纯化细菌抗原的制作方法

专利名称：：纯化细菌抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从包括肺炎链球菌(S化印tococc^;"eMmom'ae)在内的革兰氏阳性细菌获得的菌毛，制备和分离菌毛的方法以及用该菌毛诱导抗革兰氏阳性细菌免疫应答的应用。本发明还提供检测革兰氏阳性细菌感染的方法，治疗革兰氏阳性细菌感染的方法和鉴定革兰氏阳性细菌菌毛与基质结合的抑制剂的方法。还提供与该菌毛结合的抗体。背景革兰氏阳性细菌肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)是全球发病和死亡率的主要原因，其是四种主要感染性疾病杀手之一，其它三种是HIV、疟疾和肺结核(1-5)。它是呼吸道感染，例如中耳炎、鼻窦炎和社区获得性肺炎(communityacquiredpneumonia)的主要原因，但也是侵袭性疾病，例如败血症和脑膜炎的重要病原体。虽然肺炎球菌是破坏性病原体，但它也能广泛无害地寄居于曰间护理中心的健康儿童中(6，7)。肺炎球菌疾病中主要的毒力因子是多糖荚膜，依据多糖荚膜可将肺炎球菌分成至少90种不同血清型(8)。据称其它遗传因子，例如CbpA(胆碱结合蛋白A)和肺炎球菌溶血素对于毒力至关重要(9-11)。肺炎链球菌感染通过先寄居在鼻咽中而导致侵袭性疾病，但其粘附机制尚未了解。在体外，有包膜的肺炎球菌的粘附能力远低于无包膜无毒力的衍生物(4)，即使荚膜表达是上呼吸道成功寄居所必需的。这些观察结果提示在体内，虽然肺炎球菌产生厚的荚膜，但仍有粘附性(5)。在其它革兰氏阳性细菌，例如白喉棒杆菌(Coo^e6acfen'wwt^fe/^/ae)(12，13)、放线菌属(A^'"om;;ceyspp.)(14)和最近的A群链球菌(GAS)及B群链球菌(GBS)(15,16)中，已通过电子显微镜鉴定到菌毛样表面结构，并作了遗传学以及生物化学表征(12，13，15，16)。在放线菌属中，1型菌毛基因介导与牙齿和粘膜表面的粘附(17)。然而，需要病原性链球菌属的菌毛在感染性疾病中的生理学作用和功能的功能数据。革兰氏阳性菌毛是通过转肽酶反应形成的延伸聚合物(extendedpolymer),所述反应包括共价交联含特定氨基酸基序的亚单位蛋白，由特异性分选酶(sortase)组装。分选酶还负责菌毛与肽聚糖细胞壁的共价连接。发明概述本发明描述了革兰氏阳性细菌肺炎链球菌的菌毛的分离和表征，等等。菌毛在肺炎链球菌和其它革兰氏阳性细菌的致病机理中起作用，其本身可用于抵御革兰氏阳性细菌感染的治疗和免疫方法，等等。在一些方面，本发明提供分离的革兰氏阳性细菌菌毛，例如肺炎链球菌菌毛、A群链球菌(GAS)菌毛或B群链球菌(GBS)菌毛。在一些实施方式中，所述菌毛包含肺炎链球菌RrgA蛋白、肺炎链球菌RrgB蛋白和肺炎链球菌RrgC蛋白中的至少一种，例如具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽，或它们的加工形式。在一些实施方式中，分离的菌毛的分子量约lxlO5-lxl07Da，或者在一些实施方式中为2xl06-3xl06Da。在一些实施方式中，分离的菌毛是长约0.1-2pm(例如，约O.l、0.2、0.5、1、1.5或2nm)的纤丝。在一些实施方式中，分离的菌毛直径约10nm(例如，约8、9、10、11或12nm)。在一些实施方式中，分离的菌毛包含三种原纤丝。在一些实施方式中，通过酶消化(例如，利用一种或多种裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，变溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过机械剪切(例如，通过超声波)从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过降低或抑制SrtA活性从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，用能干扰细胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)处理细胞而从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，菌毛基本上游离于细菌细胞。在一些实施方式中，菌毛基本上不含肽聚糖。在一些实施方式中，本发明的特征在于制备分离的革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌菌毛)菌毛的方法，其中所述方法包括使产生革兰氏阳性细菌菌毛的细菌细胞经酶消化或机械剪切而从细胞分离菌毛。在一些方面，本发明的特征在于包含一种或多种分离的革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)的免疫原性组合物。在一些方面，本发明的特征在于分离革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌、GAS或GBS菌毛)的方法，其中所述方法包括从产生革兰氏阳性细菌菌毛的细菌细胞(例如，革兰氏阳性细菌细胞或经转化而能产革兰氏阳性菌毛的细菌细胞)分离菌毛，以及从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过酶消化(例如，利用一种或多种裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，变溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过机械剪切(例如，通过超声波)从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过降低或抑制SrtA活性从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，用能干扰细胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)处理细胞而从细胞分离菌毛。在一些实施方式中，分离包括采用密度梯度离心。在一些实施方式中，分离包括降低多分散性，例如按照大小分离诸组分，如采用凝胶过滤层析。在一些实施方式中，分离包括一步或多步层析，例如凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析或亲和层析。在一些实施方式中，该方法还包括一步或多步浓縮。在一些方面，本发明的特征在于与分离的革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合型抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。在一些实施方式中，例如利用酶、放射性同位素、毒素、对比剂(如，金颗粒)或荧光团标记所述抗体。在一些实施方式中，相比于所述抗体与构成菌毛的各种蛋白质的结合，所述抗体优先结合分离的细菌菌毛或其片段。在一些实施方式中，相比于所述抗体与选自RrgA、RrgB或RrgC的未形成复合物的菌毛蛋白质的结合，所述抗体优先结合菌毛复合物。在一些实施方式中，所述抗体不与未形成复合物的RrgA、RrgB或RrgC特异性结合。在一些方面，本发明的特征在于诱导抵御革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的免疫应答的方法，其中所述方法包括将有效量的革兰氏阳性细菌菌毛，例如肺炎链球菌菌毛(如，分离的肺炎链球菌菌毛)给予对象，例如人或非人动物。在一些方面，本发明的特征在于检测对象，例如人中革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的方法，其中所述方法包括检验对象的样品，例如血清或痰中存在革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)的证据。在一些实施方式中，存在革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)的抗体是存在革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)的证据。在一些实施方式中，相比于所述抗体与未形成复合物的菌毛蛋白质(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的结合，所述抗体优先结合菌毛复合物。在一些实施方式中，所述抗体不与未形成复合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC)特异性结合。在一些方面，本发明的特征在于检测对象人中革兰氏阳性细菌感染，例如肺炎链球菌感染的方法，其中所述方法包括使样品与特异性结合革兰氏阳性细菌菌毛，例如肺炎链球菌菌毛结合的试剂(例如，抗体)相接触，并检测该试剂与样品组分的结合。在一些实施方式中，相比于所述抗体与未形成复合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的结合，所述抗体优先结合菌毛复合物。在一些实施方式中，所述抗体不与未形成复合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC)特异性结合。在一些方面，本发明的特征在于治疗已被或怀疑已被革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的对象(例如，人对象)的方法，其中所述方法包括将有效量的能特异性结合革兰氏阳性菌毛的试剂给予该对象。在一些实施方式中，所述试剂是抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合型抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段)。在一些实施方式中，所述试剂(例如，抗体)阻断革兰氏阳性细菌与细胞，例如宿主细胞的粘附或结合。所述细胞可以是上皮细胞，例如肺或鼻咽上皮细胞，在一些实施方式中，与构成菌毛的各蛋白质相比，所述抗体特异性结合分离的细菌菌毛或其片段。在一些实施方式中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合一种或多种肺炎链球菌菌毛蛋白，例如RrgA、RrgB或RrgC(例如，一种或多种具有SEQIDNO:2、4或6所示氨基酸序列的多肽，或它们任一种的加工形式)。在一些实施方式中，所述试剂(例如，抗体)特异性结合具有SEQIDNO:4的氨基酸残基316-419的多肽。在一些实施方式中，粘附试验检测与对照相比，所述试剂(例如，抗体)阻断至少50%的肺炎链球菌与A549肺上皮细胞粘附。在一些方面，本发明的特征在于测定已被或怀疑已被革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的对象(例如，人对象)的治疗过程的方法，其中所述方法包括检验对象的样品中是否存在针对革兰氏阳性菌毛的抗体，并根据该抗体的存在与否选择治疗过程。如果未检测到该抗体，所述方法还可包括用抗体试剂治疗对象。如果检测到该抗体，该方法还包括用抗炎药治疗对象。本发明的特征还在于包含以下多肽的分离的革兰氏阳性菌毛，所述多肽包含具有最多50个(例如，最多40、30、20、10或5个)氨基酸取代、插入或缺失的革兰氏阳性(例如肺炎链球菌)菌毛蛋白氨基酸序列。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，革兰氏阳性菌毛蛋白是RrgA(例如，SEQIDNO:2)、RrgB(例如，SBQIDNO:4)或RrgC(例如，SEQIDNO:6)。在一些实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:2、4或6中两个或多个的氨基酸序列，或其中任一种的免疫原性片段。在一些实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:2、4和6所示氨基酸序列，或它们全部的免疫原性片段。本发明的特征还在于分离的革兰氏阳性菌毛的免疫原性片段，例如含有肺炎链球菌菌毛蛋白，如RrgA、RrgB和RrgC的那些片段(例如，SEQIDNO:2、4和6的免疫原性片段)。本发明的特征还在于诱导抵御革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的免疫应答的方法，其中所述方法包括将有效量的分离的革兰氏阳性菌毛给予对象，例如人对象。本发明的特征还在于产生革兰氏阳性菌毛的方法，所述方法用一种或多种足以产生菌毛的核酸转化宿主细胞并从宿主细胞分离该菌毛。在一些方面，本发明的特征在于在细胞中表达抗-革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛抗体的方法，其中所述方法包括在细胞中表达编码抗-革兰氏阳性菌毛抗体的核酸。在一些方面，本发明的特征在于从含革兰氏阳性细菌的样品中纯化革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的方法，其中所述方法包括提供含有抗体的亲和基质，而所述抗体能与结合于固体支持物上的革兰氏阳性菌毛特异性结合；将该样品与该亲和基质接触以形成亲和基质/革兰氏阳性细菌复合物;将该亲和基质/革兰氏阳性细菌复合物与其余的样品相分离;和从亲和基质上释放所述革兰氏阳性细菌。在一些方面，本发明的特征在于将细胞毒性剂或诊断剂递送给革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的方法，其中所述方法包括提供与能特异性结合革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛的抗体或其片段偶联的细胞毒性剂或诊断剂，并使细菌与此抗体-试剂或片段-试剂偶联物接触。在一些方面，本发明的特征在于鉴定肺炎链球菌调节剂的方法，其中所述方法包括使易受肺炎链球菌感染的细胞，例如HEP2细胞、CHO细胞、HeLa细胞或A549肺上皮细胞与候选化合物和肺炎链球菌接触，测定肺炎链球菌的活性，例如与细胞(例如，A549肺上皮细胞)的粘附能力是否受到抑制，其中肺炎链球菌活性受抑制表明(候选化合物)是肺炎链球菌抑制剂。在一些方面，本发明的特征在于鉴定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛结合的调节剂的方法，其中所述方法包括使易与革兰氏阳性菌毛结合的动物细胞与候选化合物和具有革兰氏阳性菌毛的细菌细胞接触，测定该细菌细胞与该动物细胞的结合是否受到抑制，其中结合活性受抑制表明(候选化合物)是革兰氏阳性菌毛结合抑制剂。在一些方面，本发明的特征在于鉴定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛结合调节剂的方法，其中所述方法包括使易与革兰氏阳性菌毛结合的细胞与候选化合物和革兰氏阳性菌毛接触，测定该菌毛与该细胞的结合是否受到抑制，其中结合活性受抑制表明(候选化合物)是革兰氏阳性菌毛结合抑制剂。在一些方面，本发明的特征在于鉴定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛结合调节剂的方法，其中所述方法包括使易与革兰氏阳性菌毛结合的细胞与候选化合物和革兰氏阳性菌毛蛋白或其细胞结合片段接触，测定该菌毛蛋白或其细胞结合片段与该细胞的结合是否受到抑制，其中结合活性受抑制表明(候选化合物)是革兰氏阳性菌毛结合抑制剂。在一些方面，本发明的特征在于鉴定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛结合调节剂的方法，所述方法包括使易与革兰氏阳性菌毛结合的蛋白，例如胞外基质蛋白或其革兰氏阳性菌毛结合片段与候选化合物和革兰氏阳性菌毛、革兰氏阳性菌毛蛋白或其片段接触，测定该两种蛋白或其片段之间的结合是否受到抑制，其中结合活性受抑制表明(候选化合物)是革兰氏阳性菌毛结合抑制剂。本发明的特征还在于包含分离的革兰氏阳性细菌菌毛(例如，肺炎链球菌菌毛)的药物、免疫原性组合物和疫苗组合物。本发明的特征还在于革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)在制备治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的免疫原性组合物或疫苗组合物中的应用。本发明的特征还在于可用于医药的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)。本发明的特征还在于用于治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)。本发明的特征还在于包含特异性结合肺炎链球菌菌毛的试剂(例如，抗体)的药物组合物。本发明的特征还在于特异性结合肺炎链球菌菌毛的试剂(例如，抗体)在制备治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的药物中的应用。本发明的特征还在于用于医药的这些试剂。本发明的特征还在于这些试剂在治疗或预防革兰氏阳性细菌感染中的应用。本发明的特征还在于分离肺炎链球菌菌毛的方法，其中所述方法包括从产肺炎链球菌菌毛的肺炎链球菌，例如肺炎链球菌TIGR4分离菌毛，和分离的肺炎链球菌菌毛。在一些实施方式中，通过酶消化(例如，用一种或多种裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，变溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))从肺炎链球菌细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过机械剪切(例如，通过超声波)从肺炎链球菌细胞分离菌毛。在一些实施方式中，通过降低或抑制SrtA活性从肺炎链球菌细胞分离菌毛。在一些实施方式中，用能干扰细胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)处理细胞而从肺炎链球菌细胞分离菌毛。在一些实施方式中，所述方法包括用核酶降解核酸。在一些实施方式中，所述方法包括降低多分散性，例如采用凝胶过滤层析按照分子大小分离肺炎链球菌菌毛。在一些实施方式中，所述方法包括一步或多步层析步骤，例如凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析或亲和层析。在一些实施方式中，产生肺炎链球菌菌毛的肺炎链球菌细胞表达比肺炎链球菌TIGR4更多的菌毛。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员常规理解相同的意义。虽然可利用与本文所述相似或等价的那些方法和材料，但下述的是合适的方法和材料。本文述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文纳入本文作为参考。如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是说明性而非限制性的。本发明一种或多种实施方式中的细节见以下附图和说明书。通过说明书和附图以及以下其它实施方式中可明白本发明的其它特征、目的和优点。附图简述图1.(A)在细菌表面显示丰富菌毛的肺炎链球菌菌株T4的负染色(negativestaining)。(B)显示无菌毛的突变型菌株T4A(n^4-^D)的负染色。(C)显示丰富菌毛的T4A(mgM)突变体的负染色。(D)在细菌表面显示无菌毛的T4A(厅W-WD，wgM)突变体的负染色。(E)利用抗-RrgA免疫金标记T4。(F)利用抗-RrgB(5nm)和抗-RrgC(10nm)免疫金标记T4。抗-RrgB显示染色整个菌毛(棒，200nm)。(G)用抗-RrgB(5nm)和抗-RrgC(10nm)双重标记的T4菌毛的高放大率。其显示用抗-RrgC特异性标记菌毛，箭头所示(棒，100nm)。(H)免疫金标记缺失突变型肺炎链球菌T4A0r^4-WD)，用抗-RrgB和抗-RrgC检测到表面没有可见的菌毛(棒，200nm)。图2.血清型4菌株T4(TIGR4)中islet的基因组构成，并与序列已知的实验室菌株R6作比较。19F菌株，ST162^具有相似的构成，全长序列相同性为98%，而无包膜的菌株R6及其祖先D39是菌毛-islet-阴性菌株。插入序列(/S1167)侧接阳性菌株中的基因座[转座酶之一是移码的(fs)]，而RUP元件(肺炎球菌中的重复单位)在菌毛-islet-阴性菌株中鉴定至U。显示了此基因座的大小及其G+C含量。标出了阴性调节子的位置。包括编码无乳链球菌(5V/^/7toc<9ccws"ga/"cf/ae)禾卩白喉棒杆菌(C(rj^eZ)"cfen'wmd^/^/^n'ae)的菌毛结构的islet的基因组构成比较。图3.(A)利用4-12%聚丙烯酰胺梯度凝胶和RrgB抗血清作蛋白质印迹检测表达菌毛的菌株(T4，T4A(mgM)，ST162观和ST162^A(mgM))中的高分子量(HMW)聚合物梯，而缺乏菌毛的突变型菌株(T4A(厅^-WD)，T4A(rr^4-WZ)，wg")和ST162^A0t^4-w/DX)没有HMW聚合物。与各种野生型相比，wgM突变体显示强度增加。(B)对于缺乏islet的D39、引入r/Mislet的突变型D39(D39A0rgJ"WD))及其/VM缺失衍生菌株(D39A0rgJ-^tD)A(W^4))，利用4-12%梯度凝胶以RrgB抗血清进行蛋白质印迹。图4.(A)D39和D39A0rgv4画sWD)以及D39A0rgv4-^tD)AO/M)粘附A549肺上皮细胞单层。(B-D)粘附A549肺上皮细胞的D39(B)、D39A(at^4-WD)(C)和D39A0r^4-w")A0^力(D)的免疫荧光显微镜。显示了用抗-荚膜抗体标记肺炎球菌(绿色)以及用罗丹明显示的上皮细胞F-肌动蛋白。图5.(A-E)用有菌毛的T4及其同基因无菌毛缺失突变型T4A(ATg^-w^>)鼻内攻击C57BL/6小鼠。(A和B)接种5x106cfb(高剂量，A)或5x105cfii(中等剂量，B)后的小鼠存活情况。利用卡普兰-迈耶对数排名检验分析存活情况。(C-E)体内竞争感染实验，其中先将T4及其同基因突变型T4A0r^4-^VD)以1:1的比例混合再进行鼻内感染。如下所述计算竞争性指数(CI)，各圆环代表各竞争实验组中每只小鼠的CI。1以下的CI表明突变体相对于野生型菌株为竞争劣势。<10爿的CI值设定为l(T4。所有小鼠都有细菌寄居。(C)高剂量攻击后(n二20)细菌寄居、肺炎和菌血症的CI。20只小鼠中，只有14只显示肺炎(定义为从肺中回收到细菌)，14只有菌血症。(D)中等剂量攻击后(11=IO)细菌寄居的CI。IO只小鼠中，只有5只显示肺炎，l只有菌血症。(E)低剂量攻击后(nMO)细菌寄居的CI。IO只小鼠中，只有4只显示肺炎，无小鼠产生菌血症。(F)用野生型D39及其同基因菌毛islet插入衍生菌株D39A0r^-^D)或r/M基因灭活的D39A(;r^4"W/))A(r^4)混合感染后，细菌寄居和肺炎的CI。1以上的CI表明D39A0rg」-sWD)中存在WMislet获得毒力。图6.r/M菌毛islet在全身性宿主炎性反应中的作用。用高攻击剂量(5x106-2x107cfo)的T4、ST162^和它们的同基因突变型T4A0rgJ-^D)以及ST162^A(AT^4"WD)腹膜内攻击小鼠，感染后6小时杀死小鼠。(A)高剂量腹膜内攻击后血液中的细菌生长。显示了每只小鼠的结果。水平线表示中值，通过曼-惠特尼U检验分析得到无显著性差异(PX).05)。(B)血清TNF应答。数据以平均值和SEM表示。曼-惠特尼U检验建立有统计学显著意义(**，P<0.0001;*，P<0.001)。(C和D)用T4和T4A(—"刚(C)或ST162观和ST16219FA(n^-WD)(D)接种后各小鼠的TNF应答与菌血症水平相关。图7.分析与图6所示相同的腹膜内攻击后的IL-6应答。血液中的细菌生长示于图6A。(A)感染后6小时的血清IL-6应答。数据以平均值和SEM表示(曼-惠特尼U检验；*，P<0.0001)。(B)用T4和T4A(rrg」-WD)接种后各小鼠的IL-6应答与菌血症水平相关。图8是肺炎球菌T4菌毛的结构蛋白RrgA、RrgB和RrgC的分析。8A是在革兰氏阳性菌毛蛋白中发现的预计基序的示意图。8B是肺炎链球菌(T4)中存在的预计菌毛蛋白和E-盒基序的序列。显示棒状杆菌种菌毛蛋白和E-盒的序列以供参考(Ton陽That等，2004，Mol.Microbiol.，53:251-261;Ton-That和Schneewind，2004，TrendsMicrobiol.，12:228-34;Scott禾口Zahner;2006，Mol.Microbiol.，62:320-330)。8C总结了在肺炎球菌T4RrgA、RrgB和RrgC中发现的基序。8A和8C,S:N-末端信号肽，P:菌毛蛋白基序，E:E-盒，C邻胞壁分选信号基序，M:疏水性延伸和带电荷的尾部。图9A描述了用考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶，其显示纯化的RrgA和RrgB蛋白的自身缔合。图9B描述了显示纯化的RrgA和RrgB蛋白的自身缔合的免疫印迹。图9C描述了纯化的RrgA、RrgB和RrgC蛋白进行尺寸排阻层析的一系列痕迹线(trace)。观察到RrgA和RrgB的分子量较高的复合物。图IOA是描绘通过蔗糖梯度纯化高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛的直线图。图10B是描绘通过尺寸排阻层析纯化高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛的痕迹线图。图10C描述了高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛纯化结果的聚丙烯酰胺凝胶。左侧的凝胶显示银染色的结果。右侧的凝胶显示含特异性结合RrgB的抗体作的免疫印迹。图11A描述与RrgB的预计氨基酸序列相比，进行Edmann分析以测定菌毛蛋白N-末端氨基酸序列(下划线)的结果。菌毛蛋白的N-末端对应于预计的信号肽酶切割位点(/)。图11B描述了胰蛋白酶消化纯化高分子量菌毛的质谱分析结果。高分子量菌毛的胰蛋白酶肽序列(斜体字)(从SDS-PAGE凝胶分离)与预计的RrgB氨基酸序列(黑体字)匹配。