸序列"是指不构成CCR2氨基酸序列的一部分的无免疫原性氨基酸序列。这种序列优选的为本发明的这个方面的分子赋予了溶解性，优选的提高所述嵌合分子在血清中的半衰期。所述异源氨基酸序列一般定位于本发明的CCR2肽的氨基或羧基末端。如所提及的，至少一个异源氨基酸序列可以结合到本发明的CCR2氨基酸序列上。例如，至少一个CCR2氨基酸序列可以插入两个异源序歹'j之间，如Hoogenboom(1991)Mol.Immunol.28:1027-1037所描述的。所述异源氨基酸序列可以通过任何肽或非肽的4建附着于所述CCR2氨基酸序列上。CCR2氨基酸序列对所述异源氨基酸序列的附着可以通过直接的共价结合(肽键或取代的肽键)或间接的结合例如通过使用具有功能基团的接头来实现。功能基团包括但不限于，游离羧酸(C(=0)OH)、游离氨基(NH2)、酯基(C(=0)OR，其中R是烷基、环烷基或芳基)、酰卤基团(C(=0)A，其中A是氟化物、氯化物、溴化物或石典化物)、卣素(氟化物、氯化物、溴化物或碘化物)、羟基基团(OH)、硫醇基团(SH)、氰基(C^N)、游离C-氨基曱酸基团(NR"-C(=0)-OR',其中每个R'和R"独立地是氢、烷基、环烷基或芳基)。可以根据本发明的这个方面使用的异源氨基酸序列的实例是免疫球蛋白序列，例如免疫球蛋白重量结构域的铰链和Fc区域(参见美国专利No.6,777，196)。本发明的这个方面的嵌合体中的免疫球蛋白部分可以从IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得，以下将进一步讨论。从与适合的免疫球蛋白恒定区序列(免疫粘附素)连接的受体序列构建的嵌合体是本领域已知的。文献中报道的免疫粘附素包括T细月包受体[Gascoigne""/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:2936-2940(1987)]、CD4[Caponetal.，Nature337:525-531(1989);Traunecker""/"Nature,339:68-70(1989);Zettmeissle"/.,DNACellBiol.USA,9:347-353(1990);Byrn""/.,Nature,344:667-670(1990)];L-选择蛋白(归巢受体)[(WatsonJ.Cell.Biol.,110:2221-2229(1990);Watson""/.,Nature,349:164-167(1991)]、CD44[Aruffo""/.,Cell,61:1303-1313(19卯)]、CD28和B7(LmsleyW"/，J.Exp.Med.,173:721-730(1991)];CTLA-4[Lisley"a/.,丄Exp.Med.174:561-569(1991)];CD22[Stamenkovic"a/"Cell,66:1133-1144(1991)];TNF受体[Ashkenazi"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-10539(1991);Lesslauer,Eur.J.Immunol.,27:2883-2886(1991);Peppele/1a/.,J.Exp.Med.,174:1483-1489(1991)];NP受体[Bennette,"/.,J.Biol.Chem.266:23060-23067(1991)]和IgE受体a[Ridgway""/,,J.Cell.Biol.,115:abstr.1448(1991)]的融合物。一般地，在这种融合物中，嵌合分子将保持至少功能上活性的免疫球蛋白重链的恒定区的铰链和CH2和CH3结构域。融合物也可产生于恒定区的Fc部分的C-末端，或紧^接重链的CHI的N-末端或轻《连的相应区域。在异源序列和CCR2氨基酸序列之间融合(接合)的确切位点不是关键的。特定的位点是本领域公知的，可以选择以优化本发明的这个方面的嵌合分子的生物学活性、分泌或结合特征(参见以下的实施例部分的实施例3)。虽然有可能将完整的重链恒定区结合到本发明的CCR2氨基酸序列，优选的是融合较短的序列。例如，刚好在绞链区中木瓜蛋白酶切割位点上游开始的序列被用于融合物中，所述木瓜蛋白酶裂解位点化学上划定了IgGFc;当重链恒定区的第一个残基为114时是残基216，或其它免疫球蛋白的类似位点。在特别优选的实施方式中，CCR2氨基酸序列被融合到IgGl、IgG2或IgG3重链的绞链区和CH2和CH3，或CH1、铰链、CH2和CH3结构域(参见美国专利NO.6,777，196)。进行融合的确切位点不是关键的，可以通过常规的实验确定最佳位点。如所提及的，用于构建本发明的这个方面的嵌合分子的免疫球蛋白序列可以来自IgG免疫球蛋白重链恒定区。使用人类IgGl和IgG3免疫球蛋白序列是优选的。使用IgGl的主要优点是IgGl可以在固定化的蛋白A上有效地纯化。相比之下，IgG3的纯化需要蛋白G，一种显然较不方便的介质。然而，当选择Ig融合配偶体用于特定的嵌合体构建时，应当考虑免疫球蛋白的其他结构和功能部分。例如，IgG3铰链是更长和更柔性的，从而它可以适应更大的CCR2氨基酸序列，而其与IgGl融合时可能不折叠或不能正确地起作用。另一种考虑可能是化合价；IgG是二价的同二聚体，而诸如IgA和IgM的Ig亚型可以分别产生基本的Ig同二聚体单位的二聚或五聚结构。在选择本发明的这个方面的嵌合分子的免疫球蛋白部分时的其他考虑在美国专利NO.6,77,196中描述了。因而，本发明的这个方面的分子可以包括异源氨基酸序列，如上所述。作为上文提及的补充或选择，本发明的CCR2氨基酸序列(能够结合MCP-1)可以附着于非蛋白质部分，选择在受试者中为无免疫原性的这种分子。这种分子是高度稳定的(可能由于非蛋白质部分赋予的位阻而对体内蛋白水解活性有抗性)，并且可以使用常用的固相合成方法来生产，这是便宜的和高效的，下文中进一步说明。然而，要理解的是，仍然可以使用重组技术，从而借此重组肽产物经历体外修饰(例如，下文进一步描述的PEG化)。如所提及的，CCR2氨基酸序列附着于非蛋白质部分。如在此使用的用语"非蛋白质部分"是指附着于上述CCR2氨基酸序列的、不包括氨基酸(肽键)的分子。根据当前优选的实施方式，本发明的这个方面的非蛋白质部分是聚合物或共聚物(合成的或天然的)。本发明的非蛋白质部分的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、二乙烯醚和顺丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA;参见，移寸^口，KanedaY,e/a/.,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.239:160-5)以及苯乙烯马来酐共聚物(SMA;参见例如，MuY,"a/.,1999,BiochemBiophysResCommun.255:75-9)。这种非蛋白质部分的生物结合为CCR2氨基酸序列赋予了稳定性(例如，对抗蛋白酶活性)和/或溶解性(例如，在生物液体，例如血液、胃液内)，而保持了它的生物学活性并延长了它的半衰期。在表现出短的半衰期和血液的快速清除的治疗性蛋白质的情况下，生物结合是特别有益的。生物结合的蛋白质在血浆中提高的半衰期是来自蛋白质结合物的增加的大小(其限制了它们的肾小球滤过作用)以及由于聚合物位阻而降低的蛋白水解作用。一般地，每个肽附着的聚合物链越多，半衰期延长越大。然而，采取方法来不降低本发明的CCR2氨基酸序列的特定活性(即，MCP-1结合)。CCR2氨基酸序列与PEG的生物结合(即，PEG化)可以使用PEG衍生物来实现，所述PEG衍生物例如PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酉旨、单曱氧基PEG2-NHS、羧曱基化的PEG的琥珀酰亚胺基酯(SCM-PEG)、PEG的笨三唑石炭酸酯书f生物、PEG的缩水甘油醚、PEG对硝基苯基碳酸酯(PEG-NPC，例如曱氧基PEG-NPC)、PEG酪、PEG-正吡咬基-二硫化物、羰基二咪唑基(carbonyldimidazol)-活化的PEGs、PEG-硫醇、PEG-马来酰亚胺。这些PEG衍生物是以各种分子量商业上可获4寻的[参见，例i口Catalog,PolyethyleneGlycolandDerivatives,2000(ShearwaterPolymers,Inc.