一类抗血小板聚集肽及其应用的制作方法

专利名称：一类抗血小板聚集肽及其应用的制作方法
一类抗血小板聚集肽及其应用本发明涉及一种具有旋光性的多肽类物质及其在心脑血管中的应用，属医药化 工领域。
背景技术：
血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人 的血小板数为每立方毫米10 30万)，血小板的功能主要是促进止血和加速凝血，同 时血小板还有维护毛细血管壁完整性的功能。血小板聚集功能亢进对引起和加重心肌缺 血是非常重要的因素。血小板被启动发生聚集，除参与血栓形成外，聚集时TXA2水平 升高还可引起冠脉痉挛，引起微血栓，形成心肌微血管阻塞，使心肌微循环发生障碍。 血小板聚集性增高的疾病常见于心脑血管疾病，如冠心病、心肌梗死、心绞痛、脑梗 塞、缺血性中风及外周血管病等，还有高胆固醇血症、糖尿病和肾脏病等。抑制血小板 聚集功能对抑制动脉血栓形成、心脑血管疾病和各种血栓栓塞性疾病的防治都具有重要意义。孔毅(Toxicon，54(2009) 103-109)等在蛇毒中发现了三肽类化合物焦谷氨
酸-天冬酰氨-色氨酸，研究了其药效，发现该化合物具有明显的抗血小板聚集作用和抗 血栓形成作用。氨基酸序列的改变和构型的改变会影响化合物的药效和半衰期，天然蛋白都是 由L型氨基酸构成的，L型氨基酸构建的自组装短肽具有较好的生物相容性，在体内被 L型酶降解。而D型氨基酸的自组装短肽一般不能被L型酶降解(Luo Z.，Zhao X., Zhang S.Macromol.Biosci.[J], 2008，8(8) 785-791),体内稳定存在的时间相对较长。 如细胞壁中含有的D氨基酸的细菌可以防止被蛋白水解酶消化掉；同时，含有D天冬 氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、亮氨酸等D型氨基酸的多肽，因具有抗菌活性而应用于临床 (Wakayama M, Yoshimune K, HiroseY, et al J.M ol.Catal. (B)，En.[J], 2003，23: 71 78)。本发明合成了旋光性的D和L型氨基酸组成的多肽类化合物，并研究了其作用。

发明内容
本发明的目的是提供一类具有旋光性的三肽化合物，特别是这些化合物具有抗 血小板聚集的作用。本发明的另一个目的是提供一类具有旋光性的三肽化合物，特别是采用固相合 成、柱分离的方法得到目标化合物。Fmoc固相合成是以Fmoc为保护基保护氨基酸，逐 步完成接肽反应的一种方法。由于脱Fmoc保护基以及将产物从树脂上切下时反应条件温 和，副反应少，所以Fmoc固相合成法已经被广泛采用。本发明以6种旋光性的氨基酸 即L-色氨酸[(L) Trp]、D-色氨酸[(D) Trp]、L-天冬酰氨[(L) Aot]、D-天冬酰氨[(D) Asn], L-焦谷氨酸[(L) Pyr]、D-焦谷氨酸[(D) Pyr]及其保护氨基酸为原料，选用2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl chloride resin)，Fmoc固相合成法为技术基础，从C端(羧
基端)向N端(添加氨基酸)进行系列多肽的合成。本发明的另一个目的是提供一类具有旋光性的三肽化合物，特别是将这些化合 物制成临床需要的口服制剂或注射剂。技术方案本发明采用固相合成的技术，选用旋光性的氨基酸及其保护氨基酸为原料合成 了多肽，将这些多肽加入到富血小板血浆，同时加入诱导剂，测定其聚集率，发现本发 明的多肽化合物都具有较强的抗血小板聚集功能。一种具有下式(1)的含有三个氨基酸序列的多肽，或其药学上可接受的盐[Xai]-[Xa2]-[Xa3] (1)当Xa1 为(D)Pyr 时，Xa2 为(L)Aot 或(D) Asn，Xa3 为(L)Trp 或(D)Trp ；或者，Xa2为(L)Trp 或(D) Trp，Xa3 为(L)Asn 或(D)Asn ；当Xa1S (L)Pyr 时，Xa2 为(L) Trp 或(D) Trp，Xa3 为(L) Aot 或(D)Asn;或者，Xa2为(D) Aot，Xa3 为(L) Trp 或(D)Trp;或者，Xa2S(L)Asn,Xa3 为(D)Trp;其中(L)和(D)分别代表左旋和右旋氨基酸。其多肽类化合物为(D) Pyr- (L) Trp- (D) Asn ；
