生物样本采集/运输组合物及方法

专利名称：生物样本采集/运输组合物及方法
技术领域：
本发明涉及用于采集、运输和储存含有核酸群的生物样品的组合物和方法，可随后用一种或多种常规方法或测定分离、纯化和/或表征所述核酸群。
背景技术：
在分子和诊断分析领域，不管样本是取自远程现场点、医生办公室还是实验室，保持生物样品中核酸(特别是那些包含在由人患者获得的诊断样品中的核酸)稳定的能力常常决定该核酸能否被成功分析。生物样品中的核酸在室温迅速降解和/或变性，通常必须储存在冰点温度下以保持稳定，然而，随着时间的推移仍然会发生某种程度的降解。当样本采集自远程现场点，或离医生办公室或实验室环境非常远的距离时，尤其是在进行样品分析之前持续稳定的冷却器/冰箱/冷藏室条件的获得可能受到限制或不能获得时，例如当电力或冰箱/冷藏设备的获得不可靠或不存在时，扩大了这一问题。当用于下游分析的所需核酸包括特别易于被内源性或外源性核酸酶活性降解的核糖核酸(RNA)时，进一步加剧与采集和处理希望由其获得核酸的生物样本相关的问题。市售样本运输方法通常使用专门的运输介质用于生物样品由采集点到分析点的运输，具体而言，限制样品可储存的时间的包装需要样品即使是在运输或延长储存期间持续保持在低温，实际上限制了采集点和诊断实验室之间的可能的时间和距离。除了有关样本的稳定性的担忧外，还常常另外存在关于储存和运输所采集样品中所用的试剂的处理和/或储存的担忧。例如，试剂本身常常需要低温或其它专门的维护以保持稳定性。例如，由于这些稳定性问题，将试剂运输到现场点、使用之前在现场点的储存以及将生物样本和试剂运回检验点是主要问题。操作生物样本时的另一个重要关注点，是活的有传染性的病原体或生物制剂由样本向环境的潜在接种、释放或传播。目前已经有在处理可能有传染性或另外引起健康或安全风险的样品时采用的特定方案。如果让样品保持有活力和/或生物学完整以保持其用于检测的完整性，则参与采集、运输和检验过程的个体可能暴露于高危传染物。另外，如果发生传染物释放，现场或样品采集场所附近的(或运输期间附近的)无辜旁观者可能处于暴露中。因此，所需的安全措施通常增加将所述样品从一个位置移动到另一个位置所需的费用和精力。直到最近，病原体检测的临床实验室方法还是费力、昂贵的过程，需要有特定经验的高度知识渊博和内行的科学工作者。大多数临床诊断实验室采用常规培养方法，所述方法通常需要3 7天来培养病毒，对于一些其它细菌靶标甚至需要更长时间。此外，常规的培养需要采集、运输及实验室增殖和处理有潜在传染性的生物制剂，例如依波拉、禽流感和严重急性呼吸综合征(SARS)等等。80年代中期，聚合酶链式反应(PCR)的出现使临床分子诊断领域发生了巨大的变化，但此后不久，90年代中期出现了实时PCR。使用例如实时定量PCR(qPCR)或逆转录酶 PCR(RT-PCR)及定量、实时、逆转录酶PCR(qRT-PCR)测定的基于核酸的检测平台，可在数小时内提供结果，与传统培养和分离方法需要数天相比，这使分子检测方法成为现代诊断实验室分析的支柱。检测化学的最新改良，例如新改良的报告/猝灭荧光染料、小沟结合剂(MGB) (TaqMan MGB , Applied Biosystems ；关于一般参考亦参见例如 Baraldi 等，Rire Appl. Chem. ,75(2-3) 187-194，2003)和稳定的扩增试剂，业已为更灵敏和高度特异性的核酸检测测定铺平了道路，并业已证明比落伍的基于细胞培养的方法更及时、更健全、更经济。在其它核酸检测策略方面的进展，例如转录介导的扩增、连接酶链反应(LCR)和所谓的 “芯片实验室”多重测定，也有助于临床实验室从培养瓶到微阵列的转变。几家商业公司(例如 Qiagen [Valencia, CA，USA]、Roche Applied Science[Indianapolis, IN,USA]>Gen-Probe[San Diego, CA, USA]禾口 bioMerieux[Durham, NC，USA])，已开发出用于自动化进行从样品分离到分子分析的核酸提取过程的仪器。例如， Tigris DTS (Gen-Probe, San Diego, CA, USA)使全部检测过程自动化，2004年年底由美国食品和药品管理局(FDA)批准用于同时检测砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和淋病奈瑟氏淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)，其使用 Gen-Probe 的 APTIMA C0MB0-2 扩增的核酸检验(NAT)测定。鉴于当代的检测和测定系统对高质量核酸样品的要求，目前本领域需要安全、容易的采集、储存和运输系统，所述系统保持包含在多种生物样品和样本中的核酸的完整性和质量。此外，目前亦需要在没有对一种或多种采集试剂、生物样品本身或包含其中的核酸群的冷藏、冷冻或其它特殊处理的情况下，持续长时间在周围环境(即非理想的)条件下于远程或野外地点采集、保存和运输样品(尤其是那些含有有害的或病原生物体的样品)。而且，目前需要更经济和更方便的采集/运输/储存介质，所述介质最大限度减少病原体暴露于工作人员或无辜旁观者的风险，允许使用单步制剂，并有助于含有高保真度、高质量核酸群的生物样本长距离或长时间方便地进行环境运输。发明概述本发明包括新的有用的组合物以及制备和使用所述组合物的方法，所述组合物可有利地改进用于从一种或多种生物来源中制备核酸的常规采集、裂解、运输和储存方法。因此，本发明有利地提供采集和保存的制剂，用以灭活和裂解含有核酸的生物样本，并保存生物样本内的核酸(例如RNA或DNA)，优选全部在单一反应容器中，使得至少基本上保持并优选完全保持核酸的完整性，以便可容易地获得部分核酸用于分子诊断分析。本发明的另一优点是，所述制剂可以使得分离或释放出的核酸能够至少基本上保持稳定，而无需持续稳定的冷却器温度，例如冷藏或冷冻。本文揭示的一步制剂(one-step formulation)实现以下主要功能使样品内的病原体失活或被杀死；裂解细胞并从细胞分离或释放核酸；灭活内源或外源核酸酶及其它细胞酶以防止存在于样品中的核酸的降解；和促进在环境温度下采集和处理样品，在随后的样品运输和储存期间稳定核酸，通过使用基因组外、无义RNA载体分子保存样品的完整性，所述载体分子也用作内部阳性对照(IPC)以监测被处理样品的保真度。单步制剂优选在单一反应区或反应容器中实现所有这些所需功能的能力，是优于目前可用方法的特别显著的优势。目前已有的技术不包括单步组合物，所述单步组合物供用于使含有核酸的生物组分灭活，通过裂解细胞并分离或释放核酸来释放核酸，保持释放的核酸群和定量样本保真度的适宜IPC的完整性。本发明既稳定存在于用于诊断测试的样本中的核酸又保持所述核酸的完整性，同时还提供用于监测采集介质保真度的便利方法，所述方法采用容易检测的、可定量的RNA载体分子。本发明的一步制剂允许优选同时使含有核酸的生物组分灭活、裂解和分离或释放核酸、稳定和保存。在一个实施方案中，灭活、裂解和分离或释放、稳定和保存中的一些或所有都序贯进行。然而，在优选实施方案中，这些功能中的大多数或优选全部同时发生。在所有实施方案中，将一步制剂与样品混合以启动这些功能。这与以前的技术形成对比，以前的技术中灭活不一定发生，并且裂解、稳定和保存发生在连续的分开步骤中，每一步骤通常使用分开加入的一种或多种截然不同的试剂及方案。与需要许多序贯步骤以使误差最小化、避免试剂不相容性并提供对结果的逐步控制的先前的核酸分离方法不同，本发明在单一步骤制剂中提供所有这些好处，而且还增加了更多的好处保持核酸完整性，通过使用内部无义RNA载体分子监测储存/采集/运输过程的保真度，促进样品核酸的更高提取和纯化效率，以及改善其最终收率。本发明的一步制剂优选促进同时灭活含有核酸的生物组分、裂解并从细胞碎片释放核酸、稳定和保存核酸， 降低生物样品内含有的核酸群在裂解之前、期间或之后可能发生的降解的几率。开发并优化了所揭示的组合物以1)促进从临床或环境样本制备高质量核酸；2) 灭活、杀死或以其它方式中和生物样品中潜在的有传染性的病原体，以促进安全处理及运输所采集的样本；和3)长时间稳定释放出的(即“裸的”)DNA/RNA而不会水解或核酸酶降解释放的核酸。本文所述组合物理想地用于临床、现场和调度应用，或用于大体积样品的采集/ 提取。在一种或多种所揭示组合物中采集的样本是生物灭活的，可安全地运输，通常甚至不需要冷藏或干冰。在某些实施方案中，考虑加入核酸(例如RNA和/或DNA)以有益于所揭示方法的多种目的和应用a)作为“载体”(先前已显示加入少量的补充RNA/DNA以提高/增加样品/样本的总收率，特别是对可能含有低量靶标的原始样本(即细胞、病毒和细菌)的总收率)；b)作为IPC用于下游分子过程，并跟踪或监测来自待检测的采集样品的核酸制品的保真度；和c)用于与下游定量分析例如qRT-PCR等的“校准物(calibrator)，，比较。在所述实施方案中，可将一种或多种已知的或“对照”核酸以终浓度为约lag-约lmg，更优选约 Ifg-约1 μ g，还更优选约Ipg-约Ing加入到组合物中。在阐明性实施方案中，本发明提供分离的单链(ss)或双链(ds)RNA、DNA、PNA或其杂合体，其可用作(a)载体分子用于帮助从怀疑含有核酸的生物样品回收多核苷酸；和 /或(b)IPC(即“已知的”、“报告分子”、“对照”、“标准品”或“标记”)序列以监测样本采集的完整性和保真度及多核苷酸的分离/稳定。在某些实施方案中，本发明提供可用作载体分子和/或IPC的分离的dS-RNA、ds-DNA、ds-PNA或其杂合体。在另外的实施方案中，本发明提供可用作载体分子和/或IPC序列的分离的SSRNA、SSDNA、SSPNA或其杂合体。在例示性实施方案中，本发明提供既可用作载体分子又可用作IPC序列的分离的ssRNA分子。所述分子可自天然来源分离，在实验室制备，或作为备选，可以是含有天然和非天然序列两者的杂合体。如本文所述，因为本发明组合物尤其可用于自怀疑含有病原体源的多核苷酸的哺乳动物(特别是人)来源获得的生物样本的分离和表征，因此优选作为载体和/或阳性对照化合物采用的一种或多种序列，基本上含有通常不能在哺乳动物基因组内或对所述哺乳动物为致病的生物体的基因组内发现的一级核苷酸序列。例示性的哺乳动物包括但不限于牛、绵羊、猪、狼、犬、马、猫、熊、鼠、狮子、野兔、山羊和非人灵长类。优选这种非哺乳动物、非病原体特异性的载体/报告序列不可交叉反应，即基本上不能或优选不能与哺乳动物或病原体特异序列杂交，因此，在配制对照/载体序列中特别优选非编码、非简并(即无意义)序列，以使对照/载体序列与自采集的样本获得的分离多核苷酸群的成员的杂交减到最低。因此，例示性的载体/对照序列基本上不与或优选不与自哺乳动物基因组分离的多核苷酸群结合(即在严格杂交条件下杂交)，或不与自对哺乳动物为致病的细菌、真菌、病毒基因组分离的多核苷酸群结合。本领域普通技术人员已知的例示性的严格杂交条件包括但不限于以下所述或与其等同的杂交条件(a)用含有约5X SSC、0. 5% SDS 和 1. OmM EDTA (pH 8.0)的溶液预洗涤；(b)于 5X SSC 中在约 60°C -约 70°C 温度下杂交过夜；和(c)随后用含有0. SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC各自在约65°C -约 70°C温度下洗涤20分钟。尽管可在本发明组合物中和具体而言在本文揭示的制剂(例如PSS制剂)中使用任何实用长度的载体分子，但优选载体分子的长度为约40-约900个核苷酸长；更优选约50-约800或作为备选约60-约700个核苷酸长；还更优选约70-约600或作为备选约 80-约500个核苷酸长；甚至更优选约90-约400个核苷酸或作为备选约100-约300个左
右核苷酸长。因此，预期所有多核苷酸的中间长度落入本公开内容范围内，包括但不限于以下长度的载体分子序列约45个核苷酸长、约50个核苷酸长、约55个核苷酸长、约60个核苷酸长、约65个核苷酸长、约70个核苷酸长、约75个核苷酸长、约80个核苷酸长、约85个核苷酸长、约90个核苷酸长、约95个核苷酸长、约100个核苷酸长、约120个核苷酸长、约 140个核苷酸长、约160个核苷酸长、约180个核苷酸长、约200个核苷酸长、约220个核苷酸长、约240个核苷酸长、约260个核苷酸长、约280个核苷酸长或甚至约300个左右核苷酸长。尽管预期任何实际的、无义/最低限度交叉杂交的多核苷酸序列可用于制备载体序列，以促进在其中期需对照序列的情况下改进多核苷酸靶标群的分离，但对所述分子的一级核酸序列有额外的要求，即该序列必须是可用一种或多种常规分子生物学技术检测和