图12显示用HMW菌毛的抗血清(50pl/小鼠)免疫(腹膜内)并用260CFU的T4/小鼠攻击(腹膜内)的BALB/c小鼠的菌血症和死亡率。T4A菌毛制品用作阴性对照。A.攻击后24小时的菌血症。圆圈=每只小鼠每ml血液的CFU值；水平棒=各组的几何平均值；虚线=检测下限(S卩，虚线以下在血液样品中检测不到CFU)。B.死亡进程.菱形=每只动物的存活天数；水平棒=各组存活天数的中值；虚线=观察终点(即，虚线以上的动物在终点处存活)。ctrl=只接受相应佐剂加盐水的小鼠；抗-菌毛=纯化HMW菌毛的抗血清；抗-A菌毛=纯化对照(T4A菌毛)的抗血清；*=<0.05禾口**=<0.01，与相应的对照组相比。图13显示纯化的重组蛋白(BSA、RrgA、RrgB、RrgC)和天然菌毛与BSA及胞外基质蛋白粘蛋白I、透明质酸、玻连蛋白、硫酸软骨素、乳铁蛋白、胶原I和IV、层粘连蛋白、纤连蛋白和血纤蛋白原的结合结果的系列图。BSA用作阴性对照。通过ELISA以405nm吸光度定量测定结合。图14显示通过用纯化菌毛和A菌毛对照制品体外攻击诱导外周血单核的细胞(PBMC)和单核细胞产生炎性细胞因子TNF-a、IL-12p40和IL-6的系列直方图。图15描述了用RrgB特异性抗体作免疫金标记的肺炎链球菌细菌的电子显微照片。图16描述了用RrgA(与15nm金颗粒偶联)、RrgB(与5nm金颗粒偶联)和RrgC(与10nm金颗粒偶联)的特异性抗体作免疫金标记的纯化菌毛制品的电子显微照片。RrgB是菌毛的主要组分。沿着菌毛的长度可发现RrgA和RrgC，常发现RrgA成簇。图17描述了用磷钨酸(PTA)作负染色的纯化菌毛的电子显微照片，以5000x放大率观察。图18是菌毛结构分析以测定菌毛平均直径的示意图。图19是菌毛结构分析以测定菌毛体积的示意图。图20是产生菌毛的改进2D表示的方法的示意图，所述方法求取菌毛电子显微照片的平均值并过滤这些照片。图21是菌毛的旋转2D视角的示意图，显示由三股原纤丝构成的螺旋结构。图22是测定两处菌毛横断面结构的密度概况示意图。图23描述了菌毛结构的模型。菌毛由至少3股"原纤丝"，按照巻曲螺旋结构排列而成，平均直径为10.5-11.0nm，螺距为13.2nm。结节处菌毛的直径是6.8nm，每股"原纤丝"的直径是3.5nm。发明详述申请人分离和表征了革兰氏阳性细菌，肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)的菌毛。经鉴定这些菌毛由肺炎链球菌TIGR4(—种临床荚膜血清型4分离物)表达，其基因组由基因组研究院(TheInstituteforGenomicResearch)测序(参见万维网址tigr.org)。这些菌毛由病原性分离株，rlrAislet表达，其存在于一些而非所有临床肺炎球菌分离株中。菌毛在鼠科感染模型中显示对于肺炎球菌粘附肺上皮细胞以及寄居至关重要。类似地，菌毛还显示能影响小鼠肺炎和菌血症的产生。此外。表达菌毛的肺炎球菌在全身性感染中引发的肿瘤坏死因子(TNF)应答高于无菌毛(nonpiliated)的同基因突变株，这表明菌毛在宿主炎性应答中起作用。因此，本发明的特征在于革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)菌毛和菌毛蛋白组合物以及它们在抵御革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的治疗和免疫方法中的应用。肺炎链球菌菌毛肺炎球菌菌毛由肺炎链球菌TIGR4中存在的r/Mislet编码，其含有3种分选酶和编码含LPXTG基序的蛋白质的3种基因0rg厶wg5和/rgQ。抗RrgA、RrgB和RrgC蛋白的免疫金标记抗体检测肺炎链球菌表面的伸长纤丝状结构。抗-RrgA显示能标记细菌细胞表面，提示RrgA能将菌毛结构锚定在细胞壁上。抗-RrgB显示能遍布整个菌毛，而抗-RrgC聚集于菌毛尖端。菌毛基因缺失使菌毛染色消失，而菌毛操纵子(/ngM)的阴性调节剂缺失造成细胞表面的菌毛量增加。肺炎链球菌菌毛在细胞表面位置使得它们成为有吸引力的抗原。从肺炎链球菌TIGR4分离均质或接近均质的菌毛，显示其分子量范围是2x106-3x106Da。纯化的菌毛是最长约1pm和直径约10nm的伸长纤丝状，免疫金标记在分离的菌毛中检测到RrgB和RrgC蛋白。示范性厅gj核酸序列(TIGR注释号sp0462)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>示范性RrgA氨基酸序列(TIGR注释号SP0462)如下所示'MIi'NRETHMKKVRKIFQKAVAGIiCCISQLTAFSSIVADAETPETSPAIGKVV工KBTGEGGALIjGDAVFEIjKNNTDGTTVSQRTEAQTGEAIFSNIKPGTYTtiTEAQPPVGYKPSTKQWTVEVEKNGRTTVQGEQVENREEALSDQYPQTGTYPDVQTPYQ:iIKVDGSEKNGQHKALNPNPYERVIPEGTIiSKR工YQVNNLDDNQYGIELTVSGKTVYEQKDKSVPIiDWIliliDNSNSMSlTIRNKNARRAERAGEATRSIjIDKITSDSENRVALVTYASTIFDGTEFTVEKGVADKNGKRLNDSIiFWNYDQTSFTTNTKDYSYLKLTNDKNDIVELKNKVPTEAEDHDGiMRIjMYQFGATFTQKALMKADEIIiTQQARQNSQKVIFHITDGVPTMSYPI'NFNHATFAPSYQNQLUAFFSKSPNKDG工LiIjSDFITQATSGEHTIVRGDGQSYQMFTDKTVYEKGAPAAFPVKPEKYSEMKAAGYAVIGDPINGGVTWLNWRESILAYPFNSNTAKITNHGDPTRWYYNGN工APDGYDVFTVG工G工NGDPGTDEATATSFMQS工SSKPENYTNVTDTTKIIiEQLNRYFHTIVTEKKSIENGTITDPMGEIiIDIiQIjGTDGRFDPADYTLTANDGSRIiENGQAVGGPQNDGGLLKNAKVIjYDTTEKRIRVTGLYLGTDEKVTIjTYNVRLNDEFVSNKFYDTNGRTTLHPKEVEQKJTVRDFP工PKIRDVRKYPE工TISKEKKLGDIEPIKVNKNDKKPIiRGAVFSIiQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFipsrLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPAGYEFTNDlblY工TNEPIPPKREYPRTGGIGMLPFYLIGCMMMGGVIiIiYTRKHP(SEQ.IDNO:2)RrgA含有分选酶底物基序YPXTG(SEQIDNO:8)，在以上SEQIDNO:2中以下划线显示。两种推定的Can蛋白B-型结构域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:2的氨基酸残基62-132和751-824处鉴定。现已鉴定到推定的vonWillebrand因子A型结构域(Sadler，1998，Annu.Rev.Biochem.，67:395-424;Ponting等，1999，J.Mol.Biol.，289:729-4226-579)。该vonWillebrand因子A型结构域可能涉及肺炎链球菌菌毛介导的细胞粘附或细胞信号转导特性。示范性核酸序列(TIGR注释号sp0463)如下所示ATGAAATCAATCAACAAATTTTTAACAATGCTTGCTGCCTTATTACTGACAGCGAGTAGCCTGTTTTCAGCTGCAACAGTTTTTGCGGCTGGGACGACAACAACATCTGTTACCGTTCATAAACTATTGGCAACAGATGGGGATATGGATAAAATTGCAAATGAGTTAGAAACAGGTAACTATGCTGGTAATAAAGTGGGTGTTCTACCTGCAAATQCAAAAGAAATTGCCGGTGTT]ATGTTCGTTTGGACAAATACTAATAATGAAATTAT"TGATGAAAATGGCCAAACTCT^GGAGTGAATATTGATCCACAAACATTTAAACTCTCAGGGGCAATGCCGGCAACTGCAATGAAAAAATTAACAGAAGCTGAAGGAGCTAAATTTAACACGGCAAATTTACCAGCTGCTAAOTATAAAATTTATGAAATTCACAGTTTATCAACTTATGTCGGTGAAGATGGAGCAACCTTAACAGGTTCTAAAGCAGTTCCAATTGAAATTGAATTACCATTGAACGATGTTGTGGATGCGCATGTGTATCCAAAAAATACAGAAGCAAAGCCAAAAATTGATAAAGATTTCAAAGGTAAAGCAAATCCAGATACACCACGTGTAGATAAAGATACACCTGTGAACCACCAAGTTGGAGATGTTGTAGAGTACGAAATTGTTACAAAAATTCCAGCACTTGCTAATTATGCAACAGCAAACTGGAGCGATAGAATGACTGAAGGTTTGGCATTCAACAAAGGTACAGTGAAAGTAACTGTTGATGATGTTGCACTTGAAGCAGOTGATTATGCTCTAACAGAAGTAGCAACTGGTTTTGATTTGAAATTAACAGATGCTGGTTT再GCTAAAGTGAATGACCAAAACGCTGAAAAAACTGTGAAAATCACTTATTCGGCAACATTGAATGACAAAGCAATTGTAGAAGTACCAGAATCTAATGATGTAACATTTAACTATGGTAATAATCCAGATGACGGOAATACTCCAAAGCCGAATAAGCCAAATGAAAACGGCGATTTGACATTGACCAAGACATGGGTTGATGCTACAGGTGCACCAATTCCGGCTGGAGCTGAAGCAACGTTCGATTTGGTTAATGCTCAGACTGGTAAAGTTGTACAAACTGTAACTTTbACAACAGACAAAAATACAGTTACTGTTAACGGATTGGATAAAAATACAGAATATAAATTCGTTGAACGTAGTATAAAAGGGTATTCACCAGATTATCAAGAAATCACTACAGCTGGAGAAATTGCTGTCAAGAACTGGAAAGACGAAAATCCAAAACCACTTGATCCAACAGAGCCAAAAGTTCTTACATATGGTAAAAAGTTTGTC^AAGTTAATGATAAAGATAATCGTTTAGCTGGGGCAGAATTTGTAATTGCAAATGCTbATAATGCTGGTCAATATTTAGCACGTAAAGCAGATAAAGTOAGTCAAGAAGAGAAGCAGTTGGTTGTTACAACAAAGGATGCTTTAGATAGAGCAGTTGCTGCTTATAACGCTCTTACTGCACAACAACAAACTCAGCAAGAAAAAGAGAAACTTGACAAAGCTCAAGCTGCTTATAATGCTGCTGTGATTGCTGCCAACAAfGCATTTGAATGGGTGGCAGATAAGGACAATGAAAATGTTOTGAAATTAGTT^TCTGATGCACAAGGTCGCTTTGAAATTACAGGGCTTCTTGCAGGTACATATTACTTAGAAGAAACAAAACAGCCTGCTGGTTATGCATTACTAACTAGCCGTCAGAAATTTGAAOTGACTOCAACTTCTTATTCAGCGACTGGACAAGGCATTGAGTATACTGCTGGTTCAGGTAAAGATGACGCTACAAAAGTAGTCAACAAAAAAA"fCACTATCCCACAAACGGGTGGTATTGGTACAATTATCTTTGCTGTAGCGGGGGCTGCGATTATGGGTATTGCAGTGTACGclATATGTTAAAAACAACAAAGATGAGGATCAACTTGCTTAA('SEQIDNO-3)示范性RrgB氨基酸序列(TIGR注释号SP0463)如下所示MKS工NKFIjTMLAALIiIjTASS:LFSAATVFAAGITTTSVTVHKLLATDGDMDKIANE:LETGNYAGNKVGVI/PANAKEIAGVMFVWTNTNNEIIDENGQTIjGVNIDPQTFKLSGAMPATAMKKLTEAEGAKFNXAJNLPAAKYKIYE工HSIjSTYVGED6ATIiTGSKAVPIEIE:LPLNDWDAHVYPKNTEAKPKIDKDFKGKANPDTPRVDKDTPVNHQVGDWEyEIVTK工PALANYATANWSDRMTEGLAFNKGTVKVTVDDVALEAGDYALTEVATGFDLKLTDAGLAKVNDQWAEKTVKITYSATLNDKAIVEVPESNDVTFNyGNNPDHGNTPKPNKPNENGDIiTI/TKTWVDATGAP工PAGAEATFDLVNA。TGKVVQTVTLTTDKNTVTVNGLDKNTEYKFVERSIKGYSADYQEITTAGEIAVKNWKDEKTPKPIiDPTEPKVVTYGKKFVKVNDKDNRIAGAEFVIANADNAGQYLARKADKVSQEEKQI/WTTKDALDRAVAAYNALTAQQQTQQEKEKVDKAQAAYNAAV工AMJNAFEWVADKDKrENWKLVSDAQGRFEITGLLAGTYYLEET.KQPAGYALLTSRQKPEVTATSYSATGQGIEYi:AGSGKDDATKVVNKKITIPQTpGIGTIIFAVAGAAIMGIAVYAYVKNMKDEDQIA(SEQIDNO:4)RrgB含有分选酶底物基序IPXTG(SEQIDNO:9)，在以上SEQIDNO:4中以下划线显示。推定的Can蛋白B-型结构域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:4的氨基酸残基461-605处鉴定。示范性厅gC核酸序列(TIGR注释号sp0464)如下所示ATGATTAGTCGTATCTTCTTTGTTATGGCTCTGTGTTTTTCTCTTGTATGGGGTGCA.CATGCAGTCCAAGCGCAAGAAGATCACACGTTGOTCTTGCAATTGGAGAACTATCAGGAGGTGGTTAGTCAATTGCCATCTCGTGATGGTCATCGGTTGCAAGTATGGAAGTTG■GATGATTCOTATTCCTATGATGATCGGGTGCAAATTOTAAGAGACTTGCATTCGTGGGATGAGAATAAACTTTCTTCTTTCAAAAAGACTTCGTTTGAGATGACCTTCCTTGAGaatcagattgaagtatctcatattccaaatggtctttactatgttcgctctattatccagacggatgcggtttcttatccagctgaatttctttttgaaatgacagatcaaacggtagagcctttggtcattgtagcgaaaaaaacagatacaatgacaacaa^gotgaagctgataaaggtggatcaagaccacaatcgcttggagggtgtcggctttaAattggtatcagtagcaagagatgtttctgaaaaagaggttcccttgattggagaataccgttacagttcttctggtcaagtagggaqaactctctatactgataaaaatggagagatttttgtgacaaatcttcctcttgggaactatcgtttcaaggaggtggagccactggcaggctatgctgttacgacgctggatacggatgtccagctggtagatcatcagctggtgacgattacggttgtcaatcagaaattAccacgtggcaatgttgactttatgaaggtggatggtcggaccaatacctctcttcaaggggcaatgttcaaagtcatgaaagaagaaagcggacactatactcctgttcttcaaaatggtaaggaaotagttgtaacatcagggaaagatggtcgtttccgagtggaaggtctagagtatgggacatactatttatgggagctccaagctccaactggttatgttcaattaacatcgcctgtttcctttacaatcgggaaagatactcgtaaggaactggtaacaotggttaaaaataacaagcgaccacggattgatgtgccagatacaggggaagaaaccttgtatatcttgatgcttgttgccattttgttgTTTGGTAGTGGTTATTATCTTACGAAAAAACCAAATAACTGA(SEQIDNO:5)示范性RrgC氨基酸序列(TIGR注释号SP0464)如下所示MISRIFFVMALCFSLVWGAHAVQAQEDHTLVLQL咖YQEWSQLPSRDGHRLQWKL.DDSYS.YDDRVQIVRpiiHSWDENKLSSFKKTSFEMTFIiENQ:rEVSHIPNGIiYYVRS工IQTDAVSYPAEFIiFEMTDQTVEPLV工VAKKTDTMTTKVKL工KVDQDHNRLEGVGFKLVSVARDVSEKEVPIiIGEYRYSSSGQVGRTIiYTDKNGE工FVTNLPIiGNYRFKEVEPIjAGYAVTTLDTDVQIjVDHQLVTITVVNQKLPRGNVDFMKVDGRTNTSIiQGAMFKVMKEESGHYTPVLQNGKEVVVTSGKDGRFRVEGLEYGTYYLWEIjQAPTGYVQLTSPVSFTIGKDTRKEIiVTWKNNKRPRIDVPDTGEETI/yiliMIiVAILLFGSGYYLTKKPNN(SEQ工DNO:6)两种推定的Can蛋白B-型结构域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:6的氨基酸残基163-251和273-352处鉴定。RrgC含有分选酶底物基序VPXTG(SEQIDNO:10)，以上SEQIDNO:6中以下划线显示。其它革兰氏阳性细菌菌毛本文所述的方法和组合物可利用任何革兰氏阳性细菌的菌毛。现已在GAS(例如，酿脓链球菌(S"e;^ococcz^;;;oge"e力)(Mora等，2005，Proc.Natl.Acad.Sci,USA,102:15641-6)、GBS(例如，无乳链球菌O^w/^ococcz^aga/ac"ae))(Lauer等，2005，Science,309:105;WO2006/078318)、内氏方夂线菌(」c""om戸^swaes/w"刷(Yeung等，1998，Infect.Immun.，66:1482-91)、白喉棒杆菌(Coo^e6a"eWwmc^/2f/7e〃'ae)(Ton-Tha等，2003，Mol.Microbiol.,50:1429-38;Ton-That禾卩Schneewind，2004，Trends.Microbiol.,12:228—34)、产气荚膜梭菌(C/oWW&wmpe^W"ge""和粪肠球菌(￡^^^0"^>^。//力中鉴定了已知和推定的菌毛蛋白。本文所述的方法和组合物可利用其它革兰氏阳性细菌的菌毛。这种革兰氏阳性细菌包括但不限于厚壁菌门，例如链球菌属(如肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、猪链球菌(S.w&)、兽瘟链球菌(S.zoo印Wew/cw)、绿色链球菌(S.v/nWa朋)、变异链球菌(S.mwto似)、格氏链球菌(S.go^om7)、马链球菌OS.e《w/));芽孢杆菌属(Sfl"7/ws)(例如，炭疽芽孢杆菌(5.a"Arac&)、蜡状芽孢杆菌(5.cerew)、枯草芽胞杆菌(及w6"/"));利斯特菌(i^^^)(如，无害利斯特菌(丄./朋ocw)、单核细胞增生利斯特菌(丄.w朋oc;^oge"ey));葡萄球菌属0Sto;/2;;/ococcM)(如金黄色葡萄球菌OS.awrew力、表皮葡萄球菌epWerm/flfo)、山羊葡萄球菌ca;me)、腐生葡萄球菌(S.s，—,'c一、路邓葡萄球菌/w^/"w冊/s)、施氏葡萄球菌(S.■sc/z/ez/eW));肠球菌属CE"&rococcw51)(如粪肠球菌(五./aecafe)、屎肠球菌(五./aec/wm))、乳杆菌属(La"o6ac/〃w"、乳球菌(丄a"ococcw"(如乳酸乳球菌(丄./acto));明串珠菌属(Lewco"oWoc)(如肠膜明串珠菌(丄.mese她ro,tfes));梳状菌属(尸ec""齒力；片球菌属CPed/ococc—;醋酸杆菌属(^cefoZaCe〃.ww);梭菌属(C7oitA7'd/wm)($口肉毒梭菌(C1.Zow//wwm)、艰难梭菌(C^^cZ/e)、产气荚膜梭菌(C./7e，/"ge""、破伤风梭菌(C.^to"/));瘤胃球菌属(iwm/"ococczw)(如白色瘤胃球菌(i.a/6ws));螺旋杆菌属(Zfe"o6acfen'wm);(//e/z'05p/n7/wm)禾口鼠孢菌属(S/o;-omw5(3);禾口方夂线菌，例如放线菌属04"/"om;;ce&力(如内氏放线菌)；棒杆菌属(Coo;"e6a"e〃'wm)(如，白喉棒杆菌、(C.e^c/e似))、节杆菌属C4W/^oZ^c^);双歧杆菌属(5诉afo6a"eWwm)(如长双歧杆菌(5./owgwm));弗兰克氏菌属CFmwha);微球菌属(Mcrococcws);小单孢菌属(Mz'cromowo印ora);分枝杆菌属(Mj;co6ac/eW"m)(如，结核分枝杆菌(T^"6en:w/a^)、麻风分枝杆菌(Mleprae)、牛分枝杆菌(MZjov/力、非洲分枝杆菌(Ma/Wca"wm)、田鼠分枝杆菌(Mm/cro"));诺卡式菌属(7Voc。W/fl)(如，星状诺卡式菌(TV.(x^e/"o/tfey));丙酸杆菌属(尸rop/om力a"eWwm)禾口链霉菌属(S^"e/^omyces)(如，索马里链霉菌OS,■soma//ew1^)、除虫链霉菌(S.awm"//&)、天蓝色链霉菌(i5.coe/,co/or))。分离的菌毛分离的革兰氏阳性(例如肺炎链球菌)菌毛和包含革兰氏阳性菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的其它菌毛样结构或它们的片段或变体可用于本文所述的方法中并用作免疫原性组合物的抗原以在对象中产生抗体和/或刺激免疫应答。包含革兰氏阳性菌毛蛋白变体在内的菌毛也可用于本文所述的方法，并用作免疫原性组合物的抗原以在对象中产生抗体和/或刺激免疫应答。与革兰氏阳性蛋白氨基酸序列(例如，SEQIDNO:2、4或6)有至少80%序列相同性(例如，85%、90%、95%、98%或99%)的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛样多肽也可用于所述新方法。此外，含最多50个，例如l、3、5、10、15、20、25、30、或40个氨基酸插入、缺失或取代(如保守性氨基酸取代)的革兰氏阳性菌毛多肽可用于本文所述的组合物和方法中。可利用ncbi.nlm.nih.gov/BLAST对公众公开的BLAST2.0程序测定两条氨基酸序列之间的相同性百分比。采用无空位比对和默认参数(BLOSUM62矩阵、空位存在成本(gapexistencecost)为11、每个残基空位成本(perresiduegapcost)为1，X比例(lambdaratio)为0.85)进行序列比较。Altschul等，1997，NucleicAcidsResearch,25:3389-3402描述了BLAST程序所用的数学算法。本文所用的"保守性氨基酸取代"表示多肽中氨基酸家族内的氨基酸取代。氨基酸家族是本领域公认的，其依据氨基酸侧链的物理和化学特性。家族包括以下含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；含酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)；含不带电荷侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)；含非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)；含分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸);和含芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。某种氨基酸可属于一个以上的家族。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白，可将其配制或纯化成寡聚(菌毛)形式。在一些实施方式中，寡聚形式是超寡聚物(hyperoligomer)。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含以寡聚(菌毛)形式分离的革兰氏阳性菌毛蛋白。可纯化或配制包含革兰氏阳性菌毛蛋白的寡聚物或超寡聚物菌毛结构用于免疫原性组合物中。一个或多个肺炎链球菌菌毛蛋白开放读框的多核苷酸序列可用编码被替代ORF的片段的多核苷酸序列替代。或者，一个或多个肺炎链球菌菌毛蛋白开放读框可用与被替代的ORF具有序列同源性的序列替代。一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白序列通常包含LPXTG基序(例如LPXTG(SEQIDNO:ll))或其它分选酶底物基序。肺炎链球菌菌毛蛋白的LPXTG分选酶底物基序通常以式X,X2X3X4G表示，其中氨基酸1位的X是L、V、E、Y、I或Q;如果氨基酸1位的X是L，则氨基酸2位的X是P;如果氨基酸1位的X是E或Q，则氨基酸2位的X是V;如果氨基酸l位的X是V，则氨基酸2位的X是V或P;氨基酸3位的X是任何氨基酸残基；如果氨基酸1位的X是V、E或Q，则氨基酸4位的X是T;如果氨基酸1位的X是L，则氨基酸4位的X是T、S或A。LPXTG基序的一些例子包括YPXTG(SEQIDNO:8)、IPXTG(SEQIDNO:9)、LPXSG(SEQIDNO:57)、VVXTG(SEQIDNO:12)、EVXTG(SEQIDNO:13)、VPXTG(SEQIDNO:10)、QVXTG(SEQIDNO:14)、LPXAG(SEQIDNO:15)、QVPTG(SEQIDNO:16)和FPXTG(SEQIDNO:17)。