专利名称：：通过dsRNA结合域与PTD/CPPS的融合物转导运输siRNA的制作方法
技术领域：
：本发明涉及向细胞进行核酸运输。更具体地，本发明涉及用融合到对阴离子电荷进行中和的核酸结合域的蛋白质转导域来向细胞运输带阴离子电荷的分子如siRNA。
背景技术：
：对作为一种选择性降解mRNA的细胞机制的发现允许耙向操作细胞培养物中的细胞表型靶向以及可能研发出定向疗法(Behlke,Mol.Ther.13,644-670,2006;Xie爭乂，DrugDiscov.Today11,67-73,2006)。尽管siRNA具有很大的潜力用于细胞表型的操作，但由于其大小以及带有负(阴离子)电荷的性质，因而siRNA是不能进入细胞的大分子。实际上，siRNA超过Lipinski的"5s规则"的25倍，该规则被用于膜可扩散分子的细胞运输，通常这些分子的大小限制在小于500Da。因此，在缺少运输载体或转染剂的情况下，棵siRNA即使在毫摩尔浓度的条件下也不进入细胞(Barquinero爭乂，GeneTher.11Suppl1,S3-9,2004)。重要关注集中使用对siRNA进行浓缩并在细胞膜穿孔的阳离子脂质，以解决siRNA的运输问题。尽管被广泛应用，但转染剂仍然不能够有效运输到许多细i包类型中，尤其是原代细胞以及造血细胞系(T细胞和B细胞,巨噬细胞)。此外，脂质转染剂常常导致不同程度的细胞毒性，其可从肺瘤细胞中的轻微水平到原代细胞中的高水平。最近的细胞定向靶向法抗体融合至DNA浓缩鱼精蛋白(Song爭人，Nat.Biotechnol.23,709-717,2005)以及siRNA融合至受体耙向的RNA适体(McNamara爭乂，NatBiotechnol.24,1005-1015,2006)|是供了将siRNA运输到所选择的细胞中的可能。尽管这两种方法^f艮有前途，但它们不能够将siRNA运输到100%的表达受体的肿瘤细胞中，也不容易进行改变以适合其它的非受体表达细胞，并且只在几种细胞类型上经过测试。最近，通过包含胆固醇形成LDL粒子以及PEI缩合的方法而引入聚集体形成纳米粒子或者将siRNA封装在脂质体中以掩蔽负电荷的方法已经显示出能够在不同程度上成功地将siRNA运输到一些肺瘤细胞中(Scherr爭人，Ann.Hematol.83,1-8,2004;Schiffelers爭乂，NucleicAcidsRes.32，e149,2004;Song爭乂，2005;Soutschek爭乂，Nature432,173-178,2004;Urban-Klein爭乂，GeneTher.12,461-466，2005;Zhang爭入，Genet.VaccinesTher.3,5,2005)。因此，i殳计出通过快速、非毒性机制来解决针对100。/。的所有细胞类型、原代以及致瘤细胞的siRNA大分子运输问题，对于在细胞培养物中RNAi扩增的潜能、靶向筛选以及治疗剂研制来讲显是重要的。
发明内容本发明提供一种组合物，其含有核酸结合蛋白质，其与带阴离子电荷的核酸复合形成核酸结合蛋白质-核酸复合物；以及连接到该核酸结合蛋白质-核酸复合物的蛋白质转导域(PTD)。一方面，核酸结合蛋白质含有双链RNA结合域(DRBD)。另一方面，核酸是带有阴离子电荷的核酸。再一方面，核酸含有dsRNA。本发明进一步提供一种含有融合多肽的组合物，该多肽含有i)含有蛋白质转导部分(PTD)的第一结构域，该转导部分具有膜运输功能；以及ii)含有核酸结合蛋白质的第二结构域；b)核酸，其中该核酸带有阴离子电荷并且与核酸结合蛋白质相互作用，且其中PTD-核酸结合蛋白质-核酸的全部阴离子电荷相对于单独的核酸减少；以及c)药学上可接受的载体。本发明提供了一种融合多肽，其含有a)蛋白质转导域(PTD)，该转导域包括膜运输功能；以及b)中和或减少结合的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域。本发明还包括一种药物组合物，其含有a)蛋白质转导域(PTD)，该转导域包括膜运输功能；以及b)中和或减少连接的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域和药学上可接受的载体。本发明提供一种将带有阴离子电荷的核酸分子引入到细胞中的方法，该方法包括将细胞与组合物接触，该组合物包括核酸结合蛋白质与带阴离子电荷的核酸复合形成的核酸结合蛋白质-核酸复合物，以及连接到该核酸结合蛋白质-核酸复合物的蛋白质转导域(PTD);或与融合多肽接触，该融合多狀含有a)蛋白质转导域(PTD)，该转导域含有膜运输功能；以及b)中和或减少结合的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域和连接的核酸。。本发明还进一步提供一种将带有阴离子电荷的核酸分子引入到细胞中的方法，其包括用核酸分子与核酸结合域结合以中和或减少阴离子电荷，以及将复合物连接至蛋白质转导域(PTD)并用PTD-电荷中和后的核酸与细l包进4于4妄触。本发明还提供一种编码融合多肽的分离的多核苷酸，该融合多肽包括a)蛋白质转导域(PTD),该转导域包括膜运输功能；以及b)中和或减少结合的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域。本发明还提供一种含有多核苷酸的载体以及含有载体和/或多核苷酸的宿主细胞。本发明提供一种制备融合多肽的方法，其包括对本发明的多核苷酸进行表达以及对所表达的融合多肽进行基本地纯化。本发明还提供一种制备融合多肽的方法，其包括在一定条件下对含有本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞进行培养，由此多核苷酸得以表达并且表达的融合多肽被基本纯化。本发明提供一种制备用于转导细胞的组合物的方法，包括将带阴离子电荷的核酸与融合多肽进行接触，该融合多肽含有a)蛋白质转导域(PTD)，该转导域包括膜运输功能；以及b)中和或减少结合的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域。本发明还提供一种包括一个或多个容器的试剂盒，容器含有(a)蛋白质转导域；以及(b)核酸结合蛋白质。该试剂盒中还进一步含有dsRNA分子。本发明提供了方法和組合物，其使用蛋白质转导域(PTD)通过对多核苷酸上的电荷进行可逆掩蔽或中和，以将siRNA运输到细胞中。一方面，双链RNA(dsRNA)结合域(DRBD)被用于掩蔽电荷。另一方面，2~4个DRBD覆盖dsRNA的柱形表面并且对多核苷酸需要被运输的基本部分进行掩蔽。DRBD以序列独立的方式进行结合，这样任何多核苷酸(如siRNA)都可以通过本发明的方法和组合物来得到运输。该公开提供了融合多肽以及构建物，其用于将带有阴离子电荷的包括诊断剂和治疗剂的核酸分子运输到细胞中或研究对象体内。该融合构建物包括蛋白质转导域和核酸结合域，或蛋白质转导域和核酸，该核酸表面包覆有可对其上的阴离子电荷进行充分中和的一个或多个核酸结合域。例如，阴离子RNA的电荷中和可孝奪》文阳离子PTD并且还可防止缀合物的聚集。暴露出的PTD与细胞表面相互作用，诱发大胞饮作用并促使其从大胞饮体逃逸出来进入细胞质。一旦进入到细胞中，核酸结合蛋白质(如DRBD)或者^皮除去，例如通过含有蛋白质，如将siRNA载入RISC中涉及的TRBP的内源DRBD，或者可加入去稳定基元，如PEST序列，允许从细胞质中的siRNA去除。图1A-E示出了PTD-DRBD介导的向细胞内siRNAs的运输。(A)PTD-DRBD结合到si西A的示意图。DRBDs掩蔽约16bp的dsRNA，在两端留有阴离子电荷，其被假设为被第一个阳离子PTD结合。(B)基于在TAT-Cre的工作(Wadia爭乂，2004)而提出的PTD-DRBD:siRNA细胞进入机制。自由阳离子PTD域与细胞表面的阴离子蛋白多糖相互作用(l)诱导大胞饮作用(2),然后大胞饮体的pH下降增强小泡逃逸(3),PTD-DRBD:siRNA细胞质解体(4)以及siRNA载入到RISC中。(C)PTD-DRBD结合到Cy3-标记的19基体siRNA的EMSA分析。检测到两种不同的更高级的复合物。M,dsDNA梯带标记(laddermarker)。(D)用PTD-DRBD:siRNA-Cy3加入6小时后处理的H1299细胞进行的显微分析。对细胞进行清洗并采用胰蛋白酶/肝素处理以在显微分析前去除细胞外结合的物质。(E)釆用PTD-DRBD:siRNA对dGFP和dDsRed进行RNAi敲减(knockdown)。使用siRNAs对共表达整合的去稳定dGFP和dDsRed报道蛋白的H1299细胞根据指示处理6小时，24小时后清洗并进行流式细胞分析。GFP1和GFP2siRNA是独立的序列；SN,沉默阴性对照siRNA;Luc,荧光素酶对照siRNA。平均值归一化为百分比对照，误差条表示SEM，所有实验均进行3次重复。图2A-D示出了PTD-DRBD介导的dGFPRNAi应答的分析(A和B)。如所示，处理后的H1299dGFP/dDsRed细胞在1天(A)和2天(B)时的dGFPRNAi应答的流式细胞计数单细胞直方图分析。(C)为H1299dGFP/dDsRed细胞的单siRNA处理后dGFPRNAi敲减衰变动力学的流式细胞术分析，如所示。(D)为H1299dGFP细胞的多重siRNA处理后dGFPRNAi敲减衰变动力学的流式细胞术分析，图所示。平均值归一化为百分比对照，误差条表示SEM，所有实验均进行3次重复。图3A-F示出了内源性GAPDHmRNA通过PTD-DRBD:siRNA的敲减。(A-F)为在处理后6、12、24、36、72和96小时H1299细胞内的内源性GAPDHmRNA表达的定量TaqManRT-PCR分析，如所示。平均值归一化为卩2微球蛋白并记录为^^莫拟GAPDH对照的百分比，误差条表示SEM，所有实验均进行3次重复。图4A-F示出了在多种细胞类型中PTD-DRBD运输siRNA诱导的RNAi应答。(A和B)对在(A)人源THP-1巨噬细胞中的dGFPRNAi应答以及对在(B)鼠源B16F0黑素瘤细胞中的野生型eGFPRNAi应答的流式细胞术单细胞直方图分析，如所示。(C-F)分别为对(C)人源HFF原代成纤维细胞，(D)人源JurkatT细胞，(E)人源HaCaT角质形成细胞，(F),人源T98G恶性胶质瘤细胞进行单siRNA处理后dGFPRNAi敲减衰变的流式细胞术分析，如所示。平均值归一化为百分比对照，误差条表示SEM，所有实验均进行3次重复。图5A-E显示人源胚胎干细胞的PTD-DRBD:siRNA耙向分化。(A)表达野生型eGFP的人源H9胚胎干细胞经过PTD-DRBDGFP2siRNA加入2天处理时的荧光显微分析。(B)使用PTD-DRBDOct4或对照荧光素酶(Luc)siRNAs对HUES9hESC处理后2天的Oct4免疫印迹分析。(C)示出了使用PTD-DRBD运输的Oct4或对照荧光素酶(Luc)siRNAs处理的人源HUES9胚胎干细胞的细胞分裂曲线。(D)使用PTD-DRBD运输的Oct4或荧光素酶(Luc)siRNAs处理2天后对HUES9hESCs中Oct4和SSEA4表达的免疫组织化学分析。抗体Alexa594-缀合的抗-Oct4(红色)，Alexa488-缀合的抗-SSEA-4(绿色)。基因组DNA,Hoechst(蓝色)。(E)使用PTD-DRBD运输的Oct4或荧光素酶(Luc)siRNAs处理10天后对HUES9hESC中GATA6和SSEA4的表达的免疫组织化学分析。抗体Alexa594-缀合的抗-GATA6(红色)，Alexa488-缀合的抗-SSEA-4(绿色)。基因组DNA，Hoechst(蓝色)。图6A-D示出了细胞毒性。