/或定量的。为此，本发明提供至少含有与适合检测的探针特异性杂交(即结合)的第一序列域的载体/报告分子，所述探针包括但不限于分子标记探针及其衍生物。例示性的标记探针为包含分子领域普通技术人员已知的放射性的、发光的、化学发光的、荧光的、酶的、磁性或自旋共振的标记的探针。在阐明性实施方案中，标记探针至少含有第一小沟结合剂。在某些实施方案中，为了促进常规可检测标记探针的结合，本发明的载体/报告分子至少含有与至少第一可检测探针特异性结合的约10-约60个核苷酸长的第一序列域。尽管第一序列域可以是完整载体序列中的任何实用长度，但优选第一序列域为约 12-约50个核苷酸长；更优选为约14-约45个核苷酸长；还更优选约16-约40个左右核苷酸长；还更优选约18-约30个左右核苷酸长。因此，预期探针杂交序列域的所有中间长度落入本公开内容范围内，包括但不限于以下长度的探针结合域约13个核苷酸长、约14个核苷酸长、约15个核苷酸长、约16个核苷酸长、约17个核苷酸长、约18个核苷酸长、约19个核苷酸长、约20个核苷酸长、约21个核苷酸长、约22个核苷酸长、约23个核苷酸长、约M个核苷酸长、约25个核苷酸长、约 26个核苷酸长、约27个核苷酸长、约观个核苷酸长或甚至约四或30个左右核苷酸长。当期需可通过一种或多种基于扩增的方法(包括但不限于基于PCR的方法)来检测载体/报告序列时，可期需载体/报告序列的其它的分子特征，即序列或至少其部分可用一种或多种基于聚合酶链的测定扩增。例如，对于基于PCR或FRET的方法，可期需载体/ 报告分子至少含有与正向PCR扩增引物(通常约20-约40个核苷酸长)特异性结合的第二序列域和与反向PCR扩增引物(通常也是约20-约40个核苷酸长)特异性结合的第三序列域。优选第二和第三序列域可操作地定位，以促进在有效扩增核酸区段的至少第一部分的条件下自正向和反向引物进行所述至少第一部分的PCR引导扩增。当期需可通过一种或多种基于非对称性扩增的方法(包括但不限于不对称PCR、 分子杂交、基于亲和标记的方法等)检测载体/报告序列时，并不一定需要一对正向和反向引物结合域一用适当的诊断测定，仅单一的第二序列域可足以检测该载体序列。在所述实施方案中，可采用单一的检测/复制引物(或聚合酶结合域)。通常所述序列域为约15-约 35个左右核苷酸长，但利用常规的分析方法可采用任何常规的靶定域。在分子领域认为所述域的设计和一级序列为日常工作，因此在普通技术人员的知识范围内。在某些实施方案中，视IPC序列长度和一级核苷酸而定，第一序列域与第二、第三序列域或甚至与第二和第三序列域两者共享至少第一共有核苷酸序列区。所述序列重叠可能只是一个或多个核苷酸，或作为备选，为由5到10个或更多个核苷酸组成的较大重叠区域。在例示性的实施方案中，可通过一种或多种适当的分子生物学技术来制备IPC序列，包括例如通过包含对照序列或作为备选包含与对照序列本身互补的核酸序列的多核苷酸的体外转录。如以下实施例所述，制备对照序列的一种方法包括制备DNA双链体，可从该 DNA双链体合成单链RNA对照序列。例示性的单链RNA对照序列包括但不限于那些含有下列RNA序列中的至少约105 个、至少约95个、至少约85个、至少约75个、至少约65个、至少约55个、至少约45个、至少约35个或至少约25个左右相邻核苷酸的序列5 ‘ -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGG CAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO :2)。在阐明性实施方案中，分离的单链核糖核酸分子可通过包括多核苷酸体外转录的过程制备，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2的核酸序列，或大体上由或作为备选由SEQ ID NO 2的核酸序列组成。在一个所述实施方案中，单链RNA对照序列可从DNA序列体外合成，所述DNA序列含有来自以下序列的至少约90个、至少约80个、至少约70个、至少约60个、至少约50个、 至少约40个、至少约30个或至少约20个或更少的相邻核苷酸5 ‘ -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGG CAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO 1)。在例示性的实施方案中，分离的单链核糖核酸分子可通过包括多核苷酸体外转录的过程制备，所述多核苷酸包含SEQ ID NO :1的核酸序列，或大体上由或作为备选由SEQ ID NO :1的核酸序列组成。本发明一方面提供用于检测自用所揭示的样品采集/储存制剂制备的生物样品获得的多种多核苷酸内RNA载体分子存在与否的方法，所述制剂包括但不限于本文所述的一种或多种制剂，包括但不限于PSS制剂。还有用于定量测定样品中RNA载体分子的量并监测制剂在稳定和保护所分离多核苷酸的分子保真度方面的有效性的方法。通过比较经过一段时间后样品中剩余的载体分子的量和存在于初始溶液中的载体分子的已知量，人们可以测定载体分子在存在于生物样品期间遭受的降解量。人们可以利用这种相关性，估计自原始样品释放出的多核苷酸群随着时间的推移已发生降解的程度。另一方面，本发明提供用于快速检测生物样品中的特定多核苷酸序列例如IPC序列的方法。从整体和一般意义上看，该方法包括使用常规方法例如PCR和对靶序列特异的正向和反向引物扩增怀疑含有特定序列的核苷酸群，特异性探针套与得到的单链PCR产物杂交，进行解链曲线分析，并分析单链PCR产物与杂交探针的杂合体的Tm变化。在一个实施方案中，本发明提供用于利用基于PCR的方法快速检测多核苷酸(例如载体IPC序列)的存在情况的方法，所述方法通常包括以下步骤(a)从待分析的样品分离多核苷酸；(b)通过利用对靶标序列特异的引物套的PCR扩增多核苷酸；(c)让一种或多种对目的多核苷酸特异的标记探针与自步骤(b)获得的单链PCR产物杂交；和(d)检测样品中标记探针的存在情况，其表示分离的多核苷酸群中特定靶标序列的存在情况。用标记“探针”序列检测多核苷酸的一种所述方法利用荧光共振能量转移(FRET) 过程。例示性的FRET检测方法往往涉及包含供体荧光团和受体荧光团的荧光团对，其中供体荧光团能够向受体荧光团传递共振能量。在例示性的FRET测定中，供体荧光团的吸收光谱基本上不与受体荧光团的吸收光谱重叠。本文所用“供体寡核苷酸探针”，是指用荧光共振能量转移对的供体荧光团标记的寡核苷酸。本文所用“受体寡核苷酸探针”，是指用荧光共振能量转移对的受体荧光团标记的寡核苷酸。本文所用“FRET寡核苷酸对”，通常包括 “锚定”或“供体”寡核苷酸探针和“受体”或“传感器”寡核苷酸探针，当供体寡核苷酸探针和受体寡核苷酸探针二者都与其互补靶标核酸序列杂交时，所述寡核苷酸对形成FRET关系。用作荧光共振能量转移对的可接受的荧光团对为本领域技术人员所熟知，包括但不限于荧光素/罗丹明、藻红蛋白/Cy7、荧光素/Cy5、荧光素/Cy5. 5、荧光素/LCRed 640及荧光素/LC Red 705等等。可用例如计算机程序例如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc.， Cascade, CO,USA)来设计用于扩增特定IPC序列的引物。尽管任何实用长度的引物可用于本发明实践中，但寡核苷酸引物一般为约10-约60个左右核苷酸长(包括但不限于所有的中间整数，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59或甚至60或更多个核苷酸长)。本发明还提供用于提高自怀疑含有多核苷酸的生物样品获得纯化的这类多核苷酸群的效率的方法。从整体和一般意义上看，所述方法包括让样品与组合物以足以提高自生物样品获得纯化的多核苷酸群的效率的量和时间接触，所述组合物包含一种或多种本文所述的制剂(包括但不限于PSS制剂)及载体和/或IPC核酸区段。在例示性的实施方案中，生物样品中多核苷酸群的完整性，和/或自样品获得的多核苷酸中的至少一种的至少第一序列的保真度，在以下情况下至少基本上得以保持(即所述群中至少75%的核苷酸基本上为全长)当包含样品的组合物在约-20°C到约40°C温度下储存约7到约14天或更长时间时；或者，在约-20°C到约40°C温度下储存约7到约14
11天或更长时间时；或者作为备选在约20°C到约40°C温度下储存约14到约30天或更长时间时。或者，生物样品中多核苷酸群的完整性至少基本上得以保持，如使得当与最初采集样品时存在于溶液中的量相比时，群体中的核苷酸至少约80%、至少约85%、至少约 90%或至少约95%或更多存在于溶液中。在优选实施方案中，样品的完整性基本上得以保持，使得所有或几乎所有存在于原始样品中的多核苷酸会随着时间得以保持(即无可检测到的降解)。在所揭示方法的实施中，优选从采集时间到分离、纯化或表征其中的多核苷酸群的时间，不到约20%的原始存在于所采集的样品中的多核苷酸群在随后的储存期间随着时间而被降解。优选基本上不到约15%的原始存在于所采集的样品中的多核苷酸群在随后的储存期间随着时间而被降解，更优选不到约10%的原始存在于所采集的样品中的多核苷酸群在随后的储存期间随着时间而被降解，还更优选不到约5%的原始存在于所采集的样品中的多核苷酸群在随后的储存期间随着时间而被降解。在特别优选的实施方案中，不超过约5%、约4%、约3%、约2%或约的原始存在于所采集的样品中的多核苷酸群在随后的储存期间随着时间而被降解。优选不管样品的储存条件如何皆如此高完整性保存样品质量，并且可基本上保持以下时间至少约7天、至少约14天、至少约21天、至少约30天、至少约45天、至少约60天或甚至至少约90天或更长。用于采集、储存和/或运输可自其获得一种或多种核酸群的生物源样品的所揭示方法，亦可进一步任选包括一个或多个步骤，所述步骤包括但不限于(a)分析和/或定量测定自样品获得的一种或多种多核苷酸；(b)检测所采集样品中载体分子(即IPC)的存在情况；(c)测定所采集样品中的IPC量；和/或(d)测量所采集样品中IPC的序列保真度， 或测定所采集样品中IPC的降解百分比。尽管可用分子领域普通技术人员已知的任何常规方法测定自本发明实践获得的或在本发明实践中利用的特定多核苷酸序列的存在情况、完整性或序列保真度，但在一个实施方案中，使用PCR扩增方法。同样地，目的多核苷酸完整性的测定可包括在给定条件下PCR循环阈值(Ct)的测定，所采集的核酸的序列保真度、定性完整性的测定可通过常规的DNA或RNA测序方法测定，所述方法包括但不限于Maxam-Gilbert的基于化学的方法、 Sanger等的双脱氧链终止法、Mathies等的基于染料荧光团的方法或Nyren和Ronaghi所述的焦磷酸测序技术。本发明例示性的制剂包括一步采集溶液，所述溶液裂解生物样品、稳定自该生物样品制备的核酸和保存所述核酸的完整性，用于后续RNA和/或DNA分离、检测、定量、扩增和/或分析。在某些实施方案中，将本发明的无义载体/IPC组合物调配在一步样品采集/储存 /运输介质中，所述介质包括a) —种或多种离液剂(优选每种在组合物中存在的量为约 0. 5M-约6M) ；b) 一种或多种洗涤剂(优选每种在组合物中存在的量为约0. -约)； c) 一种或多种螯合剂(优选每种在组合物中存在的量为约0. OlmM-约ImM) ；d) 一种或多种还原剂(优选每种在组合物中存在的量为约0. 05M-约0. 3M)；和e) —种或多种消泡剂 (优选每种在组合物中存在的量为约0. 0001% -约0. 3% )。例示性的离液剂包括但不限于硫氰酸胍(GuSCN)、盐酸胍(GuHCl)、异硫氰酸胍(guanidine isothionate)、硫氰酸钾(KSCN)、碘化钠、高氯酸钠、尿素或其任意组合。另外的例示性离液剂和离液盐的描述可参见美国专利号5，234，809(通过对其明确引用以其整体具体结合于此)。