一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白序列可包含菌毛基序序列。菌毛基序序列的一些例子包括WLQDVHVYPKHQXXXXXXK(SEQIDNO:58)、濯YNVVAYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:59)、WLYDVNVFPKNGXXXXXXK(SEQIDNO:60)、WIYDVHVYPKNEXXXXXXK(SEQIDNO:61)、丽YNVHVYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:62)、FLSEINIYPKNVXXXXXXK(SEQIDNO:63)和DVVDAHVYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:64)。示范性的共有菌毛基序序列是(W/F/E/D)-X-X-X-(V/I/A)-X-(V/I/A)-(Y/F)陽P-K-(應/D)-XXXXXXX隱(K/L)(SEQIDNO:65)或WXXXVXVYPK(SEQIDNO:76)。菌毛基序的保守性内部赖氨酸可用作分选酶反应中的亲核位点。一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白序列可包含E-盒基序序列。E-盒基序序列的一些例子包括FCLVETATASGY(SEQIDNO:66)、FCLKETKAPAGY(SEQIDNO:67)、YVLVETEAPTGF(SEQIDNO:68)、YCLVETKAPYGY(SEQIDNO:69)、YKLKETKAPYGY(SEQIDNO:70)、YPITEEVAPSGY(SEQIDNO:71)、YRLFENSEPAGY(SEQIDNO:72)、示范性E-盒基序共有序列是(Y/F)-X-(L/I)-X-E-T-X-(A/Q/T)-(P/A)-X-G-(Y/F)(SEQIDNO:75)或LXET(SEQIDNO:77)。本文所述的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛可影响革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)粘附和侵入上皮细胞的能力。菌毛还可影响革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)通过上皮细胞层转运的能力。一种或多种革兰氏阳性菌毛优选能结合上皮细胞表面或与之缔合。革兰氏阳性菌毛还可结合血纤蛋白原、纤连蛋白或胶原或与之缔合。据认为，革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)分选酶蛋白参与含LPXTG的表面蛋白的分泌和锚定。在与wgj、/Tg5和/rgC基因相同的病原性islet中发现的基因一W、WC和w^O编码这些肺炎链球菌分选酶蛋白。可从革兰氏阳性细菌获得用于本文所述方法中的分选酶蛋白和分选酶蛋白的变体。革兰氏阳性(例如肺炎链球菌)菌毛蛋白可以通过膜相关转肽酶，例如分选酶共价连接于细菌细胞壁。分选酶的功能是切割(优选在LPXTG基序的苏氨酸和甘氨酸残基之间)表面蛋白。然后分选酶协助在苏氨酸羧基和细胞壁前体，例如脂质II之间形成酰胺键连接。然后通过细菌细胞壁合成时的转糖基化(transglycoslylation)和转肽反应将该前体掺入肽聚糖中。参见Comfort等，Infection&Immunity(2004)72(5):2710-2722。在一些实施方式中，本发明包括含有寡聚菌毛样结构的组合物，所述结构包含革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC(如SEQIDNO:2、4或6))。寡聚菌毛样结构可包含多个单位的菌毛蛋白质。在一些实施方式中，寡聚菌毛样结构可包含两种或更多种菌毛蛋白质。在一些实施方式中，寡聚菌毛样结构包括超寡聚菌毛样结构，所述结构包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、150、200个或更多个)寡聚亚单位，其中各亚单位包含菌毛蛋白或其片段。寡聚亚单位可经菌毛基序内的保守性赖氨酸共价连接。寡聚亚单位可经LPXTG基序，优选分别通过苏氨酸或丝氨酸氨基酸残基共价连接。在一些实施方式中，寡聚菌毛样结构是分离的菌毛。在一些实施方式中，要掺入本发明寡聚菌毛样结构的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白或其片段包含菌毛基序。寡聚菌毛可单用或与本发明联用。在一些实施方式中，本发明包括寡聚形式的肺炎链球菌菌毛。在一些实施方式中，所述菌毛是超寡聚形式。纯化菌毛的方法可通过，例如机械剪切或酶消化分开细胞与菌毛，然后分离分开的菌毛从而能自表达革兰氏阳性菌毛或菌毛样结构(例如，链球菌菌毛，如肺炎链球菌、A群链球菌和B群链球菌的菌毛)的细胞，例如细菌细胞纯化菌毛。纯化菌毛合适的细菌细胞包括有菌毛的革兰氏阳性细菌菌株、已用一种或多种革兰氏阳性菌毛蛋白，例如肺炎链球菌RrgA、RrgB和RrgC(如SEQIDNO:2、4和6)转化的无菌毛革兰氏阳性细菌，以及用一种或多种革兰氏阳性菌毛蛋白，例如肺炎链球菌RrgA、RrgB和RrgC(如SEQIDNO:2、4和6)转化的革兰氏阴性或前其它细胞。用于纯化菌毛的细胞通常只产生一种或多种所需类型的菌毛，例如内源或异源菌毛。对于异源菌毛的产生，可通过，例如突变或重组DNA方法改变细胞，使之不产生内源性菌毛。可用于纯化的产菌毛革兰氏阳性细菌细胞通常表达一种或多种相容的分选酶，从而将菌毛表达在细胞表面。一般通过机械剪切、酶消化、降低或抑制SrtA活性或用干扰细胞壁完整性的化合物处理使菌毛与革兰氏阳性细菌细胞分开。机械剪切可物理除去细胞的菌毛，而其它方法可清除菌毛的附着点(例如，通过降解细胞壁或菌毛组分)。细胞与菌毛分开后，可通过，例如离心分开菌毛与细胞。机械剪切的非限制性例子包括超声处理、玻璃珠剪切和混合。超声方法的讨论可见，例如Yamaguchi等，2004，CurrentMicrobiol.，49:59-65。玻璃珠剪切的方法可见，例如Levesque等，2001，J.Bacterid.,183:2724-32。机械剪切的通用方法可见，例如Wolfgang等，1998，MolMicrobiol.,29:321-30;Trachtenberg等，2005，J.Mol.Biol.，346:665-676;Parge等，19卯，J.Biol.Chem.，265:2278-85;Isaacson等，1981，J.Bacteriol.，146:784-9;Korhonen等，1980，Infect.Immun.，27:569-75;Hahn等，2002，J.Mol.Biol,，323:845-57;St.Geme等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:11913-18;Weber等，2005，J.Bacteriol.，187:2458-68;禾卩Mu等，2002，J.Bacteriol.,184:4868-74。适合于酶消化的非限制性例子包括细胞壁降解酶，例如变溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶。酶消化的方法见，例如Bender等，2003，J.Bacteriol.，185:6057-66;Ton-That等，2004，Mol.Microbiol.,53:251-61;禾卩Ton-That等，2003，Mol.Microbiol.,50:1429-38。对于对象的菌毛下游给药而言，可利用多种酶除去可导致不良宿主反应的细胞壁组分。抑制或降低SrtA活性的非限制性方法包括通过引入SrtA的功能丧失等位基因、删除内源性SrtA基因、表达能降低SrtA表达的核酸(例如反义或miRNA)和用能抑制SrtA活性的化合物处理细胞来降低SrtA活性(参见，例如Marrafini等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，70:192-221，2006)。示范性的分选酶A抑制剂包括甲烷-硫代磺酸酯(例如，MTSET禾口(2-磺基乙基)甲烷-硫代磺酸酯)(Ton-That和Schneewind，J.Biol.Chem.，274:24316-24320，1999)，对-羟基苯甲酸汞(p-hydroxymercuribenzoicacid)，葡糖基类固醇(3-谷固醇-3-0-吡喃型葡萄糖(glucosylsterol(3-sitosterol-3-0-glucopyranol)(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67:2477-79，2003)，盐酸小檗碱(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，68:421-24，2004)，肽酰基-重氮甲烷(LPAT-CHN2)(Scott等，Biochem.J.，366:953-58，2002)，肽酰基-氯甲烷(LPAT-CH2C1)，肽酰基-乙烯砜[LPAT-S02(Ph)](Conolly等，J.Biol.Chem.，278:34061-65，2003)，乙烯砜(例如，二-、乙基-、甲基-和苯基乙烯砜)(Frankel等，J.Am.Chem.Soc，126:3404-3405，2004)，亚膦酸基团取代了苏氨酸残基的LPXTG基序肽(例W，LPE\|/{P02H-CH2}G)(Kruger等，Bioorg.Med.Chem.，12:3723-29,2004)，取代的(Z)-二芳基-丙烯腈(Oh等，J.Med.Chem.，47:2418-21，2004)，和各种药用植物的提取物(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66:2751-54，2002)。干扰细胞壁完整性的化合物的非限制性例子包括甘氨酸和抗生素，例如青霉素(如，甲氧青霉素、阿莫西林、氨苄西林)、头孢菌素(如，头孢氨苄、头孢丙烯、头孢吡肟)、糖肽(如，万古霉素、替考拉宁、雷莫拉宁)和环丝氨酸。可借助密度，例如密度梯度离心将分离的菌毛与其它组分分开。例如，可通过蔗糖梯度离心分离菌毛。含革兰氏阳性菌毛的样品通常因菌毛中存在不同数量的菌毛蛋白亚单位而含有分子量不同的聚合物。为降低多分散性，可通过尺寸分离含革兰氏阳性菌毛的样品。例如，可采用凝胶过滤或尺寸排阻柱。还可利用超滤膜降低革兰氏阳性菌毛的多分散性。还可采用亲和方法，例如亲和层析分离革兰氏阳性菌毛。可将能与革兰氏阳性菌毛特异性结合的蛋白质，例如能与菌毛组分特异性结合的抗体或优先与菌毛结合的抗体固定于固体支持物(例如，层析基材)上，使含革兰氏阳性菌毛的样品与固定的结合蛋白质接触。这种亲和分离方法还可用于分离、纯化或富集表达革兰氏阳性菌毛的细胞制品。还可采用本领域已知的任何其它蛋白质纯化方法，例如沉淀、柱层析方法和样品浓縮分离革兰氏阳性菌毛。所述分离可包括，例如凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析或亲和层析。其它方法描述于，例如Ruffolo等，1997，Infect.Immun.，65:339-43。蛋白质纯化的方法详细描述于，例如Scopes,R.K.，《蛋白质纯化原理和实践》(ProteinPurification:PrinciplesandPractice),第三版，1994，斯普林格公司(Springer),纽约。纯化期间，对各部分中存在的革兰氏阳性菌毛随后可进行电泳(例如，聚丙烯酰胺电泳)，检测特异性结合革兰氏阳性菌毛的试剂(例如，抗菌毛蛋白的抗体或优先结合菌毛的抗体)的结合情况，和/或检测菌毛的活性，例如与蛋白质或细胞结合(活性)。抗体本发明的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛还可用于制备革兰氏阳性或革兰氏阳性菌毛蛋白的特异性抗体。在一些实施方式中，这些抗体能与寡聚或超寡聚形式的革兰氏阳性菌毛蛋白特异性(例如，优先)结合。本发明还包括革兰氏阳性菌毛蛋白特异性抗体的组合，选择这种抗体来提供抵御范围增加的血清型和分离菌株的保护作用。本发明的革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛特异性抗体包括一个或多个生物学部分，所述生物学部分可通过化学或物理方式与革兰氏阳性菌毛多肽某表位结合或缔合。本发明的抗体包括与分离的菌毛蛋白相比，能优先结合革兰氏阳性菌毛的抗体。本发明包括从多克隆和单克隆抗体制品，以及以下抗体杂交(嵌合)抗体分子(参见，例如Winter等，(1991)Nature349:293-299;和美国专利号4,816,567);F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异质二聚体，参见，例如Inbar等(1972)ProcNatlAcadSciUSA69:2659-2662;和Ehrlich等(1980)Biochem19:4091-4096);单链Fv分子(sFv)(参见，例如Huston等，(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5897-5883);二聚和三聚抗体片段构建物；小抗体(minibody)(参见，例如Pack等(1992)Biochem31:1579-1584;Cumber等(1992)JImmunology149B:120-126);人源化抗体分子(参见，例如Riechmann等(1988)Nature332:323-327;Verhoeyan等(1988)Science239:1534-1536;禾P1994年9月21日公布的美国专利公布号GB2,276,169);和从这些分子获得的任何功能片段，其中这些片段保留亲代抗体分子的免疫学结合特性。本发明还包括通过非常规方法，例如噬菌体展示获得的抗体。本发明的抗体可以是多克隆、单克隆、重组，例如嵌合型或人源化，完全人的、非人的，例如鼠科，或单链抗体。制备这种抗体的方法是已知的。在一些情况中，这些抗体具有效应物功能，可固定补体。这些抗体还可与毒素、报道基团或显影剂偶联。在一些实施方式中，本发明的革兰氏阳性菌毛蛋白特异性抗体是单克隆抗体。单克隆抗体包括含有均质抗体群的抗体组合物。可从鼠科杂交瘤以及利用人而非鼠科杂交瘤获得的人单克隆抗体获得单克隆抗体。参见，例如Cote等，《单克隆抗体和癌症治疗》(MonoclonalAntibodiesandCancerT'iierapy)，AlanR.Liss，1985，第77页。嵌合型、人源化，例如完全的人抗体对于包括反复给药在内的应用，例如人对象的治疗性治疗(和一些诊断性应用)是理想的。这些抗体还可用于预防性或治疗性治疗革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染。这些抗体可阻断革兰氏阳性细菌对宿主细胞的粘附或一些其它活性。此外，可利用这些抗体将毒素或治疗剂，例如抗生素递送至革兰氏阳性细菌细胞。这些抗体可用于诊断性应用，例如检测生物学样品中是否存在革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白。可诊断性使用抗-菌毛或菌毛蛋白抗体作为临床检验过程的一部分来监测组织中的该蛋白质的水平，例如测定某给定治疗方案的效力。将此抗体与可检测试剂偶联(即，物理连接，例如直接或间接；艮P，抗体标记)可有助于检测。可检测试剂的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、对比剂、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；对比剂的例子包括用于电子显微镜的电子致密材料，例如金颗粒或用于磁共振成像的磁活性材料，例如超磁铁颗粒(supermagneticironparticles);发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性材料的例子包括125I、mI、"S和311。这些诊断性抗体可用于检测受感染患者中是否存在革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的方法中，例如检验该患者的样品。然后可根据有菌毛的革兰氏阳性细菌的存在与否选择治疗方案。例如，可用抗生素治疗感染了无菌毛革兰氏阳性细菌的患者，而用菌毛结合化合物，例如抗体和/或抗炎药(例如，IL-6或抗-TNF制剂，如抗-TNF抗体)治疗感染了菌毛革兰氏阳性细菌的患者。筛选试验在一些方面，本发明提供鉴定调节剂的方法(本文也称为"筛选试验")，所述调节剂即是从能抑制革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的活性，例如结合活性的一种或多种测试化合物(例如，抗体、蛋白质、肽、肽模拟物(peptidomimetics)、类肽、小的无机分子、小的非核酸有机分子、核酸(例如，反义核酸、siRNA、寡核苷酸或合成的寡核苷酸)、或其它药物)中鉴定的候选化合物或试剂。如此鉴定的化合物可用于治疗方案中以调节革兰氏阳性细菌的结合或粘附活性，或阐明革兰氏阳性菌毛的生物学功在一些实施方式中，提供试验来筛选测试化合物以鉴定与革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或其一部分结合的那些化合物。可以测试与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白结合的化合物的调节革兰氏阳性菌毛的相关活性，例如粘附、感染或炎性应答的能力。可采用本领域已知的组合文库方法中的任何方法获得本文所述方法使用的测试化合物，包括生物学文库；类肽文库(具有肽官能团，但具有新型非肽骨架的分子文库，这些分子耐受酶消化，但保留了生物活性，参见例如Zuckermann等，1994，J.Med,Chem.，37:2678-2685);空间可寻址的平行固相或液相文库；需要去巻积(deconvolution)的合成文库方法；"一珠一化合物(one-beadone-compound)"文库方法；和采用亲和层析筛选的合成文库方法。生物学文库和类肽文库方法局限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，1997，AnticancerDrugDes.，12:145)。本领域已知合成分子文库的方法的例子，例如刊于DeWitt等，(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卯:6909;Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:11422;Zucke醒nn等，1994，J.Med.Chem,，37:2678;Cho等，1993，Science,261:1303;Carrell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33:2059;Carell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33:2061;禾卩Gallop等，1994，J.Med.Chem.，37:1233)。化合物文库可存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques，13:412-421)，或小珠上(Lam，1991，Nature,354:82-84)，芯片上(Fodor，1993，Nature,364:555-556)，细菌(Ladner，美国专利号5,223,409),孢子(Ladner，美国专利号5,223,409)，质粒(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:1865-1869)，或噬菌体上(Scott禾卩Smith,1990，Science,249:386-390;Devlin,1990，Science,249:404-406;Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:6378-6382;Felici，1991，J.Mol.Biol.，222:301-310;和Ladner，同上)。在一些实施方式中，所述试验是细胞试验，其中表达革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或其生物学活性部分的细胞，例如细菌细胞与测试化合物接触，通过，例如监测细胞结合来测定该测试化合物调节革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白活性的能力。例如，所述细胞可以是哺乳动物来源，如小鼠、大鼠或人来源。所述细胞可以是上皮细胞，例如A549肺上皮细胞。可以通过，例如将化合物，如底物与放射性同位素或酶标记偶联，从而能通过检测复合物中的标记化合物，例如底物来测定化合物，例如底物与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的结合情况，从而能评估测试化合物调节革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白与配体或底物，例如细胞或蛋白质，例如血纤蛋白原、纤连蛋白或胶原结合的能力。或者，可将革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白偶联于放射性同位素或酶标记以监测测试化合物调节复合物中革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白与底物结合的能力。例如，可用放射性同位素(例如，125I、35S、14C或311)直接或间接标记化合物(例如，革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白结合伴侣)，通过射线(radioemission)的直接计数或闪烁计数法检测放射性同位素。或者，可用，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶等酶标记化合物，通过合适底物转变为产物来检测酶标记。可通过标记或不标记任何相互作用物之一来评估某化合物与革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白相互作用的能力。例如可用微型生理机能测试仪(microphysiometer)检测化合物与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的相互作用，而无需标记该化合物或革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白(McConnell等，1992，Science257:1906-1912)。本文所用的"微型生理机能测试仪"(例如，Cytosenso,)是利用光可寻址电势传感器(LAPS)检测细胞酸化其环境速度的分析仪器。该酸化速度的改变可用作化合物与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白之间相互作用的标志。一些实施方式提供无细胞试验，其中革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或其生物学活性部分与测试化合物接触，评估该测试化合物与革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或其生物学活性部分结合的能力。该新试验中使用的革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的生物学活性部分通常包括参与与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白分子相互作用的片段。无细胞试验包括在足以允许耙基因蛋白和测试化合物相互作用的条件和时间下制备该两组分的反应混合物，从而形成可以除去和/或检测的复合物。还可采用，例如荧光能量转移(FET)(参见，例如Lakowicz等，美国专利号5,631,169和Stavrianopoulos等，美国专利号4,868,103)检测两种分子之间的相互作用。选择第一"供体"分子上的荧光团标记物，其发射的荧光能量被第二"接受"分子上的荧光标记物吸收，而该荧光标记物因吸收能量而能发出荧光。或者，"供体"蛋白分子可简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择的标记物应能发出不同波长的光，从而能区分"接受"分子标记物与"供体"的标记物。由于标记物之间能量转移的效率与二分子相隔的距离有关，因而可以评估分子之间的空间关系。在二分子之间发生结合的情况中，试验中"接受"分子标记物的荧光发射应是最大值。通过本领域熟知的标准荧光检测装置(例如，使用荧光计)可常规检测FET结合情况。在一些实施方式中，可采用实时生物分子相互作用分析(BIA)(例如，Sjolander等，1991，Anal.Chem.，63:2338-2345和Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.，5:699-705)测定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白与靶分子(例如，血纤蛋白原、纤连蛋白或胶原多肽或其片段)结合的能力。"表面等离振子共振"或"BIA"能实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物(例如，BIAcore)。结合后表面质量的改变(表明结合事件)导致该表面附近光的折射率改变(表面等离振子共振(SPR)的光学现像)，从而产生可用作生物分子之间的实时反应标志的可检测信号。在一些实施方式中，将靶基因产物或测试物质锚定在固相上。检测反应结束时锚定在固相上的靶基因产物/测试化合物复合物。可将靶基因产物锚定在固体表面，可用本文所述的可检测标记物直接或间接标记未锚定的测试化合物。可采用蛋白质微阵列技术将多种靶基因产物锚定在固相上，所述技术的名称还有蛋白质芯片技术和固相蛋白质阵列技术。本领域普通技术人员熟知蛋白质微阵列技术，这些技术依据(但不限于)在固定的基材上获得经鉴定肽或蛋白质的阵列，使靶分子或生物学成分与这些肽结合，评估这种结合。