专利名称：骨吸收抑制用食品原材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物。本发明的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物具有骨吸收抑制作用，因而作为以 骨疾病的预防或治疗、骨强化等为目的的骨吸收抑制剂以及作为用于骨疾病的预防或治疗 或者抑制骨吸收的药品、饮食品和饲料的有效成分非常有用。
背景技术：
近年来，伴随着高龄化，骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病具有增加的倾向。在 骨组织中，不断进行着骨生成和骨吸收，在年轻时骨生成和骨吸收保持着良好的平衡，但随 着年龄的增长，由于各种原因该平衡倾向于骨吸收(解偶联)。并且，长时间持续该状态的 话会使得骨组织变脆，导致发生骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病。认为如果能够防止 该解偶联，则能够预防骨质疏松症、骨折、腰痛等各种骨疾病。以往，作为防止解偶联、预防或治疗各种骨疾病的方法，曾进行了以下方法(1) 食物补钙，(2)轻微运动，(3)日光浴，(4)药物治疗等。对于食物补钙，使用碳酸钙、磷酸钙 等钙盐以及蛋壳、鱼骨粉等天然钙制剂。然而，它们未必能称作适合经口摄取的原材料。对 于轻微运动而言，认为慢跑或散步等较佳，但体弱的情况下即便是轻微的运动也非常麻烦， 而且卧床的老人更是几乎无法运动。从补充活化维生素D3的观点来看，日光浴是很好的， 但仅靠日光浴是不够的。药物投与中使用Ia-羟基维生素D3、降钙素制剂等，已知其对骨 质疏松症的治疗是有效的。然而，这些物质本身是药品，不能作为食品原材料使用。本发明人等为了获得能够作为食品原材料使用的具有骨强化作用的物质，对存在 于乳中的骨强化因子进行了持续的探索。结果发现，从乳清蛋白质的水溶性级分除去了乳 清来源的盐而得的蛋白质和肽混合物具有骨强化作用(例如，参照专利文献1)。并且，发现 对该蛋白质和肽混合物的水溶液进行乙醇处理、加热处理、加盐处理、超滤膜处理而得的级 分具有促进成骨细胞增殖的作用和骨强化作用(例如，参照专利文献2、3)。另外，发现存在 于乳中的碱性蛋白质具有促进成骨细胞增殖的作用、骨强化作用和防止骨吸收的作用(例 如，参照专利文献4)。专利文献1 日本专利3160862号公报专利文献2 日本专利3092874号公报专利文献3 日本特开平5-320066号公报专利文献4 日本专利3112637号公报
发明内容
发明要解决的问题本发明发现了一种能够作为食品原材料使用的、具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质 级分或乳蛋白质级分分解物，其课题在于提供一种含有该具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质 级分或乳蛋白质级分分解物的骨吸收抑制剂，以及提供配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物的药品、饮食品和饲料。用于解决问题的方案本发明人等尝试对新的骨吸收抑制原材料进行探索，结果发现获得了与以往的食品原材料相比显示出更强的骨吸收抑制作用的级分。并且，基于这些见解，以致获得了含有 该具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物的骨吸收抑制剂、以及配合 有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物的药品、饮食品和饲料。本发明为包含下述方案的发明。(A)涉及一种具有以下特性的乳蛋白质级分(1)其为乳来源；(2)其为含有在十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分子量在 12，000 16，000道尔顿范围内的蛋白质的级分；(3)构成氨基酸的组成中含有18 20重量％的碱性氨基酸、且碱性氨基酸/酸性 氨基酸的比在0.7 0.9的范围内；(4)具有骨吸收抑制作用。(B) 一种乳蛋白质级分分解物，其通过用蛋白酶将前述乳蛋白质级分分解而获得。