专利名称：一种血小板生成素拟肽冻干制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有血小板生成素拟肽的冻干粉针，以及相应的制备工艺。
背景技术：
慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种自身性免疫性疾病，由致血小板减少的一种自身免疫反应引起，其特征是血小板数降低，其患者面临出血高风险，往往导致患者小血管出血，症状为淤青、鼻出血和牙龈出血，严重者可出现致命性胃肠道和脑内出血。目前治疗ITP的主要手段是使用免疫抑制类药物，如皮质类固醇、静注免疫球蛋白、抗D免疫球蛋白和Genentech公司产品利妥昔单抗，而对严重衰竭性病人的最后一着则是行脾切除术。其中大多数治疗药物未曾经历随机安慰剂对照临床试验的考察，虽对不同患者群均有效，但同时也会产生严重的毒副反应，其作用机制是阻止血小板破坏，而非促进血小板产生。血小板生成素(TPO)为一种糖蛋白，主要产生于肝脏，在巨核细胞及血小板的产生中起着重要的调节作用。其与c-Mpl结合后可激活下游信号级联反应，从而导致巨核细胞的分化和增值，且伴随着血小板水平升高。第1代促血小板生成剂-糖基化全长重组人血小板生成素(rhTPO)和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长及发育因子(PEG-rHuMGDF)随之问世。其可促进健康受试者体内巨核细胞生成，并提高血小板数量，且在用于治疗癌症患者、 免疫性血小板生成素减少性紫癜患者及接受非清髓性化疗的癌症患者的研究中均获得了成功。然而，第1代促血小板生成剂可能会导致受试者体内产生抗TPO抗体，因而具有诱发血小板减少症的风险，糖基化全长重组人血小板生成素(rhTPO)和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长及发育因子(PEG-rHuMGDF)的开发被迫停止。此后研究人员在多肽文库中寻找随机、无相关性的多肽，企图可在不产生抗TPO抗体的情况下刺激依赖于TPO的细胞株；在尝试将筛选得到的多肽连接于各种载体分子，以增加其半衰期。由此开发出以血小板生成素拟肽为代表的第2代促血小板生成剂。血小板生成素拟肽在健康受试者及ITP患者中的试验均获得了成功，且试验中亦未见受试者体内产生抗TPO抗体。血小板生成素拟肽为一种新型重组蛋白，可特异性结合并激活血小板生成素 (TPO)受体c-Mpl，从而显著提高血小板水平。血小板生成素拟肽含有两个相同的亚单位， 每个亚单位分别由一个IgGl Fc结构区和c-Mpl结合区共价结合构成，且与TPO无氨基酸序列同源性，故不会在用药者体内产生抗TPO抗体。血小板生成素拟肽的生产是利用基因工程技术构建出血小板生成素拟肽原核表达菌株，采用发酵工程技术实现了血小板生成素拟肽高密度发酵，通过蛋白质复性和纯化技术纯化出符合药用级别的血小板生成素拟肽原液，配制成制剂。主要用于治疗脾切除及非脾切除的成人免疫性血小板减少症。但是，蛋白质药物的生物学活性受多种环境因素的影响，可能发生多种物理或化学变化，例如聚合、氧化和降解等现象，从而大大丧失活性。因此我们选择了适合的剂型、辅料、生产工艺，通过控制关键的工艺条件，使制的的产品保持了很高的活性和稳定性。中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，适合产业化生产。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种能稳定保存血小板生成素拟肽蛋白，并适合于实际临床使用的含有重组血小板生成素拟肽的冻干纷针。为达到发明目的，本发明采用的技术方案是
一种含有血小板生成素拟肽的冻干粉针，所述冻干粉针由血小板生成素拟肽与药用级稳定性辅料溶于PH5 6的缓冲液中得到，所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0. 1 Img/mL。血小板生成素拟肽原液由我公司制备，其制备方法在我公司申请的专利申请号为 201110235281.5中已有详细记载，在此不再獒述。所述稳定性辅料可根据需要适当添加。 本发明中优选稳定性辅料为甘露醇、甘氨酸和吐温80，优选甘露醇质量浓度为2-8%，更优选甘露醇质量浓度为5%。优选甘氨酸质量浓度为1_5%，更优选甘氨酸质量浓度为2. 5%。 优选吐温80体积浓度为0. 001%-0. 01%,更优选温80体积浓度为0. 005%。所述血小板生成素拟肽的蛋白浓度为0. 1 lmg/mL。所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、或柠檬酸缓冲液、或醋酸一醋酸钠缓冲液。所述缓冲液优选为醋酸一醋酸钠缓冲液，浓度为5 50mmol/L。