，Huntsvlle,Ala.)]。如果希望，许多上述衍生物是可以以单功能的单曱氧基PEG(mPEG)形式获得的。一般地，添加到本发明的CCR2氨基酸序列的PEG应当从分子量(MW)数百道尔顿到约100kDa(例如，在3-30kDa之间)。可以使用更大MW的PEG,但可能引起PEG化的肽的产量的一些损失。也应当监视较大的PEG分子的纯度，因为难以获得象较低分子量PEG可获得的那样高纯度的较高分子量PEG。优选的是使用至少85%纯度、更优选的至少90%纯度、95%纯度或更高纯度的PEG。在例如Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego，Calif.(1996),atChapter15andmZalipsky""/.,"SuccimmidylCarbonatesofPolyethyleneGlycol,"mDunnandOttenbrite,eds.，PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.(1991)中进一步讨论了分子的PEG化。方便地，PEG可以通过位点特异性诱变附着于CCR2氨基酸序列的选定位置，只要保持了结合物的活性(即，MCP-1结合)。例如，在SEQIDNO:1所列CCR2氨基酸序列的5位的半胱氨酸残基可以是PEG化的耙点。作为补充或选4奪，其他半胱氨酸残基可以一皮添加到CCR2氨基酸序列(例如，在N-末端或C-末端)以借此充当PEG化的靶点。可以进行计算分析来选择诱变而不损害活性的优选的位置。可以采用活化的PEG的各种结合化学作用，活化的PEG例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯砜(VS)、PEG-丙烯酸酯(AC)、PEG-正吡啶基二硫化物。制备活化的PEG分子的方法是本领域已知的。例如，PEG-VS可以在氩气下通过PEG-OH的二氯甲烷(DCM)溶液与NaH反应，然后与二乙烯砜反应(摩尔比OH1:NaH5:二乙烯基砜50，以0.2克PEG/mLDCM)来制备。PEG-AC可以在氩气下通过PEG-OH的DCM溶液与丙烯酰氯和三乙胺反应(摩尔比OHl:丙烯酰氯1.5:三乙胺2，0.2克PEG/mLDCM)来制备。这些化学基团可以附着于线性化的、2臂、4臂或8臂PEG分子。虽然结合到半胱氨酸残基是可以借助来PEG化本发明的CCR2氨基酸的一种便利的方法，如果希望也可以使用其他的残基。例如，乙酸酐可以用于与NH2和SH基团反应，而不是COOH、S--S或-SCHg基团，而过氧化氲可以用于与-SH和-SCH3基团反应，而不是NH2。反应可以在适合于与所述肽中期望的残基结合的条件下采用利用了公知的反应性的化学作用来进行。对于本发明的CCR2氨基酸序列与PVP的生物结合，借助于4，4'-偶氮双(4-氰戊酸)作为基团起始剂以及3-巯基丙酸作为链转移剂，通过在二甲基甲酰胺中的游离基聚合来从N-乙烯基-2-吡咯烷酮合成带有末端COOH-的PVP。产生的具有Mr6,000平均分子量的PVP可以通过高性能液相色谱分离和纯化，合成的PVP的末端COOH基团通过N-羟基琥珀酰亚胺/二环己基碳二亚胺法来活化。基本上如通过引用合并在jt匕的HaruhikoKamada,"/.,2000,CancerResearch60:6416-6420中所描述的，CCR2氨基酸序列与60倍摩尔过量的活化的PVP反应，用氨基caploic酸(相对于活化的PVP5倍摩尔过量)终止反应。使用例如高性能液相色谱(HPLC)来分离、纯化和鉴定产生的结合的CCR2分子(例如，PEG化的或PVP结合的CCR2)。此外，与其受体(例如CCR2)的结合特异性，基本上如对于其他趋化因子所描述的[例如，MCP-la，参见，例如HesselgesserJ,1998(同上)，通过引用将其完全合并在此]。本发明的这个方面的分子可以是生物化学合成的，例如使用标准的固相技术合成的。这些方法包括排阻固相合成、部分固相合成法、片段缩合和经典的溶液合成。当肽相对短(即，10kDa)时和/或当它不能通过重组技术产生(即，不由核酸序列编码，例如下文进一步描述的"标签")并由此涉及不同的化学作用时，优选的使用这些方法，固相肽合成步骤是本领域7^知的，由JohnMorrowStewartandJamsDillahaYoung,SolidPhasePeptideSyntheses(2ndEd"PierceChemicalCompany,1984)进一步描述了。合成的肽可以通过制备高效液相层析法[CreightonT.(19")■Proteins,structuresandmolecularprinciples.WHFreemanandCo.N.Y.]来纯化，其组成可以通过氨基酸测序来确i人。在期望大量本发明肽的情况下，本发明的肽可以使用例如由Bitter""/.,(1987)MethodsinEnzymol.153:516-544，Studier"a/.(1990)MethodsmEnzymol.185:60-89,Brisson"a/.(1984)Nature310:511-514,TakamatsuWa/.(1987)EMBOJ.6:307-311,CoruzziW(1984)EMBOJ.3:1671-1680以及Brogli"a/.,(1984)Science224:838-843,Gurley"a/.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565andWe'ssbach&Weissbach,1988,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,NY,SectionVIII,pp421-463所描述的重组技术来产生。筒言之，将表达构建体(即，表达载体)导入宿主细胞中，所述表达构建体包括分离的多核苷酸(即，从其天然产生来源分离的，例如SEQIDNO:10)，所述多核苷酸包含位于调节元件的转录控制之下的编码本发明CCR2(任选地与编码异源氨基酸序列的核酸序列按读码同框融合)的核酸序列。例如，编码本发明的CCR2肽的核酸序列(例如，SEQIDNO:1)同框连接到免疫球蛋白cDNA序列(例如，SEQIDNO:3和5)。要理解的是，也可以使用基因组免疫球蛋白片段的连接。在这种情况下，融合需要存在用于表达的免疫球蛋白调节序列。编码IgG重链恒cDNA库分离，通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术。编码CCR2氨基酸序列和免疫球蛋白的核酸序列可以串联地连接到表达构建体(载体)中，其指导在选定的宿主细胞中的有效表达，以下进一步说明。对于在哺乳动物细胞中表达，可以使用基于pRK5的载体[Schall""/.，Cell,61:361-370(1990)]和基于CDM8的载体[Seed,Nature,329:840(1989)]。确切的4妄点可以通过使用寡核苷酸指导的秀变[Zoller"《NucleicAcidsRes.,10:6487(1982);Capon"a/,,Nature,337:525-531(1989)]在设计的接点密码子之间除去额夕卜的序列来创建。可以使用合成的寡核苷酸，其中每一半与期望的接点两侧的序列互补；理想地，这些寡核苷酸是11到48mer。做为选择，PCR技术可以用于与适合的载体同框地连接分子的两个部分。将表达构建体导入宿主细胞的方法是本领域公知的，包括电穿孔、脂转染和化学转染(例如，磷酸钙)。还参见随后的实施例部分的实施例2。将"转化的"细胞在适合的条件下培养，其容许由所述核酸序列编码的嵌合分子的表达。在预定的时间之后，从所述细胞或细胞培养物回收表达的嵌合分子，根据重组多肽的最终用途进行纯化。取决于使用的宿主/载体系统，许多适合的的转录和翻i奪元件，包括组成型和可诱导的启动子、转录增强子元件、转录终止子等等，可以用于表达载体中[参见，如J^口Bitter""/.，(1987)MethodsmEnzymol.153:516-544]。除了含有用于插入的编码序列[编码嵌合体]的转录和翻译的必需元件之外，本发明的表达构建体也可以包括被设计来优化表达的融合蛋白的稳定性、生产、纯度、产量或毒性的序列。编码序列。