(A-D)细胞，如所示，用模拟、月旨质转染或PTD-DRBD加siRNA进行处理后，如所述，对其进行流式细胞术前向散射(FSC)以及侧向散射(SSC)分析来检测细胞毒性。结果记录为活细胞相对于才莫拟对照的百分比。图7显示在第一天使用500,000U87MG-EGFRvIH恶性胶质瘤细胞对棵鼠进行颅内接种。在第10天，使用靶向EGFRvIII的PTD-DRBD:siRNA对该鼠进行处理。使用PTD-DRBD加入24、48、72小时后，杀死鼠并取得连续的冠状脑切片。邻近的脑切片使用H&E染色，或根据所述用抗-EGFR抗体加上H染色进行IHC。在24小时时EGFR染色减轻，随后在48和72小时EGFR染色的显著减少表明EGFRRNAi应答已在恶性胶质瘤中扩散。具体实施例方式在这里和所附的权利要求中使用的单数形式"一"、"一个"和"这个"除非文中特别指明，包括其复数形式。因此，例如，事物"一个PTD"包括复数个这样的PTD，事物"细胞"包括一种或多种本领域技术人员已知的细胞，等。除非另外定义，这里使用的所有科技和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的意思相同的意思。虽然此处叙述了示例性的方法、器件和材料，但与这里所描述的相似或相同的方法和材料也可以被用于实施本发明公开的方法和组合物。以上和本文中讨论的出版物被提供，只是说明其公开内容先于本申请提交日。但不应理解为由于现有公开，而承认本发明的发明者们无权早于这样的公开内容。由于细胞膜所造成的生物利用度的限制，向细胞运输功能性试剂的能力就存问题。即，细胞的质膜形成一有效的屏障，其将细胞内摄取的分子限制在那些几乎无极性的以及大小小于约500道尔顿的分子。以前用于提高蛋白质内化的研究集中于带有受体配体的融合蛋白(Ng爭乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:10706-11,2002)或将其包装成包装成笼形的脂质载体(Abu-Amer爭乂，J.Biol.Chem.276:30499-503,2001)。然而，这些技术常常导致差的细胞摄取以及细胞内螯合作用进入胞吞路径。本发明的优点包括胞内运输核酸，所述核酸用其他途径难以进行转染且不可能进行显微注射。例如，原代淋巴细胞很难进行转染，需要对DNA构建物进行电穿孔。这一过程效率很低，会杀死90-99%的细胞，小于10%的存活下来的细胞产生治疗结果。本公开提供了融合多肽以及组合物，其可用在细胞转导以及细胞调节中。本公开中的融合多肽包括包含膜运输功能的转导部分结构域以及足以可逆中和核酸上阴离子电荷的核酸结合域。在进一步的方面，本发明的融合多肽包括能够与核酸结合域相互作用的阴离子核酸分子(如dsRNA)。-使用这些方法和组合物可以治疗各种疾病以及病症。例如，通过运输抗肺瘤siRNA可以抑制、阻止以及石皮坏肿瘤细胞的生长。例如，抗肿瘤siRNA可以为靶向作用编码爿f足进血管生成的多肽的基因的siRNA。在本领域已知与肿瘤生长相关的各种血管生成蛋白。因此，应当理解的是，本公开不局限于任何特定的核酸结合域或核酸结构域。相反，核酸结构域可为任何核酸结合域，其能够可逆中和或减少需要被运输的核酸中的阴离子电荷。此外，任何带有阴离子电荷的核酸(如dsRNA、siRNA和类似物)都可以使用此处所描述的方法和组合物进行运输。本发明提供可用于对干扰RNA剂进行运输的方法和组合物。RNA干扰(RNAi)是这样一个过程，在该过程中信使RNA(mRNA)被小干扰RNA(siRNA)降解，该小干扰RNA来源于双链RNA(dsRNA),该双链RNA含有与需要进行沉默的耙基因相同或非常相似的核苦酸序列。该过程阻止了通过转录后、翻译前操作产生靶基因编码的蛋白质。因此，也可以实现对显性疾病基因的沉默。涉及植物、蝇类以及蠕虫的遗传和生物化学研究已发现它们具有相似的过程，在这些过程中dsRNA被一种称为切酶即dsRNA核糖核苷酸内切核糖核苷酸酶切割为短的干扰RNA(siRNA)(Bernstein爭乂，2001;Hamilton&Baulcombe,1999,Science286:950;MeisterandTuschl,2004,Nature431,343-9),因此可从原始的单个dsRNA产生多个分子。siRNA被载入多聚体RNAi沉默复合物(RISC),产生催化激活以及mRNA的靶向特异性(HannonandRossi，Nature431,371-378,2004;NovinaandSharp,Nature430,161-164,2004)。在siRNA载入RISC的过程中，反义链或引导链从siRNA中分离出来并停靠在RISC催化亚基Argonaute-2(Ago2)中(Leuschner爭乂，EMBORep.7,314-320,2006)。将mRNA从细胞核中导出进入到细胞质中被认为在抵达核糖体前要经过活化的RISC,因此可进行基因表达的直接、转录后、翻译前调节。理论上，每一个细胞的mRNA均可通过选择性RNAi应答的诱导来进行调节。21-23bp的siRNAs在有效地诱导哺乳动物细胞RNAi应答的能力现在是常规的(Sontheimer,Nat.Rev.Mol.CellBiol.6,127-138,2005)。siRNA的50%抑制浓度(IC5o)在10-100pM范围内，显著低于具有1-10nM范围的ICso的最好药物。因此，由于其极好的选择性，RNAi已成为细胞表型、定位遗传路径、发现以及验证治疗目标定向操作的基础，并且具有重要的治疗潜力。RNAi最受关注的方面包括(1)dsRNA,而不是单链反义RNA是干扰剂；(2)该过程是高度特异性的并且相当有效(每个细胞仅需要几个dsRNA分子就能进行有效干扰)；(3)千扰活性(和假定的dsRNA)可引起远离引入位点的细胞和组织中的干扰。然而，有效地运输dsRNA是困难的。例如，分子重量为13,860道尔顿的21bpdsRNA不能穿过细胞膜而进入细胞质，这是由于RNA的(1)大小以及(2)极度的负(酸性)电荷。将运输物进行大分子融合到阳离子多肽转导域(PTD)(也称为细胞穿透肽，CPP)上，如TAT、8xArg、Antp(SnyderandDowdy,2005,ExpertOpin.DrugDeliv.2,43-51)，可被用于帮助大分子的摄取。PTD可用来将多种大分子运输物，包括多肽、蛋白质、PNA以及DNA载体运输到100%的原代和转化细胞中，以及大部分，但非全部的组织中。包含PTD的临床前模型当前正在几个临床试验中进行测试(Schwarze爭乂，1999,Science285,1569-1572;Eguchi爭乂，2001,J.Biol.Chem.276,2620426210;Koppelhus爭乂，2002,AntisenseNucleicAcidDrugDev.12,51-63)。阳离子PTD通过大胞饮作用进入到细胞中，大胞饮作用是一种所有细胞的特殊液态摄取形式。对模型小泡的生物物理学研究表明运输物从大胞饮体小泡中逃逸到细胞质中时需要降低pH(Magzoub爭乂，2005,Biochemistry44,14890-14897)。PTD或CPP的阳离子电荷对于分子横向跨越细胞膜是必需的。意料之中的是，阳离子PTD(6-8个正电荷)与阴离子siRNA(约40个负电荷)的缀合导致电荷发生中和并且PTD失活，无siRNA进入细胞(Turner爭乂，2007,BloodCellsMolDis.,38(1),l隱7)。然而，阳离子TAT和阴离子RNA(或DNA)通过可逆的二硫键的化学缀合导致阳离子TATPTD的电荷中和，由此消除或降低对有效跨越细胞表面以及转导细胞所需的电荷。此外，由于大量的多余负电荷存在，如在21bpdsRNA上相对于TAT上有限阳离子电荷的过量负电荷，任何缀合到RNA上的自由TATPTD都会产生聚集且出现肽-核酸缀合体发生沉淀。因此，尽管PTD具有很大的能够将大分子siRNA运输到细胞内的潜力，但是siRNA对PTD的电荷中和使得应用该方法存在很大的障碍。本发明的方法和组合物可逆地掩蔽或中和了核酸(如dsRNA)上的电荷。本发明利用了核酸结合蛋白质来掩蔽核酸上的阴离子，同时保留了跨越细胞膜所必需的阳离子电荷，由此保持PTD的阳离子活性使其能够跨越细胞膜并对细胞进行转导。本发明提供了有用的方法和组合物来解决大分子的运输问题。为了避免PTD电荷中和以及解决siRNA运输问题，本发明的一种实施方式提供了一种通用的siRNA运输方法，其包括一可操作地连接到dsRNA结合域(DRBD)的PTD运输结构域，以形成结合了siRNA且掩蔽其负电荷的PTD-DRBD构建物。DRBD以序列独立的方式结合到siRNA上，该方式允许PTD-DRBD介导的向细胞内的siRNA运输。使用PTD-DRBD运输siRNA，在所有受试细胞类型中均发现RNAi以非细胞毒性的方式对多个细胞靶产生应答，包括原代成纤维细胞、角质形成细胞、T和B细胞、巨嗟细胞、神经元细胞以及人源胚胎干细胞(hESC)。例如，本发明显示PTD的融合蛋白(如TAT运输肽)以及PKR的dsRNA结合域(DRBD)可有效地对细胞进行转导。DRBD结合到dsRNA并覆盖或寺备蔽dsRNA。一方面，可使用一个或多个DBRD来覆盖dsRNA的阴离子表面。例如，一方面，2~4个DRBD覆盖dsRNA的圓柱形表面。DRBD以序列独立的方式结合到dsRNA，这意味着任何核酸(如siRNA)都可以在不需考虑序列组成的情况下使用本方法来进行运输。可选的方法包括在核酸(如siRNA)和PTD-DRBD(如TAT-DRBD)融合蛋白之间设计出二硫键或酯键以进一步增强结合亲合力。该复合物随后被还原并释放到细胞内部。同样地，siRNA可覆盖DRBD和以生物敏感的可逆方式直接缀合到siRNA的TAT。—旦PTD-DRBD-核酸复合物跨越膜，PTD-DRBD-核酸复合物随后一皮还原并在细胞内释;故。然后通过切酶，一种类似RNAseIII的核糖核普酸酶对dsRNA进行水解，以释放出沉默靶基因的siRNA。因此，RNAi的选择性治疗人类疾病的效力能够更有效地被运输到受体和细胞中。本发明克服了使RNAi难以运输和不能够被运输的大小以及电荷的限制。通过可逆中和核酸(如dsRNA)上的阴离子电荷，PTD能够在离体以及活体内将带有阴离子电荷的核酸运输到细胞中。在本领域中已知晓多种蛋白质转录域/肽,并且已显示能够有助于摄取连接到结构域的异源分子(如运输物分子)。这种转导域通过一种称为大胞饮作用的过程来帮助摄取。然而，大胞饮作用是所有细胞进行的非选择性形式的胞吞作用。因此，这种蛋白质转导的非选择性方面也导致了大部分的PTD运输物在活体内被转导到非靶细胞，由此大大需要更多的原料。因此，从药理学角度来讲，PTD与当前使用的小分子治疗剂类似，其不能够特异地运输到活体内期望的细胞及组织中。对能够有效通过真核生物细胞的细胞质膜的几种蛋白质的发现得以确认出衍生出肽传导域的一类蛋白质。这些蛋白质中表征最好的是果蝇同源蛋白antennapedia转录蛋白(AntHD)(Joliot爭乂，NewBiol.3:1121-34,1991;Joliot爭乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1864-8,1991;LeRoux爭乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9120-4,1993)、单纯性疱渗病毒结构蛋白VP22(ElliottandO，Hare,Cell88:223-33,1997)、HIV-1转录激活TAT蛋白(GreenandLoewenstein,Cell55:1179-1188,1988;FrankelandPabo,Cell55:1189-1193,1988)以及最近的朊病毒蛋白质的阳离子N誦端结构域。