参见，例如G.MacBeath和S.L.Schreiber，"将蛋白质印刷成微阵列以进行高通量功能测定"(PrintingProteinsasMicroarraysforHigh-ThroughputFunctionDetermination),Science289(5485):1760-1763，2000。微阵列基材包括但不限于玻璃、二氧化硅、铝硅酸盐、硼硅酸盐、金属氧化物，例如氧化铝和氧化镍，各种粘土、硝酸纤维素或尼龙。可用化合物涂布微阵列基材以促进在基材上合成探针(例如，肽)。可利用偶联剂或基材上的基团将第一氨基酸共价连接于基材。本领域技术人员已知各种偶联剂或基团。可将肽探针直接合成在基材上预定的栅格中。或者，可将肽探针点样在基材上，在这种情况中，可用化合物涂布基材以促进探针与基材的结合。在这些实施方式中，以精确的预定体积和栅格的模式将预先合成的探针施加于基材，优选利用计算机控制的机器人以接触印刷(contact-printing)方式或非接触印刷方式，例如喷墨或压电递送将探针施加于基材。可将探针共价连接于基材。在一些实施方式中，一种或多种对照肽或蛋白质分子粘附于基材，对照肽或蛋白质分子能测定例如肽或蛋白质质量和结合特征，试剂质量和效力，杂交成功(率)及分析阈值和成功(率)等因素。在一些实施方式中，优选固定革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白，抗菌毛或菌毛蛋白的抗体，或革兰氏阳性菌毛结合蛋白(例如，抗体)以促进形成复合物的与未形成复合物的一种或多种蛋白质的分离，以及适应试验的自动化。测试化合物与革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的结合，或在候选化合物存在或不存在下革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白与靶分子的相互作用可以在任何适合含有反应物的容器中进行。这些容器的例子包括微量滴定板，试管和微量离心管。在一个实施方式中，可以提供融合蛋白，将其加入结构域从而能将所述蛋白质的一种或两种结合于基质。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/菌毛蛋白的融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到密苏里州圣路易斯市西格玛化学品公司的谷胱甘肽SepharoseTM珠上(SigmaChemical,St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后使之与测试化合物混合或与测试化合物和未吸附的靶蛋白或革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白混合，在有助于复合物形成的条件下(例如，生理条件的盐和pH)培育混合物。培育后，洗涤这些珠或微量滴定板孔以除去未结合的组分，固定基质(在珠的情况中)，如上所述直接或间接测定复合物。或者，可将复合物与基质解离，采用标准技术测定革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白结合或活性的水平。将革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或结合靶标固定在基质上的其它技术包括采用生物素和链霉亲和素的偶联。可采用本领域已知的技术(例如，伊利诺斯州罗克福德市皮尔斯化学品公司(PierceChemicals,Rockford，IL)的生物素化试剂盒)，从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或靶分子，将其固定在包被链霉亲和素的96孔板上(皮尔斯化学品公司)。为进行这种试验，将未固定的组分加入含有锚定组分的包被表面。反应完成后，在能将形成的任何复合物维持固定在固体表面上的条件下除去(例如，通过洗涤)未反应组分。可采用多种方法检测锚定在固体表面上的复合物。如果以前未固定的组分已被预先标记，则检测到固定在表面的标记物表明复合物形成。如果以前未固定的组分未被预先标记，可利用间接标记物检测锚定在表面的复合物；例如利用固定组分的特异性标记抗体(进而能用，例如标记的抗-Ig抗体直接标记或间接标记该抗体)。在一些实施方式中，利用与革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白或结合靶标特异性结合，但不干扰革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白与其靶标结合的抗体实施该试验。可将这些抗体衍生后固定到平板的各孔上，未结合的靶标或革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白通过抗体偶联而截留在各孔中。除上述GST-固定复合物的那些检测方法外，检测这些复合物的方法包括利用革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或靶分子的反应性抗体免疫检测复合物，以及依赖检测革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白或耙分子相关酶活性的酶联试验。在一些实施方式中，可在液相中进行无细胞试验。在这种试验中，可通过各种标准技术分开反应产物与未反应的组分，所述技术包括但不限于差速离心(例如，Rivas等，1993，TrendsBiochem.Sci.，18:284-287);层析(凝胶过滤层析、离子交换层析)；电泳(例如，Ausubel等编，，1999，《分子生物学最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),J.W公司(J.Wiley):纽约)；和免疫沉淀(例如，Ausubel等编，1999，《分子生物学最新方法》，J.W公司纽约)。本领域技术人员已知这些树脂和层析技术(例如，Heegaard，1998，J.Mol.Recognit，11:141-148禾口Hage等，1997，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699:499-525)。此夕卜，还可方便地采用本文所述的荧光能量转移来检测结合情况而无需从溶液中进一步纯化复合物。在一些实施方式中，所述试验包括使革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白或其生物学活性部分与结合革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白的已知细胞或化合物(例如，蛋白质)接触以形成试验混合物，使该试验混合物与测试化合物接触，测定该测试化合物影响革兰氏阳性菌毛或革兰氏阳性菌毛蛋白与该细胞或化合物结合的能力。在一些实施方式中，表达肺炎链球菌菌毛的细菌细胞的结合试验包括培育表达肺炎链球菌菌毛的细菌细胞与A549肺上皮细胞，洗涤以除去未粘附的细菌细胞后，检测粘附的细菌细胞。可通过本领域已知的任何方法，例如检测抗体与粘附细菌细胞的结合情况或裂解上皮细胞，计数相关细菌细胞的数目来检测细菌的粘附情况。HEP2细胞、CHO细胞或HeLa细胞也可用于表达肺炎链球菌菌毛的细菌细胞结合试验中。免疫原性组合物包含革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛的本发明免疫原性组合物还可包含一种或多种抗原性试剂。示范性抗原包括下述那些。此外，可用本发明组合物治疗或预防任何下述微生物或相关微生物所致的感染。用于免疫原性组合物的抗原包括但不限于以下所列的一种或多种，或衍生自以下所列一种或多种的抗原—輔微脑膜炎奈瑟球菌(W.mem'"gZ"cfes):脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135、Y和/或B(l-7)的蛋白质抗原；脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制品(8、9、10、11);脑膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、W135和/或Y的糖抗原，包括LPS，例如血清群C的寡糖(参见，PCT/US99/09346;PCTIB98/01665;和PCTIB99/00103);肺炎链球菌糖或蛋白质抗原，特别是肺炎链球菌的糖或PhtD的蛋白质或抗原性肽(BVH-ll-2，SP1003，spr0907)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtE(BVH-3，SP1004，spr0908)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtB(PhpA，BVH-ll，SP1174,sprl060)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtA(BVH-ll-3，SP1175,sprl061)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Wizemann等，Infect.Immun.，69:1593-98，2001;Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);NanA(SP1693,sprl536)(Tong等，Infect.Immun.，73:7775-78，2005);SP1872(sprl687)(Brown等，Infect.Immun,，69:6702-06，2001);PspC(CbpA，SP21卯，sprl995KOgunniyi等，Infect.Immun.，69:5997-6003，2001);PspA(SP0177,spr0121，spr1274)(Briles等，Vaccine,19:S87-S95，2001);SP0498(spr0440);LytB(SP0965，spr0867)(Wizemann等，Infect.Immun.，69:1593-98，2001);AliB(SP1527，sprl382);PpmA(SP0981，spr0884)(Overweg等，Infect.Immun.，68:4180-4188，2000);LytC(SP1573，sprl431)(Wizemann等，Infect.Immun.,69:1593-98，2001);PsaA(Briles等，Vaccine,19:S87-S95，2001);PdB(Ogunniyi等，Infect.Immun.，69:5997-6003，2001);RPhp(Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001);PiuA(Jomaa等，Vaccine,24:5133-39，2006);PiaA(Jomaa等，Vaccine,24:5133-39,2006);6PGD(Daniely等，Clin.Exp.Immunol.,144:254-263，2006);或PppA(Green等，Infect.Immun.，73:981-89，2005);无乳链球菌特别是B群链球菌抗原；酿脓链球菌特别是A群链球菌抗原；粪肠球菌或屎肠球菌特别是美国专利号6,756,361提供的三糖重复或其它肠球菌衍生抗原；幽门螺杆菌包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原；百日咳博德特菌(50^^&/&;eWMM/力例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选还与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3抗原混合；金黄色葡萄球菌包括任选与无毒重组铜绿假单胞菌(i^e^/omo"w。w"g/m^0外毒素A偶联的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，例如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白质的抗原，侵染素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)，抑制吞噬细胞吞噬作用的表面因子(荚膜，A蛋白)，类胡萝卜素，过氧化氢酶产生，A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核细胞膜的膜破坏性毒素(任选脱毒的)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)；表皮葡萄球菌特别是表皮葡萄球菌黏液相关抗原(SAA);腐生性葡萄球菌(Sto//y^ococcwm/^o;/^/cw力(导致尿道感染)特别是腐生性葡萄球菌抗原的160kDa血凝素；铜绿假单胞菌特别是内毒素A、Wzz蛋白、铜绿假单胞菌LPS、更尤其是从PAOl(05血清型)分离的LPS;和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(InfectImmun.2001年5月；69(5):3510-3515);炭疽杆菌(5flc/〃wa"Amc/"(炭疽)例如A-组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))的炭疽杆菌抗原(任选脱毒的)，二者可以共有称为保护性抗原(PA)的B-组分；粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃acaf^t/za//":(呼吸道)包括外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS;鼠疫耶尔森菌(7e"/"/apw他)(鼠疫)例如Fl荚膜抗原(InfectImmun.，2003年1月；71(1):374-383)，LPS(InfectImmun.1999年10月；67(10):5395)，鼠疫耶尔森菌V抗原(InfectImmun.1997年11月;65(11):4476-4482);小肠结肠炎耶尔森菌(ye"/m'fle"^oco/Z"ca)(胃肠病原体)特别是LPS(InfectImmun.2002年8月；70(8):4414);假结核耶尔森菌(7e"/m'a/wewflfo^6ercw/ow'力胃肠病原体抗原；结核分枝杆菌(M;/co6a"e/^m化6en:w/ow力例如脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任选配制在阳离子脂质载体中(InfectImmun,2004年10月;72(10):6148)，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(ProcNatlAcadSciUSA.2004年8月24日；101(34):12652)，和/或MPT51抗原(InfectImmun.2004年7月；72(7):3829);嗜肺性军团病杆菌(丄^/0^//";7"e,o;Ma)(军团病)嗜肺性军团病杆菌抗原-任选衍生自含破坏的osc/基因的细胞系(InfectImmun.1998年5月；66(5):1898);立克次体(//cA:eto/a):包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(BiochimBiophysActa.2004年11月1日；1702(2):145)，LPS和表面蛋白抗原(SPA)(JAutoimmun.1989年6月；2增刊:81);大肠杆菌(五.包括肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散性粘附性大肠杆菌(diffuselyadheringE.coli)(DAEC)、肠病原性(enter叩athogenic)大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性(enterohemorrhagic)大肠杆菌(EHEC)的抗原；霍乱弧菌(^n'oc/zo/erae):包括蛋白酶抗原，LPS,特别是霍乱弧菌II的脂多糖，01InabaO-特异性多糖，霍乱弧菌0139，IEM108疫苗的抗原(InfectImmun.2003年10月;71(10):5498-504)和/或紧密连接毒素(Zot);伤寒沙门菌(^^0"6/^0^"')(伤寒热)包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，即vax-TyVi);鼠伤寒沙门菌0^/附0恥//"(胃肠炎)从其衍生的抗原考虑可用于微生物和癌症治疗，包括flk的血管生成抑制和调节；单核细胞增多性利斯特菌("We〃'awo"oc^oge"e力(免疫受损或老年人中的全身性感染，胎儿感染)衍生自单核细胞增多性利斯特菌的抗原优选用作运胞质内递送本发明偶联物/缔合组合物的载体/载体；牙龈卟啉单孢菌(尸o^/^omowwg/"g/vafc):特别是牙龈卟啉单孢菌外膜蛋白(OMP);破伤风例如破伤风类毒素(TT)抗原，优选用作结合/偶联本发明组合物的运载体蛋白；白喉例如白喉类毒素(如CRMm)，此外考虑将能调节、抑制ADP核糖基化或与之结合的抗原与本发明组合物联用/共同给药/偶联，所述白喉类毒素可用作运载体蛋白；博氏疏螺旋体CSo厅e/Z"6w^/or/en')(莱姆病)例如P39和P13(膜内在蛋白，InfectImmun.2001年5月；69(5):3323-3334)，VisE抗原性变异蛋白质(J.Clin.Microbiol.1999年12月；37(12):3997)的相关抗原；乙型流感嗜血杆菌(/Zflewo;/zz7w/"y/we"zae):例如其糖抗原；克雷伯菌(尺/e6wW/fl):例如OMP，包括OMPA，或任选与破伤风类毒素偶联的多糖；淋病奈瑟球菌(7Ve&^r/ago"o^r/zoeae):包括Por(或膜通道蛋白)蛋白，例如PorB(参见Zhu等，Vaccine(2004)22:660-669)，转移结合蛋白，例如TbpA和TbpB(参见Price等，InfectionandImmunity(2004)71(1):277誦283)，混浊蛋白(例如Opa)，可还原修饰的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(参见Plante等，JInfectiousDisease(2000)182:848-855)，还可参见，例如W099/24578,W099/36544,WO99/57280,WO02/079243);肺炎衣原体(C7^m;^/a/wewmom'ae):特别是肺炎衣原体蛋白抗原；砂眼衣原体(C/z/am;^afrac/wwa^):包括衍生自血清型A、B、Ba和C(砂眼致病因子，致盲的原因)，血清型L!、L2和L3(与性病淋巴肉芽肿(Z^m;AogAYmw/owflfve"erewm)有关)禾口血清型D-K的抗原；苍白密螺旋体(7V印o"ewapa〃/^m)(梅毒)特别是TmpA抗原；和杜克雷嗜血杆菌(Z/aemo;Mw^c^y/)(导致软性下疳)包括外膜蛋白(DsrA)。如果未专门述及，本发明的其它细菌抗原可以是任何上述的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白质抗原。其它细菌抗原还可以包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、减毒的和/或纯化的任何上述细菌。本发明的细菌或微生物衍生抗原可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性的以及需氧或厌氧的。此外，任何上述细菌衍生的糖(多糖，LPS、LOS或寡糖)可以偶联于另一物质或抗原，例如运载体蛋白(如，CRM197)。这种偶联可以是通过还原胺化糖上的羰基部分而实现与蛋白质上的氨基直接偶联，例如美国专利号5,360,897和Ca"J5/oc/zemCe〃SZo/.1984年5月；62(5):270-5中所述。或者，糖可以经接头，例如琥珀酰胺或《生物偶联技术》(BioconjugateTechniques),1996和CRC，《蛋白质偶联和交联化学》(ChemistryofProteinConjugationandCross-Linking),1993中提供的其它连接键偶联。疯毒贫嚴流感病毒(/"/"e"Zfl):包括完整的病毒颗粒(减毒的)、裂解的或含有血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)表面蛋白的亚单位，流感抗原可以衍生自鸡胚或用细胞培养物增殖，和/或流感抗原衍生自甲、乙和/或丙型流感(病毒)，等等；呼吸道合胞体病毒(RSV):包括RSV的A2毒株的F蛋白(JGenVirol.2004年ll月；85(11部分):3229)和/或G糖蛋白；副流感病毒CParaf"y7wewzawVtw)(PIV):包括1、2和3型PIV，优选含有血凝素、神经氨酸酶和/或融合糖蛋白；脊髓灰质炎病毒(/>0//0^>7):包括小RNA病毒科的抗原，优选脊髓灰质炎病毒抗原，例如OPV，或优选IPV;麻疹病毒(Afe似/w):包括任选与Protollin混合的裂解麻疹病毒(MV)抗原和/或MMR疫苗中存在的抗原；腮腺炎病毒(Mwm/w):包括MMR疫苗中存在的抗原；风疹病毒(7^^//。)包括MMR疫苗中存在的抗原以及登革热病毒在内的披膜病毒科(rogav/nWae)的其它抗原；狂犬病病毒(/aW"):例如冻干的灭活病毒(RabAvertTM);黄病毒科病毒(F/flv/wWcfeev/nwes):例如(和从中衍生的抗原)黄热病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒(l、2、3或4型)、蜱传脑炎病毒和西尼罗病毒；杯状病毒科(<^//(^>油6):其抗原；HIV:包括HIV-1或HIV-2毒株抗原，例如gag(p24gag和p55gag)、env(gpl60禾口gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、小蛋白(miniprotein)(优选p55gag和gpl40v缺失)和分离株HIVmb、HIVSF2、HIVLAV、HIVlav、HIV固、HIV-1CM235、HIV-1US4、HIV-2;猿免疫缺陷病毒(STV)等的抗原；轮状病毒(7otov/ms):包括VP4、VP5、VP6、VP7、VP8蛋白(ProteinExprPurif.2004年12月；38(2):205)和/或NSP4;鼠疫病毒(尸eW/v/ri^):例如经典猪热病毒(classicalporcinefevervirus)、牛病毒性腹泻病毒和/或边境病病毒的抗原；细小病毒(尸arvov/rws):例如细小病毒B19;冠状病毒(CorwwWn^):包括SARS病毒抗原，特别是其刺突蛋白或蛋白酶，以及WO04/92360所包括的抗原；甲型肝炎病毒例如灭活的病毒；乙型肝炎病毒例如表面禾n/或核心抗原(sAg)以及前表面序列(presurfacesequences),pre-Sl和pre-S2(以前称为pre-S)，以及上述的组合，例如sAg/pre-Sl、sAg/pre-S2、sAg/pre-Sl/pre-S2禾卩pre-Sl/pre-S2，(参见，例如AHBV《疫苗-人疫苗和疫苗接种》(Vaccines-HumanVaccinesandVaccination),第159-176页；和美国专利号4,722,840，5,098,704，5,324,513;Beames等，J.Virol.(1995)69:6833-6838;Birabaum等，J.Virol(1990)64:3319-3330;禾BZhou等，J.Virol.(1991)65:5457-5464);丙型肝炎病毒例如E1、E2、E1/E2(参见Houghton等，Hepatology(1991)14:381)、NS345多蛋白、NS345-核心多蛋白、核心、和/或非结构区的肽(国际公布号WO89/04669;WO90/11089和WO90/14436);丁型肝炎病毒(HDV):其衍生的抗原，特别是HDV的S抗原(参见，例如美国专利号5,378,814);戊型肝炎病毒(HEV):其衍生的抗原；己型肝炎病毒(HepatitisGvirus)(HGV):其衍生的抗原；水痘带状疱疹病毒(Farc/ce〃azoWerWn^):衍生自水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗原(J.Gen.Virol(1986)67:1759);E-B病毒衍生自EBV的抗原(Baer等，Nature(1984)310:207);巨细胞病毒CMV抗原，包括gB和gH(《巨细胞病毒》(Cytomegaloviruses)(J.K.McDougall编，S-V公司(Springer-Verlag)，1990)第125-169页)；单纯疱疹病毒包括HSV-1或HSV-2毒株的抗原和糖蛋白gB、gD和gH(McGeoch等，J.Gen.Virol.(1988)69:1531和美国专利号5，171，568);人疱疹病毒衍生自其它人疱疹病毒，例如HHV6和HHV7的抗原；和HPV:包括人乳头瘤病毒(HPV)相关的或衍生的抗原，例如E1-E7、Ll、L2及其融合物中一种或多种，特别是本发明的组合物可包含病毒样颗粒(VLP)，该颗粒含有L1主要衣壳蛋白，更具体地说，HPV抗原具有抗HPV血清型6、11、16和/或18中一种或多种的保护作.用。还提供了包括在《疫苗》(Vaccines),第4版(Plotkin和Orenstein编，2004);《医学微生物》(MedicalMicrobiology),第4版(Murray等编，2002);《病毒学》(Virology),第3版(W.K.Joklik编，1988);《基础病毒学》(FundamentalVirology),第2版(B.N.Fields和D.M,Knipe编，1991)中的抗原、组合物、方法和微生物，考虑可将它们与本发明组合物联用。此外，抗原包括活的、减毒的、裂解的和/或纯化的任何上述病毒。