这些包括但不限于，微生物，例如用含有嵌合体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有嵌合体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有嵌合体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)感染的或用重组质粒表达载体例如Ti质粒转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统是优选地用于表达本发明的嵌合体。用于分子表达的宿主细胞系的选择主要取决于表达载体。真核表达系统是优选的(例如，哺乳动物和昆虫)，因为它们容许翻-斧后的修饰(例如，糖基化)。另一种考虑是所需要的蛋白质的量。毫克量通常可以通过瞬时转染来产生。例如，腺病毒EIA转化的293人类胚肾细胞系可以用基于pRK5的载体通过磷酸钙方法改良法来瞬时转染以容许有效的表达。基于CDM8的载体可以用于通过DEAE-葡聚糖法来转染COS细胞(AruffoCell，61:1303-1313(1990);ZettmeisslDNACellBiol.US,9:347-353(1990))。如果希望更大量的蛋白质，可以在宿主细胞系的稳定转染之后表达分子(参见，例如实施例小节的实施例2)。要理解的是，分子的N-末端的疏水性前导序列的存在将确保转染的细胞对分子的加工和分泌。要理解的是，可以优选的使用细菌或酵母宿主系统来降低生产成本。然而，由于细菌宿主系统缺少蛋白质糖基化机制，生产之后的糖基化可能是需要的。在任何情况下，在有效的条件下培养转化的细胞，其容许大量的重组多肽的表达。有效的培养条件包括，但不限于，有效的培养基、生物反应器、温度、pH值和允许蛋白质生产的氧条件。有效的培养基是指任何培养基，在其中培养细胞来产生本发明的重组嵌合分子。这种培养基一般包括具有可同化碳、氮和磷酸盐源，以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养物例如维生素的水溶液。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定平皿和陪氏平皿中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、pH值和氧含量下进4于。这些培养条件是本领域普通技术人员的专门技能之内的。取决于用于生产的载体和宿主系统，产生的本发明的蛋白质可以保留在重组细胞之内、分泌到发酵培养基中、分泌到两层细胞膜的间隔中，例如E.coli中的周质间隙中；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。在培养预定时间之后，进行重组蛋白质的回收。用语"回收重组蛋白质"是指收集含有蛋白质的完整的发酵培养基，并且不必暗指其他的分离或纯化步骤。本发明的蛋白质可以使用各种标准的蛋白质纯化技术来纯化，例如但不限于，亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水性相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆凝集素A层析、层析聚焦和差异溶解。本发明的分子优选的以"基本上纯的"形式获得。如在此使用的，"基本上纯的"是指容许所述蛋白质在以下描述的各种应用中有效使用的纯度。包含免疫球蛋白氨基酸序列的嵌合分子可以通过亲和层析方便地纯化。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于在嵌合体中使用的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可以使用蛋白A来纯化基于人类yl、或了4重4连的嵌合分子[Lmdmark""/.,丄Immunol.Meth.,62:1-13(1983)]。蛋白G优选地用于所有的小鼠同种型和用于人类y3[Guss""/，EMBOJ.,5:1567-1575(1986)]。亲和配体所附着的固相支持物最常见的是琼脂糖，但其他固相支持物也是可用的。与琼脂糖可以实现的相比，机械稳定的固相支持物，例如受控的孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯容许更快的流速和更短的处理时间。将嵌合分子与蛋白A或G亲和柱结合的条件完全由Fc结构域的特征，即它的种类和同种型来确定。一般地，当选择了适合的配体时，直接从未条件化的培养液发生有效的结合。本发明的这个方面的嵌合分子一个区别特征是，对于人类yl分子，对蛋白A的结合能力相对于相同的Fc型的抗体有些减弱。在含有温和的离液盐的酸性pH值(在3.0或3.0以上)或在中性pH值緩冲液中，结合的本发明的这个方面的嵌合分子可以被有效地洗脱。这种亲和层析步骤可以产生>95%纯度的嵌合分子制备物。医学级纯度是治疗性应用必需的。本领域已知的其他方法可以用于替代或补充在蛋白A或G上的亲和层析来纯化包括免疫球蛋白部分的嵌合分子。这种嵌合分子在亲硫凝胶层析[Hutchens""/"Anal.Biochem.,159:217-226(1986)]和固定的金属螯合物层析[Al-Mashikhie"/.,J.DairySci.,71:1756-1763(1988)]中的表现类似于抗体。然而，与抗体相比，它们对离子交换柱的表现不仅由它们的等电点决定，还由可能由由于它们的嵌合性质而存在于分子中的电荷偶极决定。要理解的是，本发明的分子可以被用于结合任何配体，所述配体例如通过E3结构域来结合CCR2。这些可以包括CCL7、CCL8和CCL13[D'Ambrosi。(2003)J.Immunol.Methods273:3-13]。本发明的这个方面的分子可以用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病。因而，根据本发明的另一方面，提供了在有需要的受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的分子，从而在所述受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病。在此使用时，术语"受试者"是指哺乳动物，优选人类受试者。在此使用时，术语"治疗"是指防止、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或停止MCP-1/CCR2相关疾病的有害影响。在此使用时，用语"MCP-1/CCR2相关疾病"是指发作或进展取决于MCP-1和其受体CCR2间的相互作用的疾病。动脉粥样硬化、癌症(例如，前列腺癌、乳房癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、食道癌、成神经细胞瘤)、多发性石更化、粉瘤、单核细胞性白血病、肾脏疾病(例如，血管球性肾炎)、hamman-nch综合症、子宫内膜异位、类风湿性关节炎、细支气管炎、哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病(例如，结肠炎)、牙槽炎、再狭窄、脑外伤、银屑病、特发性肺纤维化和移植动脉硬化构成的组。本发明的分子可以直接地或在药物组合物中施用给受试者，在所述药物组合物中它与适合的载体或W武形剂混合。在此使用时，"药物组合物"是指一种或多种在此描述的活性成分与其他化学成分例如生理学适合的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是促进化合物向有机体的施用。优选的，所述药物组合物是无免疫原性的。在此使用时，术语"活性成分"是指本发明的分子责任产生预期的生物学效果。下文中，可互换使用的用语"生理学上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"是指不对有机体引起的显著刺激以及不消除施用的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些用语中。因而，例如，本发明的药学上可接受的载体可以包括脂氨基酸。做为选择，本发明使用的药学上可接受的载体可以包括包埋材料，例如多元醇(即，碳水化物)。