不仅这些蛋白质可以通过质膜，而且与其它的蛋白质如酶P-半乳糖香酶的结合，足以刺激这些复合物的细胞摄取。这种嵌合蛋白质以生物活性的形式出现在细胞质和细胞核中。对该过程的表征显示以受体独立的方式摄取这些融合蛋白的过程是快速的，常常发生在几分钟内。此外，这些蛋白质的转导似乎不会受细胞类型的影响，并且能够有效地对培养细胞进行约100%的转导，没有明显细胞毒性(Nagahara爭乂，Nat.Med.4:1449-52,1998)。除了全长蛋白质外，蛋白质转导域也被成功地用来诱导在细胞内摄取DNA(Abu-Amer,见上)、反义寡核普酸(Astriab-Fisher爭乂，Pharm.Res,19:744-54,2002)、小分子(Polyakov爭乂，Bioconjug.Chem.11:762-71,2000)和甚至40纳米的无机铁粒子(Dodd爭人，J.Immunol.Methods256:89-105,2001;Wunderbaldinger爭乂，Bioconjug.Chem.13:264-8,2002;Lewin爭乂，Nat.Biotechnol.18:410-4，2000;Josephson爭乂，Bioconjug.,Chem.10:186-91,1999)，这些都表明该过程没有明显的大小限制。蛋白质转导域(PTD)与异源分子(如多核苷酸、小分子或蛋白质)的融合足以引起它们以依赖于浓度的方式转导进多种不同的细胞中。此外，用于蛋白质运输的这项技术看似避开了与基于DNA和药物的技术相关的问题。然而，需要重点提及的是RNAi分子是高价阴离子，和在本发明之前这类核酸分子还未能够使用PTD进行有效转导。PTD本身通常为阳离子。这些阳离子蛋白质转导域携带其连接的运输物进入脂膜筏内体，并通过破裂内体小泡将它们的运输物释放到细胞质中。PTD的例子包括AntHD、TAT、VP22、阳离子朊病毒蛋白结构域及其功能性片段。本发明提供了方法和組合物，其将PTD如TAT以及多精氨酸的使用与能够对核酸(即"运输物")结构域上的阴离子电荷进行中和的核酸结合域组合在一起。这些组合物提供方法，由此治疗或诊断剂能够靶向作用细胞，因此PTD导致组合物^皮才聂取进靶细胞内。通常，融合分子的转导^4几乎可以为任何合成或天然存在的氨基酸序列，其能够转导或帮助转导融合分子。例如，根据本发明可通过使用蛋白质转导域来完成转导，这些转导域为例如，HIVTAT蛋白质或其片段，其在N-末端或C-末端共价连接到核酸结合域(如DRBD)上、覆盖了核酸结合域(如DRBD)的核酸上或同时连接到这二者上。可选地，蛋白质转导域可含有antennapedia同源异型域或HSVVP22序列、朊病毒蛋白的N-末端片段或其合适的转导片段，例如那些本领域已知的片段。PTD的类型和大小受到包括期望转导程度的几个参数的支配。通常，PTD至少能够转导至少约20%、25%、50%、75%、80%或90%、95%、98%或达到，并且包括约100%的细胞。转导效率，通常表示为转导的细胞的百分比，可通过几种常用的方法进行确定。PTD会显示细胞进出速率(有时分别表示为k！和k2),其支持在细胞内至少为皮摩尔量的融合分子。PTD以及任何运输物的进出速率可使用可检测标记的融合分子通过标准动力学分析容易确定或至少被估计。通常，进出速率的比率在约5~约100，到约1000的范围内。—方面，可用于本发明的方法和组合物中的PTD含有以基本上为(x-螺旋结构为特征的肽。已经发现当PTD显示显著的a-螺旋结构时转导是最佳的。在另一种实施方式中，PTD包括含有碱性氨基酸残基的序列，所述残基基本上沿肽的至少一面排成直线。可用于本发明的PTD域可为天然存在的肽或合成的肽。在本发明的另一方面，PTD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含强a螺旋结构，其中精氨酸(Arg)残基位于螺旋柱下方。在另一种实施方式中，PTD域含有下述通式表示的肽B广X广X2-X3誦B2-X4國Xs-B3(SEQIDNO:l)，其中B2、和B3分别独立地为相同或不同的石威性氨基酸；且XpX2、X3、X4和X5分别独立i也为相同或不同的a-螺旋结构增强氨基酸。在另一种实施方式中，PTD域可使用下述通式表示B广X广X2-B2画B3-XrX4-B4(SEQIDNO:2)其中B丄、B2、B3和B4分别独立地为相同或不同的碱性氨基酸；且X^X2、X3和X4分别独立地为相同或不同的a-螺旋结构增强氨基酸。另外，PTD域含有基本残基，如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，并且可进一步含有至少一个足以将"扭结"引入到域中的脯氨酸(Pro)残基。这类域的例子包括朊病毒的转导域。例如，这种肽含有KKRPKPG(SEQIDNO:3)。在一种实施方式中，域为通过下述序列表示的肽X-X-R-X-(P/X)-(B/X)画B-(P/X)隱X-B-(B/X)(SEQIDNO:4),其中X为任何a螺旋结构的促进残基例如丙氨酸；P/X可以为脯氨酸或X为上面定义的残基；B为碱性氨基酸残基，如精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys);R为精氨酸(Arg)并且B/X可以为上面所定义的B或X。在另一种实施方式中，PTD为阳离子，由7-10个氨基酸組成且具有式KX!RX2Xi(SEQIDNO:5)，其中X！为R或K，且乂2为任何氨基酸。这样的肽的例子包含RKKRRQRRR(SEQIDNO:6)。根据本发明另外的转导域包括TAT片段，其含有至少TAT片段中的氨基酸49-56,到全长TAT序列(如参见SEQIDNO:7)。TAT片段可包括足以增强片段的a-螺旋的一个或多个氨基酸变化。在一些情况下，引入氨基酸变化会添加公认的a-螺旋增强氨基酸。可选地，氨基酸变化涉及从TAT片段中去除一个或多个阻碍a螺旋结构的形成或稳定性的氨基酸。在更为具体的实施方式中，TAT片段将包括至少一个氨基酸被a-螺旋增强氨基酸取代。尽管重组DNA技术可在某些情况下使用，但TAT片段通常是通过标准肽合成技术制得。在一种实施方式中，对取代加以选择，这样在TAT片段中至少两个碱性氨基酸残基基本上与沿着这样在TAT49-56序列中至少两个碱性氨基酸残基基本上沿着该序列的至少一面直线排列。可用在本发明的组合物和方法中的附加的转导蛋白质(PTD)包括TAT片段，其中TAT49-56序列已被改性，这样序列中至少两个碱性氨基酸沿着TAT片段中的至少一面基本直线排列。示例性TAT片段包括在TAT的至少氨基酸49-56中的至少一个特定的氨基酸取代，该取代与沿着该段的至少一面与49-56序列上的碱性氨基酸残基，通常TAT49-56序列直线排列。还包括嵌合PTD域。这种嵌合转导蛋白质包括至少两种不同的转导蛋白质的部分。例如，嵌合转导蛋白质可通过将两种不同的TAT片段，如一种来自于HIV-1而另一种来自于HIV-2或者一种来自于朊病毒蛋白而另一种来自于HIV，进行融合而形成。PTD可与任何数量的核酸结合域(如DRBD)进行连接或融合。核酸结合域起中和或降低将通过PTD进行运输的核酸分子的阴离子电荷的作用。核酸结合域通过充分减少阴离子电荷，这样PTD域的阳离子电荷通过跨越膜足以对细胞进行转导，促进对含有核酸的融合构建物的摄取。可连接到PTD上的示例性的RNA结合蛋白质包括组蛋白、RDE-4蛋白或鱼精蛋白。鱼精蛋白是富含精氨酸的蛋白质，包括如序列RSRRRRRRSCQTRRR(SEQIDN0:15)。其它的dsRNA结合蛋白以及在括号内的它们登录号包括PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、BAB19354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143楊、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57175、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登录号EAA14308。在本领域可根据登录号知道这些核酸结合蛋白的序列。与所迷的登录号相关的序列在此以引用的方式明确地全部并入本申请。核酸结合多肽可以包括任何上述登录号的全长多肽、任何上述的片段以及含有1~10个氨基酸取代的改性多肽，其中的氨基酸取代含有在上述列出的登录号中指明的序列。可以理解的是PTD可与核酸进行融合，其中核酸覆盖足以减少任何阴离子电荷的一个或多个核酸结合域。可选地，PTD也可操作地连接至核酸结合域(如DRBD)，其反过来覆盖带阴离子电荷的核酸。PTD和阴离子核酸分子(如dsRNA)可使用氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯连接剂进行连接。例如，含有3'-氨基并带有3-碳接头的siRNA可用于与将siRNA连接到PTD。siRNA通过异源双功能交联剂与PTD进4亍缀合。在PTD与siRNA之间或DRBD与siRNA之间可形成二硫键，以助于靶向/定时释放。在PTD与核酸或在DRBD与核酸之间的二硫键可发生断裂以释放出核酸。其中PTD可操作地连接到核酸结合域(如DRBD)，这两个域可通过化学合成的或多核苷酸构建物表达的肽接头进行连接，其中这两个域可操作性连接，这样它们的编码框产生含有PTD域和DRBD域的单功能多肽。如提及的，这里公开的融合多肽的组份如PTD核酸结合域(如DRBD),以及核酸结构域，和任选的肽接头，可以按几乎任意方式组织，只要保证融合多肽具有期望的功能(如足够的阳离子电荷)即可。本发明提供融合多肽或嵌合蛋白，其含有一个或多个连接至核酸结合域的PTD，该核酸结合域以直接或间接的方式连接至核酸结构域(如治疗或诊断DNA、RNA、siRNA和类似物)。这几个域中的每一个都可以直4妄连接或^皮接头肽分隔开来。域可以以任何顺序出现。此外，融合多肽可含有帮助识别和/或纯化融合多肽的标记，如6xHIS标记。可被用在本发明的融合多肽和方法中的肽接头基本包括约20或30个氨基酸，通常约10或15个氨基酸，更常见的1~5个氨基酸。接头序列通常是柔性的，以不会将融合分子限定在一个单一的刚性构象内。接头序列例如可用来如将PTD域与核酸结合域和/或核酸结构域隔开。例如，肽接头序列可位于蛋白转导域和核酸结构域之间，如提供分子柔性。选择接头部分的长度，以对含有PTD域融合构建物的多肽的生物活性实现最优化，并且可不通过过度实验而根据经验来确定。接头部分应足够长且足够柔韧以允许核酸结合域自由地与核酸相互作用或反之亦然。接头部分的例子为—Gly—Gly—、GGGGS(SEQIDNO:8)、(GGGGS)N(SEQIDNO:9)、GKSSGSGSESKS(SEQIDNO:10)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQIDNO:11)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQIDNO:12)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQIDNO:13)或EGKSSGSGSESKEF(SEQIDNO:14)。例如，在下述文章中有对连接部分的描述Huston爭乂，Proc.Nat，lAcad.Sci85:5879,1988;Whitlow爭乂，ProteinEngineering6:989,1993;以及Newton爭乂，Biochemistry35:545,1996。其它合适的肽接头在美国专利4,751,180和4,935,233中进行了描述，其在此以引用的方式并入。该公开提供了含有PTD和核酸结合蛋白的嵌合/融合多肽。