(D) Pyr- (D) Trp- (L) Asn ；(D) Pyr- (L) Trp- (L) Asn ；(D) Pyr- (D) Trp- (D) Asn ；(D) Pyr- (L) Asn- (L) Trp ；(D) Pyr- (D) Asn- (D) Trp ；(D) Pyr- (L) Asn- (D) Trp ；(D) Pyr- (D) Asn- (L) Trp ；(L) Pyr- (D) Trp- (D) Asn ；(L) Pyr- (L) Trp- (L) Asn ；(L) Pyr- (L) Trp- (D) Asn ；(L) Pyr- (D) Trp- (L) Asn ；(L) Pyr- (D) Asn- (D) Trp ；(L) Pyr- (D) Asn- (L) Trp ；(L)Pyr-(L)Asn-(D)Trp ；其中(L)和(D)分别代表左旋和右旋氨基酸。上述化合物具有抗血小板聚集的作用，并能用于治疗与血小板聚集相关的心脑 血管疾病，如缺血性中风、炎症、哮喘等相关的疾病上述多肽化合物加入适宜药用辅料，制成适用于临床的药物制剂。药物制剂 为片剂、口腔崩解片、分散片、缓控释片、胶囊、缓控释胶囊、冻干粉针、无菌分装粉 针、溶媒析晶粉针。有益效果本发明所涉及的多肽化合物结构中含有手性氨基酸，是一种新型的具有旋光性的多肽类化合物。本发明提供的旋光性三肽化合物具有很强的抗血小板聚集的作用，且 活性强于已公开的蛇毒中发现了三肽类化合物焦谷氨酸_天冬酰氨_色氨酸。实施方式合成过程中需要用到缩合试剂、切割试剂进行肽的链接及保护基团的除去，分 别如下所述。缩合试剂1)苯并三唑-N，N, N' , N'四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(分子量379.3)2)羟基-苯并三唑(HOBt)3) 二异丙基乙胺(DIEA)(分子量129.25)切割试剂1)三氟乙酸(TFA)2)三异丙基硅烷(TIS)具体实施例1 合成(D) Pyr- (L) Asn- (L) Trp(1)、树脂的活化称取1.0lg2-氯三苯甲基氯树脂放入小烧杯中，加入DMF溶胀30min后倒出一 半体积的DMF加入等体积的DCM再溶胀30min，倒入砂心漏斗后抽滤干.树脂的活化过 程中配制脱保护液取6ml呱啶(Pip)倒入棕色瓶中，后加入24mlDMF，混合放置。
(2)、Fmoc- (L) Trp (Boc)-树脂的制备称Fmoc-(L) Trp (Boc)-OH 1.74g用DMF溶解，溶解完全后。反应装置连好后通 氮气，将Fmoc-Trp(Boc)-OH的DMF溶液加入到含树脂的砂心漏斗中，后再加入DIEA 1.2ml，室温反应2小时。(3)、脱保护将反应后的树脂滤干，用DMF洗三次，抽滤干，加入脱保护试剂，反应 40min。反应完全后滤去反应液，将树脂用DMF洗涤。此间称Fmoc-(L) Aot(Trt)-OH 1.97g,缩合剂 HBTU1.44g(3.80mmol)，用 DMF 约 4ml 溶 lOmin。(4)、接第二个氨基酸(L)Aot将⑶步处理后的反应器中通氮气，加入再加入Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH和 HBTU的DMF溶液，氮气流速处于稳速状态，后加入1.2mlDIEA，反应2h.(5)、脱保护将接上第二个氨基酸的树脂用DMF洗4-5次，抽滤干，加入脱保护试剂反应 40min.(茚三酮显色法检测是否反应完全)，反应完全后滤去反应液，将树脂用DMF洗涤 滤干。此间称(D)PyrO.55g(4.26mmol)，缩合剂 HBTU1.44g,用 DMF 约 4ml 溶 IOmin0(6)、接第三个氨基酸(D)Pyr将(5)步处理后的反应器中通氮气，加入再加入(D) Pyr和HBTU的DMF溶液， 氮气流速处于稳速状态，后加入1.2mlDIEA，反应2h.(7)、切割切割试剂TFA 9ml，Tis 0.5ml，水0.5ml。将反应后的溶液用DMF洗4次， 无水甲醇1次，DCM2次，无水甲醇2次，每次洗涤不少于lmin，滤干。将树脂从反 应器中转移至三颈瓶中。抽滤干将抽干的树脂转移到三颈瓶中，加入切割试剂，磁力搅拌3h.将三颈瓶中的反应液用抽滤漏斗将其抽滤入圆底烧瓶中，树脂再加入含Iml TFA的 DCM溶液IOml洗涤树脂2次，收集滤液。在滤液中加入10倍体积的冰乙醚，有大量沉 淀析出，该沉淀即为目的多肽AAP，充分震荡后静置30min。用抽滤漏斗将乙醚抽干， 再将其放入真空干燥器中干燥24h，即得初产物，产率约59%。(8)、纯化用岛津色谱系统及Waiters Delta-Pak C1825 X IOOmm制备柱来制备纯品。色谱柱Delta-PakC1825 X 200mm流动相A液5%甲醇+水相中0.05%三氟乙酸B液95%甲醇+水相中0.05%三氟乙酸流速5ml/min检测波长214nm。进样量一次累计进样量为15ml，主峰分五次分别收集。将收集的各组分，分 别旋转蒸发，温度控制在40°C以下。在-40度的条件下冷冻干燥，除去组分中的甲醇和 三氟乙酸，即得高纯度的(D)Pyr-(L)Asn-(L)Trp。