适合于用作赋形剂的碳水化物的非限制性实例包括麦芽糊精(例如，GlucidexRoquette)、海藻糖(例如，TrehaloseMerck)、纤维二糖、葡萄糖、果糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、龙胆二糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇(例如，MaltisorbRoquette)、乳辟唐醇、赤薛醇、异麦芽酉同斗唐醇(palatimtol)、木糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇和核糖醇、蔗糖、棉子糖、龙胆糖、车前糖、毛蕊糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖和环己六醇。然而做为选择，本发明使用的药学上可接受的载体是适合于口服施用的孩史球体。例如，农义球体可以包括在胃中的pH值水平(例如，低于4的pH值水平)下对溶解或酸降解有抗性的有机材料的水不溶性基质，基本上如Vaghefi等人的美国专利No.6,849,271所描述的，通过引用将其合并在此。这种有机基质材料可以是，例如，甘油三酯、氪化植物油、蜡或蜡的混合物、聚烷氧基烷基醚、聚烷氧基烷基酯和水不溶性的部分降解的蛋白质。要理解的是，所述生物结合的聚合物(例如，本发明的PEG化的CCR2肽)可以用在药学上可接受的载体中并作为其一部分，因而充当用于递送CCR2氨基酸序列的载体分子，而同时充当递送载体的成分。这种双重用途的优选的实施方式是脂质体载体，例如，PEG结合的脂质体，如例如George等人的美国专利申请No.20030186869中所描述的，通过引用将其完全合并在此。在此，术语"赋形剂"是指添加到药物组合物中来进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的非限定性实例包括碳酸钙、磷酸4丐、各种糖类和淀粉种类、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。酉己制和施用药物的#支术可以最新X反本的"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,PA中找到，通过引用将其完全合并在此。适合的施用途径可包括例如，口服、直肠的、穿粘膜的，特别是经鼻、肠的或胃肠外的递送，包括肌肉内的、皮下的和髓内的注射，以及鞘内的、直接心室内的、静脉的、腹膜内的、鼻内的或眼球内注射。作为选择，人们可以以局部而不是全身性方式来施用药物组合物，例如，直接将药物组合物注射进患者的组织区域。本发明的药物组合物可以通过本领域7>知的过程，例如通过常夫见的混合、溶解、粒化、制成糖衣、研磨、乳化、密封、捕集或冻千过程来制备。因而本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体按常规的方式来配制，所述载体包括便于将活性成分加工成可以药学上使用的制品的赋形剂和辅助剂。适当的配方取决于给药途径的选择。对于注射，可将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选的在生理学相容的缓冲液例如Hanks'溶液、Rmger's溶液或生理盐水li冲液中。对于穿粘膜施用，将适合于需透过的障碍物的渗透剂用在配方中。这种渗透剂是本领域公知的。对于口力良施用，所述药物组合物可以通过卩吏活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体混合来容易地配制。这些载体使得所述药物组合物能被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶嚢、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、悬浮液等等，用于由患者口服摄取。口服使用的药理学制品可以在添加所希望的辅助剂之后，使用固体赋形剂、任选的研磨所述产生的混合物、以及加工农么粒的混合物以获得片剂或糖衣丸核，来制备。特别地，适合的赋形剂是填充物，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素和碳酰胺纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果希望，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如海藻酸钠。锭剂核心提供有适合的包衣。为了这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以添加到所述片剂或糖衣丸包衣中用于鉴别或表征不同的活性化合物剂量组合。可以口服使用的药物组合物包括由明力交制成的push-fit力史嚢，以及由明胶和成形剂，例如甘油或山梨醇制成的软的密封的胶嚢。push-fit胶嚢可以含有与填料例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶嚢中，活性成分可以溶解或悬浮在适合的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应当是适合于所选给药途径的剂量。对于口腔施用，所述组合物可采用按常井见方式配制的片剂、锭剂的形式。对于吸入施用，使用适合的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟曱烷或二氧化碳，以气溶胶喷雾呈现的形式从密封的包装物或喷雾器方便地递送根据本发明使用的活性成分。对于加压的气雾剂来说，剂量可以通过提供递送计量量的阀门来确定。例如，在分配器中使用的明胶的胶嚢和药筒可以配制为含有化合物的粉末混合物和适当的粉末基剂，例如乳糖或淀粉。在此描述的药物组合物可以配制为通过注射用于肠胃外施用，例如，通过弹丸注射(bolusmjection)或连续的输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，在任选地带有添加的防腐剂的安鲁瓦瓶或多剂量容器中。所述组合物可以是在油或水赋形剂中悬浮液、溶液或乳剂的形式，可以含有配方试剂，例如悬浮、稳定和/或分散试剂。用于肠胃外施用的药物组合物包括水可溶形式的活性制品的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制备为适合的油性或基于水的注射悬浮液。适合的亲油性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以含有提高悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠盐、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可以含有适合的稳定剂或提高活性成分的溶解性以允许制备高浓度溶液的试剂。做为选择，活性成分可以是粉未形式，用于在使用前与适合的赋形剂，例如，无菌的无热原的基于水的溶液来构建。通过使用诸如可可脂或其他甘油酯的常规栓剂基剂，本发明的药物组合物也可以一皮配制为直肠的组合物，例如一全剂或滞留灌肠剂，。适合于在本发明的上下文中使用的药物组合物包括一些组合物，其中以有效量包含活性成分来实现预期的目的。更具体地，"治疗有效量，，是指有效防止、减轻或改善失调(例如，缺血)的症状或延长接受治疗的受试者的存活的活性成分(例如，核酸或构建体)的量。治疗有效量的确定处于本领域技术人员的能力之内，特别是考虑在此提供的详细公开的情况下。对于用于本发明的方法任何制品，可以最初从体外和细胞培养分析来估计剂量或治疗有效量。例如，可以在动物模型中配制剂量来实现期望的浓度或滴度。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂曰里。在此描述的活性成分的毒性和疗效可以通过标准的药学步骤在体外、在细胞培养物或实-睑动物中确定。从这些体外和细胞培养分析获得的数据可被用于配制用于人类的剂量范围。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以变动。可以由独立的医师#4居患者的状况选择确切的制剂、给药途径和剂量。(参见，例如Fmgl,E.(1975),"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,"Ch.1,p.l.)可以分别地调节给药数量和施用间隔来提供足够的活性成分血浆或脑水平来诱导或抑制生物效应(即，最低有效浓度，MEC)。