一方面，嵌合/融合多肽含有PTD，其连接至对阴离子dsRNA电荷进行掩蔽的双链RNA结合蛋白。—方面，本发明的融合构建物可含有，除了PTD和核酸结合域外，靶向域。靶向域可为受体或受体配体，其用于将融合构建物引导至对关联结合域进行表达的特定的细胞类型上。多肽(包括融合多肽)是指聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为a-氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。多肽含有氨基酸序列并且包括改性的序列如糖蛋白、逆反(retro-inverso)多肽、D-氨基酸改性的多肽等等。多肽包括天然存在的蛋白质以及那些重组或合成的蛋白质。多肽可以含有超过一个的域，其给予多肽的特定片段或部位功能。域，例如包含多肽的一部分，其显示出至少一个有用的表位或功能域。两个或多个域可以功能性接连，这样每个域保留其功能并构成单个的多肽(如融合多肽)。例如，PTD的功能片段包括一保留了转导活性的片段。生物功能性片段，例如大小变化，从小至能够结合抗体分子的表位的多肽片段，到大至能够参与细胞内的特征诱导或规划表型改变的大型多肽。在一些实施方式中使用了逆反肽。"逆反"表示在一个或多个氨基酸中发生tt-羧基反转以及对映体变化(如左旋(L)到右旋(D))。本公开中的多肽包括如氨基酸序列的氨基-羧基反转，含有一个或多个D-氨基酸的氨基-羧基反转，以及含有一个或多个D-氨基酸的非反转的序列。稳定的并保留其生物活性的逆反才莫拟肽可通过Bmgidou"a/.(Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2):685-693,1995)和Chorev"(TrendsBiotechnol.13(10):438-445,1995)中的描述进行设计。逆反多肽的整个结构特征类似于亲代L-多肽的结构特征。然而，这两种分子大致为镜像，这是因为它们共享本质上的手性二级结构元素。基于肽键反向和手性反转的主链模拟肽表示了肽和蛋白质的重要的结构改变，这对于生物技术来讲非常重要。抗原性和免疫原性可通过新陈代谢稳定的抗原如天然抗原肽的所有D-以及逆反异构体获得。这里提供几种PTD衍生模拟肽。多肽及片段可与天然衍生的多肽或域具有相同或基本相同的氨基酸序列。"基本相同"表示氨基酸序列大部分，但不是完全相同，但保留了与其相关的序列的功能活性。功能活性的一个例子是片段能够转导或能够结合到RNA上。例如，这里对具有转导活性的全长TAT片段进行描述。通常，如果两种多肽或域的序列至少85%、90%、95%、98%或99%相同，或在序列中有保守的改变，那么它们就是"基本相同"的。计算机程序，例如BLAST程序(Altschul爭乂，1990)可用来对比序列同一性。本公开中的多肽由通过肽键或改性的肽键即肽等构物相互连接起来的氨基酸组成，并且还可以含有除20基因编码的氨基酸以外的氨基酸。对多肽的改性可通过天然过程完成，如翻译后加工的处理，或通过本领域所熟知的化学改性技术来完成。这些改性在基本教科书和更为详细的专著以及很多的研究文献中有详细的描述。在肽或多肽中进行的改性可在任何位置发生，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当理解的是，在给定的肽或多肽中，相同类型的改性可以在几个位点以相同或不同的程度进行。此外，给定的肽或多肽可以含有多种类型的改性。例如，肽或多肽受到泛素化而发生支化，并且其可以为带有或不带有支链的环。环状、支化以及分支的环状肽或多肽可以通过翻译后加工的天然过程得到或通过合成方法得到。改性包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价结合、血红素的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂类或脂类衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、形成二硫键、脱曱基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、r羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、曱基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、戊烯化、外消旋、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的向蛋白质中的氨基酸加入，如精氨酰化，以及泛素化。(例如参见，PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,2ndEd.,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);POSTTRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,pgs.1-12(1983);Seifter爭乂，MethEnzymol182:626-646(1990);Rattan爭乂，AnnN.Y.AcadSci663:48-62(1992》。本公开中的多肽域或融合多肽可通过常规/使用的方法合成，例如那些包括对a-氨基g吏基团进行t-BOC或FMOC保护的方法。这两种方法均涉及分步合成，在合成中从肽的C末端开始，在每一步中加入单个氨基酸。(参见Coligan,爭乂，CurrentProtocolsinImmunology,WileyInterscience,1991,Unit9)。本公开中的多肽还可以通过众所周知的固相肽合成法进行合成，例如在Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149,1962;以及StewartandYoung,SolidPhasePeptidesSynthesis,Freeman,SanFrancisco,1969,pp.27-62的描述中，使用了每克聚合物中含有0.1-1.0mMol胺的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。在完成化学合成后，在0。C使用液体HF-10。/。苯曱醚，处理约1/4-1小时将肽去保护并从聚合物中分离出来。将试剂蒸发后，使用1%的乙酸溶液将肽从聚合物中提取出来，然后将之冻干而得到粗制材料。可使用诸如用乙酸作为溶剂，在SephadexG-15上凝胶过滤的技术对肽进行纯化。对柱洗脱液中合适的馏分进行冻千得到均相肽，然后使用标准的技术对其进行表征，如氨基酸分析、薄层层析、高效液相色谱法、紫外光吸收光谙法、摩尔旋光度或测定溶解度。如需要，还可以使用固相埃德曼降解对肽进行定量分析。另一方面，本公开提供一种用于制备含有PTD域以及核酸结合域或RNA的融合多肽的方法，该方法通过在多核苷酸能够进行表达的条件下培养含有编码融合多肽的多核苷酸的宿主细胞，并回收融合多肽而实现。对本公开中编码融合多肽多核苷酸可操作地连接到启动子上以在原核或真核表达细胞中进行表达。例如，这种多核苷酸可合并到表达载体中。重组分子生物技术可用来连接例如PTD域与DRBD域生成本公开的多核苷酸，这样表达后含有这些域的多肽在功能上有效。术语"可操作地连接"或"可操作地结合"表示在通过调节序列调节的多肽的调节和/或编码域之间的功能连接，以及在融合多肽的编码域之间的连接，这样使得每个域都符合读框地连接以得到所期望的多肽序列。因此，本公开还包括分离的对本公开内的多肽进行编码的多核苷酸(如DNA、cDNA或RNA),包括本公开内的融合多肽。编码这里所描述的多肽的类似物、突变体、保守改变以及变异体的多核苷酸^fe包括在内。这里使用的术语"分离的"表示多聚核苷酸，其基本不含蛋白质、脂质以及与活体内产生的多核苦酸天然结合的其它多核苷酸。通常，多核普酸中至少70%、80%或90%与其它物质中分离，且用于在离体合成多核苷酸的常规方法可用来代替活体内方法。这里所使用的"多核香酸，，表示脱氧核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其以分离的片段或较大的基因构建物组分的形式存在(如将启动子可操作地连接到对本公开的肽进行编码的多核苷酸上或可操作地连接到异源编码域上)。许多基因构建物(如质粒或其它的表达载体)在本领域中是已知的并且可用来在无细胞系中或原核或真核(如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中生成本公开的多肽。考虑到遗传密码的简并，本领域技术人员可容易地合成对本公开的多肽编码的多核苦酸。本公开的多核苷酸可方便地用于常规的分子生物学方法中用来生成本公开的肽。这种多核苷酸包括天然生成的、合成的或目的操作的多核苷酸。对PTD域或DRBD域或其功能片段进行编码的多核香酸包括由于遗传密码简并后所形成的序列。对PTD域或DRBD域或其功能片段进行编码的多核苷酸序列可根据这里所提供的多肽序列以及参考这里所提供的登录号很容易被确定。存在20种天然氨基酸，其中的大多数受一个以上的密码子的编码。因此，只要最终的多肽含有产生功能PTD或DRBD多肽域的氨基酸，则括含有所有简并的核苷酸序列的多核苷酸都包括在内。对融合多肽及其域进行编码的多核苷酸可插入到"表达载体，，中。术语"表达载体，，表示本领域已知的基因构建物，如质粒、病毒或其它的载体，其可设计成含有对本公开的多肽进行编码的多核苦酸。这类表达载体通常为含有启动子序列的质粒，该启动子序列有助于插入的基因序列在宿主细胞中的转录。表达载体通常含有复制起点和启动子，以及允许进行表型选择转化细胞的基因(如抗生素抗性基因)。各种启动子，包括可诱导的和组成启动子，都可以用在本公开中。通常，表达载体含有复制位点和调控序列，其来自于与宿主细胞相容的物种。可使用本领域技术人员所熟知的常规技术用多肽转化或转染宿主细胞。例如，当宿主细胞为大肠杆菌(五.co/Z)时，能够进行DNA摄取的感受态细胞可使用本领域已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法进行制备。可选地，还可使用物理方法如电穿孔法或微注射法。电穿孔法通过高压电脉冲而将多肽转移到细胞内。另外，多核苦S交还可使用本领域熟知的方法通过原生质体融合而被引入宿主细胞内。用于对真核细胞进行转化的合适的方法，例如电穿孔法和脂质转染法也是已知的。本公开中包含的"宿主细胞，，可为任何细胞，在该细胞内，本公开的多核苷酸可用来对其融合多肽或其功能域进行表达。该术语还包括宿主细胞的任何子代。有用的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞(如酵母细胞)、植物细胞以及动物细胞。本公开的融合多肽可通过在原核生物中对融合多肽编码的多核苷酸进行表达而制得。这些原核生物包括但不限于，微生物，如通过编码本7>开的融合多肽的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体进行转化的细菌。这些构建物可在在大肠杆菌中进行大规才莫表达用于离体分析。宿主细胞可为高等真核细胞，如哺乳动物细胞或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可为原核细胞，如细菌细胞。向宿主细胞中51入构建物可通过磷酸钩转染、DEAE-Dextran介导的转染或电穿孑L实现(Davis,L.,Dibner,M.,Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology(1986))。