实施例 2 合成(D) Pyr- (L) Trp- (D) Asn以Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (L) Trp (Boc)-和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D) Pyr-(L) Trp-(D) Am。实施例3 合成(D) Pyr- (D) Trp- (L) Asn以Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (D) Trp (Boc)-和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D) Pyr-(D) Trp-(L) Am。实施例4 合成(D) Pyr- (L) Trp- (L) Asn以Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (L) Trp (Boc)-和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D) Pyr-(L) Trp-(L) Asn。实施例5 合成(D) Pyr- (D) Trp- (D) Asn以Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (D) Trp (Boc)-和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方法，合成得到(D) Pyr-(D) Trp-(D) Asn。实施例6 合成(D) Pyr- (D) Asn- (D) Trp以 Fmoc- (D) Trp (Boc) -、Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH 和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方法，合成得到(D) Pyr-(D) Am-(D) Trp。实施例 7 合成(D) Pyr- (L) Asn- (D) Trp以Fmoc- (D) Trp (Boc) _、Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH 和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D) Pyr-(L) Asn-(D) Trp。实施例8 合成(D) Pyr- (D) Asn- (L) Trp以Fmoc- (L) Trp (Boc) _、Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH 和(D) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D) Pyr-(D) Am-(L) Trp。实施例9 合成(L) Pyr- (D) Trp- (L) Asn以Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (D) Trp (Boc)-和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(D) Trp-(L) Asn。实施例10 合成(L) Pyr- (L) Trp- (L) Asn
以Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (L) Trp (Boc)-和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(L) Trp-(L) Am。实施例11 合成(L) Pyr- (L) Trp- (D) Asn以Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH> Fmoc- (L) Trp (Boc)-和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(D)Pyr-(L)Trp-(D)AM实施例 12 合成(L) Pyr- (D) Asn- (D) Trp以Fmoc- (D) Trp (Boc) _、Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH 和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(D) Asn-(D) Trp。