MEC将随每种制品变化，但可以从体外数据来估计。实现MEC所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。可以使用检测分析来确定血浆浓度。取决于要治疗的状况的严重度和反应性，给药可以是单次或多次施用，疗程持续从几天到几个星期，或直到实现治愈或实现疾病状态的减弱。毫无疑问，要施用的组合物的量将取决于待治疗的受试者、痛苦的严重度、施用的方式和处方医师的判断，等等。如果希望，本发明的组合物可以存在于包装或分配器设备中，例如PDA批准的试剂盒，其可以含有一种或多种含有所述活性成分的单位剂型。例如，所述包装可以包括金属或塑料薄膜，例如泡罩包装。所述包装或分配器设备可以伴有施用的说明。所述包装或分配器设备也可以伴随有由管理药物的制造备、使用或销售的政府部分4几构开具规定形式的注意事项公告，所述公告反映机构批准了组合物的形式用于人类或兽医学施用。例如，这种注意事项公告可以包括由美国食品和药品管理局对于处方药物的和批准和经批准的的产品插入物批准插页的标签。配制在药学上可接受的载体中包含本发明的制品、配制在药学上可接受的载体中的组合物也可以被制备、置于合适的容器中，并被标记上对以上进一步详述的适应症的治疗。要理解的是，本发明的这个方面的分子(例如，嵌合的蛋白)可以通过基因治疗的方式向受试者提供。因此，以上描述的哺乳动物表达构建体可以采用上文描述的任何适合的施用方式(即，体内基因治疗)来向受试者施用。做为选择，经由合适的基因递送工具/方法(转染、转导、同源重组，等等)和所需的表达系统将核酸构建体导入适合的细胞，然后在培养中扩展修饰的细胞并返回到受试者中(即，离体基因治疗)。当前优选的体内核酸转移技术包括使用病毒或非病毒构建体如腺病毒、慢病毒、单纯性疱疹I病毒或腺病毒相关病毒(AAV)和基于脂质的系统的转染。用于基因的脂质介导转移的有用的脂质是，例如，DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkmson"a/"CancerInvestigation,14(1):54-65(1996)]。用于基因治疗的最优选的构建体是病毒，最优选的是腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。病毒构建体例如逆病毒构建体包括至少一个转录启动子/增强子或基因座界定元件，或通过其他的方式如可变剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰来控制基因表达的其他元件。这种载体构建体还包括包装信号、长末端重复(LTR)或其部分，以及适合于病毒使用的正链和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。此外，这种构建体一般包括信号序列，用于肽从其置身其中的宿主细胞分泌。优选地，用于这个目的的信号序列是哺乳动物信号序列，例如lgK前导序列(例如，SEQIDNO:7和8)。任选地，构建体还可以包括指导多聚腺苦酸化的信号，以及一个或多个限制性位点和翻i奪终止序列。举例来说，这种构建体一般将包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二《连DNA合成起点和3'LTR或其部分。可以使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸和树枝状聚合物(dendrimers)。本发明的CCR2肽对MCP-1的亲和性使得其能用在MCP-1的纯化和;险测中。因而，根据本发明的又另一个方面，提供了包含标签和本发明的CCR2肽的分子。在此使用时，术语"标签"是指由结合配偶体例如抗体、螯合剂或抗生物素蛋白(生物素)分子特异性识别的部分。所述标签可以置于CCR2肽的C-末端或N-末端，只要它不影响其生物学活性(例如，MCP-1结合)。例如，标签多肽具有足够的残基以提供表位(即，表位标签)，针对该表位可以产生抗体，而又足够短从而不千扰CCR2肽的生物学活性。所述表位标签优选还是十分独特的，以致针对它的抗体基本上不与其他表位交叉反应。适合的标签多肽一般地具有至少六个氨基酸残基，通常在约8-50个氨基酸残基之间(优选的，在约9-30个氨基酸残基之间)。优选的是聚组氨酸序列，其结合镍，容许通过例如所描述的Ni-NTA层析来分离标签的蛋白质(Lmdsaywa/.Neuron17:571-574(1996)]。这种CCR2的表位标签的形式是期望的，因为它的存在可以使用针对所述标签多肽的标记的抗体来检测。而且，提供表位标签允许本发明的CCR2肽容易地通过使用抗标签抗体的亲和纯化来纯化。涉及抗体的亲和纯化纟支术和^^断分析在此稍后il明。标签多肽和它们相应的抗体是本领域/〉知的。实例包括流感HA标签多肽和它的抗体12CA5(FieldMol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988));c-myc标签和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan""/.，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985));和单纯性疱渗病毒糖蛋白D(gD)标签和它的抗体(PaborskyW"/.，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990))。已经/>开了其他标签多月太。实如j包4舌Flag月太[Hopp"a/.,BioTechnology,6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martinet/.，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽[Skmner"J.Biol.Chem.，266:15163-15166(1991)];和T7基因10蛋白狀标签[Lutz陽Freyermuthe/1"/，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]。一旦选4奪了标签多肽，可以使用本领域公知的方法来产生它的抗体。这些抗体是商业上可获得的，例3口来自Sigma,St.Louis.USA。本发明的这个方面的分子可以用于从生物样品分离MCP-1或检测其中MCP-1的存在。如在此使用的，用语"生物样品"是指生物流体，例如其中存在MCP-1的血液、血清、血浆、淋巴、胆汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、泪、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、腹腔积液、脓、条件培养基等等。根据本发明的这个方面，MCP-1的分离通过以下方式来实现使生物样品与本发明的这个方面的分子接触，从而MCP-1和所述分子形成复合物(使用容许分子与MCP-1结合的緩冲液、温度条件，实例参见datta-MannanandStone2004,上文)；并分离所述复合物从而从所述生物样品分离MCP-1。为了分离所述复合物，分子优选的固定在固相支持物上。如在此使用的，用语"固相支持物"是指目的试剂(例如，本发明的这个方面的分子)可以粘附的非水基质。固相支持物的实例包括但不限于，部分或全部地由玻璃(例如，受控的孔隙玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅树脂形成的固相支持物。在某些实施方式中，取决于实际情况，固相支持物可以包括测定^^的孔；在其它实施方式中，其是纯化柱(例如，亲和层析柱)。这个术语还包括离散微粒的不连续固相，例如那些在美国专利No.4,275,149中描述的。做为选择，这样的分子可以用于检测生物样品中MCP-1的水平。对于诊断应用，分子一^:地将用可检测的部分标记。可检测部分可以是能够直接或间接地产生可检测信号的任何一种。例如，所述可检测部分可以是放射性同位素、荧光或化学发光化合物，或标签(例如上文描述的，标记的抗体可以与之结合)。本发明的分子可以应用于任何已知的测定方法，例如竟争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫^CJ定测定。Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158(CRCPress,Inc.,1987)。