(C) 一种骨吸收抑制剂，其含有(A)所述的乳蛋白质级分或(B)所述的乳蛋白质级 分分解物。(D) 一种骨吸收抑制用药品，其配合有(A)所述的乳蛋白质级分或(B)所述的乳蛋 白质级分分解物。(E) 一种骨吸收抑制用饮食品，其配合有(A)所述的乳蛋白质级分或(B)所述的乳 蛋白质级分分解物。(F) 一种骨吸收抑制用饲料，其配合有㈧所述的乳蛋白质级分或⑶所述的乳蛋 白质级分分解物。发明的效果本发明的以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物为有效 成分的骨吸收抑制剂、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分 解物的药品、饮食品和饲料，通过经口摄取，可在体内抑制骨吸收。因此，本发明的以乳蛋白 质级分为有效成分的骨吸收抑制剂、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分的药 品、饮食品和饲料，由于可在人或动物的生物体内抑制骨吸收，因而具有骨强化作用，且对 于抑制骨质疏松症等骨量减少有效。
图1所示为测定尿中骨吸收标志即脱氧吡啶啉(de0Xypyridin0line，DPD)量的尿 中总量和肌酸酐所对应的DPD浓度的结果的图(试验例2)。
具体实施例方式本发明涉及以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物为有 效成分的骨吸收抑制剂、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分 分解物的药品、饮食品和饲料。
本发明的这种乳蛋白质级分例如能够通过如下方式获得使脱脂乳或乳清等乳原 料与阳离子交换树脂接触，用0. 3M的食盐溶液清洗后，用0. 6M的食盐洗脱液使吸附于该 树脂上的乳蛋白质洗脱从而获得。另外，作为盐类，除了食盐以外可以使用钾盐、铵盐、磷 酸盐、醋酸盐、碳酸盐等，通过将清洗液的离子强度适当调整为0. 3 0. 4、将洗脱溶液的离 子强度适当调整为0. 55 0. 65，能够获得本发明的乳蛋白质级分。另外，还可以通过将该 洗脱级分回收，利用反渗透(RO)膜或电渗析(ED)法等进行脱盐和浓缩，并根据需要进行 干燥来获得。作为反渗透(RO)膜，可以例示Desal-3 (Desalination公司制)、HR-95 (Dow Danmark公司制)、NTR-729HF(日东电工公司制)等。另外，电渗析(ED)装置可以例示Yuasa Ionics Inc.或日本炼水公司制的电渗析装置。另外，作为获得乳来源的微量蛋白质级分的方法，已知有如下方法在使乳或乳来 源的原料与阳离子交换体接触后，用PH超过5、且离子强度超过0. 5的洗脱液使吸附于该 阳离子交换体上的碱性蛋白质级分洗脱，从而获得乳来源的微量蛋白质级分的方法〔日本 特开平5-202098号公报〕；使用海藻酸凝胶而获得的方法〔日本特开昭61-246198号公报〕； 使用无机多孔性颗粒从乳清中获得的方法〔日本特开平1-86839号公报〕；使用硫酸化酯化 合物从乳中获得的方法〔日本特开昭63-255300号公报〕等。本发明中，以这样的方法可以 获得乳来源的蛋白质级分。这样回收的乳蛋白质级分通常可以通过冷冻干燥等粉末化后使用。本发明中使用的具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分优选其构成氨基酸的组成中含有18 20重量％的碱性氨基酸、且碱性氨基酸/酸性氨基酸的比在0. 7 0. 9的 范围内。若在该范围之外的话，无法发挥本申请发明的效果。另外，本发明品为以分子量 12，000 16，000道尔顿、等电点10以上的蛋白质为主要成分的蛋白质混合物。乳蛋白质级分分解物具有与乳蛋白质级分同样的氨基酸组成，例如，可以通过使 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶作用于通过上述方法获得的乳蛋白质级分，进 而根据需要用胰酶等蛋白酶作用，从而能够获得平均分子量在4，000以下的分解物。另外， 乳蛋白质级分分解物通常可以通过冷冻干燥等粉末化后使用。