优选的，所述冻干粉针由血小板生成素拟肽与甘氨酸溶于pH5 6的浓度为 5 50mmol / L醋酸-醋酸钠缓冲液中得到，所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0. 1 Img / mL，所述甘露醇质量浓度为2-8%，甘氨酸质量浓度为1 4%，吐温80体积浓度为 0.001%-0. 01%。更优选的，所述冻干粉针由血小板生成素拟肽蛋白与甘氨酸溶于pH5. 5、浓度 20mmol / L的醋酸-醋酸钠缓冲液中得到，所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0. 5mg / mL, 所述甘露醇质量浓度为5%，甘氨酸质量浓度为2. 5%，吐温80体积浓度为0. 005%。本发明所述的含有血小板生成素拟肽冻干粉针的有益效果主要体现在提供了一种能稳定保存血小板生成素拟肽蛋白的冻干制剂，并适合于产业化生产。
具体实施例方式为了提高含有血小板生成素拟肽药剂的稳定性，进行了深入的研究并且发现如果从合适的辅料挑选几种加入制剂中，并通过选择合适的PH及血小板生成素拟肽的蛋白浓度，则可以有效达到这个目的。在血小板生成素拟肽药剂稳定性研究过程中，选取了外观检测，SDS-PAGE电泳检测，反相高效液相色谱分析，生物活性检测等作为考察指标，来观察血小板生成素拟肽药剂的变化情况。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例1 缓冲系统对血小板生成素拟肽稳定性的影响
可注射药物制剂中PH是影响蛋白制品稳定性的一个重要因素。通过加入合适的缓冲盐类，来维持制剂PH。如加入磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等。为了考察不同pH条件下制剂的稳定性，按如下条件进行了不同PH条件对制剂稳定性的影响实验分别配制醋酸-醋酸钠缓冲体系，柠檬酸盐，磷酸盐缓冲体系，Iml /瓶(蛋白浓度为 0. 5mg/ml)，pH 设计有 4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0 浓度均为 20mmol/L，(见下表1)。通过使用SUPERDEX G-25脱盐柱将血小板生成素拟肽原液的缓冲体系替换成设计组，并将上述不同缓冲体系的血小板生成素拟肽溶液放置于37°C条件下存放进行稳定性试验，分别于7、14、观和60天取样检测电泳纯度(见表2)。检测方法；SDS-PAGE非还原电泳方法。 表1 不同缓冲体系的配制
权利要求
1.一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述冻干制剂由血小板生成素与药用辅料溶于PH5-6. 0的药用缓冲液中得到，所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0. I-Img/ ml;所述药用辅料为甘露醇、甘氨酸和吐温80，甘露醇质量浓度为2-8%，甘氨酸质量浓度为 1-5%,吐温80体积浓度为0. 001%-0. 01%。
2.如权利要求1所述的一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0. 5 mg/ml。
3.如权利要求1所述的一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述甘露醇质量浓度为5%，甘氨酸质量浓度为2. 5%，吐温80体积浓度为0. 005%。
4.如权利要求1-3任一所述的一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、或柠檬酸缓冲液、或醋酸-醋酸钠缓冲液。
5.如权利要求4所述的一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5 50mmol/L，优选20 mmol/L。
6.如权利要求5所述的一种血小板生成素拟肽冻干制剂，其特征在于所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为20 mmol/L。
全文摘要
本发明提供了一种血小板生成素拟肽冻干粉针剂，所述冻干制剂由血小板生成素与药用辅料溶于pH5-6.0的药用缓冲液中得到，所述血小板生成素拟肽蛋白浓度为0.1-1mg/ml;所述药用辅料为甘露醇、甘氨酸和吐温80，甘露醇质量浓度为2-8%，甘氨酸质量浓度为1-5%，吐温80体积浓度为0.001%-0.01%。该发明所述的含有血小板生成素拟肽的冻干制剂具有高效、简便、低成本，并适合于产业化生产。
文档编号A61K47/26GK102552184SQ201210034540
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者刘宁, 刘红军, 宋磊, 陈文芳 申请人:山东泉港药业有限公司