分子和任选的固相支持物和成像试剂(例如，抗;、生色底;勿等等^可以被包装在具有适合的缓冲液和防腐剂的适合的容器中，用于诊断。在参阅无意用来限制的以下实施例时，本发明的其他目的、益处和新的特征对于本领域的普通技术人员将变得明显。另外，上文中描述的各种实施方式和方面以及在以下的权利要求部分中要求权利的每一种都可以在以下实施例中找到实验支持。实施例现在参考以下实施例，其与以上的描述一同以非限制性的方式说明了本发明。一般地，在此使用的术语和本发明中使用的实验方法包括分子的、生物化学的、微生物学的和重组DNA的技术。这些技术已经在文献中充分i兌明了。参见，例如，MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook"<a/.，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel"a/.，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularClonmg",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson""/,,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birrena/.(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美国专利Nos.4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中阐述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis，J.E.,ed.(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994);Stitese/1a/,(eds),"BasicandClmicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);MishellandShiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);在专利和科学文献中广泛地描迷了可用的免疫测定，参见，例如，美国专利Nos.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996，345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011，771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"Gait，M.J.,ed.(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.，andHigginsS.J.,eds.(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.，andHigginsS.J.，Eds.(1984);"AmmalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsmEnzymology"Vol.1-317，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak""StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);通过引用将所有这些合并在此，如同在此完全地阐述了一样。在这个文件的通篇提供了其他一般的参考文件。其中的步骤被认为是本领域公知的，为了读者的方便而提供。通过引用将其中含有的所有信息合并在此。,/i/靡婆症,慈l^示7乂,MC尸-/使用关于针对包括MCP-1(CCL2)在内各种趋化因子的抗体在前列腺癌症患者中存在性的ELISA测试，确定了CCL2与前列腺癌症之间的if关系。,悉4^f本-与以色列Haifa的CARMEL和RAMBAM医疗中心的泌尿科学部合作进行了人类实验工作。所有的血清和组织样品在日期为2003年11月11日的Helsinki委员会批准No.1822之下从RAMBAM医院的患者获得。由来自CARMEL医疗中心泌尿科学部的AviStem教授进行病理分析。患者的临床数据在以下的表1中概述。在#646,漆產的4;t-使用之前详细描述的ELISA测试来才全测针对每种测试的趋化因子的Ab滴度(Wildbaum,G.,M.Nahir,andN.Karin.2003.Beneficialautoimmunitytoproinflammatorymediatorsrestrainstheconsequencesofself-destructiveimmunity.Immunity19:679)。重组人类趋化因子SDF-1(CXCL12)、MlP隱la(CCL3)、MIP-l卩(CCL4)、IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、MIP-3a(CCL20)、MIP-3(3(CCL-19)、Lymphotactm(XCLl)、MIG(CXCL9)、RANTES(CCL5)、MCP-3(CCL7)和MCP-l(CCL2)全部购自PeproTech,RockyHill,NJ。人类MIF购自R&DSystems(Minneapolis,NM)。錄果#/#^#症,悉;#^云7#对^(:尸-/的^著的《,戎庫谅i来自23位前列腺癌症患者，21位具有良性前列腺肥大(BPH)的个体、11位对照受试者的血清(以下的表3)测试了针对各种趋化因子的自身抗体的存在，特别是参与癌症的那些，包括SDF-1(CXCL12)、MIF、M1P-1cx(CCL3)、MIP-1P(CCL4)、IL-8(CXCL8)、IP隱IO(CXCL10),、MIP-3oc(MCP-10)、MIP-3(3(CCL-19)、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、MIG(CXCL9)、RANTES(CCL5)、MCP-3(CCL7)和MCP-1(MCP-1)。,3-,悉者凝#炎'《;^#一在征集的前列腺癌症患者的数目23年龄，年[中值(范围)]74(64-81)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>征集的良性前列腺肥大患者的数目21<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>所有测试的趋化因子中，前列腺癌症患者具有专门针对MCP-1的高显著度的抗体滴度(图la，log2Ab滴度11.85±0.8)。在健康个体和BPH患者中抗MCP-1抗体的基线滴度(log2)是5-6，与根据任何其他的趋化因子观察到的没有不同。因而，前列腺癌症患者显示了针对MCP-1的高度特异性的和选择性的抗体反应(图la,p<0.01)。统计分析揭示了，约82%的前列腺癌症患者(19/30),和患有非恶性的BPH的仅4.7%(1/21)的患者显示了针对MCP-1的显著反应(log2Ab滴度>10,p<0.01)(图lb)。这些结果表明，MCP-1CCR2相互作用的抑制作用可以用来抑制由MCP-1/CCR2调节的癌症和其他疾病。ccw嵌合戚的Z^^j勿^屑辦f和,验,潔CCW2f五3,-/gG淘建#^Z^:图2显示了CCR2(E3)-IgG嵌合体表达构建体的示例。根据之前用来产生CTLA4-Ig的基础方案(VanOosterhout,A.J.，C.L.Hofstra，R.Shields,B.Chan,I.VanArk,P.M.Jardieu,andF.P.Nijkamp.1997MurineCTLA4-IgGtreatmentinhibitsairwayeosmophiliaandhyperresponsivenessandattenuatesIgEupregulationmamurinemodelofallergicasthma.AmJRespirCellMolBiol17:386)来产生IgGl构建体，修改是编码人类IgGl重链的恒定区(铰链-CH2-CH3)的cDNA从LPS和IL-4活化的外周血单核细胞(PBMC)克隆到pSecTag2/HygroB(Invitrogen,SanDiego,CA)上。