作为成为具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级分的供给源的乳或乳来源的原料，可 以使用牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等乳，可以直接使用这些乳，或者也可以使用这些乳的还元 乳、脱脂乳、乳清等。在投与本发明的骨吸收抑制剂时，可以将作为有效成分的具有骨吸收抑制作用的 乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物以其原本的状态使用，也可以根据常规方法制剂为粉 末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、饮用剂等而使用。此外，还可以将这些乳蛋白质级分或乳蛋白 质级分分解物直接或者制剂化后，将其配合到营养剂或饮食品等中，从而谋求抑制骨吸收。 另外，本发明的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物对于热比较稳定，因而还能够在通常 进行的加热杀菌条件下加热杀菌。本发明中，为了发挥骨吸收抑制作用，可以考虑体重、性别和年龄等而适当确定配 合量，通常在成人的情况下，可以将本发明品即乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物的配 合量等调整为每天摄取1 50mg。这样，本发明品在低用量下也具有效果。通过经口摄取 将本发明的具有骨吸收抑制作用的成分制成骨吸收抑制剂、或者配合有其的药品、饮食品 和饲料，从而发挥骨吸收抑制作用。
以下，示出参考例、实施例和试验例来详细说明本发明，但它们仅仅例示出本发明 的实施方式，本发明并不受这些例子的任何限制。[参考例1]
根据以下方法(参照日本专利第3112637号)，调制可确认骨强化效果的市售乳蛋 白质级分。用去离子水充分清洗填充有0. 5升作为阳离子交换树脂的磺化Chitopearl (富士 纺绩制)的直径IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未杀菌脱脂乳通过该柱后，用去离 子水充分清洗该柱，使含有0. 95M氯化钠的0. 05M磷酸缓冲液(ρΗ7. 0) 2. 5升通过该柱从而 使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。然后，通过反渗透(RO)膜处理对该洗脱液脱盐、浓缩后，进 行冷冻干燥，获得粉末状的乳蛋白质级分。重复该操作2次，获得104g的蛋白质级分。该 蛋白质级分的等电点为7. O 8. 5，该蛋白质级分中所含的碱性氨基酸为17. 8%。实施例1用去离子水充分清洗填充有0. 5升作为阳离子交换树脂的磺化Chitopearl (富 士纺绩制)的直径IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未杀菌脱脂乳通过该柱后，用含 有0. 3M氯化钠的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)充分清洗该柱，然后，使含有0. 55M氯化钠的 0.05M磷酸缓冲液(pH7. 0)2. 5升通过该柱从而使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。然后，通过 反渗透(RO)膜处理对该洗脱液脱盐、浓缩后，进行冷冻干燥，获得粉末状的乳蛋白质级分。 进行5次该操作，获得37. 4g的乳蛋白质级分。该级分的分子量为12，OOO 16，OOO道尔 顿，等电点为10以上，该乳蛋白质级分中所含的构成氨基酸中，碱性氨基酸为18 20%。 另外，碱性氨基酸/酸性氨基酸的比为0. 7 0. 9。实施例2用去离子水充分清洗填充有0. 5升作为阳离子交换树脂的磺化Chitopearl (富士 纺绩制)的直径IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未杀菌脱脂乳通过该柱后，用含有 0. 4M氯化钠的0. 05M磷酸缓冲液(ρΗ7. 0)充分清洗该柱，使含有0. 65M氯化钠的0. 