例示性的洗涤剂包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDQ、十二烷基硫酸锂(LDS)、牛磺脱氧胆酸钠(NaTDC)、牛磺胆酸钠(NaTC)、甘氨胆酸钠(NaGC)、脱氧胆酸钠(NaDC)、胆酸钠、烷基苯磺酸钠(NaABQ、N-十二烷酰肌氨酸(NLQ、羧酸盐类(即皂类)、磺酸盐类、硫酸盐类、磷酸酯类和多磷酸酯类、烷基磷酸酯类、单烷基磷酸酯(MAP)、全氟羧酸盐类、包括美国专利号5，691，四9(通过对其明确引用以其整体具体结合于此)所述的那些在内的阴离子洗涤剂或其任意组合。例示性的还原剂包括但不限于2-巯基乙醇(β -ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、 二硫苏糖醇(DTT)、甲酰胺、二甲亚砜(DMSO)或其任意组合。在优选实施方案中，还原剂包括或为TCEP。例示性的螯合剂包括但不限于乙二醇四乙酸(EGTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N，N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵(ammonium bicitrate)、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任意组合。在优选实施方案中，螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或其组合。在更优选的实施方案中，螯合剂包括EDT。本发明的组合物可进一步包含消泡剂，以防止通常因制剂中存在洗涤剂引起的泡沫的形成。消泡剂有助于移取和处理所揭示的组合物。例示性的表面活性剂/消泡剂包括但不限于椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱(cocoamidopropyl hydroxysultaine), 烷基氨基丙酸、咪唑啉羧酸酯类(imidazoline carboxylates)、甜菜碱、磺基甜菜碱 (sulfobetaine)、磺基甜菜碱(sultaines)、烷基酚乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、聚氧乙烯化聚氧化丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、长链羧酸酯、链烷醇酰胺(alkonolamides)、叔炔属二醇(tertiary acetylenic glycols)、聚氧乙烯化硅酮、N-烷基吡咯烷酮、烷基多糖苷 (alkylpolyglycosidases)、硅酮聚合物例如Antifoam A. 或聚山梨醇酯例如Tween 或其任意组合。在优选实施方案中，消泡剂包括硅酮聚合物。任选本发明的组合物可进一步包含一种或多种缓冲剂(优选每一种在最终组合物中存在的量为约ImM-约1M)。例示性的缓冲剂包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MEQ、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1，3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、3-(环己氨基)-1-丙磺酸 (CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、4_ (2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、 3- (N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、3- (N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(M0PS0)、哌嗪-N，N ‘-双 (2-羟基)丙磺酸(P0PS0)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPQ、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸 (TES)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、 N-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)JjS 嗪-1，4-双O-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐或其任意组合。在优选的实施方案中， 缓冲剂包括柠檬酸盐。
期需包含一种或多种所述任选但优选的缓冲剂以控制制剂的pH，因为已发现核酸提取在PH约5到7的范围内最佳。优选选择所揭示组合物中采用的一种或多种缓冲剂以在pH约6-pH约8的范围内提供显著的缓冲能力，更优选在pH约6-约7范围内，还更优选在pH约6. 2-约6. 8的范围内。在例示性的实施方案中，I^rimeStore 溶液(本文也称为 “PSS”)的 pH 优选约为 6. 9 士 0.25。本发明组合物亦可任选进一步包含一种或多种短链(优选1-6个碳[即C1-C6]) 醇)烷醇(优选每种在组合物中存在的量为约-约25%，但若需要的话可使用更高百分比的醇)。例示性的短链烷醇包括直链和支链醇，例如而不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任意组合。本发明的组合物亦可进一步任选包括一种或多种另外的化合物或试剂，包括但不限于阳离子官能化的两性离子化合物，例如甜菜碱(包括但不限于N，N, N-三甲基甘氨酸、椰油酰胺丙基甜菜碱等等)、类蛋白(包括但不限于卵清蛋白及牛、马或人源血清白蛋白)和渗透剂(包括但不限于三甲胺N-氧化物(ΤΜΑ0)、二甲基巯基丙酸内盐 (dimethylsulfoniopropionate)、肌氨酸和糖类或糖醇，包括但不限于海藻糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露醇、山梨醇、福寿草醇等等)。优选本发明的组合物提供充分的缓冲能力以适当稳定自样品获得的多核苷酸群， 最优选在配制期间缓冲到PH约6. 4-6. 9，并当样品与本文所述储存/采集制剂接触时让分离的多核苷酸群保持在相似的PH范围内。本发明组合物通常至少基本上并优选完全让样品中存在的任何内源或外源RNA 酶或DNA酶失活，使得样品中的核酸在样品采集、裂解、储存和运输期间基本上免于任何降解并优选不降解或不丧失完整性，以用于后续的体外或体内分析。本发明的储存/运输/采集组合物的例示性的制剂阐述于本文实施例中，包括但不限于包括以下的组合物，其包含约4M离液剂(例如硫氰酸胍、盐酸胍、异氰酸胍或其任意组合)、约10-30mM的螯合剂(例如EGTA、HEDTA, DTPA, NTA、EDTA、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任意组合)、约 0. 25%的洗涤剂(例如 SDS、LDS、NaTDC, NaTC, NaGC, NaDC、胆酸钠、NaABS, NLS 或其任何盐或组合)、约0. IM的还原剂(例如β -ME、DTT, DMSO,甲酰胺、TCEP或其任意组合)和约0. 1 %的表面活性剂/消泡剂(例如硅酮聚合物[例如Antifoam A ]或聚山梨醇酯[例如Tween ]或其任意组合)。本发明样本采集组合物的另外的例示性制剂包括但不限于以下组合物，其包含约 3M的离液剂(例如硫氰酸胍、盐酸胍、异氰酸胍或其任意组合)、约lmM-0. 5M的还原剂(例如β -ME、TCEP,甲酰胺、DTT、DMSO或其任意组合)、约1_约IOmM的螯合剂(例如EGTA、 HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任意组合)、约0. 25%的洗涤剂(例如SDS、LDS、 NaTDC、NaTC、NaGC、NaDC、胆酸钠、NaABS、NLS或其任何盐或组合)和任选但优选约0. 0002% 的消泡剂(也称为防沫剂)(例如硅酮聚合物或聚山梨醇酯或其任意组合)以及约IOOmM 的缓冲剂(例如Tris、MES、BES、Bis-Tris, HEPES, MOPS、碳酸氢盐、柠檬酸盐、磷酸盐或其任意组合)。所揭示的多核苷酸分离和稳定组合物的另一种例示性制剂，包括但不限于以下组合物，其包含约1-约4M的离液剂，例如硫氰酸胍、盐酸胍或异氰酸胍；约0. 5-100mM的螯合剂，例如EDTA或柠檬酸钠，或两者；约0. 1-约1 %的阴离子洗涤剂，例如SDS或N-十二烷酰肌氨酸钠盐；约0. 001-0. 0001%的表面活性剂或润湿剂，例如硅酮聚合物、Antifoam A ；约10-约500mM的缓冲剂，例如Tris-HCl ；和约10-约25%的短链烷醇，例如乙醇。在特定实施方案中，本发明提供以下组合物，其包含约2. 5M硫氰酸胍；约0. 5mM TCEP ；约IOmM柠檬酸钠；约0. 4% N-十二烷酰肌氨酸钠盐；约0. 0002% Antifoam A ；约 IOOmM Tris-HCl ；约 0. ImMEDTA ；以及约 23% 乙醇。本发明还提供用于自怀疑含有核酸的样品获得多核苷酸群的方法。该方法通常涉及在对自样品获得多核苷酸群有效的条件下，让样品与一定量的所揭示的组合物之一混合 (associate) 0本发明不需要分离该群来“获得”样品，因为随后的诊断可能需要或可能不需要这样的分离。本发明还提供制备本文所述采集/裂解/运输/储存组合物的一步水性制剂用于采集核酸例如RNA和/或DNA的方法。从整体意义来看，该方法通常涉及在反应区中于约20°C -90°C温度下将一种或多种离液剂与无核酸酶水混合；然后在该反应区中让溶解的一种或多种离液剂与一种或多种还原剂、一种或多种螯合剂以及一种或多种洗涤剂混合， 以形成中间组合物；任选让硅酮聚合物以足以使在进一步制备一步水性制剂期间的泡沫形成减到最少的量与中间组合物混合；将足量的缓冲剂与中间组合物混合以保持约6-6. 9的 PH ；任选将第二螯合剂加至反应区；然后将第二中间组合物的温度升高到约60-95°C达约 1-30分钟，并使温度降至环境条件；然后任选让C^6醇与反应区中的内容物混合；和任选调节 pH 至约 6. 4-6. 9。在另外的实施方案中，本发明提供用于制备适合自怀疑含有核酸的生物样品或样本获得多核苷酸群的一步水性制剂的方法。该方法通常涉及至少以下步骤a)让样品与以下量的一步水性制剂接触，所述量有效于i)至少基本上杀灭样品中潜在的有传染性的病原体或使其失活；ii)至少裂解部分细胞以自样品释放RNA和/或DNA ；和iii)至少基本上抑制或防止样品中释放的多核苷酸进一步水解或酶促降解、修饰或失活，以便自样品获得多核苷酸群。优选本发明方法至少包括让样品与一定量的一种或多种所揭示的组合物在 O0C -约40°C温度下(更优选在4°C -约35°C温度下，还更优选在10°C -约30°C温度下) 接触至少M小时的时期，更优选至少48小时、至少72小时、至少96小时或更长的时期，而不导致包含在与所述组合物接触的样品中的核酸实质上变质、降解、酶促切割和/或溶核消化、修饰或加工。在某些实施方案中，本发明的方法至少包括让样品与一定量的一种或多种所揭示的组合物在约0°C -约40°C温度下(更优选在约4°C -约35°C温度下，还更优选在约 IO0C -约30°C温度下，还更优选在约15°C -约25°C温度下)接触至少7天的时期，更优选至少14天、至少21天、至少28天或甚至更长的时期，而不导致包含在如此处理的样品中的核酸显著变质、降解、酶促切割和/或溶核加工。应该理解，让样品与本发明组合物混合只需要进行短时间，但为了避免立即分离来自样品的核酸和本发明一步组合物的需要，所有材料可在以上规定的时期保持接触而没有任何实质的核酸降解或没有任何核酸降解。