合适的宿主细胞的代表性例子可叙述如下真菌细胞如酵母；昆虫细胞如果蝇S2以及斜紋夜蛾(spod叩tera)Sf9;动物细胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤；植物细胞等。根据这里的教导，对合适的宿主的选择被认为是在本公开的本领域技术人员的能力范围之内的。宿主细胞可为真核宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一方面，宿主细胞是适合在细胞培养基中生长的哺乳动物产生细胞。通常用在工业中的这类细胞的例子是CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos;Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠)、PC12以及W138细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛用于制备多种复杂的重组蛋白，如细胞因子、凝血因子以及抗体(Brasel爭乂，Blood88:2004-2012,1996;Kaufman爭乂，J.BiolChem263:6352-6362,1988;McKinnon爭乂，JMolEndocrinol6:231-239,1991;Wood爭乂，J.Immunol145:3011-3016,1990)。二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷突变细胞系(Urlaub爭乂，ProcNatlAcadSciUSA77:4216-4220,1980)是常用的CHO宿主细胞系，这是因为有效的DHFR可选择的和可扩增的基因表达系统使得在这些细胞中可进行高水平重组蛋白表达(Kaufman,MethEnzymol185:527-566,1990)。此外，这些细胞作为粘附或悬浮培养基易于操作，并显示出相对较好的遗传稳定性。CHO细胞以及在它们中表达的重组蛋白已经被全面地地表征并且经过管理机构批准用于临床生产。真核系统以及典型的哺乳动物表达系统允许对表达的哺乳动物蛋白进行合适的翻译后改性。那些具有对初级转录物合理加工、糖基化、磷酸化以及有益地分泌基因产品基因产物的细胞机器的真核细胞可^皮用作宿主细胞来对本公开的PTD-融合多肽进行表达。这种宿主细胞系可包括^旦不局限于，CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293以及WI38。对于长期的、高产量的生产重组蛋白来讲，通常使用稳定的表达。不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以使用由适合的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的编码本公开的融合多肽和选择标记的cDNA来进行转化。选择标记赋予选择性致死剂抗性，且在异源多核苷酸稳定整合后，允许抗性细胞的生长。这种抗性细胞生长形成灶，其反过来可被克隆和扩增到细胞系中。例如，在引入外源DNA后，工程细胞可^f皮允许在富集培养基中生长1-2天，然后转到选择培养基中。多种选择系统可供使用，包括但不限于单纯疱渗病毒胸苷激酶(Wigler爭乂，Cell,11:223,1977)、次黄噤呤-鸟噤呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026,1962),以及腺嘌呤-鸟噪呤磷酸核糖转移酶(Lowy爭乂，Cell,22:8n,l兆0)基因可分别应用于tk-，hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可用于对以下进行选择的基础dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler爭乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567,1980;O'Hare爭乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:1527,1981);gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072,1981);neo,其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin爭乂，J.Mol.Biol.,150:1,1981);以及hygro，其赋予对潮霉素基因的抗性(Santerre爭人，Gene,30:147,1984)。另外描述了选择基因即，trpB,其允许细胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，其允i午细胞利用组氨醇而不是组氨酸(Hartman&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8047,1988);以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氦酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟曱基)-DL-鸟氨酸、DFMO6勺^元'1"生(McConlogueL.,In:CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratory,ed.,1987)。在酵母中，多种含有组成性或可诱导启动子的载体可被使用(<列^口参见CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,Ed.Ausubel爭乂，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,Ch.13,1988;Grant爭乂，"ExpressionandSecretionVectorsforYeast,"inMethodsinEnzymology,Eds.Wu&Grossman,Acad.Press,N.Y,Vol.153,pp.516-544,1987;Glover,DNACloning,Vol.II,IRLPress,Wash.,D.C.,Ch.3,1986;"Bitter,HeterologousGeneExpressioninYeast,"MethodsinEnzymology，Eds.Berger&Kimmel,Acad.Press,N.Y.,Vol.152,pp.673-684,1987;andTheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces,Eds.Strathem爭入,ColdSpringHarborPress,Vols.IandII,1982)。组成性酵母启动子，如ADH或LEU2，或可诱导启动子，如GAL可被使用("CloninginYeast,"Ch.3,R.RothsteinIn:DNACloningVol.11,APracticalApproach,Ed.DMGlover,IRLPress,Wash.,D.C.,1986)。另外，还可使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。行编码的多核苷酸的宿主细胞来表达不同的域(如PTD或DRBD)。然后使用现有技术中已知的方法(如在这里描述的方法)对域进行纯化。接着将域进行直接或间接的化学连接(例如用肽接头)而形成融合的多肽。可选地，对融合多肽编码的多核苷酸在宿主细胞中进行表达并且使用已知的方法对融合多肽进行纯化，而不论采用哪种方法形成融合多肽；将融合多肽与核酸(如带阴离子电荷的dsRNA)在核酸结合蛋白(如DRBD)与核酸以序列独立的方式进行相互作用接触条件下接触。融合构建物可含有一个或多个核酸结合蛋白(如DRBD)。一方面，核酸分子(如dsRNA)与至少两个核酸结合蛋白进行相互作用。任何本领域已知的用于蛋白质纯化的方法均可以用来分离本公开中的多肽域或融合多肽。例如，可使用制备色谱分离法以及免疫分离法(例如那些使用单克隆或多克隆的抗体的分离方法)。载体肽可帮助融合多肽的分离。这类载体肽或纯化标记物可操作地连接到本公开的PTD、DRBD或PTD-DRBD融合多肽上。例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)可采用谷胱甘肽琼脂糖亲和柱进行纯化。当来自于金黄色葡萄球菌Otop/j;;/ococa^aweM)的蛋白质A或ZZ域被用作标记物时，可使用IgG隱琼脂糖凝胶亲和柱一步完成纯化。属于绿脓杆菌(i^eM^w朋ay爿en/gz朋w)外膜蛋白质F的N端半分子的pOprF肽很容易被纯化，这是因为其是外膜制备物中突出蛋白种。如需要，融合蛋白可使用试剂进行纯化，这些试剂可与融合肽的杀微生物肽功能片段进行特异地反应(例如特异的结合)。例如，与DRBD与PTD域发生特异结合的单克隆或多克隆抗体可^f皮用在常规的纯化方法中。在本领域中已熟知这类抗体的制备技术。本公开的融合多肽还可设计成含有帮助蛋白质回收的裂解位点或其它可将PTD从核酸结合蛋白或dsRNA分子中分离出来的接头部分。如这里所使用的，核酸结构域可为任何多核苷酸(如核酶、反义分子、多核苷酸、寡核苷酸等)。在这里提供的具体的例子中，核酸结构域含有dsRNA。含有与耙基因的核苷酸序列互补的siRNA序列的dsRNA可以通过任意种的方法制备。本领i或已知确^人siRNA序列的方法和一支术。在提供来自国家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)网站(可访问网址为ncbi.nlm.nih.gov)处获得的登录号或GI号后，可由WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,MassachusettsInstituteofTechnology,Cambridge,Massachusetts(目前可i方问网i止为http:〃jura.wi.mitedu/bioc/siRNAext/)的siRNA选择程序获得siRNA核苷酸序列。可选地，含有合适siRNA序列的dsRNA可使用MiyagishiandTaira的方法(2003)确定。通常，dsRNA序列越长，阴离子电荷的增加要求额外的DRBD或其它核酸结合蛋白。也存在可通过商业获得的RNAi的设计算法(http:〃rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)。可通过商业渠道来定制RNA。一旦获得后，含有siRNA序列的RNA分子可通过核酸结合蛋白结合或直接或间接连接到本公开的PTD域。将dsRNA可操作地连接到PTD或在特定条件下进行温育，这样含有核酸结合蛋白(如DRBD)或核酸结合蛋白的PTD与dsRNA进行相互作用。通常，dsRNA与核酸结合蛋白的相互作用会导致复合物(例如DRBD和dsRNA)的整体阴离子电荷的减少。本发明的方法、组合物以及融合多肽增强了对核酸分子的摄取和释放。这里使用的术语"治疗剂"表示其普通含义，包括治疗剂、预防剂以及替代剂。治疗剂分子的例子包括但不局限于，细胞周期控制剂、抑制细胞周期蛋白形成的剂，如siRNA多核苷酸对细胞周期蛋白Gl以及Dl基因的抑制；能够进行裂解为针对特定生长因子的siRNA分子的dsRNA,其中生长因子例如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-a、TGF-卩以及成纤维细胞生长因子；细胞因子，包括但不局限于，白细胞间介素1~13以及肿瘤坏死因子；抗凝剂、抗血小板剂；TNF受体域等等。