凝綠本文所用的与疫苗相结合的真菌抗原包括以下文献所述的那些抗原美国专利号4,229,434和4,368,191，用于预防和治疗须发癣菌(7Wc/zop/^o"me"togro;/z;;^s)所致的毛癣菌病(trich叩ytosis);美国专利号5,277,904和5,284,652，用于预防动物，例如豚鼠、猫、家兔、马和羊羔中皮肤真菌感染的广谱皮肤真菌疫苗，这些抗原包含有效量的杀伤马发癣菌(r.e《m>n^)、须发癣菌(颗粒状变种(var.granulare))、犬小孢子菌(Mc朋/"和/或石膏样小孢子菌(Mgy;wewn)的混悬液，其任选与佐剂混合；美国专利号5,453,273和6,132,733，用于包含有效量的均质、甲醛杀伤真菌的癣疫苗，即运载体培养的犬小孢子菌培养物；美国专利号5,948,413，其包括用于腐霉病(pythiosis)的胞外和胞内蛋白质。抗真菌疫苗中鉴定的其它抗原包括RingvacbovisLTF-130禾卩Bioveta。此外，本文所用的真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括絮状表皮癣菌(五/^Wermo/一owyoccz^s騰)、头癣小孢子菌(M/cms770r讓flwdoM/"/)、犬小孢子菌、扭曲小孢子.菌(Af/cro57oramcfc/oWwm)、马小孢子菌(M"/crc^/orwme,'"膽)、石膏样小孢子菌、矮小孢子菌(M'CT05/7W謂Wfif"謂)、同心发癣菌(7Wc/zo//z,wco"ce"Wc)、马发癣菌、鸡发癣菌(7Wc/zop一owga〃/朋e)、石膏样发癣菌(7Wc/20//^to"gy;wew附)、麦格发癣菌(7Wc/o//y^o"附eg"/"/)、须发癣菌、昆克努发癣菌(7Wc/zo;/^^w《w/wcA;eflwwm)、红色发癣菌(7Wc/zo/一own/6nw2)、舍恩莱发癣菌(JWc/zo/一o"5r/oew/e〖"/)、断发癣菌(7Wc/20/7一ow加swra朋)、疣状发癣菌(7Wc/op一owvem/C(W,)、疣状发癣菌album变禾中(var.album)、discoides变禾中(var.discoides)、ochraceum变禾中(var.ochraceum)、堇色发癣菌(7Wc/zo/A^owv/otoceww)和/或蜜块状发癣菌可用作抗原或可获得抗原与本发明组合物联用的真菌病原体包括烟曲霉(J5/erg/〃ws/扁/g齒s)、黄曲霉(A;erg〃/M、黑曲霉045/erg〃/"51m'ger)、构巢曲霉(v45^erg〃/w51m'c^/fl/w)、土曲霉(^5/erg/〃wj1fe^reiw)、聚多g/flwciw)、头状芽生裂殖酵母C8/oytoyc/z/zcwy;cescap"fl^s)、白色念珠菌(Omc/Waa/6/ca"s)、烯醇酶假丝酵母(Omc/Waewo/awe)、热带念珠菌(Ca"&Wa^"op/c"/")、光滑念珠菌(Ca"c/Wflg7o6n3M)、克鲁斯念珠菌(Ca"力WaArww/)、近平滑念珠菌(C""d油戸a戶7肌'力、类星形念珠菌(Cfl"<^/a他〃a加Wea)、克鲁斯念珠菌、(Ca"J油戸raA^se/)、葡萄牙念珠菌(Ca"c/油/wwY薩'fle)、假热带念珠(Om力Wa戸ew^/o^o;/cato)、吉利蒙德念珠菌(am&Wag"〃//ermom//)、卡里翁分支孢子菌(C7ado5^on'謹c"m'om7)、茅且球孢子菌(Cocc/cZ/ofcfey/mm〖"s)、皮炎芽生菌CS/asomycesi/^vna"d/s)、新型^^球菌(Oj/^ococcwsweo/brwa;w)、棒地霉(GeoWc/zwmc/av她m)、夹膜组织胞浆菌(历s鄉/fljwaca/ww/C訓)、巴西芽生菌CPfln3coccWo/i/"6m57'/,e肌'51)、卡氏月市囊虫(尸wewwocjAS"scaWm7)、(尸j^/z/wmw/"wW/cwmw)、瓶形酵母(尸;Xvro5^o;-"wova/e)、酉良酒酵母OSac/wromycescerev/犯e)、布,立第酵母菌(iSacc/zai-omycesZ)ow/aW,)、粟酒裂殖酵母(Sacc/^om戸s;owZe)、尖端赛多孢子菌(Sce^w;on'wmap/(w/erwm)、申克(氏)孢子丝菌(SporoAWxsc/ze"ch7)、白色毛抱子菌(7Wc/7cw/7orow6e/ge/")、鼠弓形体(7bxo//a，ago"A7)、马尼弗(氏)青霉菌(尸6"/"'〃/"附marwej^e0、鳞梦王霉属(Malasseziaspp.)、产色芽生菌属(Fonsecaeaspp.)、万吉拉菌属(Wangiellaspp.)、孢子丝菌属(Sporothrixspp.)、担子菌团属(Basidiobolusspp.)、耳霉属(Conidiobolusspp.)、根霉菌属(Rhizopusspp)、毛霉属(Mucorspp)、犁头霉属(Absidiaspp)、被孢霉属(Mortierellaspp)、小克银汉霉属(Cunninghamellaspp)禾口瓶霉属(Saksenaeaspp)。可获得抗原的其它真菌包括链格孢属(Alternariaspp)、弯孢霉属(Curvulariaspp)、长蠕孢属(Helminthosporiumspp)、镰孢菌属(Fusariumspp)、曲霉菌属(Aspergillusspp)、青霉菌属(Penicilliumspp)、褐腐病菌属(Monoliniaspp)、丝核菌属(Rhizoctoniaspp)、拟青霉属(Paecilomycesspp)、皮司霉属(Pithomycesspp)禾口分支孢子菌属(Cladosporiumspp)。本领域熟知制备真菌抗原的方法(参见美国专利号6,333,164)。在一些实施方式中，提取溶解组分，将其与真菌细胞的不可溶组分分开，其中基本上除去或至少部分除去了细胞壁，该方法的特征在于包括获得活的真菌细胞；获得基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；使基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞破裂；获得不可溶组分；和提取溶解的组分并将其与不可溶组分分开。即拔嚴在一些实施方式中，可实施本发明组合物和方法以抵御的微生物(细菌、病毒和/或真菌)包括导致性传播疾病(STD)的那些和/或在其表面展示抗原的那些微生物，所述抗原可以是本发明的靶标或抗原组合物。在一些实施方式中，组合物可与衍生自病毒或细菌STD的抗原混合。可将衍生自细菌或病毒的抗原与本发明组合物联合给予以提供抵御以下STD中至少一种的保护作用衣原体、生殖器疱疹、肝炎(特别是HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软性下疳(参见，例如WO00/15255)。在一些实施方式中，本发明的组合物与抗原共同给予以预防或治疗STD。衍生自上文详述的以下STD相关病毒的抗原与本发明组合物共同给予肝炎(病毒)(特别是HCV)、HPV、HIV或HSV。此外，衍生自上文详述的以下STD相关细菌的抗原与本发明组合物共同给予淋病奈瑟球菌、肺炎衣原体(C/z/amj^/ap"ewmo"/ae)、砂眼衣原体、苍白密螺旋体或杜克雷嗜血杆菌。呼吸道抗原在一些实施方式中，革兰氏阳性(例如肺炎链球菌)菌毛抗原是呼吸道抗原，其可用于预防和/或治疗呼吸道病原体所致感染，特别是通过降低或防止感染和/或呼吸道病毒感染的一种或多种症状来预防和/或治疗的免疫原性组合物中，所述病原体包括病毒、细菌或真菌，例如呼吸道合胞体病毒(RSV)、PIV、SARS病毒、流感(病毒)、炭疽杆菌。包含本文所述抗原(例如衍生自呼吸道病毒、细菌或真菌的抗原)的组合物可与本发明组合物联合给予具有接触特定呼吸道微生物危险或感染了呼吸道病毒、细菌或真菌的个体。可将本发明组合物与呼吸道病原体的抗原在同一时间或同一制剂中共同给予。给予组合物导致呼吸道感染的发病率和/或一种或多种症状的严重程度降低。儿科/老年人抗原在一些实施方式中，本发明的组合物可与一种或多种治疗儿科人群的抗原，例如儿科抗原联用。在一些实施方式中，儿科人群中对象的年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。在一些实施方式中，儿科抗原(与本发明组合物联用)在至少l、2或3年间给予多次。在一些实施方式中，本发明组合物可与一种或多种治疗老年人群的抗原，例如老年人抗原联用。在一些实施方式中，老年人群中对象的年龄大于50、55、60、65、70或75岁。將微可与本发明组合物联用的其它抗原包括医院获得性(医院的)相关抗原。在一些实施方式中，考虑联用寄生虫抗原与本发明组合物。寄生虫抗原的例子包括衍生自致病(包括但不限于疟疾和/或莱姆病)生物的那些抗原。在一些实施方式中，可与本发明组合物联用的抗原与蚊子传播的疾病有关和/或能有效抵御该疾病。在一些实施方式中，可与本发明组合物联用的抗原与脑炎有关和/或能有效抵御脑炎。在一些实施方式中，可与本发明组合物联用的抗原与神经系统感染有关和/或能有效抵御神经系统感染。在一些实施方式中，可与本发明组合物联用的抗原是可经血液或体液传播的抗原。微娜本发明的一些方面提供制备吸附抗原的微粒的方法。该方法包括(a)将含有以下成分的混合物分散来提供乳液(i)水，(ii)洗漆剂，(iii)有机溶剂和(iv)生物可降解的聚合物，所述聚合物选自聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。与有机溶剂相比，混合物中存在的所述聚合物浓度通常约1%-约30%，而根据洗涤剂-聚合物的重量比，混合物中存在的洗涤剂通常约为O.OOOOl:l-约0.1:1(更常见是约0.0001:1-约0.1:1，约O.OOl:l-约0.1:1，或约0扁:l-约0.1:1);(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)将抗原吸附到微粒表面。在一些实施方式中，与有机溶剂相比，所述生物可降解聚合物的存在浓度是约3%-约10%。在一些实施方式中，可以用可灭菌、无毒和生物可降解的材料制备本文所用的微粒。这些材料包括但不限于聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。在一些实施方式中，本发明所用的微粒可源自聚(a-羟酸)，特别是聚(丙交酯)("PLA")或D,L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)("PLG"或"PLGA")或D,L-丙交酯和己内酯的共聚物。微粒可源自分子量不同的任何聚合起始材料，以共聚物，例如PLG为例，各种丙交酯:乙交酯的比例(其选择在很大程度上是个选择问题)部分取决于共同给予的大分子。下文将更详细地讨论这些参数。其它抗原还包括外膜囊泡(OMV)制品。还可将抗原吸附到各种革兰氏阳性细菌的肽聚糖上以制备革兰氏阳性增强基质(GEM)颗粒，如Bosma等(Appl.Env.Microbiol.，72:880-889，2006)所述，该篇文献的内容全文纳入本文以供参考。该方法依赖于将LysM基序(Buist等，J.Bact.，177:1554-63，1995;Bateman和Bycroft，J.MoI.Biol.，299:1113-19，2000)非共价结合于酸处理细胞的细胞壁肽聚糖。简言之，将与一个或多个LysM基序相连的多肽抗原(例如，非共价或共价相连，如作为融合蛋白或通过偶联)加入酸处理的革兰氏阳性细菌。抗原肽以高亲和力结合，其可用于免疫原性组合物中。这些方法所用的示范性酸包括三氯乙酸(例如，0.1%-10%)、乙酸(例如，5.6M)、HC1(例如，0.01M)、乳酸(例如，0.72M)和甲酸(例如，0.56M)。美国专利序列号09/581,772提供了其它配制方法和抗原(特别是肿瘤抗原)。贫嚴参考以下参考文献包括可与本发明组合物联用的抗原，这些参考文献各自专门全文纳入以供参考国际专利申请W099/24578国际专利申请W099/36544.国际专利申请WO99/57280.国际专利申请WO00/22430.Tettelin等，(2000)Science287:1809-1815.国际专利申请W096/29412.Pizza等，(2000)Science287:1816-1820.PCTWO01/52885.Bjune等，(1991)Lancet338(8775).Fuskasawa等，(1999)Vaccine17:2951-2958.Rosenqist等，(1998)Dev.Biol.Strand92:323-333.Costantino等，(1992)Vaccine10:691-698.Costantino等，(1999)Vaccine17:1251-1263.Watson(2000)PediatrInfectDisJ19:331-332.Rubin(20000)PediatrClinNorthAm47:269-285，v.Jedrzejas(2001)MicrobiolMolBiolRev65:187-207.2001年7月3日提交的国际专利申请，要求GB0016363.4;WO02/02606;PCTIB/01/00166的优先权.Kalman等，(1999)NatureGenetics21:385-389.Read等，(2000)NucleicAcidsRes28:1397-406.Shirai等，(2000)J.Infect.Dis181(增刊3):S524-S527.国际专利申请WO99/27105.国际专利申请WO00/27994.国际专利申请WO00/37494.国际专利申请W099/28475.Bell(2000)PediatrInfectDisJ19:1187-1188.Iwarson(1995)APMIS103:321-326.Gerlich等，(1990)Vaccine8增刊:S63-68和79-80.Hsu等，(1999)ClinLiverDis3:卯1-915Gastofsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334-:349-355.Rappuoli等，(1991)TIBTECH9:232-238.《疫苗》(Vaccines)(1988)Plotkin和Mortimer编,ISBN0-7216-1946-0,DelGuidice等，(1998)MolecularAspectsofMedicine19:1-70.国际专利申请WO93/018150.国际专利申请WO99/53310.国际专利申请WO98/04702.Ross等，(2001)Vaccine19:135-142.Sutter等，(2000)PediatrClinNorthAm47:287-308.Zimmerman和Spann(1999)AmFanPhysician59:113-118，125-126.Dreensen(1997)Vaccine15增刊"S2-6.MMWRMorbMortalWHyrep1998年1月16:47(1):12，9.McMichae1(2000)Vaccine19增刊I:SIO1-107.Schuchat(1999)Lancet353(9146):51-6.英国专利申请0026333.5，0028727.6和0105640.7.Dale(1999)InfectDisclinNorthAm13:227-43，viii.Ferretti等，(2001)PNASUSA98:4658-4663.Kuroda等，(2001)Lancet357(9264):1225-1240;还参见第1218-1219页.Ramsay等，(2001)Lancet357(9251):195-196.Lindberg(1999)Vaccine17增刊2:S28-36.Buttery禾口Moxon(2000)JRCoilPhysiciansLong34:163-168.Ahmad和Chapnick(1999)InfectDisClinNorthAm13:113-133，vii.Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:663-567.欧洲专利0477508.美国专利号5,306,492.国际专利申请W098/42721.《偶联疫苗》(ConjugateVaccines)(Cruse等编)ISBN3805549326，特别是第10:48-114巻.Hermanson(1996)《生物偶联技术》(BioconjugateTechniques)ISBN:012323368和012342335X.欧洲专利申请0372501.欧洲专利申请0378881.欧洲专利申请0427347.国际专利申请W093/17712.国际专利申请W098/58668.欧洲专利申请0471177.国际专利申请WOOO/56360.国际专利申请WO00/67161.融合蛋白本发明所用的革兰氏-阳性(例如，肺炎链球菌)蛋白在组合物中可作为单独分开的多肽存在。在一些实施方式中，这些抗原的至少两种(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种)表达为含菌毛亚单位的一条多肽链("杂交"或"融合"多肽)。这些融合多肽主要提供两个优点第一，本身不稳定或表达不佳的多肽可通过加入合适的融合伴侣而克服这些问题；第二，由于只需进行一次表达和纯化即可产生均可用作抗原的两种多肽，从而简化了商品化生产。融合多肽可含有一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的一种或多种融合肽，其中所述第一和第二氨基酸序列选自革兰氏阳性菌毛蛋白或其片段。在一些实施方式中，融合多肽中的第一和第二氨基酸序列包含同一蛋白质的不同表位。在一些实施方式中，本发明提供含有两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种抗原的氨基酸序列的杂交体(或融合体)。在一些实施方式中，本发明提供包含两种、三种、四种或五种抗原的氨基酸序列的杂交体。可将不同的杂交多肽一起混合在一种制剂中。在这些组合中，革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛序列可以存在于多种杂交多肽中和/或以非杂交多肽存在。在一些实施方式中，抗原可以杂交体或非杂交体存在，但二者不能同时存在。杂交多肽可如式NH2-A+X-L-^-B-COOH所示，其中X是革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛蛋白或其片段的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N-末端氨基酸序列；B是任选的C-末端氨基酸序列；和n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。如果-X-部分具有野生型的前导肽序列，其在杂交蛋白中可含有或省去。在一些实施方式中，删除位于杂交蛋白N-末端的-X-部分的前导肽之外的前导肽，即Xi的前导肽得以保留，但省去了X2…Xn的前导肽。这样等于删除所有前导肽而用X,的前导肽作为部分-A-。对于(-X-L-)的各w实例，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，当n=2时，杂交体可以是NH2-X广L广X2-L2-COOH、NH2-X广X2隱COOH、NH2-X广L广X2-COOH、NH2-X广X2-L2-COOH，等等。接头氨基酸序列-l-通常是短序列(例如，20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(g卩，包含Gly。，其中11=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(即，Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员知道其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQIDNO:53),其中Gly-Ser二肽从SamHI限制性位点产生因而有助于克隆和操作，而(Gly)4四肽是典型的聚-甘氨酸接头。在一些实施方式中，-A-是任选的N-末端氨基酸序列。其通常是短序列(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员知道其它合适的N-末端氨基酸序列。在一些实施方式中，如果Xi缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，则-A-是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，含1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。在一些实施方式中，-B-是任选的C-末端氨基酸序列。其通常是短序列(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸标签，即HiSn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或提高蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员知道其它合适的C-末端氨基酸序列。在一些实施方式中，n是2或3。免疫原性组合物和药物在一些实施方式中，本发明组合物是免疫原性组合物。在一些实施方式中，这些组合物是疫苗组合物。在一些实施方式中，这些组合物的pH在6-8之间，在一些实施方式中，pH是约7。可用缓冲液调节pH。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可以是对人等渗的。在一些实施方式中，组合物是无菌可注射的。本发明的疫苗可以是预防性(即，防止感染)或治疗性的(即，治疗感染)。因此，本发明提供在易受革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的动物中治疗性或预防性治疗这种革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的方法，包括给予所述动物治疗或预防量的本发明组合物。例如，本发明包括在易受链球菌感染的动物中治疗性或预防性治疗肺炎链球菌感染的方法，包括给予所述动物治疗或预防量的本发明组合物。本发明还提供将本文所述组合物用作药物的本发明组合物。在一些实施方式中，所述药物能在动物中引发免疫应答(即，其是免疫原性组合物)。在一些实施方式中，所述药物是疫苗。本发明还提供本发明组合物在制备引发哺乳动物免疫应答的药物中的应用。在一些实施方式中，所述药物是疫苗。本发明还提供装有本发明组合物的一个或多个容器的试剂盒。组合物可以是液体形式或可以是冻干的，例如可以是单独的抗原。这些组合物的合适容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器和试管。可用各种材料制成容器，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌端口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内输注溶液袋或小瓶)。组合物可含有第一组分，所述第一组分可含有一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛或菌毛蛋白。在一些实施方式中，革兰氏阳性菌毛或菌毛蛋白是寡聚或超寡聚形式。试剂盒还可装有包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸缓冲盐水、林格液或葡萄糖溶液的第二容器。试剂盒还可装有最终用户可用的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。试剂盒还可装有含另一种活性物质，例如抗生素的第二或第三容器。试剂盒还可装有包装插页，该插页包含诱导抗革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的免疫力或治疗革兰氏阳性细菌感染的书面使用说明书。包装插页可以是未批准的草案包装插页或可以是食品药品管理局(FDA)或其它管理机构批准的包装插页。本发明还提供预填充了本发明免疫原性组合物的递送装置。本发明还提供在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明组合物的步骤。在一些实施方式中，免疫应答是保护性的，而在一些实施方式中，免疫应答包括抗体和/或细胞介导的免疫力。该免疫应答优选诱导持续时间长的(例如，中和性)抗体和对接触一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)抗原快速起反应的细胞介导免疫力。该方法可引起加强应答。本发明提供中和哺乳动物革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染的方法，包括将有效量的本发明免疫原性组合物，本发明疫苗或识别本发明免疫原性组合物的抗体给予该哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。如果疫苗是预防性使用，所述人是男性或女性(发育期(bearingage)儿童或青少年)。或者，所述人是老年人(例如，年龄在50、55、60、65、70或75岁以上)，所述人还可以患有潜在的疾病，例如糖尿病或癌症。在一些实施方式中，所述人是怀孕的女性或老年人。在一些实施方式中，这些应用和方法可用于预防和/或治疗革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)所致疾病。这些组合物对其它链球菌细菌也有效。这些组合物对其它革兰氏阳性细菌也有效。检测治疗性治疗效力的一种方法包括给予一种或多种本发明组合物后监测革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)细菌感染。给予这些组合物后可监测针对本发明组合物中革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)抗原的免疫应答。评估本发明免疫原性组合物中蛋白质组分的免疫原性的一种非限制性方法是重组表达该蛋白质，通过免疫印迹筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明该患者已产生针对所述蛋白质的免疫应答，即该蛋白质是免疫原。还可采用该方法鉴定免疫显性蛋白和/或表位。检测治疗性治疗效力的另一种非限制性方法包括给予本发明组合物后监测革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)的感染。