优选基本上保持自样品释放到组合物中的多核苷酸群的完整性，即使是当包含样品的组合物储存在环境温度下和甚至持续延长的时期时，所述时期包括但不限于储存大于约10天、大于约20天或甚至大于约30天或更长。同样地，期望基本上保持自样品释放到组合物中的多核苷酸群的完整性，即使是当包含样品的组合物储存在亚热带和热带温度下——甚至持续延长的时期时，所述时期包括但不限于储存大于或等于约5天、大于或等于约10天、大于或等于约15天或甚至大于或等于约20、约25、约30、约35、约40、约60或约 90天或甚至更长。在本发明方法的实践中，优选样品中含有的至少一种或多种生物细胞被基本上裂解以将包含在所述细胞中的至少第一群多核苷酸或第一的多个多核苷酸释放到组合物中。 优选所揭示组合物的组分足以使所述群从所有或基本上所有的残留细胞/组织和/或样品碎片(包括但不限于脂质、磷脂、肽、蛋白质、多糖、脂多糖、多元醇、细胞器、膜组分等等)释放。亦期望在本发明方法的实践中，至少一种或多种可能存在于样品中、样品上或样品本身周围的外源或内源核酸酶，被组合物的一种或多种组分基本上灭活，使得当样品内含有的生物细胞基本上被裂解以自细胞释放多核苷酸群时，得到的核酸不会被破坏、损坏或溶核地切割。优选所揭示组合物的一种或多种组分在当DNA酶或RNA酶存在于样品中时有效破坏、灭活或基本上抑制所述DNA酶或RNA酶的生物活性。还期望在本发明方法的实践中，当一种或多种目的微生物、病毒、真菌和/或其它病原体或生物体在采集时存在于样品中、样品上或样品周围时，所述目的微生物、病毒、真菌和/或其它病原体或生物体在与组合物接触时被裂解、充分灭活或基本上杀死，这便于从业者对样品的安全处理。优选所揭示组合物的一种或多种组分有效使致病性样品基本上或优选完全无致病性，而不需要向组合物中加入另外的组分。然而，在某些应用中，还可期望组合物包含一种或多种另外的抗微生物剂、抗病毒剂或抗真菌剂以使其基本上不致病， 因而对用于从业者处理而言为安全的。优选含有样品的组合物至少充分稳定，以允许组合物中的样品在周围环境、接近周围环境或甚至更冷或更暖条件下储存至少基本上(或完全)从样本或样品采集的时间基本上直到分析或表征来自样品中的至少第一群多核苷酸的时间。本文所用“周围环境温度” 可指约18°C _25°C的温度，或在一些实施方案中，更优选从约20°C -约22°C。在某些实施方案中，含有样品的组合物可在以下温度储存至少基本上从采集时间到将自样品获得的多核苷酸进一步用一种或多种常规分子生物学方法分离、纯化或表征的时间约0°C -约40°C温度下，更优选在约4°C -约30°C温度下，更优选在约10°C -约25°C 温度下。在某些实施方案中，含有怀疑含有核酸的样品的组合物将使核酸稳定在如此程度，以致即使组合物在周围环境、冰箱或零度以下温度经过长时间的储存后该核酸也保持至少基本上不被降解(即至少基本上稳定)。期望这一稳定性将提供储存的样品中含有的多核苷酸在经过长时间样品储存后至少约70%、至少约85%、更优选至少约90%、更优选至少约95 %或甚至更优选至少约98 %不被降解。在某些实施方案中，基本上样品中含有的所有多核苷酸得以稳定，使得在经处理样品的采集、裂解、储存和运输期间保持多核苷酸的原始完整性。
在某些实施方案中，该方法优选提供自生物样品制备的核酸群，其中在将样品最初引到组合物中之后，再将其在组合物中在_20°C到约40°C温度下储存至少M、48、72或96 小时或更长的时期之后，样品中含有的不到约15%的多核苷酸会在样品采集、裂解、储存和运输期间被降解。在相关的实施方案中，该方法优选提供自生物样品制备的核酸群，其中在将样品最初引到组合物中之后，再将其在组合物中在-20°C到约40°C温度下储存至少M、48、72或 96小时或更长的时期之后，样品中含有的不到约10%的多核苷酸会在样品采集、裂解、储存和运输期间被降解。同样地，在本文揭示方法的一些应用中，所揭示组合物的使用将优选提供自生物样品制备的核酸群，其中在将样品最初引到组合物中之后，再将其在组合物中在-20°C到约 40°C温度下储存至少M、48、72或96小时或更长的时期之后，样品中含有的不到约5%的多核苷酸会在样品采集、裂解、储存和运输期间被降解。在某些情况下，通过本发明方法制备的核酸群可保持足够的完整性，使得即使当组合物在0°c到约40°C温度下储存数天到数周时间时不超过约或2%的样品会被降解。 事实上，本发明者已显示，用所揭示方法分离的核酸样品以其非降解形式保持至少基本上稳定、优选稳定数周到甚至数月或更长时间，即使是当含有核酸的组合物储存在10°C到约 40°C温度下时。在一个优选实施方案中，上述温度范围的上限为约37°C，因此本文所用术语 “稳定”，可指上述关于在给定温度下经历特定的时长后的核酸群完整性的不同实施方案。本发明的多核苷酸，尤其是可用于制备IPC的多核苷酸，优选至少含有可操作地连接到阳性对照序列(PCS)的第一聚合酶转录区。所述区可被可操作地定位在PCS的上游，使得当适当的聚合酶(例如T3、SP6或T7聚合酶等)与PCS在适当的反应条件下接触时，扩增PCS。构建体可进一步包含单引物，或作为备选两条或更多条引物(例如“正向”和 “反向”引物)可用于促进PCS的表达。可用于本发明实践中的例示性的引物包括但决不仅限于与PCS本身或与PCS的立即上游(5‘)和或下游(3')区域特异性结合的引物序列。 在阐明性实施方案中，PCS至少含有与第一检测探针(包括但不限于本文所述的发光的、荧光的、化学发光的或FRET探针)特异性结合的第一区域可用于制备IPC的多核苷酸也可进一步任选包含一种或多种天然的、合成的、同源的、异源的或杂合的启动子、加强子、调节元件、接头、间隔基、结合域或转录激活位点等。在阐明性实施方案中，本发明者已证明所揭示的样品采集/运输介质可成功地用于允许生物样品采集并储存数天到数周到数月的时间，即便是当储存在周围环境条件下时。因此，所揭示的制剂提供有效的组合物以保持分离核酸群的保真度和完整性长达约1 周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周或甚至约10周或更长时间，而样品中含有的多核苷酸没有显著的质量退化。事实上，样品的长期储存即使是在周围环境和接近周围环境条件下达数月或更长时间也是可能的一这是优于本发明者在本发明期间调查的任何常规商用制剂的重要改进。利用所采集样本的体外分析获得的数据表明，采集并储存于所揭示的采集/储存 /运输制剂之一中的样品，当储存在溶液中达几天到几周到几个月或更长的时间时，保持基本上不被降解和有功能活性。约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或甚至约8周或更长的时间之后获得的结果的比较，显示了该溶液在防止针对分离多核苷酸的大量核酸酶活性以及保护分离的分子免受污染或分子降解方面的有效性。本发明包括组合物，所述组合物包含a) —种或多种离液剂；b) —种或多种洗涤剂；c) 一种或多种还原剂；d) —种或多种螯合剂；e) —种或多种缓冲液；和f)长约60到 500个核苷酸的分离的单链核酸分子，其包含以下核酸区段，所述核酸区段(1)包括与约 12-约40个核苷酸长的标记探针特异性结合的第一序列域，所述标记探针对检测所述核酸区段有特异性；(2)包括与约20-约40个核苷酸长的正向PCR扩增引物特异性结合的第二序列域；和(3)包括与约20-约40个核苷酸长的反向PCR扩增引物特异性结合的第三序列域；其中第二和第三序列域可操作地定位，以促进在有效扩增所述核酸区段的至少第一部分的条件下自正向及反向引物PCR引导扩增所述至少第一部分；其中在严格杂交条件下所述分子基本上不与哺乳动物基因组或对哺乳动物致病的细菌、真菌或病毒基因组结合； 另外其中(a)-(e)以以下量存在于组合物中，当样品与怀疑含有核酸群的组合物接触时， 所述量足以使所述样品中的一种或多种蛋白质变性；使所述样品中的一种或多种核酸酶灭活；杀死所述样品中的一种或多种病原体；或防止所述样品中的一种或多种核酸不被降解。在一个实施方案中，(a)-(e)中的每一项存在于组合物中的量，足以抑制或防止包括单链核酸分子在内的核苷酸群在约10°C到约40°C温度下储存约1天到约90天的时间时大量降解。在另一实施方案中，a) —种或多种离液剂每种以约0. 5M到约6M的量存在；b) 一种或多种洗涤剂每种以约0. 到约(重量/体积)的量存在；c) 一种或多种还原剂每种以约0. 05M到约0. 3M的量存在；d) —种或多种螯合剂每种以约0. Olm M到约Im M的量存在；e) —种或多种缓冲剂每种以约Im M到约IM的量存在。在又一实施方案中，标记探针至少包括第一小沟结合剂、放射性标记、发光标记、化学发光标记、荧光标记、酶标记、 磁性标记或自旋共振标记或其组合。在一个优选实施方案中，组合物包含a) —种或多种离液剂，包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或其任意组合；b) —种或多种洗涤剂，包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸盐、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-十二烷酰肌氨酸或其任意组合；c) 一种或多种还原剂，包括2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲亚砜或其任意组合；d) —种或多种螯合剂，包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N，N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、 柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任意组合；或e) —种或多种缓冲剂，包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N，N-双O-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3_双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷、 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐或其任意组合。在另一优选实施方案中，组合物进一步包含下列的一种或多种g) —种或多种选自硅酮聚合物、聚山梨醇酯及其任意组合的表面活性剂；h) —种或多种选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇及其任意组合的短链烷醇；和i) 一种或多种选自硅酮聚合物、聚山梨醇酯及其任意组合的消泡剂；和它们的任意组合。在再一实施方案中，让组合物a)缓冲到pH为约6. 0到7. 0 ；b)基本上无RNA酶或DNA酶活性；或c)进一步包含细菌、病毒或真菌来源的分离多核苷酸群，包括RNA、DNA、 PNA或其任意组合。在优选实施方案中，组合物包含a)约4M的硫氰酸胍；约30mM的柠檬酸钠；约0. 25% (重量/体积)的十二烷基硫酸钠；约0. 25% (重量/体积)的N-十二烷酰肌氨酸钠盐；(ν)约0. IM的2-巯基乙醇；和约0. 1 %的硅酮聚合物(重量/体积)；b) 约3M的硫氰酸胍；约ImM的TCEP ；约IOmM的柠檬酸钠；约0. 5%的N-十二烷酰肌氨酸；约 0.0002%的硅酮聚合物；约IOOmM的2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-ニ醇(TRIS)；和约 0. ImM的EDTA ；c)约IM到约4M的硫氰酸胍；约0. 5mM到IOmM的TCEP ；约ImM到IOOmM的柠檬酸钠；约0. 到约的SDS或NLS ；约0. 001%到约0. 0001 %的硅酮聚合物、约IOmM 到约 500mM 的 TRISJ^] 0. ImM 到约 ImM APCA、EDTA、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA 或柠檬酸盐；以及约10%到约25%的乙醇(体积/体积)；或d)约3M的硫氰酸胍；ImM的TCEP ；约IOmM 的柠檬酸钠；约0. 5%的N-十二烷酰肌氨酸钠盐；约0. 0002%的硅酮聚合物；约IOOmM的 TRIS ；约0. ImM的EDTA ；及约10%到约25%乙醇(体积/体积)。