4吏用这些方法和组合物可以治疗各种疾病以及病症。例如，运输抗肿瘤siRNA后，可以抑制、阻止以及石皮坏肺瘤细胞的生长。例如，抗胂瘤siRNA可以为靶向作用编码促进血管生成的多肽的基因的siRNA。在本领域已经熟知与肿瘤生长相关的各种血管生成蛋白。本发明的融合多肽可用于运输带阴离子电荷的核酸分子(例如dsRNA、siRNA、DNA、反义、核酶等等)，用于对许多疾病和病症的治疗和/或诊断。例如，融合多肽可用于治疗细胞增生症，其中核酸结合域(如DRBD)对核酸上的电荷进行中和，这些核酸被用于耙向作用诱导细胞增生的基因。PTD域有助于摄取融合多肽以及核酸结合域(如DRBD)。因此，融合多肽可用于对具有细胞增生症的细胞进行治疗。类似地，本发明的融合多肽可用于治疗炎性疾病和病症、感染、血管疾病和病症等。因此，应当理解的是本公开不局限于任何特定的核酸结合域或核酸结构域。相反，核酸结构域可为任何核酸结合域，其能够中和或减少需要被运输的核酸中的阴离子电荷。此外，任何带有阴离子电荷的核酸(如dsRNA、siRNA等)都可以使用本发明中的方法进行运输。尽管融合多肽可以作为药物组合物-故单独施用，^旦通常本公开的融合多肽与药学上可接受的载体配制为药物组合物。本公开的药物组合物用载体、赋形剂和添加剂或助剂可制备成包括本公开的融合多肽的适合对研究对象进行施用的形式。经常使用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖类、云母、乳蛋白、明胶、淀;盼、维生素、纤维素及其衍生物、动物油和;f直物油、聚乙二醇及溶剂，如无菌水、醇类、甘油和多元醇。静脉内载体包括液体以及营养补充物。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体。其它的药学上可接受的载体包括水溶液、无毒性的赋形剂包括盐、防腐剂、緩冲剂等，如Remington'sPharmaceuticalSciences,15thed.,Easton:MackPublishingCo.,1405-1412,1461-1487(1975)以及TheNationalFormularyXIV"14thed.,Washington:AmericanPharmaceuticalAssociation(1975)中戶斤描述的，其内容在此通过引用的方式并入。根据本领域中的常规技术对药学组合物的各种组份的pH以及精确浓度进行调节。可参考GoodmanandGilman's,ThePharmacologicalBasisforTherapeutics(7thed.)。本公开的药物组合物可局部或系统施用。"治疗有效剂量"表示预防、治疗或至少在某种程度上抑制疾病或病症的症状(如抑制细胞繁殖)所需要本公开融合多肽的量。当然，所使用的有效量需取决于疾病的严重程度以及研究对象的体重和通常状况。通常，在离体使用的剂量可对原位施用药物组合物所需要的量提供有用的指导，且可用动物模型来确定治疗特定病症所需要的有效剂量。在Langer,Science,249:1527,(1990);Gilman"a/.(eds.)(1990)中对各种考虑的因素进行了描述，其在此通过引用的方式并入。这里所使用的"施用治疗有效剂量"旨在包括对能够发挥出所期望的治疗功效的研究对象给予或施用本公开的药物组合物的方法。治疗有效剂量可根据因素进行改变，如研究对象的感染程度、个体的年龄、性别以及体重。给药方案可经调整而^是供最佳的治疗应答。例如，可每日施用分次剂量或可才艮据治疗中出现的紧急事件而成比例地减少剂量。药物组合物可以合适方式施用，如通过注射(如皮下、静脉等)、口服、吸入、经皮给药或直肠施用。根据施用途径，可对药物组合物进行包衣以保护药物组合物不受可使药物组合物失去活性的酶，酸和其他天然条件的作用(例如本领域熟知的肠溶衣)。药物组合物还可进行肠胃外或腹膜内施用。分散液可以在甘油、液态聚乙二醇或这二者的混合物以及油中进行制备。在正常的存储和使用条件下，这些制备物中可含有防腐剂以防止微生物的生长。适合进行注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(此处可溶解于水)或分散液或可即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。组合物通常是无菌的以及是易于进行注射的液态。通常组合物在生产条件下保持稳定并且能够存储和防止微生物，如细菌和真菌的污染作用。载体可以为溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇以及液态聚乙二醇等)，它们合适的混合物以及植物油。例如，通过使用合适的包衣如卵磷脂，在分散液的情况下，通过在分散液中保持所需要的粒子大小，以及通过使用表面活性剂可以保持合适的流动性。通过各种抗菌以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸脂类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可实现防止微生物作用。在许多情况下，等渗剂例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠可以被用在组合物中。可注射组合物的长效吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶而实现。制备无菌可注射的溶液可将药物组合物按需要的量加入到具有上述所列举的一种组分或组合组分的适当溶剂中，再按需要进行过滤消毒。通常，分散液是通过将药物组合物加入到无菌载体中制得，其中载体含有一种基本的分散介质以及来自于上述列举的所需要的其它组分。例如，具有惰性稀释剂或可吸收食用载体的药物組合物可进行口服。药物组合物和其它的组分还可封装到硬壳或软壳明胶胶嚢中，压缩成药片或直接添加到研究对象的饮食中。对于口服治疗来讲，药物组合物中可加入赋形剂并以可吸收药片、含片、锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸嚢剂等的形式使用。这种组合物和制备物应含有至少1重量％的活性化合物。当然，组合物和制备物的含量可以变化并且适宜地在整个单位重量的约5%~约80%。药片、片剂、药丸、胶嚢等还可含有下述物质粘合剂，如西黄蓍胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁以及增甜剂如蔗糖、乳糖或糖精或者调味剂如薄荷油、冬青油或樱桃香精。当剂量单位的形式是胶嚢时，其除了含有上述类型的材料外还含有液体载体。也可存在各种其他的材料作为包衣或用来改变剂量单位的物理形式。例如，药片、药丸或胶嚢可用虫胶、糖或二者包衣。糖浆或酏剂中可含有试剂、蔗糖作为增甜剂、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料以及调味剂，如樱桃香精或橙香精。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料都应为药用纯并且在使用量中基本无毒性。此外，药物组合物可加入到緩释制备物和制剂中。因此，"药学上可接受的载体"包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌制剂、等渗和吸收延迟剂等。使用这些介质和试剂作为药学活性物质为本领域熟知。除了那些现已知的与药物组合物不相容的那些传统介质或试剂之外，在治疗组合物和治疗方法中的使用这些介质和试剂被包括在内。也可在组合物中添入补充活性化合物。以剂量单位的形式配制成肠道外组合物的特别有利之处在于易于施用并且剂量统一。这里使用的"剂量单位形式"表示物理离散单位，其适合用作被治疗的研究对象的单位剂量；含有预先确定量的药物组合物的每个单位是经过计算得到，其与期望的药物载体组合使用时可产生期望的治疗效果。本公开的剂量单位形式的规格与药物组合物的特性以及需要获得的特定的治疗效果相关。为了以有效量方便以及有效地施用，将主要药物組合物与可接受剂量单位的合适的可药用载体进行复合。在组合物含有补充活性成份的情况下，通过参考所述成卩分的常规剂量以及施用方式来确定组合物的剂量。下面的实施例是对本公开发明进行阐述，但不局限于此。实施例PTD-DRBD融合蛋白pPTD-DRBD的构建物设计以及纯化可以通过/人人源HepG2cDNA库PCR克隆PKRDRBD-1，随后插入到含有单个N-末端TATPTD、HA表位标记以及C-末端6xHis纯化标记的NpTAT载体中构建(Wadia爭乂，2004)。向N-端中插入另外两个的TATPTD以生成pPTD-DRBD。为制备表达EGFP-PEST(dGFP)或DsRed-PEST(dDsRed)慢病毒的VSVG,从pCSC-SP-CW(Miyoshi爭乂，1998)和pd2EGFP-Nl-或pDsRed-Express-DR(BDclontech)中构建pCSC-SP-CW-EGFP腸PEST或pCSC-SP-CW-DSRED。为了进行蛋白表达，使用pPTD-DRBD对BL21condonplus(DH3)大肠杆菌(Strategene)细胞进行转化，在37°C下在LB中进行培养，然后在使用400pMIPTG进行诱导后于25°C下培养12小时。在4,500g下进行离心5分钟对细胞进行回收，在緩冲液A(20mMHepes[pH7.5],500mMNaCl,5pg/ml抑蛋白酶肽，1pg/ml亮抑蛋白酶肽，0.8mMPMSF)加20mM咪唑进行超声并且在50,000g下进行离心15分钟分离出可溶蛋白。PTD-DRBD通过Ni-NTA柱(Qiagen)进行纯化，随后负载到緩冲液B(50mMHepes[pH7.5],20mMNaCl,5%甘油)中的Mono-SAKATFPLC并在緩沖液C(缓冲液B加5MNaCl)中洗脱。纯化的PTD-DRBD用PBS-10。/。甘油进行透析，在50^MPTD-DRBD快速冷冻并存储在-2(TC。细胞培养的条件。H1299、HaCaT、HFF、B16F0细胞在10%FBS-DMEM、抗生素中进行培养。T98G细胞在5%FBS-MEM、抗生素中进行培养。JurkatT细胞与NamalwaB细胞在10%FBS-RPMI、抗生素中进行培养。THP-1巨喧细胞在10%FBS-RPMI加1mM丙酮酸钠、4.5g/L葡萄糖、50pM|3-巯基乙醇、抗生素中进行培养。hESC系HUES9是一馈赠物，而H9hESC是从WiCell中获得的。H9hESC在鼠成纤维细胞饲养层上的加有55P-巯基乙醇20%敲除(knockout)血清-DMEM國F12、NEAA、Gluta-Max、4ng/mlbFGF、抗生素中进行培养。HUES9hESC在HUES培养基(10%敲除血清-DMEM力。10%Plasmonate、55pM|3-巯基乙醇、NEAA、Gluta-Max、4ng/mlbFGF、抗生素)中生长，在对鼠成纤维细胞预处理24小时的培养基中没有伺养层。用表达dGFP和/或dDsRed慢病毒的VSVG进行感染以得到表达dGFP和dDsRed的细胞。使用FACS对VSVG-dGFP和/或VSVG-dDsRed感染的细胞进行分离。将PTD-DRBDsiRNA运输到细胞中。典型的PTD-DRBDsiRNA运输反应进行如下将水中10pl的1-5siRNA与PBS-10%甘油中10pl的10-50[iMPTD-DRBD加4plPBS-10o/o甘油在水上进行混合45分钟，培养基中进行1:5的稀释并加入到7.5x104细胞/孔的48孔板中保持6小时，最终的siRNA浓度在100-400nM之间。