检测预防性治疗效力的一种手段是给予组合物后监测针对本发明组合物中革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)抗原的全身性(例如，监测IgGl和lgG2a的产生水平)和粘膜(例如，监测IgA的产生水平)免疫应答。一般测定免疫接种后但在攻击前革兰氏阳性细菌血清特异性抗体应答。在一些实施方式中，先用体外和体内动物模型评估本发明的疫苗组合物，再给予宿主，例如人。还可将免疫原性组合物(给予)革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)感染攻击的动物模型，例如豚鼠或小鼠来体内测定本发明免疫原性组合物的效力。免疫原性组合物可以衍生自或不衍生自与攻击血清型相同的血清型。在一些实施方式中，免疫原性组合物衍生自与攻击血清型相同的血清型。在一些实施方式中，免疫原性组合物和/或攻击血清型可衍生自革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)血清型。体内效力模型包括但不限于(i)利用人革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)血清型的鼠科感染模型；(ii)鼠科疾病模型，其是利用适应小鼠的革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)菌株(例如在小鼠中特别具有毒力的那些菌株)的鼠科模型；和(iii)利用人革兰氏阳性细菌(例如，肺炎链球菌)分离株的灵长类模型。免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。免疫应答可以是提高的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身性和粘膜免疫应答中的一种或两种。在一些实施方式中，免疫应答是增强的全身和/或粘膜免疫应答。增强的全身和/或粘膜免疫应答体现在TH1和/或TH2免疫应答增强。在一些实施方式中，增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA产生增加。在一些实施方式中，粘膜免疫应答是TH2免疫应答。在一些实施方式中，粘膜免疫应答包括IgA产生增加。活化的TH2细胞增强抗体产生，因此在对胞外感染起反应中有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致IgGl、IgE、IgA和以后保护作用的记忆B细胞产生。TH2免疫应答可包括一种或多种TH2免疫应答相关细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加，或IgGl、IgE、IgA和记忆B细胞的产生增加。在一些实施方式中，增强的TH2免疫应答包括IgGl产生增加。TH1免疫应答可包括CTL增加、一种或多种TH1免疫应答相关细胞因子(例如，IL-2、IFNy和TNFP)增加、活化巨噬细胞增加、NK活性增加或IgG2产生增加中的一种或多种。在一些实施方式中，增强的TH1免疫应答包括IgG2产生增加。具体地说，可单用含有一种或多种本发明革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛抗原的本发明免疫原性组合物，或与能引发Thl和/或Th2应答的其它抗原和任选的免疫调节剂联用。本发明组合物通常直接给予患者。某些组合物优选特定的途径，例如可产生更有效的免疫应答(优选CMI应答)，或者不大可能诱导副作用，或者更易于给药。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、真皮内、静脉内、肌肉内或注射至组织间质的间隙)直接递送，或直肠，口服(例如，片剂、喷剂)，阴道，局部，透皮(例如，参见WO99/27961)或经皮(例如，参见WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(例如，参见WO03/028760)，眼部，耳部，肺部或其它粘膜给药来实现直接递送。在一些实施方式中，可利用本发明引发全身性和/或粘膜免疫力。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含引发中和抗体应答的一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛抗原和引发细胞介导免疫应答的一种或多种革兰氏阳性(例如，肺炎链球菌)菌毛抗原。在一些实施方式中，中和抗体应答防止或抑制原始革兰氏阳性细菌感染，同时能引发增强的Thl细胞应答的细胞介导免疫应答能防止感染的进一步扩散。免疫原性组合物可包含一种或多种革兰氏阳性菌毛抗原和一种或多种非菌毛革兰氏阳性抗原，例如胞质抗原。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含一种或多种革兰氏阳性表面抗原或类似抗原，和一种或多种其它抗原，例如能引发Thl细胞应答的胞质抗原。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案中。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径，例如胃肠外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠外加强等给予各种剂量。可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将组合物制备成溶液或混悬液形式的可注射剂。还可制备适合于先溶解或悬浮在液体载体中再注射的固体形式(例如，冻干的组合物)。可以制备用于局部给药的组合物，例如软膏、乳膏或粉末。可以制备用于口服给药的组合物，例如片剂或胶囊、喷剂、或糖浆(任选调味)。可以利用细粉或喷雾制备用于肺部给药的组合物，例如吸入剂。可以将组合物制备成栓剂或阴道栓剂。可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药的组合物，例如滴剂。组合物可以是试剂盒的形式，如此设计则可以先重建混合的组合物再给予患者。所述试剂盒可装有一种或多种液体形式的抗原或一种或多种冻干的抗原。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原以及任何其它组分，例如抗生素，如果需要的话。"免疫有效量"表示将该用量给予个体(单一剂量或作为一系列剂量中的一部分)可有效治疗或预防，或提高可检测的免疫应答，或防止或降低临床症状。该用量依待治疗个体的健康和身体条件、年龄、待治疗个体的分类学分组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的配制、治疗医师对医学情况的评估和其它相关因素而有所不同。预计该用量处于可通过常规试验测定的较宽范围内。组合物的其它组分除了上述组分，本发明组合物通常包含一种或多种药学上可接受的运载体，包括自身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适的运载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质凝聚物(例如，油滴或脂质体)。本领域技术人员熟知这些运载体。这些疫苗还可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药学上可接受的赋形剂的详细讨论见Gennaro(2000)《雷明顿药学科学和实践》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)，第20版，ISBN:0683306472。佐剂本发明的疫苗其它免疫调节剂联合给予。具体地说，组合物通常包含一种或多种佐剂。本发明所用的佐剂包括但不限于下文所列的一种或多种-A#矿麵微合激适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(如参见《疫苗设计》(7acc/"eZ)es/g"…)的第8和9章，(1995)，Powell和Newman编，ISBN:030644867X，普莱纳姆出版社(Plenum.:O，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，这些盐优选(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(W000/23105)。本发明疫苗中可包含铝盐，A产的剂量在0.2-1.0mg/剂之间。5.适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59(利用微流化仪配制成亚微米颗粒的5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85)。参见W090/14837。也参见Podda，"含新型佐剂的佐剂配制流感疫苗MF59佐剂配制疫苗的经验"(Theadjuvantedinfluenzavaccineswithnoveladjuvants:experiencewiththeMF59-adjuvantedvaccine)Fiacc/we(2001)19:2673-2680;Frey等，"MF59-佐剂配制流感疫苗和无佐剂流感疫苗的安全性、耐受性和免疫原性在非老年成人中比较"(Comparisonofthesafety,tolerability,andimmunogenicityofaMF59-adjuvantedinfluenzavaccineandanon-adjuvantedinfluenzavaccineinnon-elderlyadults)Fiacc/we(2003)21:4234-4237。MF59在FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗中用作佐剂。在一些实施方式中，用于组合物中的佐剂是亚微米水包油乳剂。在一些实施方式中，本文所用的亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5%w/v角鲨烯、0.25-1.0%w/v吐温80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0.25-1.0%司盘^85(失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如称为"MF59"的亚微米水包油乳剂(国际公布号WO90/14837;美国专利号6,299,884和6,451,325，全文纳入本文以供参考；和Ott等，"MF59—人用疫苗的一种安全而强效佐剂的设计与评估"(MF59--DesignandEvaluationofaSafeandPotentAdjuvantforHumanVaccines)()，刊于《疫苗设计亚单位和佐剂方法》(Kacc/"e"ewg":7TzeSw6ww"cmc爿《mw^^7jwoac/i)(Powell,M.F.和Newman,M.J.编)，普莱纳姆出版社，纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5%w/v角鲨烯(如4.3%)、0.25-0.5%w/v吐温80tm和0.5%司盘85，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化仪(微射流公司(Microfluidics)，牛顿市，马萨诸塞州)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500pg/剂，约0-250pg/剂和约0-100ng/剂。本文所用的术语"MF59-0"指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语"MF59-MTP"表示含有MTP-PE的制剂。例如，"MF59-100"含有100ngMTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳剂，其含有4.3%w/v角鲨烯、0.25。/。w/v吐温80tm和0.75%w/v司盘85TM和任选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400|agMTP-PE/剂。全文纳入本文以供参考的国际公布号WO90/14837;美国专利号6,299,884和6,451,325详细描述了用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂，例如胞壁酰肽。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。C.棘麟皂苷制剂也适用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(gz^to'a^po"an'aMolina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐齐U。皂苷也可商品化购自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata)(婚纱花(bridesveil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根(soaproot))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。已利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540披露了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇(参见W096/33739)。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫剌激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM—般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。在一些实施方式中，ISCOM含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP0109942、W096/11711和W096/33739进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见WO00/07621。皂苷佐剂开发的综述见Barr等，"ISCOM和其它皂苷佐剂"(ISCOMsandothersaponinbasedadjuvants)(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews.11:247-271。也参见Sjolander等，"口服递送的皂苷和ISCOM疫苗的摄取禾口佐齐廿活性"(UptakeandadjuvantactivityoforallydeliveredsaponinandISCOMvaccines)AdvancedDrugDeliveryReviews(1998)12:321-338。".疯毒体浙疯毒摔^^控(TZ"病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适用作本发明的佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂混合或用磷脂配制的一种或多种病毒蛋白质。它们通常无致病性、不能复制，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、QP-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白pl)。WO03/024480、WO03/024481;Niikura等，"作为呈递外来表位的口服疫苗载体的嵌合型重组戊肝病毒样颗粒"(ChimericRecombinantHepatitisEVirus-LikeParticlesasanOralVaccineVehiclePresentingForeignEpitopes)Fz>o/ogy(2002)，221:273-280;Lenz等，"乳头瘤病毒样颗粒诱导树突细胞的急性激活"(Papillomarivurs-LikeParticlesInduceAcuteActivationofDendriticCells)(2001)，JournalofImmunology(2001)5246-5355;Pinto等，"用重组HPV-16LI病毒样颗粒免疫的健康志愿者对人乳头瘤病毒(HPV)-16LI的细胞免疫应答"(CellularImmuneResponsestoHumanPapillomavirus(HPV)-16LIHealthyVolunteersImmunizedwithRecombinantHPV-16LIVirus-LikeParticles),JournalofInfectiousDiseases(2003)188:327-338;和Gerber等，"与大肠杆菌热不稳定的内毒素突变型R192G或CpG共同给予时人乳头瘤病毒-样颗粒是有效的口服免疫原"(HumanPapillomavirusVims-LikeParticlesAreEfficientOralImmunogenswhenCoadministeredwithEscherichiacoliHeat-LabileEnterotoxinMutantR192GorCpG)，JournalofVirology(2001)75(10):4752-4760。例如，Gluck等，"未来疫苗开发的新技术平台"(NewTechnologyPlatformsintheDevelopmentofVaccinesfortheFuture),Vaccine(2002)20:B10-B16进一步讨论了病毒体。鼻内三价INFLEXAL顶产品(Mischler和Metcalfe,(2002)Kacc/we20，增刊5:B17-B23)和INFLUVACPLUSTM产品中使用免疫增强型重建流感病毒体(IRIV)作为亚单位抗原递送系统。￡.一智,或微主激欲仝笏在一些实施方式中，适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如(1)應一智蘑霸多瀞fZ尸》游无毒欲生激.'这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP0689454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的"小颗粒"形式的非限制性例子。3dMPL的这种"小颗粒"足够小从而可经0.22jim膜无菌过滤(参见EP0689454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)S/oorg.MedC/zew.9:2273-2278。(2)扁^欲德脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等"OM-174,—种可能人用的新型佐剂，与柏格鼠疟原虫的环子孢子蛋白的合成C-末端片段242-310—起给予能诱导保护性应答"(OM-174,aNewAdjuvantwithaPotentialforHumanUse,InducesaProtectiveResponsewithAdministeredwiththeSyntheticC-TerminalFragment242-310fromthecircumsporozoiteproteinofPlasmodiumberghei)Facc/"e(2003)21:2485-2491;和Pajak等，"佐剂OM-174诱导鼠科树突细胞的体内迁移和成熟，，(TheAdjuvantOM-174inducesboththemigrationandmaturationofmurinedendriticcellsinvivo)F"cc/"e(2003)21:836-842。(3)督微性微嫌适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与后面鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链。可任选用类似物，例如2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代的例子可参见Kandimalla等，"分散合成的核苷酸基序识别模式具有不同细胞因子诱导模式的强效免疫调节性寡聚脱氧核糖核苷酸的设计和开发"(Divergentsyntheticnucleotidemotifrecognitionpattern:designanddevelopmentofpotentimmunomodulatoryoligodeoxyribonucleotideagentswithdistinctcytokineinductionprofiles),NucleicAcidsResearch(2003)31，(9):2393-2400;WO02/26757和W099/62923。Krieg，"CpG基序:细菌提取物中的活性成分？"(CpGmotifs:theactiveingredientinbacterialextracts),NatureMedicine(2003)9(7):831-835;McCluskie等，"利用乙肝表面抗原和CpGDNA的小鼠胃肠外和粘膜致敏-力卩强免疫方案"(Parenteralandmucosalprime-boostimmunizationstrategiesinmicewithhepatitisBsurfaceantigenandCpGDNA)，FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology(2002)32:179-185;WO98/40100;美国专利号6,207,646;美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT(SEQIDNO:54)或TTCGTT(SEQIDNO:55)。参见Kandimalla等，"Toll-样受体9:通过新型合成的CpGDNA调节识别和细胞因子诱导"(Toll-likereceptor9:modulationofrecognitionandcytokineinductionbynovelsyntheticCpGDNAs)，BiochemicalSocietyTransactions(2003)31.(部分3):654-658。CpG序列，例如CpG-AODN可特异性诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-BODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等，"利用类浆细胞树突细胞衍生的IFN-a调节CpG-A-诱导的单核细胞IFN卞可诱导蛋白-10产生"(CpG-A-InducedMonocyteIFN-gamma-InducibleProtein-10ProductionisRegulatedbyPlasmacytoidDendriticCellDerivedIFN-alpha)，J.Immunol.(2003)170(8):4061-4068;Krieg，"CpG上的A到Z，，(F醒AtoZonCpG)，TRENDSinImmunology(2002)23(2):64-65;和WO01/95935讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-AODN。在一些实施方式中，将CpG寡核苷酸构建为5'端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3'端相连以形成"免疫聚体"(immunomer)。参见，例如Kandimalla等，"CpG寡核苷酸的二级结构影响免疫朿U激活性"(SecondarystructuresinCpGoligonucleotidesaffectimmunostimulatoryactivity)，55iC(2003)306:948-953;Kandimalla等，"Toll-样受体9:通过新型合成的CpGDNA调节识别和细胞因子诱导"，BiochemicalSocietyTransactions(2003)31.(部分3):654-658;Bhagat等，"作为强效免疫刺激剂的CpG五-和六脱氧核糖核苷酸"(CpGpenta-andhexadeoxyribonucleotidesaspotentimmunomodulatoryagents),5朋C(2003)300:853-861;和W。03/035836。(4)v4D尸-樣靜基化毒紊浙SY/7游厲毒欲主欽细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。在一些实施方式中，蛋白质源自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素"LT")、霍乱(弧菌)("CT")或百日咳(杆菌)("PT")。W095/17211描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，W098/42375描述了其作为胃肠外佐剂的应用。在一些实施方式中，佐剂是脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见专门全文纳入本文以供参考的以下参考文献Beignon等，"共同施加于裸露皮肤后，大肠杆菌热不稳定肠毒素的LTR72突变体增强肽抗原引发CD4+T细胞和分泌y干扰素的能力"(TheLTR72MutantofHeat-LabileEnterotoxinofEscherichiacoliEnhancestheAbilityofPeptideAntigenstoElicitCD4+TCellsandSecreteGammaInterferonafterCoapplicationontoBareSkin)，InfectionandImmunity(2002)70(6):3012-3019;Pizza等，"粘膜疫苗作为粘膜佐剂的LT和CT无毒衍生物"(Mucosalvaccines:nontoxicderivativesofLTandCTasmucosaladjuvants),Kacc/"e(2001)19:2534-2541;Pizza等，"LTK63禾卩LTK72，用于临床试验的两种粘膜佐剂"(LTK63andLTR72,twomucosaladjuvantsreadyforclinicaltrials),/A/ed^/I^.ctoZj/o/.