在另ー实施方案中，将核酸群采集并保存在包括組合物的单一反应容器中。在又一实施方案中，样品是临床的、兽医的、流行病学的、环境的、法医的或病理来源的生物样品；或其中其包含或怀疑含有ー种或多种病毒、細菌、真菌或哺乳动物来源的多核苷酸。在优选的实施方案中，分离的单链核酸分子包括下列序列中的至少20个相邻核苷酸5' -CC CUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCMUUUCAGAGCUCAGCGAGACAGUUUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCG CUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCAGUU-3 ‘ (SEQ ID NO 2)。在一个实施方案中，每ー种上述组合物适合用于微生物、真菌或病毒感染的诊断或治疗。本发明还包括前述实施方案中任一个的组合物在制备用于诊断或治疗微生物感染或其ー种或多种症状的药物中的用途。在优选实施方案中，本发明用于诊断或治疗細菌、 病毒或真菌感染或其ー种或多种症状。本发明进一歩包括诊断试剂盒或样品采集系统，其包括a)权利要求1-11中任一项的组合物；和b)利用組合物诊断或治疗微生物感染的使用说明。本发明进一歩包括用于提高自怀疑含有多核苷酸的生物样品获得纯化的多核苷酸群的效率的方法，所述方法包括让样品与包含权利要求1-11中任一项的分离单链核酸分子的組合物接触，所用量和接触时间足以提高自生物样品获得纯化的多核苷酸群的效率。在一个实施方案中，当包含样品的組合物在约10°c到约40°C温度下储存(a)约7到约 14天的时间或(b)约14到约30天的时间吋，生物样品中的多核苷酸群的完整性或多核苷酸之一的至少第一序列的保真度至少基本上得以保持。在另ー实施方案中，(a)包含样品的組合物在约10°C到约40°C温度下储存基本上从采集时间到分离、纯化或表征其中的多核苷酸群的时间；或(b)在包含样品的組合物在约10°C到约40°C温度下储存约7到约30 天时间之后，样品中含有的不到约5%的多核苷酸群被降解。在优选的实施方案中，包含样品的組合物在(a)约10°C到约40°C温度下储存约M到约96小时的时间；或(b)约10°C 到约30°C温度下储存约7到约30天的时间。在优选实施方案中，所述方法进ー步包括分析或定量測定自纯化样品获得的多核苷酸群。在又一实施方案中，定量測定步骤包括測定分子的PCR循环阈值(CT)。本发明还包括自怀疑含有核酸的生物样品获得多核苷酸群，其包括让样品与一定量的组合物接触，所述组合物包含约IM到约4M的硫氰酸胍、约0. 5mM到约IOmM的TCEP、 约ImM到约IOOmM的柠檬酸钠、约0. 到约的N-十二烷酰肌氨酸(darcosine)钠盐、 约 0.001% 到约 0.010% 的 10% antifoam A 溶液、约 IOmM 到约 500mM 的 Tris、约 0. ImM到约ImM的EDTAJ^ 10%到约25%的乙醇(体积/体积)以及具有下列序列的核酸分子 5' -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCU ACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO :2)，其以足以稳定多核苷酸群的量存在，使得包含样品的組合物在约10°C到约40°C温度下储存至少约7到约30天的时间之后，样品中含有的不到约30%的多核苷酸群被降解。商用制剂和试剂盒本发明还提供采用所掲示的組合物和本文所述的采集/储存/运输溶液的试剂盒和样品采集系统。在特定实施方案中，所述样品采集系统可包括采集装置，例如药签、刮匙或培养物环；和采集容器，例如含有ー种或多种本文所掲示的組合物的小瓶、试管或样品杯。采集容器优选为可释放地开启(releasably openable)，使得其可被打开以添加ー步组合物并关闭和包装；可被打开以添加样品及任选采集装置的部分，并密封用于储存和运输； 或两种情况都有。采集容器可使用任何适宜的可释放或可开启结构，包括但不限于螺帽、弹簧盖(snap top)、按压旋转盖(press-and-turn top)等等。所述系统亦可进ー步任选包括ー种或多种另外的试剂、储存装置、运输装置和/或在所述系统中获得、采集、裂解、储存或运输样品的使用说明。在优选实施方案中，可已经将本发明ー步组合物置于样品可与之混合的反应区。在所述实施方案中，本发明只需要采集装置和采集容器。试剂盒也可包括一种或多种分离或提取装置，以帮助自ー种或多种其它生物分子或样品组分释放和/或分离样品中含有的ー个或多个核酸群或者多种核酸，以获得至少部分或基本上纯化的适合鉴定、检测或进ー步分子分析的核酸。亦可包装试剂盒用于商业流通，试剂盒可进ー步任选包括用于样品或样本采集、 处理或加工的ー种或多种采集、传递、运输或储存装置。所述试剂盒的ー种或多种容器通常可包括至少ー个小瓶、试管、烧瓶、瓶、杯或其它适合的容器或采集装置，其中可放置ー种或多种组合物，优选适合地分为等份样用于单个样本的采集、运输和/或储存。试剂盒亦可包括更大的容器，例如箱，其包括上述较小的単独容器以及其它采集装置、设备、试剂、使用说明等等。试剂盒也可任选包括ー种或多种另外的缓冲液、化合物或組合物，也可任选进一歩包括详细说明试剂盒在采集或储存ー种或多种生物、临床、诊断、环境、法医样品中的ー种或多种用途的ー种或多种使用说明。任选试剂盒也可进ー步提供一旦置于ー种或多种所揭示的組合物中后运输样品的使用说明，甚至可包括详细说明一种或多种采用自样品或样本分离的核酸的后续分析方法或測定的使用说明或另外的试剂。所述试剂盒还可包括多种不同采集装置和采集容器及待包括的任何其它组分，以便可将该试剂盒用于采集来自同一来源或不同来源的多个样品。在一种商业化应用中，将试剂盒以5套或更多套形式包装以便于销售和使用。附图简述为了增进对本发明原理的理解，现在要引用在附图中阐明的实施方案或实施例， 并将使用专门的语言来描述同一内容。然而，应该理解，并非意欲藉此限制本发明范围。如对本发明相关领域的普通技术人员通常会进行的，考虑所述实施方案的任何变更和进ー步的修改及本文所述本发明原理的任何进ー步应用。以下附图形成本说明书的部分，并包括以下附图以显示本发明某些方面。通过联合附图參考以下说明可更好地理解本发明，其中相似的參考数值表示相似的元素，其中


图1显示PSS(1型)的提取效率。用完整的甲型流感病毒标准量比较PSS(1型 [本文描述为“一歩+”])与RNAqueous -Micro试剂盒(Ambion，货号AM1931)提供的裂解液。为了比较，让ー步制剂或RNAqueous -Micro试剂盒提供的裂解液用于病毒RNA裂解，然后按照厂商方案提取。通过qRT-PCR用例如Applied Biosystems ABI7500序列检测系统(Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA)处理和分析一式ニ份的反应物；图2显示与商业试剂盒比较的PSS(1型)的提取效率。让用甲型流感(H3N2)或在2006-07时期采集的人临床甲型流感(HlNl)样品攻击的均质棉鼠鼻(*)在PSS中裂解，或用来自以下三种市售试剂盒各自的裂解液、方案及提取程序裂解RNAqUe0US-MiCr0 试剂盒(Ambion)、QiaAmp 病毒微型试剂盒(Viral Mini Kit) (Qiagen)和 AI/NCD MaxMag (Ambion)试剂盒。以比较Ct法用Applied Biosystems ABI7500平台评估提取效率。当用PSS(描述为“一歩制剤”)代替每ー标准市售试剂盒中提供的各自裂解缓冲液吋， 所检测的相对Ct分值及病毒拷贝最佳；图3显示裸RNA在PSS与Ambion的RNA储存溶液中的保存的比较。让单链禽 H5RNA在环境温度02- °C )下储存在PSS、RNA储存溶液(Ambion)或水中96小时。用 RNAqueous -Micro试剂盒(Ambion，货号AM1931)按照厂商推荐方案提取总共5pg的RNA， 随后用 qRT-PCR 在 Applied Biosystems ABI7500 平台(Life Technologies)上分析。用绝对定量方法以Ct给出数值；图4显示用于临床诊断采集的PSS包装形式的实例。样品采集说明使用临床采集药签(Copan Diagnostics)和含有1. 5mL PSS的5mL采集管；图5显示PSS的例示性的商用制剂。描述了三种例示性的商用采集液规格25mL 瓶、5mL和1. 5mL试管；图6阐明PSS快速杀死微生物的能力。所示为抗甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA)在培养基(TSB)中或在PS溶液中的细胞生长的比较。在 PSS中10秒钟之后，未检测到活的細菌病原体；图7A显示PSS(1型)中的鸡泄殖腔样本的灭活。PSS(1型)在彡1小时内使微生物制剂灭活。将4份原始鸡泄殖腔样品浸入PSS(1型)(上排)或水(下排)中，随后涂板到血琼脂平板上；图7B显示PSS在室温下抑制RNA碱水解达30天。室温)下，在PSS (凝胶泳道1和幻和水(凝胶泳道2和4)中孵育RNA，随后在第O天和第30天进行RT-PCR扩增(1500个碱基对)。PSS保存了所采集的RNA，并在室温下防止RNA/DNA降解多达30天；图8A描述保存于PSS中的甲型禽流感H5 “裸” RNA模板在RNA/DNA核酸酶中孵育之后的qRT-PCR分析。让H5 cRNA(2ng)与核糖核酸酶A和Tl以及DNA酶I在37°C孵育1小时，用RNAaqueous -Micro试剂盒(Ambion)提取。每种反应条件包括一式三份反应。与加入的核酸酶保存干PSS中的裸RNA的qRT-PCR Ct值(平均Ct :22. 88)与等量模板 cRNA对照(平均CTt 23. 70)相近。在没有PSS的情况下，经过核酸酶消化的模板cRNA反应物几乎完全被降解了(平均Ct :39.58)；图8B描述保存于PSS中的甲型禽流感H5“裸”RNA模板在37°C下于RNA/DNA核酸酶中孵育7天之后的qRT-PCR分析和凝胶电泳。让2ng H5 cRNA与RNA酶A、RNA酶Tl和DNA酶I 一起孵育，7天后用RNAaqueous -Micro试剂盒(Ambion)提取。每个反应包括一式ニ份反应。7天后检测了与添加的核酸酶保存干PSS中的裸RNA的qRT-PCR Ct值(平均Ct 33. 51)，在没有PSS的情况下，经过核酸酶消化的模板cRNA反应物完全被降解了，与 NTC反应相似；图8C显示PSS制剂基本上抑制样品多核苷酸被内源核酸酶消化。扩增后的产物的凝胶电泳。泳道3为来自模板RNA+PSS于37°C下达7天后的PCR产物，泳道5为阳性对照RNA的扩增。泳道5 (无扩增)含有无PSS的RNA ；泳道2和6分别为100_bp的梯条带和NTC反应；图9阐明在PSS中获得的核酸保存优于其它溶液。在环境温度Q2-25°C )下达 30天，甲型流感病毒RNA的PSS O型及2. 2型)保存与Qiagen AVL缓冲液、乙醇和病毒运输介质(VTM) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)的比较；图10显示在不同温度下，于PSS (2. 2型)中保存30天的甲型流感病毒的提取效率环境Ql-37°C )；冷冻-解冻(_25°C;32X)；周围环境温度)；和泳道5 冷藏 (4°C )；图11是以TCEP为还原剂用完整甲型流感病毒所作的Ct对摩尔浓度的曲线图；图12是以TCEP为还原剂用H5W禽流感ssRNA所作的Ct对摩尔浓度的曲线图；图13A和图1加显示TCEP和β-ME作为PSS制剂中的还原剂组分之间的比较，用単独水作为对照。在图13Α中，使用Η5禽流感RNA，而在图13Β中使用的是全病毒；图14Α显示使用PSS保存来自血液的核酸的研究结果。PPS与QIAamp DNA血液微型试剂盒中的裂解液比较对全血加RNA的提取效率。添加0. Ipg和Ipg的甲型流感RNA， 用PSS或AL裂解缓冲液提取。在两种RNA浓度下，PSS都产生较优的結果，如通过qRT_PCRCT 分值所表明；图14B将图14A中显示的涉及自血液管提取H5禽流感“裸” ssRNA的研究数据制成表格。用不同的抗凝血剂，比较PPS与QIAamp DNA血液微型试剂盒中的裂解液对全血加RNA的提取效率。在常见抗凝血剂血液采集管中用血液加RNA，PSS与Qiagen的AL裂解缓冲液相比较优；和图14C将图14A中显示的涉及PSS与商用提取试剂盒储存试剂^jIAamp Qiagen, Inc.)比较的研究数据制成表格。显示的是与QIAamp DNA血液微型试剂盒中的裂解液相比的PPS对全血加RNA的提取效率。添加0. Ipg和Ipg的甲型流感病毒RNA，用 PSS或AVL裂解缓冲液提取。在两种RNA浓度下，PSS都产生较优的結果，如qRT-PCR Ct分值所表明；图15A和图15B显示用对检测IPC特异的測定来qPCR扩增141个核苷酸的单链 DNA。图15A 用ΙΟ"6到10_13(即8-logs)系列稀释的DNA模板以一式ニ份反应进行扩増。 图15B :DNA扩增的IPC标准曲线。測定斜率为-3. 39，用E = 10H/IW)-1计算的PCR效率为 97. 23%。用 Applied Biosystems ABI7500 平台进行 qPCR ；图16A和图16B显示能够起IPC作用的130-核苷酸ssRNA载体分子的qRT-PCR扩増。在图16A中显示用5皮克(pg) (2.75父107个拷贝)到5阿克(ag)(约2-10个拷贝) 系列稀释的RNA模板以一式ニ份反应进行扩増。在图16B中显示的是扩增载体ssRNA分子的IPC标准曲线。该测定斜率为-3. 144，用E =计算的PCR效率为100%。用