然后用胰蛋白酶冲洗细胞以去除细胞外的PTD-DRBD:siRNA,随后加入新鲜的培养基以及FBS。或者将细胞与PTD-DRBD:siRNA同时涂平板保持6小时，使用力口入58pg/ml^i酸肝素的培养基冲洗10分钟，随后加入新鲜的加入FBS的培养基。对于Jurkat、Namalwa、THP-1悬浮细胞，在培养基加10%Q-血清(5mlFBS+1mlSource30Q树脂[mershamBioscience]室温下在混合平台上混合30min再进行0.22过滤)中使用100-200nMsi西A:PTDDRBD对2x105细J包进行处理1小时，，用培养基冲洗两次，随后加入新鲜的完全培养基。对于H9和HUES9hESC,在无饲料层的无血清的培养基中使用200-400nMsiRNA-PTD-DRBD对6.6x105细胞进行处理1小时，随后在成纤维细胞饲料层上无血清的培养基中处理5小时，然后使用全HUES培养基加血清处理24小时。对于siRNA对照，细胞用脂质转染胺-2000(Invitrogen)中的100nMsiRNA根据生产厂家的教导处理。在该研究中使用到的siRNAs序列EGFP1、EGFP2(沉默子GFP)、GAPDH、Oct-4、Nanog、Sox2、Cdk4以及沉默子阴性对照(Ambion);pGL3-荧光素酶(Luc)以及DsRed(Dharmacon);和EGFRvIII(FanandWeiss,2005)。免疫印迹以及RT-PCR用胰蛋白酶/EDTA回收48孔板中的7.5x104细胞/孔，在水上在RIPA缓冲液(1%TritonX-100,]%脱氧胆酸钠，40mMTris-HCl,150mMNaCl,0.2%SDS,5吗/ml抑蛋白酶肽，1吗/ml亮抑蛋白酶肽，0.8mMPMSF)中裂解30分钟制备全细胞的裂解产物，离心澄清溶液并使用10。/oSDS-PAGE进行蛋白质分离。免疫印迹分析在用4%脱脂乳、PBS-T(0.05%PBS,Tween20)在室温下封闭1小时的PVDF膜上进行，在4°C下与抗-Oct4(SantaCmz),抗-GAPDH(SantaCmz)抗体隔夜反应，与抗-a-微管蛋白(Sigma)抗体反应1小时，洗涤，暴露于HRP缀合的抗-IgG(Santacruz)抗体并通过ECL(Pierce)进行检测。为了进行GAPDHmRNATaqManTMRT-PCR(AppliedBiosystems)，如上所述用400nMGAPDH或对照荧光素酶siRNA来处理48孔板中的7.5x104dGFP-H1299细胞/孔，在加入后的6、12、24、36、72和96小时后分离总的RNA。使用Oligo-dT来合成cDNA并用TAQ-MAN探针(Ambion)在7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)上检测GAPDHmRNA表达。免疫组织化学和流式细胞术分析。用4%低聚甲醛在室温下固定细胞30分钟，在室温下于0.1%TritonX100PBS中渗透15分钟，在室温下于3。/。脱脂奶-PBS中封闭30分钟，然后在4°C下与在0.1%BSA-PBS中的抗Oct4(SantaCruz)、抗-SSEA4(SantaCruz)和抗-GATA6(SantaCruz)抗体隔夜反应。洗涤细胞并与Alexa488或Alexa594缀合的抗-IgG(MolecularProbes)在室温下反应30分钟。使用Hoechst33342(MolecularProbes)对DNA进行复染。使用共焦显微镜(Olympus)对细胞进行分析。对流式细胞计数，在指定的时间内在FACScan(BDBiosciences)上对1x104dGFP和/或dDsRed阳性细胞进行分析。siRNA的PTD-dsRNA结合域融合物的运输在研发siRNA运输策略之前，需确定的三个入选标准l)siRNA运输到100%的所有细胞类型中(原代的或转化的)，2)无细胞毒性，以及3)siRNA序列独立，这样所有的siRNA都能应用该方法。阳离子PTD的已证实的大分子运输性质^皮用于siRNA运输。然而，为了避免电荷中和的问题，将PTD融合到dsRNA结合域(PTD-DRBD)上(图1A)。DRBD通过使两个大沟中的2，-OH接触而特异结合到具有高亲合力的dsRNA上，在螺旋结构的90。表面象限上连接大沟形成4xDBRD掩蔽的~16bpdsRNA(RyterandSchultz,1998)。产生了多种PTD-DRBD融合组合，纯化达到同质并对各种PTD-DRBD融合组合进行测试，基于显示未掩蔽的siRNA突出端中和第一和/或第二PTD的实验数据(图1A和1B)放置PTD-PTD-HAtag-PTD-DRBD。向双链siRNA中加入PTD-DRBD导致多个亚基以浓度依赖的方式进行特异且迅速的结合。对PTD-DRBD运输siRNA至细胞中的能力进行检测。含有PTD-DRBD的Cy3-标记的siRNA加入细胞导致群体的所有细胞的siRNA细胞才聂耳又，而对照Cy3-标记的siRNA则不能进入细胞(图ID)。为了检验RNAi应答的PTD-DRBD运输的siRNA诱导，生成人源H1299肺腺癌报道细胞系，其含有多个整合拷贝数的载体，该载体组成性表达比野生型蛋白质(>24hr)半衰期显著短的(-2hr)的去稳定的eGFP-PEST(dGFP)和去稳定的DsRed-PEST(dDsRed)蛋白质。dGFP/dDsRed整合的报道分子可直接确定单细胞，由此确定出在群体中正在经历RNAi应答的细胞百分比，而其它的报道分子如荧光素酶或mRNA测定则不能。使用PTD-DRBD、对照DRBD、对照PTD肽或对照脂质转染结合多个GFP、DsRed和对照siRNAs对H1299dGFP/dDsRed报道细胞进行处理。对siRNA处理的报道细胞在24小时进行流式细胞分析dGFP和dDsRed的表达以及细胞生存力(图IE,图6)。重要的是，脂质转染剂仅用作独立的对照而未与任何PTD-DRBD样品使用。加入单独的PTD-DRBD、对照PTD肽或对照DRBD(无PTD)与GFPsiRNA组合，不会对dGFP或dDsRed的表达水平产生影响。相反，向细胞中加入GFPs]'RNAs和PTD-DRBD会诱发dGFP的RNAi显著敲减而不会改变内对照dDsRed。同样地，加入PTD-DRBD和DsRedsiRNA将导致dDsRed敲减而dGFP的表达不会改变。对总共5个序列独立的GFPsiRNA进行测试，所有的这5个都诱发了GFP特异性RNAi应答，而对照dDsRed无改变，其中的2个示于图1E中。由PTD-DRBD运输的GFPsiRNA对dGFP的降低也明显强于GFPsiRNAs的对照脂质转染体(图IE)。加入含有两种经验证的RISC负载的对照siRNA的PTD-DRBD、阴性沉默子(SN)以及荧光素酶(Luc)，对dGFP或dDsRed的信号无改变。很少到没有检测出PTD-DRBD处理的细胞中细胞生存力的变化，而脂质转染体导致可测的细胞毒性(图6)。用单细胞流式细胞分析检测出由PTD-DRBD对造成的显著更强的dGFPRNAi敲减应答(图IE)。在加入后24小时，PTD-DRBD运输的dGFPsiRNA在100%的细胞中诱发了最大的GFPRNAi应答(图2A)。相反，脂质转染体运输的siRNA诱发的RNAi应答既不完全又是部分穿透的，具有一群未反应的细胞，，其表达与与未处理的对照细胞等量的dGFP。在48小时，PTD-DRBD运输的GFPsiRNA保持完全的100%RNAi应答(图2B)。然而，脂质转染处理的细胞进一步分离为两种不同的群体具有与PTD-DRBD介导的RNAi类似的GFP敲减程度的dGFPRNAi应答群体以及~20%的细胞未显示出dGFPRNAi应答信号的第二群体(图2B)。所观察到的这些与脂质转染不能将siRNA运输入群体中100%的细胞，甚至在这里使用的高度可转染的肺瘤细胞完全一致，并且在siRNA运输领域中，充分意识到相关的细胞毒性。对由PTD-DRBD介导的siRNA运输诱导的RNAi应答动力学进行检验。使用PTD-DRBD、对照PTD肽或对照脂质转染体结合多个GFP、DsRed和对照siRNA对H1299dGFP/dDsRed报道细胞进行处理，然后在8天内每天使用流式细胞术进行分析(图2C)。与上面的观察一致，仅有PTD-DRBD加GFPsiRNAs诱导了dGFP特定的RNAi应答，而所有的对照组合则没有。PTD-DRBD运输的GFPsiRNA在1-3天之间保持了最多的dGFPRNAi，接着逐渐衰减，在第8天达到对照水平(图2C)。除了有限数目的应答细胞，对照脂质转染运输的GFPsiRNA诱导了具有类似于PTD-DRBD运输的siRNA的诱导和衰减动力学的GFPRNAi应答。衰变曲线与siRNA负载的RISC在细胞分裂和siRNA半衰期内被稀释的观点完全一致。为避免RNAi衰变曲线，用PTD-DRBDsiRNA在第3天和第6天对分裂细胞进行再处理。重复的处理使得在超过8天内测得的GFPRNAi应答的程度和量级得以维持(图2D)。总的来说，所观察到的这些显示了PTD-DRBD融合蛋白能够siRNA以无细胞毒性的方式有效运输到100%细胞中。尽管整合的dGFP/dDsRed基因充当了RNAi应答的优异的报道靶，但内生基因受RNAi的，即GAPDHmRNA,—种标准的对照RNAi靶的靶向作用。用由PTD-DRBD融合体运输的两种序列独立的GAPDHsiRNA处理H1299细胞导致GAPDHRNAi应答，其在添加6小时后首先检测到并在12小时达到最大的RNAi应答(图3)。相反，所有的PTD-DRBD阴性对照未能诱导GAPDHRNAi应答。有趣的是，PTD-DRBD运输的GAPDHsiRNA获得的RNAi应答明显早于相同GAPDHsiRNA的对照脂质转染运输，这表明PTD-DRBD运输的siRNA更快的载入到RISC中(图3)。这完全与所观察到的通过TAT-Cre加入得到的LoxP重组的快速检测(15min)完全一致。类似于dGFPRNAi诱导和衰变动力学，PTD-DRBD运输的GAPDHsiRNA在治疗后72小时显示出最大的RNAi应答并在96小时出现緩慢衰变。总的来说，这些观察表明PTD-DRBD介导的siRNA运输能有效的靶向作用内源的mRNA。PTD-DRBD运输的siRNA在很多种细胞类型中诱导RNAi应答。目前，还没有将siRNA运输到100%的所有细胞中的方法。例如，siRNA的脂质转染运输基本上局限于那些耐受相当的膜扰动的粘附的、高度致瘤细胞。其对大多数的原代细胞和非粘附性造血细胞系，例如T和B细胞、巨噬细胞很弱到完全无效。为了探索通用siRNA运输的可能性，dGFP逆转录病毒表达载体^皮稳定地引入到几个原代的和致瘤细胞类型中(图4)。与脂质转染导致的完全阴性结果相比，进到巨噬细胞和黑素细胞中的PTD-DRBD运输的siRNA在100%群体中诱导了GFPRNAi应答(图4A)。此外，PTD-DRBD运输的siRNA在粘附的原代人源成纤维细胞、角质形成细胞、T细胞和成胶质瘤细胞中诱导了完全的RNAi应答，它们具有类似于H1299细胞的衰变动力学(图4B)。相反，所有的阴性对照未能诱导GFPRNAi应答。本公开显示在至今为止分析的所有14种不同的原代的、致瘤的、粘附的以及非粘附细胞系中有RNAi应答(表1)，其表明PTD-DRBD融合体介导通用siRNA向细胞中的运输。表1.所有细胞系中siRNAs的PTD-DRBD运输测试总结<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在人源胚胎干细胞中PTD-DRBD介导siRNA运输。人源胚胎干细胞(hESC)具有很大的潜力来治疗人类疾病且RNAi具有将hESC靶向分化导入成熟细胞系中的潜力。