05M磷 酸缓冲液(PH7. 0)2. 5升通过该柱从而使吸附于树脂上的蛋白质洗脱。然后，通过反渗透 (RO)膜处理对该洗脱液脱盐、浓缩后，进行冷冻干燥，获得粉末状的乳蛋白质级分。进行3 次该操作，获得22. Sg的乳蛋白质级分。该级分的分子量为12，OOO 16，OOO道尔顿，等电 点为10以上，该乳蛋白质级分中所含的构成氨基酸中，碱性氨基酸为18 20%。另外，碱 性氨基酸/酸性氨基酸的比为0. 7 0. 9。实施例3将实施例1中得到的乳蛋白质级分37. 4g溶解于10升蒸馏水中后，以2%的浓度 添加胃蛋白酶(关东化学制)，在37°C下边搅拌1小时边进行水解。接着，用氢氧化钠溶液 中和至PH6.8后，添加胰酶(Sigma公司制)，在37°C下反应2小时。反应后，在80°C下 加热处理10分钟而使酶失活，然后获得乳蛋白质级分分解物36. 2g。实施例4将实施例2中得到的乳蛋白质级分22. 8g溶解于8升蒸馏水中后，以2%的浓度添 加胰蛋白酶(关东化学制)，在37°C下边搅拌1小时边进行水解。接着，用氢氧化钠溶液中 和至PH6.6后，添加胰酶(Sigma公司制)，在37°C下反应2小时。反应后，在80°C下加 热处理10分钟而使酶失活，然后获得乳蛋白质级分分解物21. lg。
[试验例1]关于参考例1和实施例1中得到的各乳蛋白质级分，按照高田等的方法[Takada， Y. et al.，Bone and Mineral, vol. 17，pp. 347-359，1992]对骨吸收抑制作用进行了研究。 将出生后10 20天的ICR系小鼠的长骨摘出，除去软组织后，将骨在含5%胎牛血清的 α -MEM溶液中机械性粉碎，得到包含破骨细胞的全部骨髓细胞。将该细胞通过含5%胎牛 血清的α-MEM溶液在象牙片上点出约2Χ IO6个细胞。数小时后，加入添加了试验试样的 含5%牛胎血清的α-MEM溶液，培养5天，研究存活的破骨细胞的骨吸收活性。另外，骨吸 收的评价通过如下方式来进行，即培养后，剥离象牙片上的细胞，用苏木精染色，通过图像 解析来测定骨吸收窝的面积。以试样空白作为对照，以对照的骨吸收窝的面积为100%时的 各试样的面积％来表示骨吸收活性。其结果如表1所示。
表 1 可确认与对照组和参考例1中得到的乳蛋白质级分相比，本发明的乳蛋白质级 分(实施例1)具有显著的骨吸收抑制作用。[试验例2]关于参考例1和实施例1中得到的各乳蛋白质级分，通过动物实验研究了骨吸收 抑制作用。动物实验中使用了 6周龄的Wistar系雌性大鼠。在1周的预备饲育后，实施卵 巢摘除手术，然后以低钙饲料(钙含量0.3% )饲育5周，处于恢复期间，然后，供于动物实 验。另外，摘除了卵巢、并以低钙饲料(AIN-76baSe)饲育了 5周的大鼠明显处于骨质疏松 症的状态。将产生了该骨质疏松症状态的大鼠以1组8只分别分配到下述3个试验组未 添加乳蛋白质级分的对照组(A组)、添加了 0. 1重量％的参考例1中得到的乳蛋白质级分 的投与组(B组)、添加了 0.1重量％的实施例1中得到的乳蛋白质级分的投与组(C组)， 分别用表2所示的试验饲料饲育4个月。另外，用酪蛋白调整各试验饲料的氮含量，使其具 有相同的氮含量(17. 06% )0表 2 对于饲育了 4个月的大鼠，在最后的1周，用代谢笼回收尿，用 osteolinks "DPD"(Sumitomo Seiyaku Biomedical Co. ,Ltd.制造)测定尿中存在的骨吸 收标志即脱氧吡啶啉(DPD)量(尿中总量)。此外，当用每天的排泄量不依赖于尿量的肌酸 酐量来修正上述DPD浓度时，能够算出作为不依赖于尿量的骨吸收标志的更准确的DPD量。 这里，尿中的肌酸酐浓度用Creatinine-testWako (和光纯药工业公司制造)进行测定，通 过算出肌酸酐对应的DPD浓度而进行了修正。投与4个月后的尿中骨吸收标志即脱氧吡啶 啉(DPD)的尿中总量和肌酸酐对应的DPD浓度的测定结果，如图1所示。由此可知，在1周 的DPD总量和肌酸酐修正后的DPD浓度的任一者方面，与对照组(A组未添加乳蛋白质级 分)相比，参考例1中得到的乳蛋白质级分投与组(B组)、实施例1中得到的乳蛋白质级分 投与组(C组)均表现出较低的值。虽然参考例1中得到的乳蛋白质也确认出具有骨吸收 抑制效果，但本发明品的该作用明显更强。另外，虽然没有示出实验结果，但在使用了实施例3和实施例4中得到的乳蛋白质 级分分解物的情况下也确认到了同样的效果。实施例5在IOOmg实施例1中得到的乳蛋白质级分中添加93. 4g水合晶体葡萄糖、5g碳酸 钙、Ig糖酯、0. 5g香料，混和，然后压片制成片状，制造本发明的骨吸收抑制剂。实施例6以表3所示的组成混合各成分并制成生面团，成形后进行烘焙，制造骨吸收抑制 用饼干。