22Applied Biosystems ABI7500 平台实施 qRT-PCR ；图17显示含有合成的ssRNA载体/IPC分子的PSS提高裸RNA病原体靶标的保存。在本研究中，将裸甲型流感RNA模板(1.27ng/yl)加到人鼻洗涤样本中，并在含(闭合方框)或不含(开ロ环)合成的RNA増加物的PSS中于37°C保存。提取RNA，随后经由 qRT-PCR检测。制剂中存在合成的SSRNA载体/IPC分子，既导致样品多核苷酸的初始提取 (第O天)増加，又导致在延长时期内稳定保存分离的多核苷酸(參见例如第31天)。图18阐明通过加入合成的ssRNA载体/IPC核酸到PSS制剂中，提高了 PSS稳定及保存溶液中的样品多核苷酸的能力。在本研究中，让完整甲型流感病毒在含(闭合方框) 或不含(开ロ环)合成的ssRNA载体/IPC増加物的PSS中于37 °C保存35天。完整流感病毒亦保存到VTM(闭合三角形)中。提取RNA并用qRT-PCR检测。制剂中存在合成的载体 RNA分子，既导致样品多核苷酸的初始提取(第O天)増加，又导致在延长时期内稳定保存分离的多核苷酸(參见例如第35天)。图19阐明合成的ssRNA载体分子在室温和37°C的稳定性。在本研究中，将合成的 RNA(0. lpg/μ 1)加入到 PSS，在室温(RT)或 37°C储存 14 天。使用 Applied Biosystems ABI7500平台用IPC测定测量RNA的稳定性作为qRT-PCR的函数。合成的RNA在RT和37°C 于14天期间稳定，无显著的Ct值损失。显示一式ニ份反应的平均值。阐明性实施方案的详述以下阐述本发明阐明性实施方案。为简明目的，并不是实际执行的所有特征都在本说明书中阐述。当然应该理解，在所述任何实际实施方案的开发中，必须做出很多具体的执行決定，以实现开发者的特定目标，例如与系统相关及商业相关约束的顺从性，其在不同执行中会有变化。同样，应该理解尽管所述开发努力可为复杂或费时的，但对受益于本公开内容的本领域普通技术人员而言这些仍然是常规工作。当样品或样本位于距离检测设施遥远的地理区域吋，本公开制剂赋予的延长的稳定、采集、运输和保存尤其有利。远程位置亦称为现场地点，包括通常不能实施诊断检测的多种环境。这些地点包括医生办公室、伤员检别分类中心、机场、边境、爆发区域及多种户外场所。所掲示的組合物和其使用方法对以下区域提供特別的优点，在该区域中无法获得电和/或冷蔵，或获得途径不稳定。因为在室温下的延长稳定性，可自任何远程场所采集样品，例如但不限于在非洲疟疾爆发位点，并可将样品运输到美国或欧洲用于实验室诊断分折。因为所掲示的采集制剂在室温或以下温度稳定，优选即使在热带或亚热带温度下也稳定一定时间，所以可将它们常规地带至现场而不担心通常可在远离采集的场所分析样品之前组分试剂(例如RNA对照)本身降解。本发明组合物可为本文所述的任何合适水性制剂，包括但不限于溶液剂、混悬剂 (包括胶体混悬剂)、浆液、乳剂、勻浆等等。优选水性制剂为溶液剂，因此在整个优选实施方案的详述中以例示性意义使用术语“溶液剤”，以指任何本发明水性組合物。本发明的重要方面涉及分离的RNA和DNA区段以及重组载体和包含以上的多核苷酸群，并涉及通过应用传统分子生物学技术创造及利用重组方法来制备RNA载体分子，所述传统分子生物学技术包括但不限于qPCR、qRT-PCR等等。本发明亦涉及核酸組合物，所述核酸組合物包含但不限干可用本文所述样本采集/储存/运送介质自ー种或多种生物样品或样本分离的DNA、RNA和PNA ；或用作载体分子和/或IPC的分离的RNA或DNA区段。本文所用术语“DNA区段”，是指不含特定物种的总基因组DNA的经分离的DNA分子。因此，用本文掲示的組合物之一自生物样品获得的DNA区段，是指与哺乳动物或人总基因组DNA分离或自所述总基因组DNA纯化的ー种或多种DNA区段。包括在术语"DNA区段"内的有DNA区段和所述区段的较小片段以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、
炳母4本同样，术语“RNA区段”是指不含特定物种的总細胞RNA的经分离的RNA分子。因此，用本文掲示的組合物之一自生物样品获得的RNA区段，是指与其它RNA分离或不含其它 RNA的纯化的ー种或多种RNA区段(天然来源或人工合成来源)。包括在术语"RNA区段" 内的有RNA区段和所述区段的较小片段。包含分离的和/或纯化的多核苷酸的核酸区段，是指基本上与其它天然存在的基因或编码蛋白质的序列分离的核酸区段，所述其它天然存在的基因或编码蛋白质的序列可存在于经历采集和随后分析的生物样品中。在特定实施方案中，本发明涉及核酸样品采集、储存和运送介质，所述介质包含有助于分离和稳定自所述样品获得的核酸的第一载体分子。优选载体分子为单链RNA分子， 但在某些情况下，亦可使用RNA RNA或RNA DNA双链体分子。尽管对于常规实施本发明不需要阐明怎样将外源载体分子和RNA分子掺入到特别是本文所掲示的样本采集/储存/运输制剂中的特定分子机理，但不受任何特定理论的限制，本发明人认为PSS和本文所述相关制剂中存在外源提供的RNA载体分子，有助于当与 PSS接触时自細胞材料释放的多核苷酸的沉淀和稳定，并且亦可用作用于以有利于多核苷酸聚集或沉淀的保护性分子形式给释放的样品核酸“涂布”或“加覆盖物”的方法。不管作用机理如何，本发明人证明在制备高质量高保真度的核酸群方面提供优于常规多核苷酸分离溶液的令人惊讶的益处，所述益处免除常规样品中惯常观察到的在采集、分离、储存和运输过程期间遭受降解和污染的有害作用。可如下制备载体分子和/或含有IPC的序列用本领域已知的常规方法部分或全部合成，或根据重组分子生物学方法(包括但不限于体外转录和/或翻译方法，例如PCR扩増)制备，或自天然生物学来源(优选自非哺乳动物来源和对哺乳动物物种非致病的来源) 获得。或者，本发明载体RNA分子可为杂合分子一含有用分子遗传和重组DNA/RNA领域中的一种或多种常规方法可操作地连接的天然和合成部分两者。在某些应用中，RNA载体分子可由ー种或多种转录起始序列、引物或探针结合域、功能化结合位点、核酸外切酶或核酸内切酶切割位点和/或功能模体或活性位点构成。术语“基本上如SEQ ID NO =X提出的序列”，意指该序列基本上对应于SEQ ID NO X的部分，并具有相当少的与SEQ ID NO :X的核苷酸不同或不为其生物学功能等同物的核苷酸(或在多肽序列情况下为氨基酸)。术语“生物学功能等同物”在本领域良好理解，并在本文中进ー步详细定义。因此，特别考虑以下序列以用于本发明实施中，该序列与本文提供的一个或多个核苷酸序列具有约85% -约90%或更优选约91% -约95%或甚至更优选约96% -约99%同一性或功能等同性。用于本发明的合适标准杂交条件包括例如，在50%甲酰胺、5XDenhardt氏溶液、 5父55(、251111磷酸钠、0. 1% SDS和100 μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA中于42°C杂交16小时，接着用0. 1XSSC、0. 1% SDS溶液在60°C序贯洗涤1小吋，以除去期需量的背景信号。用于本发明的较低严格杂交条件包括例如，在35%甲酰胺、5XDenhardt氏溶液、5XSSC、25mM 磷酸钠、0. 1% SDS和100μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA或大肠杆菌(E. coli)DNA中于42°C杂交16小吋，接着用0.8XSSC、0. 1% SDS在55°C序贯洗涤。本领域技术人员应认识到，可易于调整条件以获得所期需的严格水平。当然，本发明亦包含与本文提出的ー个或多个特定序列互补或基本上互补的DNA 区段。“互补”的核酸序列为能够按照标准Watson-Crick互补法则碱基配对的核酸序列。 本文所用术语“互补序列”，意指基本上互补的核酸序列，如可通过以上提出的相同核苷酸比较来评估，或如按照能够在相对严格条件例如刚刚的上述条件下与本文掲示的一种或多种特定核酸区段杂交所定义的。如上所述，本发明探针和引物可为任何长度。通过为序列分配数值，例如第一个残基为1，第二个残基为2等，可提出定义所有引物的算法η 至ljn+y其中η为1到序列的最后数字的整数，y为引物长度减1，其中n+y不超过序列的最后数字。因此，对于25-聚物，探针对应于1-25位、2- 位、3-27位、…等等碱基。对于 45-聚物，探针对应于1-45位、2-46位、3-47位、…等等碱基。对于60-聚物，探针对应于 1-60位、2-61位、3-62位、 等等碱基。在某些实施方案中，采用与合适的可检测标记(即“标签”)組合的本发明核酸序列用于测定杂交是有利的。本领域已知各种各样的合适指示化合物和組合物，其包括但不限于荧光配体、放射性配体、酶配体或其它配体，例如亲和素/生物素等，它们能够被检測。 在特定实施方案中，人们可期需采用荧光标记或酶标签(例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶)取代放射性或其它环境上较不理想的试剂。在酶标签情况下，已知可采用比色、产色或产荧光指示底物以提供用于检测人眼可见的样品的方法，或通过分析方法例如闪烁扫描法、荧光测定法、分光光度法等等来鉴别与含有一个或多个互补或基本上互补的核酸序列的样品的特异性杂交。—般而言，设想本文所述杂交探针既可用作溶液杂交中(如在PCR中)的试剂用于检测特定核苷酸，又可用作在采用固相的实施方案中的试剂。杂交后让核酸引物复合物与促进模板依赖性核酸合成的ー种或多种酶接触。进行亦称为“循环”的多轮扩増，直到产生足够量的扩增产物。接下来检测扩增产物。在某些应用中，可通过目视检查来进行检測。或者，检测可涉及通过化学发光、掺入放射性标记的放射性闪烁扫描法或荧光标记或甚至通过利用电或热脉冲信号的系统来间接鉴别产物。可利用多种模板依赖性过程来扩增存在于给定模板样品中的标记序列。最著名的扩增方法之ー是聚合酶链式反应(称为PCR)，其详细阐述于美国专利号4，683，195、 4，683，202和4，800，159中，它们每一个都以整体在此引作參考。另ー扩增方法是连接酶链反应(“LCR”)，其掲示于例如EPA No. 320308和美国专利4，883，750中，它们每ー个都通过对其明确引用以其整体具体结合于此。等温扩增方法亦可用于本发明中扩增核酸，在所述方法中将限制性核酸内切酶和连接酶用于实现扩增在限制性位点的一条链中含有5' -[α-硫代]-三磷酸核苷酸的靶标分子。链置換扩增(SDA)是实施等温扩增核酸的另ー种方法，所述方法涉及多轮链置換和合成，即缺ロ平移。称作修复链式反应(RCR)的相似方法，涉及让整个扩增的靶向区域的若干探针退火，接着修复反应，其中仅存在四种碱基中的两种。