然而，通过RNAi操作hESC进入特定细胞系中并最终置于患者体内将要求严格的方案，其避免hESC暴露于病毒载体和细胞毒性化合物如脂质转染。由于PTD-DRBD融合体的有效和无细胞毒性的siRNA运输，对PTD-DRBD介导的siRNA的引导hESC分化的能力进行了测试。使用慢病毒感染，生成了载有野生型eGFP报道基因的hESC细胞系。PTD-DRBD介导的eGFPsiRNA的运输导致了eGFP表达的显著降低，而所有的对照均未能诱导RNAi应答(图5A)。所观察到的这些与上面讨论的PTD-DRBD介导的siRNA运输的通用运输方面完全一致。对PTD-DRBD介导的siRNA运输影响hESC命运的能力进行了测试。需要Oct4(PFU5)转录因子来维持hESC多能性，且最近的才艮道已显示Oct4RNAi敲减导致了hESC分化(Boyer"a/.2005;Orkin,2005)。用PTD-DRBD加上Oct4siRNA进行的hESC处理导致Oct4特异性的敲减和生长速率的降低，这意味着多能性的丧失和分化的开始(图5B,C)。相反，才莫拟及对照PTD-DRBD加荧光素酶siRNA没有改变hESC的细胞形态学、生长动力学或Oct4表达水平。多能性的hESC表达了多个细胞表面的标记，包括阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA4)(Henderson爭乂，2002)。在分化进内胚层期间，hESC降低了SSEA-4表达，停止了细胞分裂，大小增加并随后表达了GATA6分化转录因子(Hay爭乂，2004)。PTD-DRBD运输的Oct4siRNA在第2天导致了Oct4表达的损失但具有持续的SSEA-4表达(图5D)。然而，在处理后的第10天，Oct4siRNA处理的细胞丧失了SSEA-4表达，并诱导了GATA6内胚层特异性转录因子的表达(图5E)。相反，模拟的和对照PTD-DRBD加上荧光素酶siRNA处理的hESC没有诱导分化或改变hESC标记表达(图5E)。总的来说，所观察到的这些显示了PTD-DRBD融合体在各种不同的原代细胞和致瘤细胞中运输siRNA和诱导特异的RNAi应答的一般能力，耙向作用内源基因和诱导hESC分化的能力。siRNA诱导的RNAi应答是细胞生物学，遗传途径的剖析，靶向校验中的关键实验方法，并具有治疗干涉的巨大潜力。然而，由于它们的大分子大小(14,000Da),以及强的阴离子电荷，siRNA无法依靠自身而进入细胞中。因此，设计出了多种方法来解决siRNA运输的问题。阳离子脂质转染剂为目前标准的siRNA离体运输载体。然而，该方法和PEIsiRNA缩合、抗体-鱼精蛋白融合siRNA缩合、胆固醇LDL颗粒形成和脂质体包埋的其他方法尽管有前景，但不能靶向作用群体中100%的细胞，特别是原代细胞和造血细胞系(T和B细胞，巨谨细胞)。因此，就非常需要一种通用的siRNA运输方法，其能够1)靶向作用100%的所有细胞类型，原代的和致瘤的，粘附的和非粘附的，2)无细胞毒性，和3)是siRNA序列独立的。这里描述的PTD-DRBDsiRNA运输方法满足了通用siRNA运输系统的多个标准。首先，PTD-DRBD融合体将siRNA运输进每个测试的细胞类型中，包括14种不同的原代和致瘤的，粘附的和非粘附的细胞类型。其次，通过无细胞毒性的大胞饮作用这一摄取所有细胞进行的特殊液相胞吞形式将PTD-介导的siRNA运输进细胞，因此不需要特异性受体高水平的表达。再次，DRBD结合至dsRNA(siRNA)序列独立的组合物，由此能够将所有的siRNA均运输进细胞。总的来说，PTD-DRBD融合体显示出运输进许多细胞类型中的通用的siRNA运输方法，这些细胞类型，特别是原代细胞不容易进行RNAi操作。尽管上面已描述了多种实施方式和特征，本领域技术人员应能理解，对上述实施方式和特征的修改和变形可在不脱离本公开的教导和由后附权利要求限定的本发明范围之下做出。权利要求1.一种组合物，包含核酸结合蛋白质，其与带阴离子电荷的核酸复合形成核酸结合蛋白质-核酸复合物；以及连接到该核酸结合蛋白质-核酸复合物的蛋白质转导域(PTD)。2.权利要求1的组合物，其中核酸结合蛋白质含有双链RNA结合域(DRBD)。3.权利要求2的组合物，其中DRBD包含选自由组蛋白、RDE-4蛋白、鱼精蛋白、包括以下所列的dsRNA结合蛋白(括号中为登录号)组成的组的序列PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、BAB19354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143416、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57]75、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登录号EAA14308。4.权利要求1的组合物，其中核酸包含dsRNA。5.权利要求l的组合物，其中PTD可操作地连接至核酸结合蛋白质。6.权利要求l的组合物，其中PTD可操作地连接至核酸。7.权利要求l的组合物，其中核酸结合蛋白质与核酸的比率为1:1。8.权利要求l的组合物，其中核酸结合蛋白质与核酸的比率为2:1。9.权利要求1的组合物，其中蛋白质转导部分(PTD)选自由含疱渗病毒VP22蛋白质的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT蛋白质的多肽、含ante皿apedia蛋白质(AntpHD)的同源异型结构域的多肽以及它们的功能片段组成的组。10.权利要求1的组合物，其中蛋白质转导域可操作地连接至至少1个核酸结合蛋白质。11.一种组合物，包含a)第一融合多肽，其包含i)包含蛋白质转导部分(PTD)的第一结构域，该转导部分包含膜运输功能；以及ii)含有核酸结合蛋白质的第二结构域；b)核酸，其中该核酸带有阴离子电荷并且与核酸结合蛋白质相互作用，且其中PTD-核酸结合蛋白质-核酸的全部阴离子电荷相对于核酸单独所带电荷减少；以及c)药学上可接受的载体。12.权利要求11的组合物，其中蛋白质转导部分(PTD)选自由含疱渗病毒VP22蛋白质的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT蛋白质的多肽、含antennapedia蛋白质(AntpHD)的同源异型结构域的多肽以及它们的功能片,殳组成的组。13.权利要求11的组合物，其中核酸包含dsRNA。14.权利要求11的组合物，其中核酸是用在原位杂交中的探针。15.权利要求11或13的组合物，其中核酸调节细胞增殖。16.权利要求15的组合物，其中调节抑制了细胞增殖。17.—种融合多肽，其包含a)蛋白质转导域(PTD)，该转导域包括膜运输功能；以及b)可中和或减少结合的核酸的阴离子电荷的核酸结合域，其中PTD可操作地连接至核酸结合域。18.权利要求17的融合多肽，其中蛋白质转导域选自由含疱渗病毒VP22域的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT域的多肽、含antennapedia蛋白质(AntpHD)的同源异型结构域的多肽、N-末端阳离子朊病毒蛋白质域以及它们的功能片段组成的组。19.权利要求1的融合多肽，其中蛋白质转导域包含选自以下序列组成的组的序列来自SEQIDNO:7的氣基酸47-57;B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3,其中B2、和B3分别独立地为相同或不同的碱性氨基酸；且X!、X2、X3、X4和X5分别独立地为相同或不同的a-螺旋结构增强氨基酸(SEQIDNO:l);B1-X1隱X2-B2-B3-X3-X4曙B4，其中B2、B3和B4分别独立地为相同或不同的碱性氨基酸，且X^X2、X3和X4分别独立地为相同或不同的a-螺旋结构增强氨基酸(SEQIDNO:2);X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/X)-X-B-(B/X),其中X为任何a螺旋结构的促进残基例如丙氨酸；P/X可以为脯氨酸或以上限定的X，B为碱性氨基酸残基且B/X可以为以上限定的的B或X(SEQIDNO:4);由7到10个氨基酸组成并含有KX1RX2X1的序列，其中Xi为R或K且乂2为任何氨基酸(SEQIDNO:5);RKKRRQRRR(SEQIDNO:6);以及KKRPKPG(SEQIDNO:3)。20.权利要求17的融合多肽，其中核酸是dsRNA或siRNA。21.权利要求17的組合物，其中核酸结合域选自由组蛋白、RDE-4蛋白，鱼精蛋白，包括以下所列的dsRNA结合蛋白(括号中为登录号)组成的组中的序列PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、B馬9354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143416、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57175、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登录号EAA14308。22.—种药物组合物，含有权利要求17的融合多肽。23.—种将带有阴离子电荷的核酸分子导入细胞中的方法，包括将细胞与权利要求1或11的组合物，或权利要求17的融合多肽接触。24.—种将带有阴离子电荷的核酸分子导入细胞中的方法，其包括用核酸结合域对核酸分子进行结合以中和或减少阴离子电荷，以及将复合物连接至蛋白质转导域(PTD)并用PTD-电荷中和的核酸与细胞进行接触。25.权利要求23的方法，其中接触是体内的或离体的。26.权利要求24的方法，其中接触是体内的或离体的。27.权利要求24的方法，其中核酸分子包含dsRNA。28.权利要求24的方法，其中dsRNA被细胞加工成siRNA。29.权利要求24的方法，其中核酸抑制靶基因产物的生成。30.权利要求29的方法，其中耙基因产物导致了细胞增生症。31.—种分离的多核苷酸，其编码权利要求17的融合多肽。32.—种包含权利要求31的多核苷酸的载体。33.—种含有权利要求32的载体的宿主细胞。34.—种含有权利要求31的多核苷酸的宿主细胞。35.—种产生融合多肽的方法，包括表达权利要求31的多核苷酸，和基本纯化表达的融合多肽。36.—种产生融合多肽的方法，包括在表达多核苷酸的条件下培养权利要求33或34的宿主细胞，和基本纯化表达的融合多肽。37.—种制备用于转导细胞的组合物的方法，包括将带阴离子电荷的核酸与权利要求17的融合多肽进行接触。38.—种包括一个或多个容器的试剂盒，含有(a)蛋白质转导域；以及(b)核酸结合蛋白质。39.权利要求38的试剂盒，进一步含有dsRNA分子。40.—种包含含权利要求17的融合多肽的容器的试剂盒。41.一种将核酸导入靶细胞中的方法，该方法包括将细胞与权利要求1或11的组合物接触。全文摘要该公开提供了融合多肽和构建物，其用于将包括诊断剂和治疗剂的带有阴离子电荷的核酸运输到细胞中或研究对象体内。该融合构建物包括蛋白质转导域和核酸结合域，或蛋白质转导域和核酸，该核酸包覆有可对其上的阴离子电荷进行充分中和的一个或多个核酸结合域。另外还提供了治疗疾病和病症如细胞增生症的方法。文档编号C07K16/00GK101421301SQ200780013087公开日2009年4月29日申请日期2007年2月9日优先权日2006年2月10日发明者史蒂文·F·道蒂,布莱恩·米德,江口晶子,贾汗季·S·瓦迪亚申请人:加利福尼亚大学董事会