人类CCR2-E3从LPS活化的人类PBMC中使用如下编码部分CCR2的6结构域(E3，分别为SEQIDNO:1禾口2)的引物来亚克隆正义cccaagcttggcctgagtaactgtgaaag(SEQIDNO:12)，反义ccgctcgagagtctctgtcacctgcgtgg(SEQIDNO:13)。在证实序列之后，将扩增的PCR产物克隆到pSec-Tag2载体(Invitrogen,SanDiego,CA)中。将人类IgGFey的铰链-CH2-CH3连接到质粒(pSec-CCR2)的CCR2(E3)下游来产生融合蛋白CCR2-IgG。潜定的/&c-CCW2f丑3，-/gG^这勿應,秀将pSec-CCR2(E3)-IgG质粒与CHODHFR迷你基因载体根据厂家的方案使用jetPEI(多相转染-IllkirchCedex,France)共转染入DG44CHO细胞(DHFR—'-)(由USA哥伦比亚大学的Dr.LawrenceChasm提供)。在含有潮霉素(hygromycme)(200)ig/ml)的培养基中筛选稳定转染的纟田胞。通过从AmershamBiosciences(Uppsia,Sweden)获得的蛋白G-Sepharose柱从上清液纯化CCR2(E3)-IgG融合蛋白，使用山羊抗人IgG-HRP(Sigma,St.Louis,MO)通过Western印迹分析来验证。CC72f五3,-/gG^一^^/,合MC尸-/通过ELISA测定确定了CCR2的E3结构域结合MCP-1的能力。五ZJ&4-通过如下的直接ELISA测定了CCR2(E3)-IgG对各种商业上可获得的人类趋化因子(PeproTech,RockyHill,NJ)的结合特异性96孑LELISA平板(Nunc,roskilde,Denemark)用100ng/mL每种趋化因子包被，用1%BSA/PBS洗涤和封闭。然后添加浓度5jig/ml的CCR2(E3)-IgG。添加HRP标记的小鼠抗人Ig(Jackson,Pennsylvama)作为第二抗体。结果显示为4S0nm处的O.D.读数。CCL2单克隆抗体(MAB679;R&DSystems,Mmne叩olis,NM)用作阳性对照(1(ig/ml)。兹l通过ELISA测定CCR2(E3)-IgG与各种细胞因子的结合。如图3所示，CCR2的E3结构域足以结合MCP-1,与测试的其他因子相比，展现了与这种趋化因子的高四倍的结合。CO2广￡3J-/gG,浙M^P-7渗^的勿/《if移勿l賓THP-1细胞从美国典型培养物保藏所获得(ATCC，Rockville,MD,ATCCAccessionNo.TIB-202),根据厂家的方案培养。勿應if移都;t-测试了CCR2(E3)-IgG抑制MCP-1诱导的THP-1细胞迁移的能力。4吏用转移孔室(CorningCostar,Cambridge,MA)进行了化学趋向性测定。将THP-1细胞与培养基(1x106细胞/孔)添加到转移孔的上室，在用培养基平衡下室之后，添加补充有或不补充可溶CCR2(E3)-IgG的重组人类MCP-l(R&DSystems,Minneapolis,NM)。然后在含有7.5%(302的湿润空气中在37。C孵育转移孔3小时。从下室收集迁移的单核细胞并计数。潜^图4显示了可溶的CCR2(E3)-IgG以剂量依赖性的方式显著地并断然地(90%)阻断MCP-1诱导的THP-1细胞迁移。用CCR2(E3)-IgG治疗小鼠-六只SCID/Bg小鼠的三个组皮下施用5x106个PC陽3Luc细月包/小鼠(ElHilali""/,ClmCancerRes.2005Febl;ll(3):1253-8.).第一组经历CCR2(E3)-IgG的重复施用(200昭/小鼠，i.v.,四天的间隔)。第二组施用匹配量的PBS,第三组施用同种型匹配的对照IgG。对于晚期治疗(即，建立的肺瘤的治疗)，在施用PC-3细胞18天后开始施用。J^GF的^^^-参见deWet,J.R.,K.V.Wood,M.DeLuca,D.R.Helmski，andS.Subramam.1987.Fireflyluciferasegene:structureandexpressionmmammaliancells.MolCellBiol7:725;Rubio,N.,M.M.Villacampa,andJ.Blanco.1998.TraffictolymphnodesofPC-3prostatetumorcellsmnudemicevisualizedusmgtheluciferasegeneasatumorcellmarker.LabInvest78:1315;Rubio,N.,M..LorgansmeasuredusmgprostatetumorPC-3cellsexpressingtheluciferasegeneasaquantifiabletumorcellmarker.Prostate44:133;Harlow,E.,andD.Lane.1988.Antibodies,alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork。在第30天处死动物，获取肿瘤并切片。使用来自SantaCruz.的兔抗VEGF(如果你需要，我可以明天给你提供cat编号)检测VEGF。炎>￡#遊泽#-如先前描述的，参见ElHilaliClmCancerRes.2005Febl;ll(3):1253-8。简言之，使用C〇2在第30天处死动物。获取肺和骨并在液氮中冷冻。然后将冷冻的组织研磨成粉未，添加裂解缓冲液(Promega)。样品涡旋数秒，混合物离心20分钟(13000rpm)。然后添加荧光素酶底物。潜^使用CCR2(E3)-Ig的治疗完全地降低了PC-3肿瘤生长-如图5a所示，与施用PBS或对照IgG的小鼠中发展的肿瘤相比，重复施用CCR2(E3)-IgG完全地抑制了PC-3肿瘤生长。使用CCR2-Ig的晚期治疗(第15天)阻断了预先建立的原发肿瘤的发展和它形成转移的能力。图5b清楚地显示了，即使当CCR2(E3)-IgG在肿瘤发展之后(细胞注射的第18天)施用，CCL2的阻断显著地降低了原发肺瘤的发展和它形成转移的能力。即使在肿瘤细胞施用的中间时间(8天)之后，CCR2(E3)-IgG仍能够抑制肿瘤发展。用CCR2(E3)-Ig治疗降低了肺瘤转移-如图5c所示，如由荧光素酶活性的降低所指明的，用CCR2(E3)-IgG治疗小鼠显著地抑制了向肺部和骨组织的紳瘤转移。与未治疗的动物相比，在两种组织中的荧光素酶活性被降低了4-10倍，并且总体达到了相同的最小水平(即，约0.5)。用CCR2(E3)-IgG治疗完全地降低VEGF表达-如图6a-f所示，与同种型匹配的对照IgG(附图6b、e)和PBS(图6d、f)相比，使用CCR2(E3)-IgG(图6a、d)显著地降低了VEGF在肿瘤位点的表达。这表明，CCR2途径的阻断抑制了VEGF的肿瘤诱导的活性。CCX2渗^#PC-3勿應迁移被CCW2J-/gG细胞迁移测定-使用CellBiolabs，SanDiego,CA的CytoSelect试剂盒测定细胞迁移。抗CCL2是从Dr.Martinez和Dr.Melado，免疫学和月中瘤学部，CentroNationaldeBiotecnologia，UAMCampusdeCantoblanco,Madrid,Spam获得的。简言之，如图7所示，PC-3细胞(106/孔)添加到转移孔平板的上室，CCL2(重组人类MCP-l、RHMCP-1;20ng/ml)添加到下孔，下孔也补充有抗CCL2(50yg)和/或CCR2(E3)-IgG(200)ig)。在37°C孵育2小时之后，通过FACS计数迁移的PC-3细胞。结果显示为三个副本的平均数土SE。结果在CCL2对前列腺癌细胞的可能的作用机制之中的是它吸引肿瘤细胞。这可以在图7中看出，CCL2与CCR2-Ig比抗CCL2mAb更好地抑制PC3细胞的迁移。CCW2尸EG必为了稳定本发明的CCR2氨基酸序列以及为了使它适合于口服和/或胃肠外施用，肽可以使用本领域已知的方法(例如，Croyle,M.A.