为了易于检测可加入作为生物素化的衍生物的另外两种碱基。在SDA中使用相似的方法。亦可用环状探针反应(CPR) 来检测靶标特异性序列。在CPR中，让具有非特异性DNA的3'和5'序列及特异性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后用RNA酶H处理反应物，将探针的产物鉴定为消化后释放的与众不同的产物作用。原始模板与另ー循环探针退火，反应重复进行。在本发明扩增步骤中亦可使用以下方法，所述方法基于在具有所得“ニ-寡核苷酸”的序列的核酸存在下两种(或更多种)寡核苷酸的连接，藉此扩增所述ニ-寡核苷酸。在任何扩增后，可期需自模板和过量引物分离扩增产物，用于测定是否出现特异性扩增。在一个实施方案中，用本领域普通技术人员已知的常规方法，通过琼脂糖电泳、琼脂糖-丙烯酰胺电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。多核苷酸和寡核苷酸组合物本文所用“核酸”或“多核苷酸”組合物，包括但不限于含有单链或双链多核苷酸的那些，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)或其任何組合或衍生物(包括例如基因组的、基因组外的、质粒、粘粒、重组体、人工的和/或合成的)。所述序列可为编码或非编码序列、有义、无义或反义序列，可以但不必一定存在于ー个或多个多核苷酸群或众多多核苷酸(本发明中的任ー种)中，多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支持物质连接。同样，本发明多核苷酸，尤其是在所掲示的样本采集/运输介质中作为载体多核苷酸或IPC分子起作用的多核苷酸，不必与本文阐明的本发明的各种实施方案中采用的特定序列同一或甚至基本上同源。尽管本发明人阐明利用特定DNA和RNA对照序列作为以下工具，其用于监测所采集、运输或储存在本文所述组合物中的多核苷酸的完整性和质量，并优选增加所述多核苷酸的稳定性，但所述对照序列不必含有所采用的特定核苷酸序列。事实上，在某些情况下，在所掲示的采集/运输/储存组合物中用作内部对照序列的多核苷酸，可包含可为所述目的获得、制备、修饰或合成的任何合适序列。此外，优选所述内部对照序列与试图用所掲示的制剂鉴别的病毒、細菌、真菌或其它病原物种没有显著的同源性或同一性。或者，适合作为IPC的多核苷酸可与ー个或多个本文掲示的例示性IPC序列同源或甚至基本上同一，因此可能能够与本文掲示的特异性IPC序列之一(或其互补序列)在中严格性、高严格性和/或甚至极高严格性杂交条件下杂交。认为用于核酸杂交的方法对分子生物学领域的普通技术人员为日常工作，因此， 本文无需提供使用所述方法的分析方法的详细论述。然而，作为指导，本领域通常认为由kuthern等推广的“中严格性”杂交条件包括，例如在含有约5X标准柠檬酸钠缓冲剂 (SSC)、0· 5%十二烷基硫酸钠(SDS)U. OmM乙ニ胺四乙酸(EDTA)(例如pH 8. 0)的溶液中预洗涤；在约50°C-约60°C温度于5X SSC过夜杂交；接着在约60_65°C用含有0. 1%SDS的 2X、0.5X和0.2X SSC中的每ー种洗涤2次20分钟。同样，“严格性”杂交条件通常包括例如在含有约5X SSC,0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)的溶液中预洗涤；在约60°C -约70°C的温度于5X SSC过夜杂交；接着在约65-70°C用含有0. 1 % SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC中的每ー种洗涤2次20分钟。同梓，“高严格性”杂交条件的代表性实例包括但不限于在含有约5X SSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)的溶液中预洗涤；在约70°C -约75°C的温度于5X SSC过夜杂交；接着在约70°C -约75°C用含有0. 1 % SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC中的每ー种洗涤2次20分钟。本领域普通技术人员亦应理解，由于遗传密码简并的结果，编码给定一级氨基酸序列的核苷酸序列有很多。这些多核苷酸中的某些与任何天然基因的核苷酸序列具有极小的同源性。虽然如此，由于密码子使用差异而变化的多核苷酸明确涵盖在本发明中。可通过常规分子生物学重组方法来制备IPC，或作为备选可通过包括化学合成 (例如固相亚磷酰胺化学合成)等等在内的本领域已知常规方法全部或部分合成IPC。亦可用标准诱变技术例如寡核苷酸定点特异性诱变在多核苷酸序列内引入修饰。亦可直接合成用于IPC的RNA分子，或作为备选通过用合适系统(例如T3、T7和SP6聚合酶等等)体外或体内转录DNA序列来制备。可对本发明多核苷酸尤其是用于制备IPC的多核苷酸，进行修饰以提高体外和/ 或体内的稳定性。所述修饰包括但不限干将侧翼序列加到5'-端、3'-端或两端；在骨架中使用磷代磷酸酯或2' -ο-甲基而不是磷酸ニ酯酶连接；和/或包含非传统碱基，例如肌苷、辫苷(queosine)和wybutosine以及腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基-、甲基-、硫代-或另外的修饰形式或其任何組合。可用确定的重组技术让本文所述核苷酸序列与多种其它核苷酸序列结合或连接。 例如，可通过克隆到多种克隆载体中的任一种来产生用作IPC的多核苷酸，所述克隆载体包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒中的ー种或多种。特定目的的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。一般而言，载体应含有在至少ー种生物体中有功能的复制起点、适宜的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记。其它元件将视所期需用途而定，对于本领域普通技术人员显而易见。或者，可通过ー种或多种模板依赖性的或扩增子指引的重组制备方法来制备IPC序列。在特定实施方案中，本发明提供多核苷酸组合物，可将所述組合物加到所掲示的采集/储存/运送介质中，以提供ー种或多种IPC来监测本文采用的取样/储存/和运送过程的保真度及完整性。所述多核苷酸组合物可含有可结合特定聚合酶、寡核苷酸引物和 /或重组探针的ー种或多种序列域。在阐明性实施方案中，可采用例示性IPC，其含有阳性对照序列(PCS)，所述PCS可用一种或多种特异性扩增引物序列扩增，并用与所述PCS的至少第一序列域特异性杂交的一种或多种寡核苷酸探针检测和/或定量測定。在某些实施方案中，可利用检测探针，其采用荧光、化学发光或FRET-特异性检测方法来检测和/或定量測定给定样品中的PCS量。样品中PCS的检测可提供用于监测本文采用的一步采集/储存 /运输溶液的有效性及保真度的内部參考标准。可设计本发明寡核苷酸引物和探针用于选择性扩增和检测ー种或多种PCS。所述引物序列适合用于杂交方法和扩增方法，例如基于PCR的扩增方法(包括例如实时PCR分折、RT-PCR等等)。同样，所掲示的寡核苷酸检测探针适于用适当的标记来标记，以用于检测并定量測定用ー对或多对本文掲示的扩增引物扩增核酸而产生的产物。当用适当标记来标记时，寡核苷酸检测探针尤其适合包含在采集/储存介质(包括但不限于PSS制剂)中的IPC-特异性核苷酸序列的基于荧光的检测，包括例如经由基于FRET的分析。FRET-标记的检测探针尤其可用于荧光測定检测方法，包括例如基于FRET 的微体积荧光測定设备。在联合的实时PCR/基于FRET的微体积荧光測定方法(实时 PCR-FRET)中，和具体地在由 Idaho Technology, Inc. (Salt Lake City,UT,USA)开发并且目前由 Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA)制造并销售的“ LightCycler ” 仪器促进的分析中，特別考虑使用一种或多种扩增和检测寡核苷酸。内部阳性对照(IPC)序列在阐明性实施方案中，本发明亦提供IPC序列，所述IPC序列包含以下核酸序列、 基本上由以下核酸序列組成或由以下核酸序列組成，所述核酸序列优选与以上掲示的任何 ー个或多个序列尤其是SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 13中的任ー个所掲示的序列有至少约 80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%或更多同一性。在相关实施方案中，本发明亦提供IPC序列，所述IPC序列在体外用包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列組成或由以下核酸序列組成的模板扩增子合成，所述核酸序列优选与来自SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:14到SEQ ID NO :23所掲示的序列中的任何 ー个或多个的至少30个邻接核苷酸序列有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约 95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%或更多同一性。多核苷酸扩增试剂盒本发明亦提供用于检测和/或扩增IPC、尤其是包含在本文掲示的制剂之一中的 RNA或DNA IPC序列的试剂盒，所述制剂包括但不限于PSS制剂。所述试剂盒通常包含对扩增IPC特异性序列所必需的两种或更多种组分，所述组分可为化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒内的ー种容器可含有第一引物，而试剂盒内的第二容器可包含第二引物。 试剂盒内的第三容器可含有杂交探针组或用于标记所述探针的一种或多种荧光探针。另外，本发明试剂盒亦可包含使用说明，例如在本文所述扩增和/或检测反应中使用引物的使用说明，以及ー种或多种荧光分子或可能必需的其它试剂，包括例如但不限于缓冲剂酶、 聚合酶、RNA酶等等。本发明提供一种或多种载体RNA或DN組合物连同一种或多种采集/运输/储存溶液(包括但不限于PSS制剂)或相容的赋形剂、缓冲剂载体、稀释剂、辅助剂和/或其它组分，如可用于分离、检测、扩增或定量检测诊断工具。基于实时PCR的FRET检测在文献中很好地阐述了实时PCR和FRET方法(參见例如美国专利号4，996，143、 5，565，322,5, 849，489,6, 162，603，其每ー专利都通过对其明确引用以其整体具体结合于此)。LightCycler 平台代表遗传突变筛选和分析中的重要突破。该系统并入可在不到20分钟内实施30个聚合酶链式反应(PCR)循环的快速气动热循环仪器。其利用在线微体积荧光计来检测并定量測定荧光标记的杂交探针，提供确定解链曲线分析必需的数据。LightCycler 平台提供革新的仪器来促进遗传分析工具的开发，并提供用于测定特定核苷酸序列和遗传突变的快速定量方法。可在制造商网站和产品应用手册中找到仪器在扩增和检测方法中的详细应用。该技术亦阐述在包括例如PCT国际专利申请公开号WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712 (每ー专利都通过对其明确引用以其整体具体结