表 3_小麦粉50. 0 (重量％ )砂糖20. 0食盐0. 5人造黄油12. 5蛋12. 1水4. 0碳酸氢钠0. 1碳酸氢铵0. 2碳酸钙0. 5乳蛋白质级分粉末(实施例1) 0. 1_实施例7制造表4所示的组成的骨吸收抑制用果汁饮料。表 4_混合异构化糖15. 0 (重量％ )果汁10. 0柠檬酸0. 5乳蛋白质级分粉末(实施例1) 0. 5香料0. 1 丐0. 1/K73.8_实施例8根据表5所示的配方混合原料，制造骨吸收抑制用狗饲育饲料。表 5_乳蛋白质级分粉末(实施例1) 2. 5(重量％ )脱脂乳粉13. 5豆饼12. 0豆油4. 0玉米油2. 0棕榈油27. 0玉米淀粉14. 0小麦粉9.0麸皮2.0维生素混 合物9.0
矿物质混合物2.0纤维素3.0_实施例9以表6所示的组成混合各成分，加压成形，调制配合有实施例3中得到的乳蛋白质级分分解物的骨吸收抑制用片剂。表 6_水合晶体葡萄糖59.4(重量％)乳蛋白质级分分解物(实施例3)16. 0玉米淀粉12.0纤维素4.0玉米油4.0维生素混合物(含胆碱)1. 0矿物质混合物3.6_实施例10以表7所示的组成混合各成分，在乳化温度85°C下乳化，调制配合有实施例4中得 到的乳蛋白质级分分解物的骨吸收抑制用加工乳酪。表 7_高达干酪43.0(重量％)切达干酪43.0柠檬酸钠2.0乳蛋白质级分分解物(实施例4) 0. 5乳来源的钙1.0/K10. 5_产业上的可利用性本发明的乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物由于具有骨吸收抑制作用，而且对 于抑制骨质疏松症等骨量减少有效，因此，能够制成以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白质级 分或乳蛋白质级分分解物为有效成分的骨吸收抑制剂、以及配合有具有骨吸收抑制作用的 乳蛋白质级分或乳蛋白质级分分解物的骨吸收抑制用药品、饮食品和饲料使用。
权利要求
一种乳蛋白质级分，其具有以下(1)～(4)的特性(1)其为乳来源；(2)其为含有在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分子量在12,000～16,000道尔顿范围内的蛋白质的级分；(3)构成氨基酸的组成中含有18～20重量％的碱性氨基酸、且碱性氨基酸/酸性氨基酸的比在0.7～0.9的范围内；(4)具有骨吸收抑制作用。
2.一种乳蛋白质级分分解物，其通过用蛋白酶将权利要求1所述的乳蛋白质级分分解 而获得。
3.一种骨吸收抑制剂，其含有权利要求1所述的乳蛋白质级分或权利要求2所述的乳 蛋白质级分分解物。
4.一种骨吸收抑制用药品，其配合有权利要求1所述的乳蛋白质级分或权利要求2所 述的乳蛋白质级分分解物。
5.一种骨吸收抑制用饮食品，其配合有权利要求1所述的乳蛋白质级分或权利要求2 所述的乳蛋白质级分分解物。
6.一种骨吸收抑制用饲料，其配合有权利要求1所述的乳蛋白质级分或权利要求2所 述的乳蛋白质级分分解物。
全文摘要
本发明的具有以下(1)～(4)特性的乳蛋白质级分，其骨吸收抑制作用优异、在骨疾病的预防或治疗中非常有用。(1)其为乳来源。(2)其为含有分子量在12,000～16,000道尔顿范围内的蛋白质的级分。(3)构成氨基酸的组成中含有18～20重量％的碱性氨基酸、且碱性氨基酸/酸性氨基酸的比在0.7～0.9的范围内。(4)具有骨吸收抑制作用。
文档编号C07K14/47GK101868475SQ200880114098
公开日2010年10月20日 申请日期2008年10月28日 优先权日2007年11月1日
发明者上辻大辅, 小野爱子, 日暮聪志, 松山博昭, 森田如一, 芹泽笃 申请人:雪印乳业株式会社