(2000)290(4-5):455-461;Scharton-Kersten等，"利用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚单位和无关佐剂白勺纟5皮免疫，，(TranscutaneousImmunizationwithBacterialADP-RibosylatingExotoxins,SubunitsandUnrelatedAdjuvants),InfectionandImmunity(2000)68(9):5306-5313;Ryan等，"大肠杆菌热不稳定毒素的突变体用作有效的粘膜佐剂经鼻部递送无细胞百日咳疫苗无毒AB复合物和酶活性对Thl和Th2细胞的不同作用"(MutantsofEscherichiacoliHeat-LabileToxinActasEffectiveMucosalAdjuvantsforNasalDeliveryofanAcellularPertussisVaccine:DifferentialEffectsoftheNontoxicABComplexandEnzymeActivityonThlandTh2Cells)，InfectionandImmunity(1999)67(12):6270-6280;Partidos等，"大肠杆菌的热不稳定肠毒素及其定点突变体LTK63增强经鼻内共免疫合成肽的增殖性和细胞毒性T细胞应答"(Heat-labileenterotoxinofEscherichiacolianditssite-directedmutantLTK63enhancetheproliferativeandcytotoxicT-cellresponsestointranasallyco-immunizedsyntheticpeptides),7mww"o/.(1999)67(3):209-216;Peppoloni等，"作为鼻内递送疫苗的安全强效佐剂的大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体，，(MutantsoftheEscherichiacoliheat-labileenterotoxinassafeandstrongadjuvantsforintranasaldeliveryofvaccines)，Kacc/wes(2003)2(2):285-293;和Pine等，"利用流感疫苗和大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒突变体(LTK63)的鼻内免疫"(IntranasalimmunizationwithinfluenzavaccineandadetoxifiedmutantofheatlabileenterotoxinfromEscherichiacoli(LTK63))，,Cowfro/ie/ewe(2002)85(l-3):263-270。氨基酸取代的数字基准优选依据Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)U(6):l165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列对比，该篇文献专门全文纳入本文以供参考。主欽搭合娜碰搭合浙生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)Co"f.Ae/ewe.70:267-276)，或者粘膜粘合剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。例如，参见WO99/27960。G.徵粒微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(ot-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即，直径约100nm到150pm，约200nm到约30|am，约500nm到约10的颗粒)，任选处理这些微粒而使表面带负电(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。//.颜体适合用作本发明佐剂的脂质体制剂的例子描述于美国专利号6,090,406;美国专利号5,916,588和EP0626169。/,覆奪z微或褒奪z;錄激湖在一些实施方式中，适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(W099/52549)。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性剂(W001/21152)。在一些实施方式中，聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。/眾艨嚴(PC尸"PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，"通过聚磷腈水溶液的凝聚制备水凝胶微球"(Preparationofhydrogelmicrospheresbycoacervationofaqueouspolyphophazenesolutions),B/omG^Wa/s(1998)，i^(l-3):109-l15禾口Payne等，"聚磷腈基质中的蛋白质释放"(ProteinReleasefromPolyphosphazeneMatrices),Adv.Drug.Del,Rev.(1998)，U(3):185誦196。〖應壁微适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。丄.^丝办墜诺厥众合激适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括但不限于Stanley,"咪喹莫特和咪唑并喹诺酮作用机制和治疗潜能"(Imiquimodandtheimidazoquinolones:mechanismofactionandtherapeuticpotential),C7/".De謂to/.(2002)27(7):571-577和Jones,"莱西喹莫特"(Resiquimod3M)，Cw〃.<9//"./"ve幼'g.Drags(2003)4(2):214-218中描述的咪喹莫特及其同系物。本发明还提供包含上述佐剂组合的组合物。例如，以下佐剂组合物是可用作本发明佐剂组合的非限制性例子(1)皂苷和水包油乳齐U(W099/11241);(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153);(3)皂苷(例如(^821)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(W098/57659);(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见EP0835318;EP0735898禾卩EP0761231);(6)含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化成亚微米乳剂或旋振(vortex)产生粒度较大的孚L剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(RibiImmunochem))，其含有2%角鲨烯、0.2。/。吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(Detox);(8)—种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL);(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸序列)。第(9)组合是优选的佐剂组合。适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如，干扰素-力、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子。在一些实施方式中，铝盐和MF59是可注射流感疫苗所用的优选佐剂。在一些实施方式中，细菌毒素和生物粘合剂是经粘膜递送的疫苗，例如鼻疫苗的优选佐剂。本发明的免疫原性组合物可与抗生素治疗方案共同给予。在一些实施方式中，先给予抗生素，再给予本发明的抗原或包含一种或多种本发明抗原的组合物。在一些实施方式中，先给予本发明的抗原或包含一种或多种本发明抗原的组合物，再给予抗生素。适用于治疗链球菌感染的抗生素的例子包括但不限于青霉素或其衍生物，或克林霉素等。以下实施例进一步说明(而不是限制)了本发明。实施例实施例1.材料与方法淑W效樣膽遂在这些背景中产生的肺炎球菌菌株和缺失突变株描述于表1。采用PCR连接诱变(23)产生了T4和ST162^的敲除突变株。用特定的引物对扩增靶基因上游和下游的片段。将上游片段构建成含Apal位点，将下游片段构建成含BamHI位点。用于构建和筛选缺失等位基因的引物见表2。用相应的限制性酶消化PCR产物(l,OOObp),纯化并与含Apal和BamHI位点的erm盒(1,306bp)(GenBank登录号AB057644)或盒，Janus(24)(1,368bp)连接。然后如(25)所述将连接混合物转化入受者肺炎球菌菌株中，接种于含红霉素(l吗/ml)或卡那霉素(400昭/ml)的血琼脂平板上。通过PCR和测序证实插入正确。表l.所用的肺炎链球菌菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>EmR，红霉素-耐受；KmR，卡那霉素耐受；SpcR，大观霉素耐受；SmR，链霉素耐受；CmR，氯霉素耐受；表2.用于产生突变株的引物和限制性酶<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>为产生含有r/Mislet的D39(血清型2菌株)的插入突变株，用CH155(在r/n4islet侧翼的/Sl167元件之一中含有mflge/^w5转座子插入的血清型4肺炎链球菌菌株)的基因组DNA转化感受态D39细胞。通过接种于大观霉素平板选择双重重组细胞，通过PCR证实islet存在。为产生D39V0rg」-w/")的r/M突变衍生株，用引物对RLRAFR/RLRARX进行突变型血清型4菌株中突变区域的PCR扩增，将纯化的扩增子转化入所需的血清型2背景。通过接种氯霉素(平板)选择重组r/M(的细胞)，通过PCR验证。7一、i^g5f踏gC舰靥、表达微众采用标准重组DNA技术构建所有表达质粒。pET21b+购自英杰公司(Invitrogen)。用罗氏公司(Roche)的PfuTurboTaq进行PCR，将基因组DNA扩增25轮。纯化PCR产物，消化，将其连接入载体中，转化入大肠杆菌TOPOIO，随后亚克隆入大肠杆菌BLR(DE3)。按照生产商的使用说明书表达重组蛋白并从转化细菌中纯化。动激逾獰用米利波尔公司(Millipore)的CentriconYM-30自旋柱构建纯化的重组RrgA、RrgB和RrgC，随后用于免疫BALB/c小鼠(20吗)和新西兰白兔(100吗)。扇染色就负染色而言，细菌在血琼脂上培养最多16小时，将菌落悬浮在0.15M二甲砷酸钠缓冲液中。将4^等份试样加入FormvarTM支持膜包被的栅格中，5分钟。用滤纸吸去过量溶液，用水配制的0.5%乙酸双氧铀染色栅格5秒，空气干燥。用飞利浦公司(Phillips)的Tecnai10电子显微镜，80kV检査样品。^疫培f—显徵翁肺炎链球菌在液体THY培养基中生长过夜。4°C，3,000rpm离心OD600为0.5的1毫升细菌悬浮液，重悬于500pl除菌过滤的PBS中。将20微升样品加入FormvarTM-包被的镍栅格中，静置5分钟。随后将这些栅格在1%低聚甲醛/PBS中固定，在封闭缓冲液(1%正常的家兔血清，1%BSA，lxPBS)中与1:10稀释的RrgA、RrgB或RrgC的多克隆小鼠抗体一起培育。用封闭缓冲液洗涤样品5次，5分钟，以l:20与金偶联的第二抗体(山羊抗-小鼠IgG，5-nm金颗粒；山羊抗-兔IgG，10nm)—起培育。用封闭缓冲液洗涤样品5次，5分钟，随后在1。/。低聚甲醛/PBS中固定30分钟。用蒸馏水中洗涤样品5次，5分钟，静置干燥。用水性乙酸双氧铀染色各栅格15秒，用TecnaiTM高-视野透射电子显微镜加工。歪颜伊迹将细菌在血琼脂平板上培养最多16小时。将细菌(30mg湿重)重悬在含400单位变溶菌素(西格玛公司)的1ml50mMTris-HCl，pH6.8中，37。C培育2小时。冻融三轮后，13,000rpm离心15分钟除去细胞碎片。70°C，用NuPageTM样品缓冲液和巯基乙醇处理50微升上清液10分钟，取10pl加载于4-12%或3-8%NuPageNovexBis-Tris凝胶(英杰公司)上。按照供应商的使用说明书用1:500稀释的RrgB抗体(小鼠免疫血清)进行电印迹和检测。，9颜微37°C，5%(:02/95%空气气氛中，将生长至指数中期(006。。=0.3-0.4)的肺炎链球菌细胞与A549细胞培育30-40分钟，用PBS(pH7.4)洗涤三次以除去未粘附的细菌。就粘附和/或内在化细菌的计数而言，用200^10.25%胰蛋白酶/1mMEDTA处理使上皮细胞与各孔脱离，加入800pl冰冷却的0.025%TritonX-100使之裂解。将合适的稀释液接种在血琼脂平板上以计数粘附于真核细胞的细菌数量，将各菌株的粘附细菌滴度与输入滴度作比较，测定粘附细菌的百分比。就荧光显微术而言，在24-孔组织培养皿中将A549单层在盖玻片上培养。在3%低聚甲醛中固定盖玻片上的感染细胞单层，用抗体标记，培育30-40分钟后，PBS洗涤。用抗-荚膜抗体标记细菌，用罗丹明偶联鬼笔毒环肽染色F-肌动蛋白渗透处理后目测观察上皮细胞。所有的实验一式四份进行，各实验在不同日期重复三次。</、嵐攻击37°C，5%(302下，将T4和ST162"F及它们各自的等基因突变株在血琼脂平板上培养16小时。直接从平板上取得菌落，温和重悬在PBS中获得OD62()=0.5，或者接种入半合成C+Y培养基，生长至对数中期(OD620=0.5)用于鼻内接种，0062()=0.2用于腹膜内(^浪种。进行适当稀释以获得所需浓度。如(5)所述，6-8周龄的C57BL/6小鼠用于T4和ST162^及它们的突变株作鼻内和腹膜内细菌攻击。D39及其等基因突变株在补加了合适抗生素的THY培养基中培养。査尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)的6-10周龄雌性CD1(英国)小鼠用于1"07细菌的鼻内攻击。对于竞争实验，将突变型和野生型细菌以1:1比例混合。通过在红霉素、链霉素和/或氯霉素血琼脂平板上选择来测定突变株cfli与野生型cfo相比的输出值。将体内竞争指数(CI)计算成突变株与野生型输出cfu除以突变体与野生型输入cfti的比值。利用BD生物科学公司(BDBiosciences)的市售ELISA试剂盒测定腹膜内攻击后血清中的TNF和IL-6。统^学力浙采用GraphPadPRISMtm第4版分析数据的统计学显著性。采用t检验或非参数曼-怀二氏检验比较连续变量(continuousvariable)。统计学显著性定义为P<0.05。37°C，5%C02下，将肺炎链球菌[T4，ST16219F，T4A(wgM)和T4A("gJ-sWD)]分离株在THY液体培养基中培养过夜。稀释样品，使之生长至OD620=0.250(约1x108/ml)。3,000rpm离心细菌培养液，重悬于lxPBS中。将15微升细菌悬浮液加入96-孔平板。将5微升20%正常家兔血清连同1:3,200的第一抗体(抗-RrgB、PI抗-RrgB、Nm抗-961)加入各孔。样品在冰上培育30分钟，然后向各孔中加入150^1l封闭缓冲液(l。/。BSA/PBS)。4°C，2,500rpm离心96-孔板5分钟。以1:100的终浓度加入用藻红蛋白作标记的第二抗-小鼠抗体，将混合物在冰上培育30分钟。然后加入150pl封闭缓冲液，样品按照上述离心。将样品重悬在200^1。/。低聚甲醛/PBS中，用BD公司(BectonDickinson)的FACSCaliber分析。在7VZ\(Wg」"wA)^V^全y^复体通过再引入敲除的基因与卡那霉素盒将Wn4islet重新引入T4A0r^4-sWD)中。首先通过PCR连接诱变将卡那霉素盒整合入野生型T4菌株中靶基因的下游。利用这些突变株的染色体DNA转化敲除株并恢复为野生型表型。在第一步中，用引物Kan-Apa和Kan-Bam扩增Janus的卡那霉素盒(Sung等，2001，Appl.Environ.Microbiol.，67:5190-6)，产生含Apal和BamHI末端的PCR产物。用T4A(^^4"WD)突变株的引物pili-rev-1-4扩增靶位点的上游和下游片段。将上游片段构建成含Apal位点，下游片段构建成含BamHI位点。用相应的限制性核酸内切酶消化所有片段，连接等摩尔量的上游片段、下游片段和卡那霉素片段。转化入T4后，在含200mg/L卡那霉素的血琼脂平板上选择转化株。对照PCR证实构建正确后，利用这些转化株的染色体DNA转化T4A(n^4-sWD)。在含卡那霉素的平板上再次选择，通过检测红霉素敏感性和菌毛表达验证突变株。实施例2.肺炎球菌中菌毛样结构的透射电子显微术证据通过透射电子显微术和负染色，发现在血琼脂平板上和(C+Y)或(THY)培养基中培养最多16小时的肺炎球菌表达了菌毛样结构。在菌株T4(TIGR4)(属于多基因座序列类型ST205的高度侵袭性血清型4克隆)以及具有多基因座序列类型162的19F型临床分离株(菌株ST162^)上发现这些结构(图1A)。该19F克隆与人携带疾病和侵袭性疾病有关，并已显示能有效寄居在C57BL/6和BALB/c小鼠的呼吸道中(5)。虽然T4的无包膜突变株(T4R)能形成菌毛，但在无包膜实验室菌株R6上未观察到菌毛。实施例3.肺炎球菌基因组中的WMIslet编码菌毛-样结构比较白喉棒杆菌的^"5C操纵子(12)和B群链球菌的粘附islet1(16)揭示了T4基因组内的推定菌毛基因簇(图2)。菌毛基因位于前述肺炎链球菌病原性islet中(18，19)。肺炎球菌r/rjislet由7种基因构成，其中wgj、厅g^和厅gC预计编码结合宿主胞外基质的含LPXTG的微生物表面组分识另U性粘附基质分子(microbialsurfacecomponentsrecognizingadhesivematrixmolecules)(MSCRAMM)(20)。此外，islet还含有三种分选酶，w/5、和sWD，以及r/M(^^-样调节剂)(基因簇的正调节齐U)的基因(18)(图2)。基因组islet侧接含有反向重复的ZS1167，其特征在于可动的基因元件(图2)。测序的菌株R6及其祖先D39缺乏r/"-菌毛islet(图2)。转录阻遏子mg"位于WMislet外端，其参与调节菌毛基因(21)。PCR扩增血清型19F的临床分离株ST162^中相应区域后进行序列分析，显示与T4islet的同源基因簇有98%相同。然而，ST162^分离株中不存在T4中功能未知的小ORF。通过PCR连接诱变构建了删除mgM基因的T4和ST162^敲除突变株，从而产生过量表达r/r^islet基因的菌株。此外，我们删除了T4(图1B)和ST162^以及它们各自mgM衍生株中的wgj-w①区域。进行负染色和电子显微术后，发现T4/ngM和ST16219FmgM突变株能产生丰富的菌毛(图1C)，而厅^4-w①缺失的细菌完全缺乏菌毛(图1D)。利用大肠杆菌中表达的RrgA、RrgB和RrgC蛋白产生抗血清，用于免疫金标记T4表达的菌毛。RrgB抗体染色整个菌毛多聚物(图1E-G)。利用RrgB-特异性抗体作FACS分析显示分别有84%和90%的T4和ST16219F细胞表达菌毛结构。在mg^突变衍生株中，几乎所有(99%)细菌有菌毛。FACS分析检测到缺乏r/Mislet的细胞无菌毛。为证实在T4和ST16219F中观察到的菌毛结构的多聚性质，用变溶菌素处理这些菌株和它们各自厅g」-s^D缺失衍生株的总提取物，用4-12%(图3A)和3-8。/。(图3B)聚丙烯酰胺梯度凝胶分离，用RrgB特异性抗血清作免疫印迹。观察到范围在<100kDa->1,000kDa的高分子量(HMW)聚合物阶梯，这类似于以前白喉棒杆菌所述的(12，13)。即使将等量的蛋白质提取物加载于凝胶上，mg^突变株的RrgB抗体染色条带强于它们各自的野生型菌株，从而支持了透射电子显微术和FACS分析时获得mg^突变株背景中肺炎球菌表达的菌毛结构百分比更高的数据。与预期的一样，T4和ST16219F中ATgJ-w①缺失突变株分别显示没有RrgB-反应性条带(图3)。然而，当将菌毛islet再引入此缺失突变株T4A0r^4-w^D)中时，利用RrgB抗血清作蛋白质印迹检测到HMW多聚物类似于野生型T4菌株的那些多聚物。采用蛋白质印迹观察到用液体培养基和平板培养的肺炎球菌菌株中均存在菌毛，即使采用透射电子显微术并不总能观察到菌毛，从而提示为何以前未发现菌毛。实施例4.r/MIslet对于肺炎球菌粘附肺上皮细胞至关重要血清型2菌株D39(类似于其无包膜衍生株R6)缺乏WMislet(图2)。将T4的完整WMislet引入D39(D39V^r^4-MD))。依据利用抗-RrgB的蛋白质印迹HMW多聚物阶梯(图3B)证明D39的这种islet插入突变株表达菌毛。D39V(n^4-sWD)中的菌毛表达依赖于正调节剂，因为在D39V(n^4-w^))的WM突变型衍生株中未观察到HMW多聚物(图3B)。利用D39、D39V0rg^-sWD)和D39V0t^4-w^)VO/M)研究与A549肺上皮细胞的粘附情况(图4)。只有表达菌毛的D39V(厅^4-^^))才与这些细胞结合(图4)。该结合类似于表达菌毛的T4,而T4的Wav4突变株显示不与A549细胞有可检测的结合。实施例5.r/MIslet影响在小鼠模型中的毒力为研究菌毛在肺炎球菌寄居和侵袭性疾病中的作用，将菌株T4和T4V(/rgJ-w^))用于鼠科感染模型中。为模拟感染的天然途径，6-8周龄C57BL/6小鼠鼻内接种高[5xl(^菌落形成单位(cfu)]和中等(5xl05cfu)剂量的肺炎球菌。通过动物尸检进行鼻咽-气管灌洗评估寄居。感染突变株的小鼠存活率较高显示无菌毛突变株的毒力低于野生型菌株(图5A和5B)。再引入r/Mislet可恢复该毒力缺陷。分别给予的野生型和突变型肺炎球菌在小鼠中寄居的程度相似(曼-怀二氏U检验无显著性，P>0.05)。然而，在大多数病例中，当将相同数量的野生型和突变型T4细菌一起鼻内给予时，在上呼吸道、肺和血液中菌毛缺陷型突变株均竞争不过野生型(图5C-E)。2型菌株D39(islet插入衍生株D39V0rgJ-sWD))，禾Qr/M突变株D39V0rg」-w^))AO/^4)也用于鼻咽携带(nasopharyngealcarriage)和肺炎的竞争实验。无菌毛的衍生株D39竞争不过有菌毛的islet插入突变型D39V(^t^4-w①)，而缺乏r/M的突变株并非如此(图5F)。该数据证明肺炎球菌菌毛在寄居、肺炎和侵袭性疾病中起作用。实施例6.WMIslet在宿主炎性应答中起作用肺炎球菌感染的结果受宿主炎性应答的影响，炎性应答可促进细菌清除以及导致局部损伤(肺炎)或全身性损伤(最严重的形式是脓毒性休克)。最近，我们证明将各种肺炎球菌克隆腹膜内给予小鼠时会引发不同的致炎细胞因子应答(26)。本文显示能产生菌毛的血清型6B菌株和T4及ST162^菌株在腹膜内攻击后均引发高TNF应答(5)。相反，克隆类型不同的血清型19F菌株，即ST42519F，在小鼠上气道中不能有效寄居，其引发低TNF应答(5)。血清型1和血清型7F分离株也一样(5，22)，其属于在人中较温和侵袭性和无致死性疾病的相关侵袭克隆类型。通过PCR、测序和Sourthern印迹杂交来分析这些克隆中是否存在WMislet。结果证明WMislet-阳性肺炎球菌菌株(分别是4和19F型的ST205"和ST162"F)引发高细胞因子应答，而rlrAislet-阴性菌株(分别是7F和1型的ST1917F、ST228!和ST306"诱导低TNF应答(5)。因此，肺炎球菌菌毛islet存在与否可以解释TNF应答的差异。为直接检验该可能性，检测用有菌毛的野生型和缺乏菌毛的厅g-w①缺失突变株腹膜内攻击小鼠后侵袭性肺炎球菌感染期间的炎性应答。还用较高感染剂量的两种缺失突变株感染以确保TNF应答低不是因为血流中细菌数量较低所致。与它们的野生型菌株相比，T4以及ST162^背景中的菌毛缺失突变株显示TNF应答(图6)和IL-6应答(图7)明显较低。将TNF值对细菌数量作图，证明对有菌毛肺炎球菌的TNF应答明显高于相同数量的无菌毛肺炎球菌(图6C和6D)。此外，将r/"islet再引入T4A0t^4-;WD)恢复了有菌毛T4的高TNF应答。这些结果证明肺炎链球菌可产生伸出细菌细胞表面的菌毛样结构。在一些但不是所有肺炎球菌菌株中发现r/"菌毛islet编码肺炎球菌菌毛。在有包膜的肺炎链球菌中，菌毛在鼠科感染模型中负责粘附培养的上皮细胞和寄居以及侵袭性疾病。菌毛表达还增强宿主炎性应答。在不同的感染阶段，肺炎球菌利用各种机制与它们的宿主相互作用。表达菌毛有助于细菌的初始粘附，从而促进鼻咽寄居。同时，表达这些结构的细菌更易于引发能促进清除的粘膜炎症，但如果炎症导致粘膜屏障损伤，也可能导致肺炎球菌侵染入组织。实施例7.肺炎链球菌菌毛的纯化用补加了5。/。去纤维蛋白羊血的胰蛋白酶大豆琼脂培养(37'C，5%<:02中过夜)肺炎链球菌TIGR4甘油原种(-8(TC)。利用新鲜的细菌接种新的琼脂平板，37°C，5%C02中培养约12小时。用35mlPBS洗涤收集的约10个平板的细菌一次，重悬于卡尔生物化学公司(Calbiochem)的2ml含有蛋白酶抑制剂混合物的原生质体缓冲液PPB中(10mMMgCl2，50mM磷酸钠，pH6.3，20%蔗糖)。将100mM磷酸钠，pH6.3配制的约450U变溶菌素加入各一半悬浮液中，37。C培育约5-8小时，轻柔震荡直至显微镜检测到形成原生质体。将含有经消化菌毛物质的上清液加载于蔗糖梯度上(25-56%，10mMMgCl2，50mM磷酸钠，pH6.3配制)，4'C以38,000rpm离心约20小时(图IOA)。4°C，利用含有蛋白酶抑制剂的缓冲液进行所有其余步骤。