实施例13 合成(L) Pyr- (D) Asn- (L) Trp以Fmoc- (L) Trp (Boc) _、Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH 和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(D) Asn-(L) Trp。实施例14 合成(L) Pyr- (D) Asn- (L) Trp以Fmoc- (L) Trp (Boc) _、Fmoc- (D) Asn (Trt) -OH 和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(D) Asn-(L) Trp。实施例15 合成(L) Pyr- (L) Asn- (D) Trp以Fmoc- (D) Trp (Boc) _、Fmoc- (L) Asn (Trt) -OH 和(L) Pyr 为原料按实施例 1 方 法，合成得到(L) Pyr-(L) Am-(D) Trp。实施例16抗血小板聚集活性测定(1)试剂的配制3.8%枸橼酸钠抗凝剂称取柠檬酸三钠0.95g，加蒸馏水溶解，并于25ml的容量瓶中定容。诱导剂ADP溶液称取二磷酸腺苷1.3mg，溶于Iml的蒸馏水中。称取15种上述实施例化合物各2mg，溶于2ml生理盐水中，配制成lmg/ml的 溶液。以(L) Pyr- (L) Asn- (L) Trp (浓度为 lmg/ml)为对照。(2)血小板的制备富血小板血浆的制备健康雌性兔3只，体重为(2.5士0.5)kg，兔颈动脉取血 80ml，用3.8%枸橼酸钠溶液与全血(1 9)混合抗凝，以500r/min离心3min，得到上层 液即富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP),余下血样以3000r/min离心lOmin，得到 贫血小板血浆(platelet poor plasma, PPP)。制备好的PRP应在2h内用完。(3)操作方法吸取300微升PPP调零，再吸取270微升PRP置于预热槽中，加入不同浓度的 受试品30微升，预热3分钟后置于测试区，加入诱导剂1.3mg/mlADP33微升，同时测 定5min内血小板聚集率。其中，空白对照为生理盐水。(4)、结果与讨论按照上述方法测定其5min内最大血小板聚集率，结果如下
权利要求
1.一种具有下式(1)的含有三个氨基酸序列的多肽，或其药学上可接受的盐 [Xai]-[Xa2]-[Xa3] (1)当 Xa1 为(D)Pyr 时，Xa2 为(L)Asn 或(D) Aot，Xa3 为(L)Trp 或(D)Trp ； 或者，Xa2 为(L)Trp 或(D) Trp，Xa3 为(L)Asn 或(D)Asn ； 当 Xa1 为(L)Pyr 时，Xa2 为(L)Trp 或(D) Trp，Xa3 为(L)Asn 或(D)Asn ； 或者，Xa2S (D) Asn，Xa3 为(L) Trp 或(D)Trp; 或者，Xa2S(L)Asn, Xa3 为(D)Trp; 其中(L)和(D)分别代表左旋和右旋氨基酸。
2.如权利要求书1所述的多肽，其多肽类化合物为 (D) Pyr- (L) Trp- (D) Asn ；(D) Pyr- (D) Trp- (L) Asn ； (D) Pyr- (L) Trp- (L) Asn ； (D) Pyr- (D) Trp- (D) Asn ； (D) Pyr- (L) Asn- (L) Trp ； (D) Pyr- (D) Asn- (D) Trp ； (D) Pyr- (L) Asn- (D) Trp ； (D) Pyr- (D) Asn- (L) Trp ； (L) Pyr- (D) Trp- (D) Asn ； (L) Pyr-(L)Trp- (L)Asn ； (L) Pyr- (L) Trp- (D) Asn ； (L) Pyr- (D) Trp- (L) Asn ； (L) Pyr- (D) Asn- (D) Trp ； (L) Pyr- (D) Asn- (L) Trp ；(L)Pyr-(L)Asn-(D)Trp;其中(L)和(D)分别代表左旋和右旋氨基酸。
3.如权利要求书1-2所述的多肽，其特征是用于治疗与血小板聚集相关的心脑血管疾 病，如缺血性中风、炎症、哮喘等相关的疾病。
4.如权利要求书1-2所述的多肽制成临床需要的口服制剂或注射剂。
全文摘要
本发明提供了一类抗血小板聚集的旋光性多肽类化合物，这类化合物由左旋或右旋的色氨酸、天冬酰氨、焦谷氨酸三种氨基酸组成，用于治疗与血小板聚集相关的心脑血管疾病，如缺血性中风、炎症、哮喘等相关的疾病。
文档编号C07K5/097GK102020699SQ200910034879
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月10日 优先权日2009年9月10日
发明者孔毅, 秦引林 申请人:秦引林