，Wa/.,2000,Hum.GeneTher.11:1721-1730;Croyle,M.A.,"a/,,2004,J.Virol.78:912-921)PEG化，所述肽具有以下的序列LysGlyLeuSerAsnCysGluSerThrSerGinLeuAspGinAlaThrGinValThrGluThr(SEQIDNO:11),除了在它的N-末端添加了赖氨酸残基之外其与SEQIDNO:1相同。例如，单甲氧基聚(乙烯)乙二醇可以通过琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(其可以从SigmaChemicals,St.Louis,Mo.获得)活化。一旦被活化，聚合物可以以约10:1(聚合物肽)的肺瘤比添加至CCR2肽，在25。C轻柔搅拌下来进一步进行PEG化反应。通过添加相对于添加的PEG数量过量(例如，10倍)的赖氨酸(SigmaChemicals)，可以停止反应。未反应的PEG、过量的赖氨酸和反应副产物通过在用100mM磷酸钾缓冲的盐水(pH7.4)平衡的Micro-BioSpmP-30层析柱(Bio-Rad)上进行缓冲液交换来消除。要理解的是，为了清楚而在独立的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以组合于单个实施方式中提供。反之，为了简便起见在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何适合的子组合来才是供。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，很明显的是，多种替换、修改和变体对于本领域技术人员是显而易见的。因此，旨在包括所有落在所附的权利要求的精神和广义范围内的这种替换、修改和变体。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请和GenBankAccession号码通过引用将它们完全地合并到本说明书中，达到如同每个单独的出jf反物、专利或专利申i青或GenBankAccession号码一皮具体和分别地指明通过引用合并在此的相同程度。此外，在本申请中所有参考文献的引用或列明不应被看作是承认这些参考文献是本发明可获得的现有技术。权利要求1.一种包含异源氨基酸序列的分子，所述异源氨基酸序列结合到缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1，并且其中所述分子是无免疫原性的。2.—种分子，其包含附着于非蛋白质部分的CCR2氨基酸序列，其中所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1，而且所述分子在受试者中是无免疫原性的。3.—种分子，包含至少两个各自能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列。4.一种包含标签的分子，所述标签附着于缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能够结合MCP-1。5.如SEQIDNO:14或15所示的分子。6.包含权利要求1、2或3的分子以及药学上可接受的载体的药物纟且合物。7.包含一种分子和药学上可接受的载体的药物组合物，所述分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述药物组合物是无免疫原性的。8.—种在有需要的受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1、2、3和/或5和Z或7的分子，从而在所述受试者中治疗MCP1/CCR2相关疾病。9.权利要求1、2、3、5或7的分子的用途，用于制备被鉴定用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病的药物。10.—种从生物样品中分离MCP-1的方法，所述方法包括(a)使所述生物样品与权利要求4的分子接触，以使得MCP-1和权利要求4的分子形成复合物；以及(b)从所述生物样品分离所述复合物从而分离MCP-1。11.权利要求1、6、8或9的任一项的分子、药物组合物、方法和用途，其中所述异源氨基酸序列包含免疫球蛋白氨基酸序列。12.^又利要求1、4、6、8、9或10的任一项的分子、药物组合物、方法和用途，其中所述缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列在SEQIDNO:2中示出。13.权利要求8或9的任一项的方法或用途，其中所述MCP-1/CCR2相关疾病选自由炎症性疾病、坏死、动脉粥样石更4匕、癌症、多发性石更化、粉瘤、单核细胞性白血病、肾脏疾病(例如，血管球性肾炎)、hamman-rich综合症、子宫内膜异位、类风湿性关节炎、细支气管炎、哞喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病(例如，结肠炎)、牙槽炎、再狭窄、脑外伤、银屑病、特发性肺纤维化和移植动脉硬化构成的组。14.权利要求4或10的任一项的分子或方法，其中所述标签是表位标签。15.权利要求4或10的任一项的分子或方法，其中权利要求4的分子附着于固相支持物上。16.权利要求1、2、3、5或7的任一项的分子，附着于非蛋白质部分。17.^又利要求2、6、8、9的任一项的分子、药物组合物、方法或用途，其中所述非蛋白质部分选自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、苯乙烯马来酐共聚物(SMA)和二乙烯醚与顺丁烯二酸酐的共聚物(DIVEMA)构成的组。18.^又利要求6或7的^壬一项的药物组合物，其中所述接受的载体被配制为用于肠胃外施用。19.^又利要求6或7的^f壬一项的药物组合物，其中所述接受的载体基本上是无免疫原性的。20.^又利要求6或7的任一项的药物组合物，其中所述药学接受的载体包括脂氨基酸。21.寿又利要求6或7的任一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括碳水化物。22.^又利要求6或7的^壬一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括微球体。23.权利要求6或7的任一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括脂质体。24.^又利要求6或7的任一项的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚合物微球体。25.—种在有需要的受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的分子，所述分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，从而在所述受试者中治疗MCP-1/CCR2相关疾病。26.—种分子用于制备药物的用途，所述分子包含缺少CCR2N-末端结构域并能够结合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述药物被鉴定为用于治疗MCP-1/CCR2相关疾病。27.权利要求25或26的任一项的方法或用途，其中所述缺少CCR2N-末端结构域的CCR2氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。28.^又利要求25或26的任一项的方法或用途，其中所述MCP-1/CCR2相关疾病选自由炎症性疾病、坏死、动力永粥样石更化、癌症、、多发性硬化、粉瘤、单核细胞性白血病、肾脏疾病(例如，血管球性肾炎)、hamman-rich综合症、子宫内膜异位、类风湿性关节炎、细支气管炎、哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病(例如，结肠炎)、牙槽炎、再狭窄、脑外伤、银屑病、特发性肺纤维化和移植动脉硬化构成的组。29.权利要求25或26的任一项的方法或用途，其中所述分子在SEQIDNO:14或15中示出。全文摘要分子和包含该分子的组合物用于分离MCP-1和治疗CCR2/MCP-1相关疾病。文档编号C07K14/715GK101160323SQ200680012540公开日2008年4月9日申请日期2006年4月10日优先权日2005年4月15日发明者G·威尔德鲍姆,L·伊扎克,N·卡林,U·韦因伯格,Y·佐哈申请人:拉帕波特家族医学科学研究所