此外，加入诺瓦金公司(Novagen)的BenzonaseTM核酸酶以除去DNA和RNA杂质。利用抗-RrgB抗体检测所收集的各梯度组分的菌毛物质。合并含菌毛的组分，用10mMMgCl2，50mM磷酸钠，pH6.3透析约1天以除去蔗糖。为降低多分散性，可加入其它层析步骤。需要时，可先浓縮合并的菌毛制品再将它们加载于阿姆山姆生物科学公司(AmershamBiosciences)的Superose610/300GL柱上(图10B)。凝胶过滤将含有不同分子量的物质的菌毛分开。根据电子显微术和十二垸基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳以及利用RrgB特异性抗体作免疫印迹判断纯化菌毛组分是否为均质(图10C)。将样品保存在-8(TC或液氮中待以后使用。纯化的高分子量菌毛显示分子量范围是2x106-3x106Da。在有SDS存在下热处理菌毛将其解离成较小分子，从而在聚丙烯酰胺-SDS凝胶上产生低分子量条带梯。Edmann降解纯化的菌毛鉴定到对应于切除信号序列产生RrgB蛋白预计的N-末端序歹!j(AGTTTTSVTVHXL;SEQIDNO:56)(图11A)。菌毛胰蛋白酶肽序列的氨基酸分析鉴定到含氨基酸序列LAGAEFVIANADNAGQYLAR.(SEQIDNO:7)(图11B)的肺炎球菌TIGR4RrgB蛋白的片段。对负染色(in/。PTA)、免疫金标记的纯化菌毛制品进行电子显微术研究。观察到最长1pm和直径约10nm的延长管状纤丝，类似于在完整细菌上检测到的。除单根的菌毛纤丝外，还观察到紧密填塞的单结构束。在免疫金EM(图15)和蛋白质印迹分析中，针对纯化RrgB和RrgC的抗血清与分离的菌毛反应。抗-RrgA、抗-RrgB和抗-RrgC的金标记模式见图16。实施例8.菌毛蛋白RrgA和RrgB的体外缔合菌毛蛋白RrgA、RrgB和RrgC如实施例1所述纯化。室温下、37°C、65°C和95'C体外培育纯化的蛋白制品5分钟。在变性的聚丙烯酰胺凝胶上对培育的制品进行电泳。在RrgA和RrgB制品中观察到高分子量复合物，但在RrgC-His制品中未观察到(图9A)。蛋白质印迹证实高分子量复合物中存在RrgA和RrgB(图9B)。通过尺寸排阻层析还在RrgA和RrgB制品中检测到高分子量复合物(图9C)。实施例9.用菌毛制备的抗血清对抵御感染具有保护作用如实施例1所述用T4细菌腹膜内攻击小鼠，此外给予小鼠抗纯化菌毛的抗血清(抗-菌毛)、用在相同条件下从不产菌毛的细菌制备的制品的抗血清(抗A菌毛)或盐水对照(对照)。在平行实验中，给予小鼠1:10稀释的相同抗血清。观察IO天期间动物的死亡率，检测攻击后24小时的细菌负载量。用未稀释的抗-菌毛血清治疗的所有小鼠的细菌负载量低于检测水平；用1:10稀释的血清治疗仍能提供一定保护作用(图12A)。与盐水对照相比，稀释和未稀释的抗-菌毛血清能显著降低死亡率(图12B)。此外，用菌毛制备的血清对菌血症和死亡率的保护作用高于抗A菌毛血清(图12A-B)。本实施例证明在动物模型中，纯化菌毛的特异性血清能提供针对肺炎链球菌感染的明显保护作用。实施例10.纯化菌毛和菌毛蛋白与胞外基质组分结合通过ELISA测定RrgA、RrgB、RrgC、纯化的菌毛和模拟纯化的菌毛与胞外基质组分的结合。检测菌毛组分与胞外基质组分粘蛋白I、玻连蛋白、乳铁蛋白、胶原I和IV、层粘连蛋白、纤连蛋白和血纤蛋白原的结合。简言之，37°C,包被丹麦罗丝克尔德市南克公司的Maxisorp96-孔平底板(Nunc，Roskilde，Denmark)l小时，然后在4"C与磷酸缓冲盐水pH7.4(PBS)配制的2pg/孔粘蛋白I、玻连蛋白、乳铁蛋白、胶原I和IV和血纤蛋白原以及lpg/孔层粘连蛋白和纤连蛋白培育过夜。BSA包被的平板用作阴性对照。用PBS/0.05%Tween20洗涤包被的各孔3次，37。C用200|il1%BSA封闭2小时。用PBS/0.05%Tween20洗涤各平板3次。首先用PBS将蛋白样品(RrgA、RrgB和RrgC)稀释至0.4吗/pl。将200^蛋白溶液和25pi菌毛制品(用PBS配制成200^总体积)及各自的对照转移入包被-封闭的平板，其中样品用PBS作连续两倍稀释。37。C培育平板2小时，4。C过夜。用PBS/0.05%TweenTM20洗涤平板3次，37'C与小鼠抗Rrg第一抗体(1/10,000稀释液)培育2小时:RrgA、RrgB和RrgC包被的平板分别与抗-RrgA、抗-RrgB和抗-RrgC(抗体)培育，菌毛包被的平板与抗RrgB抗体培育。再洗涤3次后，37°C，经与密苏里州圣路易斯市西格玛化学品公司的碱性磷酸酶偶连山羊抗小鼠IgG培育2小时显示抗原特异性IgG。观察到与胶原I、乳铁蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和血纤蛋白原明显结合(图13)。在所有情况中，观察到RrgA的结合最强，RrgC次之，RrgB的结合水平较低。纯化的菌毛显示较弱但可测的结合。本实施例证明纯化菌毛和分离的菌毛蛋白能与胞外基质组分结合，提示菌毛在粘附/寄居中起作用。实施例11.纯化菌毛诱导体外细胞因子应答在体外将外周血单核的细胞(PBMC)和单核细胞与纯化菌毛制品和从不表达菌毛的T4纯化的模拟制品接触。通过ELISA检测这些细胞对菌毛起反应中产生的细胞因子。与delta菌毛对照相比，纯化菌毛诱导炎性细胞因子TNF-a、IL-12p40和IL-6产生(图14)。未观察到对TLR2、7、8和9的诱导。实施例12.纯化菌毛的电子显微术分析将5微升纯化菌毛制品置于涂布有碳薄膜的300-目铜栅格上。然后加入5微升P/。PTA(磷钨酸)负染色这些栅格。吸干多余的液体。利用FEG200电子显微镜观察这些栅格。在低剂量条件下，以100kV加速电压和50000名义放大率(nominalmagnification)记录图像。观察到延长、可弯曲结构的菌毛(图18)。扫描电子显微图，然后转换成IMAGIC5格式(imagic5.de)。采用EMAN软件，利用正方形框(300x300像素)从数字化底片(digitizednegative)中选菌毛的相同部分。在全框内(boxed)菌毛集合之间，只处理具有相同生长方向和相似直径的直菌毛。在第一分析中，按密度、高通(high-pass)和低通(low-pass)滤过倒转框内的菌毛，然后与直径相同的模型圆柱体的投影比对(图18)。采用自我校正功能实施旋转比对，然后进行只与圆柱体轴垂直的平移比对(translationalalignment)。计算横贯纤丝轴的平均密度分布，以图解表示示。此密度分布强烈表明菌毛是一紧密的固体结构，中间没有孔洞，其整体结构计算的平均直径为11.5rnn(图18)。通过将旋转角度随机指定为比对的茎干区段获得旋转对称的三-两维体积(rotationallysymmetrizedthree-dimensionalvolume),计算的直径(llnm)相似(图19)。此外，该体积显示菌毛表面不光滑(图18-19)。通过轴平均(axialaveraging)对显示13nm重复的强烈结构特征的几个预比对茎干区段作进一步比对，从而产生信号更强的改进2D图像(图20)。这些2D图像(3D结构的投影)(图21-22)明确显示菌毛由巻曲螺旋结构排列的至少3根"原纤丝"构成，平均直径为10.5-11.0nm，螺距为13.2nm(图23)。结节位置处菌毛的直径是6.8nm，每根"原纤丝"的直径为3.5nm(图23)。参考文献(各篇文献全文纳入本文以供参考)1.Bruyn，G.A.W.和vanFurth，R.(1991)Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.10，897-910.2.Ryan，M.W.禾卩Antonelli，P.J.(2000)Laryngoscope110，961-964.3.Cutts，F.T.，Zaman，S.M.，Enwere，G.，Jaffar，S.，Levine，O.S.，Okoko，C.Oluwalana，A.，Vaughan，S.，Obaro，A.，Leach，A.等，(2005)Lancet365，1139-1146.4.Swiatlo，E.，Champlin，F.R.，Holman，S.C，Wilson,W.W.禾口Watt,J.M.(2002)Infect.Immun,70，412-415.5.Sandgren，A.，Albiger，B.，Orihuela，C，Tuomanen，E.，Normark，S.和Henriques陽Normark，B.(2005)J.Infect.Dis.192,791-800.6.HenriquesNormark，B.，Christensson，B.，Sandgren，A.，Noreen，B.，Sylvan,S.,Burman，L.G.禾卩Olsson-Liljequist，B.(2003)Microb.DrugResist.9，337-344.7.Nunes，S.，Sa-Leao，R.，Carrico,J.，Alves，C.R.，Mato，R.，AvO，A.B.，Saldanha，J.，Almeida,J.S.，Sanches，I.S.禾口deLencastre，H.(2005)J.Clin.Microbiol.43，1285-1293.8.Henrichsen，J,(1995)J.Clin.Microbiol.33，2759-2762.9.Lau，G.W.，Haataja，S.，Lonetto，M.，Kensit，S.E.，Marra，A.，Bryant,A.P.，McDevitt，D.，Morrison,D.A.禾卩Holden，D.W.(2001)Mol.Microbiol.40，555-571.10.Rosenow，C，Ryan，P.，Weiser，J.N.，Johnson,S.，Fontan，P.，Ortqvist，A.和Masure，H.R.(1997)MolMicrobiol.25，819-829.11.Tuomanen，E.(1999)CurrentOpin.Biol.2，35-39.12.Ton-That，H.，Marraffini，L.A.和Schneewind，O.(2004)Mol.Microbiol.53，251-261.13.Ton-That，H.和Schneewind，O.(2003)Mol.Microbiol.50，1429-1438.14.Kelstrup，J.，Theilade,J.和Fejerskov，O.(1979)Scand.J.Dent.Res.87，415-423.15.Mora,M.，Bensi，G.，Capo，S.，Falugi，F.，Zingaretti，C，Manetti，A.G.O.，Maggi，T.，Taddei，A.R.，Grandi，G.禾口Telford,J.L.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，15641-15646,16.Lauer，P.，Rinaudo，C.D.，Soriani，M.，Margarit，L，Mainone，D.，Rosini，R.，Taddei，A.R.，Mora，M.，Rappuoli，R.，Grandi，G.禾口Telford,J.L.(2005)Science309，105.17.Li，T.，Khah，M.K.，Slavnic，S.，Johansson,LScStromberg，N.(2001)InfectImmun.69，7224-7233.18.Hava，D.L.，Hemsley，C.J.和Camilli，A.(2003)J.Bacteriol.185，413-421.19.Hava，D.L.和Camilli，A.(2002)Mol.Microbio1.45，1389-1406.20.Schwarz-Linek，U.,Hook，M.和Potts，J.R.(2004)MolMicrobiol.52，631-641.21.Hemsley，C，Joyce,E.，Hava，D丄，Kawale，A.禾卩Camilli,A.(2003)J.Bacteriol.185，6640-6647.22.Sj0str0m，K.，Spindler，K.，Ortqvist，A.，Kalin，M.，Sandgren，A.和HenriquesNormark,B.(2006)Clin.Infect.Dis.，印刷中.23.Lau，P.C.Y.，Sung，C.K.，Lee，J.H.，Morrison,D.A.禾卩Cvitkovitch，G.D.(2002)J.Microbiol.Methods49，193-205.24.Sung，C.K.，Li，H.，Claverys，J.P.禾卩Morrison,D.A.(2001)Appl.Environ.Microbiol.61，5190-5196.25.Bricker，A,L.和Camilli，A.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.172，131-135.26.Albiger，B.，Sandgren，A.，Katsuragi，H.，Meyer-Hoffert，U.，Beiter，K.，Wartha,F.，Hornef，M.，Normark,S.禾卩HenriquesNormark，B.(2005)Cell.Microbiol.7，1603-1615.27.Fernebro，J,，Andersson，L，Sublett，J.，Morfeldt，E.，Novak，R.，Tuomanen，E.，Normark,S.禾卩HenriquesNormark,B.(2004)J.Infect.Dis.189，328-338.28.Gosink，K.K.，Maim,E.R.，Guglielmo，C，Tuomanen,E.I.禾口Masure，H.R.(2000)Infect.Immun.68，5690-5695.29.Iannelli，F.，Pearce，B.J.和Pozzi，G.(1999)J.Bacteriol.181，2652-2654.其它实施方式现已描述了本发明的许多实施方式。然而，应该知道可作出各种改进而不脱离本发明的构思和范围。权利要求1.一种分离的链球菌菌毛。2.如权利要求l所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛是肺炎链球菌菌毛。3.如权利要求2所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛包含RrgB蛋白。4.如权利要求1或2所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛的分子量为2x106-3x106Da。5.如权利要求1或2所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛通过酶消化或机械剪切与细胞分离。6.如权利要求5所述的菌毛，其特征在于，所述机械剪切包括超声波处理。7.如权利要求1或2所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛基本上游离于细菌细胞。8.—种免疫原性组合物，所述组合物包含一种或多种权利要求1或2所述的菌毛。9.一种产生如权利要求1或2所述菌毛的方法，所述方法包括使产生菌毛的细菌细胞经历酶消化或机械剪切并分离该细胞的菌毛。10.—种分离革兰氏阳性细菌菌毛的方法，所述方法包括使产生革兰氏阳性细菌菌毛的细菌细胞经历酶消化或机械剪切；和分离该细胞的菌毛。11.一种分离肺炎链球菌菌毛的方法，所述方法包括使产生肺炎链球菌菌毛的细菌细胞经历酶消化或机械剪切；和分离该细胞的菌毛。12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述机械剪切包括超声波处理。13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，利用变溶菌素进行所述酶消化。14.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，分离包括一个或多个密度梯度离心或层析步骤。15.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括降低多分散性。16.—种特异性结合革兰氏阳性菌毛的抗体。17.—种特异性结合肺炎链球菌菌毛的抗体。18.如权利要求16或17所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合型抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。19.如权利要求16或17所述的抗体，其特征在于，所述抗体被标记。20.如权利要求19所述的抗体，其特征在于，所述标记是酶、放射性同位素、对比剂、毒素或荧光团。21.如权利要求17所述的抗体，其特征在于，相比于所述抗体与未形成复合物的菌毛蛋白结合，所述抗体优先与菌毛复合物结合，所述菌毛蛋白选自RrgA、RrgB或RrgC。22.如权利要求17所述的抗体，其特征在于，所述抗体不与未形成复合物的RrgA、RrgB或RrgC特异性结合。23.—种诱导抵御革兰氏阳性细菌的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的革兰氏阳性细菌菌毛给予对象。24.—种诱导抵御肺炎链球菌的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的肺炎链球菌菌毛给予对象。25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述菌毛是分离的。26.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述对象是人。27.—种检测对象中革兰氏阳性细菌感染的方法，所述方法包括化验所述对象的样品中是否存在针对革兰氏阳性细菌菌毛的抗体。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，与菌毛组分相比，所述抗体优先结合菌毛复合物。29.—种检测对象中肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括化验所述对象的样品中是否存在针对肺炎链球菌菌毛的抗体。30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，与菌毛组分相比，所述抗体优先结合菌毛复合物。31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血清。32.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是人。33.—种检测对象中革兰氏阳性细菌感染的方法，所述方法包括使样品与权利要求16所述的抗体接触并检测该抗体与样品组分的结合情况。34.—种检测对象中肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括使样品与权利要求17所述的抗体接触并检测该抗体与样品组分的结合情况。35.—种治疗具有革兰氏阳性细菌感染的对象的方法，所述方法包括将有效量的特异性结合革兰氏阳性细菌菌毛的试剂给予对象。36.—种治疗具有肺炎链球菌感染的对象的方法，所述方法包括将有效量的特异性结合肺炎链球菌菌毛的试剂给予对象。37.如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，所述试剂是抗体。38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合型抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断革兰氏阳性细菌与细胞的粘附。40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断肺炎链球菌与细胞的粘附。41.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，所述细胞是上皮细胞。42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述上皮细胞是肺或鼻咽上皮细胞。43.如权利要求37所述的方法，其特征在于，相比于所述抗体与未形成复合物的菌毛蛋白结合，所述抗体优先与菌毛复合物结合，所述菌毛蛋白选自RrgA、RrgB或RrgC。44.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述抗体不与未形成复合物的RrgA、RrgB或RrgC特异性结合。45.如权利要求38所述的方法，其特征在于，与对照相比，检测肺炎链球菌与A549肺上皮细胞粘附的试验检测到所述抗体阻断至少50%的肺炎链球菌与该细胞粘附。46.如权利要求41所述的方法，其特征在于，与对照相比，检测肺炎链球菌与A549肺上皮细胞粘附的试验检测到所述抗体阻断至少50%的肺炎链球菌与该细胞粘附。47.如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，所述对象是人。48.—种测定具有肺炎链球菌感染的对象的治疗进程的方法，所述方法包括化验所述对象的样品中是否存在针对肺炎链球菌菌毛的抗体；和根据该抗体的存在与否选择治疗进程。49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如果未检测到存在所述抗体，给予所述对象抗生素试剂。50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如果检测到存在所述抗体，给予所述对象抗炎药。51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述对象是人。52.—种包含某种多肽的分离的菌毛或菌毛样多聚体，所述多肽包含肺炎链球菌菌毛蛋白的最多含30个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列。53.如权利要求52所述的菌毛或菌毛样多聚体，其特征在于，最多含20个氨基酸取代、插入或缺失。54.如权利要求52所述的菌毛或菌毛样多聚体，其特征在于，最多含IO个氨基酸取代、插入或缺失。55.如权利要求52所述的菌毛或菌毛样多聚体，其特征在于，最多含5个氨基酸取代、插入或缺失。56.如权利要求52-55中任一项所述的菌毛或菌毛样多聚体，其特征在于，所述氨基酸取代、插入或缺失是氨基酸取代。57.如权利要求56所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。58.如权利要求52所述的菌毛或菌毛样多聚体，其特征在于，所述蛋白是RrgA、RrgB或RrgC。59.—种在细胞中表达抗-肺炎链球菌菌毛抗体的方法，所述方法包括在该细胞中表达编码该抗-肺炎链球菌菌毛抗体的核酸。60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述抗-肺炎链球菌菌毛抗体不与未形成复合物的RrgA、RrgB或RrgC特异性结合。61.—种从含肺炎链球菌的样品中纯化肺炎链球菌的方法，所述方法包括a)提供与固体支持物结合的亲和基质，所述亲和基质包含权利要求17所述的抗体；b)使所述样品与所述亲和基质接触以形成亲和基质-肺炎链球菌复合物；c)将所述亲和基质-肺炎链球菌复合物与所述样品的剩余部分分开；和d)从亲和基质释放所述肺炎链球菌。62.—种将细胞毒性试剂或诊断试剂递送至肺炎链球菌的方法，所述方法包括a)提供与权利要求17所述抗体或其片段偶连的细胞毒性试剂或诊断试剂；和b)使所述肺炎链球菌与所述抗体-试剂或片段-试剂偶连物接触。63.—种鉴定肺炎链球菌活性调节剂的方法，所述方法包括使易受肺炎链球菌感染的细胞与候选化合物和肺炎链球菌接触；和测定肺炎链球菌活性是否受抑制，其中肺炎链球菌活性受抑制表明是肺炎链球菌抑制剂。64.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌活性是肺炎链球菌与A549肺上皮细胞粘附。65.—种鉴定肺炎链球菌菌毛结合调节剂的方法，所述方法包括使易与肺炎链球菌菌毛结合的动物细胞与候选化合物和具有肺炎链球菌菌毛的细菌细胞接触；和测定该细菌细胞与该动物细胞的结合是否受抑制，其中结合活性受抑制表明是肺炎链球菌菌毛结合的抑制剂。66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是分离的或培养的。67.—种鉴定肺炎链球菌菌毛结合调节剂的方法，所述方法包括使易与肺炎链球菌菌毛结合的细胞与候选化合物和肺炎链球菌菌毛接触，，和测定该菌毛与该细胞的结合是否受抑制，其中结合活性受抑制表明是肺炎链球菌菌毛结合的抑制剂。68.—种鉴定肺炎链球菌菌毛结合调节剂的方法，所述方法包括使易与肺炎链球菌菌毛结合的细胞与候选化合物和肺炎链球菌菌毛蛋白或其细胞结合片段接触；和测定该菌毛蛋白或其片段与该细胞的结合是否受抑制，其中结合活性受抑制表明是肺炎链球菌菌毛结合的抑制剂。69.—种分离肺炎链球菌菌毛的方法，所述方法包括使产生肺炎链球菌菌毛的肺炎链球菌细胞经历超声波处理或裂解酶消化；分开非细胞组分；和分离肺炎链球菌菌毛。70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述裂解酶是变溶菌素。71.如权利要求69所述的方法，其特征在于，采用密度梯度离心分离非细胞组分。72.如权利要求69所述的方法，其特征在于，产生肺炎链球菌菌毛的所述肺炎链球菌细胞是肺炎链球菌TIGR4细胞。73.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用核酸酶降解核酸。74.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用凝胶过滤层析分离肺炎链球菌菌毛来降低多分散性。75.如权利要求1-7中任一项所述的菌毛，其特征在于，所述菌毛包含3根原纤丝。全文摘要提供了从包括肺炎链球菌在内的革兰氏阳性细菌中分离菌毛或菌毛样结构的方法以及含有这种分离菌毛的组合物。这些组合物可用作产生抗体和免疫刺激的免疫原性组合物。还提供了抑制肺炎链球菌的方法，以及鉴定肺炎链球菌抑制剂的方法。文档编号C07K14/195GK101484464SQ200780013158公开日2009年7月15日申请日期2007年2月16日优先权日2006年2月17日发明者A·科瓦茨,I·费林希,M·希勒林曼申请人:诺华有限公司