28合)中。用于临床诊断实验室的样本采集在需要检测潜在的少量来自包括病毒在内的病原体的核酸的诊断平台或分子方案中采集是第一歩。为了促进基于核酸的检测策略的动态进步及将其整合到主流诊断实验室，对可靠健全和标准化的采集系统有巨大需要，所述采集系统明确针对下游基于核酸的检测例如前述平台来开发。本发明可备选地适合从医生办公室或手术室运输核酸，或作为备选运输到区域中心，例如医院。临床或兽医样本或法医或环境样品采集系统可包括一种或多种采集工具和ー种或多种试剂，用于有效地1)获得超过本领域目前可获得的高收率的合适样本；2)使潜在的感染性生物学病原体失活，以使其不再有活力，并可对其进行处理； 在最不担心病原体释放或污染的情况下运输或输送；或3)在环境温度下长时间有效稳定并保存来自水解或核酸酶降解的裂解的 ‘裸’RNA/DNA聚合物，直到可在诊断实验室处理样品；并且优选用于达到这些目标中的两个或更多个或全部三个。如上所述，本发明样品采集/运输/储存溶液可优于先前技术可获得的溶液提供许多明显改迸。例示性益处包括但不限于以下ー种或多种■使微生物、病毒或病原体失活、杀死和/或裂解；■使外源性或内源性核酸酶受到破坏和/或失活，所述酶包括但不限于RNA酶和 /或DNA酶；■与多种常规核酸提取、纯化和扩增系统相容；■保存样品内RNA和/或DNA的完整性；■促进在环境温度的运输和运送，甚至是在延长时间或极端温度变化下；和■适合短期(几小时到几天)、中期(几天到几个星期)或长期(几个星期到几个月)储存分离的核酸。所掲示的組合物尤其非常适合现场护理、野外研究、居家卫生保健或测试、伤员检别分类/突发事件和伤亡评估、流动法医、病理学、流行病学取样、犯罪现场调查、亲子鉴定、孕前和孕后遗传筛选、强奸/乱伦检验、家庭咨询、性传播疾病(包括但不限于HIV、梅毒、衣原体、淋病和其它性病等等)的秘密检测。同样，所掲示的組合物亦可尤其适合用于国内外人或动物群体流行病或大流行病的监测、病因学和控制，包括采集和分析含有流感病毒的样本；尤其是用于预测及控制病毒的“变换和漂移(drift) ”和鉴别或管理发生的或发展中的流行病、大流行病等等。在某些实施方案中，用本发明方法分离的核酸可在一种或多种随后的分子生物学应用、測定或技术中起模板的作用，所述应用、測定或技术包括但不限于遗传指纹识别； 扩增片段长度多态性(AFLP)PCR;限制性片段-长度多态性分析(RFLP)；等位基因特异性寡核苷酸分析(ASOA)；微卫星分析；DNA杂交；RNA杂交；可变数目串联重复(VNTR)PCR ；点印迹杂交；聚合酶循环组装(PCA)；嵌套PCR;定量PCR(qPCR)；不对称PCR ;DNA足迹法；单核苷酸多态性(SNP)基因型分型；逆-转录PCR(RT-PCR)；多重PCR(m-PCR)；多重连接依赖性探针扩增(MLPA)；连接介导的PCR(LmPCR)；甲基化特异性PCR(MPCR)；解旋酶依赖性扩增(HDA)；重叠延伸PCR(OE-PCR)；全基因组扩增(WGA)；质粒分离；等位基因扩增；位点定向诱变；高通量遗传筛选；等等，或其任何組合。在一个实施方案中，样本采集/储存/运输制剂保存、延长、促进或保持自样本释放的多核苷酸群中的至少第一核酸的稳定性达延长的时期，尤其是例如大大长于由常规样品采集介质提供的时期。优选在不需要冷藏或冷冻采集的样品情况下，甚至是当样品在周围环境条件下采集或储存时，组合物在以下时期内促进来自所述分离的多核苷酸群内的ー种或多种核酸区段的保存和稳定，所述时期包括但不限于至少约7天、优选至少约14天、更优选至少约21 天和还更优选至少约观、35、42、56、63或约70天或更长。当所述样品在远程位置或在温带、 亚热带或热带气候中采集或储存时，尤其期需所述改善的样本保存特性。在另ー实施方案中，本发明提供制备来自生物学来源的样品的核酸的所掲示組合物在不需要将样品储存在冷藏或冷冻的条件下在延长期内保持包含在自样品释放的多核苷酸群内的ー种或多种核酸的完整性和保真度方面的用途，所述延长期包括但不限于至少约5天、至少约10天、优选至少约15天、更优选至少约20天或还更优选至少约25天或更
37 ο自实施所掲示的方法获得的核酸有利地与许多常规分子和诊断分离、纯化、检测和/或分析方法相客。所掲示的組合物促进稳定的基本上不降解的多核苷酸群回收储存和运输，用于多种随后的方法，所述方法包括但不限于核酸分离、纯化、扩增和分子分析和/ 或诊断检验、測定、分析或表征等等。本发明例示性商业试剂盒以下概要提供采用本发明PSS制剂的例示性商业试剂盒(图5)。剥离-小袋(PEEL-POUCH)采集系统含有1. 5mL PrimeStore 溶液的 5_mL管；采集拭子(例如FlockedSWABS [Copan Diagnostics, Inc.，Murrieta，CA, USA])；和用于采集和/或处理样品的使用说明。(例如以50个小袋/単位包装)(參见图4A、图4B、图4C、图4D和图4E关于所述系统的示意性展示)°PRIMESTORE 储液调配后I^imeStore 储液在4°C或以下稳定至少1年或更长时间。亦显示调配的 I^imeStore 溶液在环境温度(例如约20_30°C )下稳定数个月。样品与本文掲示的I^rimeStore 制剂接触后，可合理地预期其可在0°C或以下温度无限期地储存，在冷藏(例如 40C )下储存至少1年或更长时间，在环境温度(例如约 20-30°C)下储存至少30天或更长，而不会显著损失样品的核酸組成、保真度或完整性。例如但不限干，当包含样品的組合物储存在约-20°C到约40°C温度约30天-约60天吋，自样品获得的多核苷酸群的完整性至少基本上保持并优选完全保持而无可检测的降解。用于环境样品的采集试剂盒所掲示用于采集环境样品的制剂的例示性商业包装包括但不限于含有有效量储存溶液的采集容器(例如0. l-,ο. 2-,0. 5-、1-、2-或3-!11し采集小瓶，各自含有0. ImL, 0. 2mL、0. 25mL、0. 5mL、0. 75mL或ImL PrimeStore 溶液)；和用于采集和/或处理样品的使用说明。可视推荐的一种或多种样本或一种或多种采集方法而定按需要确定采集容器的大小，或以或大或小的尺寸来包装。在某些应用中，亦可期需将单独采集装置包装到多个容器 (包括但不限于含有例如10或20个采集装置/単位包装的商业包装)中。序列比较、同一性和同源性在两个或更多个核酸或多肽序列情景中的术语“同一的”或“同一性”百分比，是指以下两个或更多个序列或子序列，其当用下述序列比较算法(或普通技术人员可获得的其它算法)之一或通过目视检查来比较及比对最大一致性时为相同的，或具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。在两种核酸情景中的术语“基本上同一的”，是指以下两个或更多个序列或子序列，其当用序列比较算法或通过目视检查来比较及比对最大一致性吋，具有以下核苷酸残基同一性至少约90%、优选91%、最优选约92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 98. 5%,99%,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4%,99. 5 %,99. 6 %,99. 7 %,99. 8 %,99. 9 %^； 更多。通常认为所述“基本上同一的”序列是“同源的”，而不必參考实际的祖先。对于序列比较和同源性測定，通常将ー个序列用作与测试序列比较的參考序列。 当使用序列比较算法吋，将测试序列和參考序列输入电脑，指定子序列坐标，若需要时则指定序列算法程序參数。然后可基于指定的程序參数将序列比较算法用于计算相对于參考序列的所述测试序列的序列同一性百分比。可如下进行用于比较的序列的最佳比对例如通过局部同源性算法(參见例如 Smith和Waterman，1981)、通过同源性比对算法(參见例如Needleman和Wunsch，1970)、 通过搜寻相似性比较方法(參见例如Pearson和Lipman，1988)、通过算法的计算机化执行例如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA)或通过目视检查。适于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的ー个实例是BLAST算法(Altschul等，1990)和BL0SUM62记分矩阵(參见例如Henikoff和Henikoff，1989)。用于实施BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心 ι www, ncpi. nlm. nih. gov/)公开犾得。除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法亦进行两个序列之间的相似性的统计学分析(參见例如Karlin和Altschul，1993)。有用的序列比对算法的另ー实例为PILEUP 程序，其用渐进的逐对比对自相关序列组产生多重序列比对。其亦可绘制显示用于产生比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用简化的渐进比对比较方法(參见例如!^eng和 Doolittle, 1987)，并采用类似于Higgins和Sharp (1989)阐述的通用比对矩阵。例示性定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的一祥的含义。尽管可在本发明实行或测试中使用与本文所述类似或等同的任何方法和組合物，但在本文中描述优选方法和組合物为。为本发明目的，以下术语如下定义本文所用术语“约”和“大约”可互換，通常应该理解为指给定数值附近的数值范围以及数值的所述范围内的所有数值(例如除非另外指出，否则“约5-15”意指“约5-约 15”)。此外，本文所有数值范围应该理解为包括范围内的每ー个整数。本文所用术语“载体”意在包括任何一种或多种溶剂、分散介质、ー种或多种涂层、 ー种或多种稀释剂、ー种或多种缓冲剂、ー种或多种等渗剂、ー种或多种溶液、ー种或多种混悬液、ー种或多种胶体、ー种或多种惰性剂等等或其組合，它们如使用的话对于给予相关动物为药学上可接受的或对于诊断目的为可接受的。通常用于化学化合物和具体用于肽及表位的一种或多种递送溶媒的使用，为药物领域普通技术人员所熟知。任何常规介质或作用剂除了与活性成分不相容的情况外，否则考虑其在诊断、预防及治疗组合物中的应用。亦可将ー种或多种补充活性成分掺入ー种或多种所掲示的免疫原性組合物中或与所述组合物联合给予。本文所用术语“核酸”包括ー种或多种以下类型聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)和任何其它类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。本文所用术语“核酸”亦包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，核糖核苷或脱氧核糖核苷通常经由亚単位之间的磷酸ニ酯键但在某些情况下经由硫代磷酸酷、甲基膦酸酯等等共价键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。例示性核酸包括但不限于gDNA ；hnRNA ；mRNA ；rRNA、tRNA、 微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核仁小RNA(snORNA)、核内小RNA(snRNA)和小时序 RNA(StRNA)等等及其任何组合。本文所用术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互換使用，包括包含至少ー个将两个或更多个氨基酸残基连接在一起的酰胺键的分子。一般而言，尽管可互換使用，但肽为相对短 (例如2-约100个氨基酸残基长)的分子，而蛋白质或多肽为相对较长的聚合物(例如100 或更多个残基长)。然而，除非由链长明确限定，否则术语肽、多肽和蛋白质可互換使用。本文所用“样品”包括含有或假定含有目的物质的任何东西。因此其可为含有核酸、蛋白质或另一目的生物分子的物质的组合物。因此术语“样品”可包括包含核酸群(基因组DNA、cDNA、RNA、蛋白质、其它细胞分子等)的溶液、細胞、组织或所述溶液、細胞、组织中的ー种或多种的群。术语“核酸来源”、“样品”和“样本”可以以广泛含义在本文互換使用，意欲包括含有核酸、蛋白质、一种或多种其它目的生物分子或其任何組合的多种生物学来源。例示性生物样品包括但不限于全血、血浆、血清、痰、尿、粪便、白血細胞、红血細胞、 血沉棕黄层、拭子(包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、 直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等等)、尿、粪便、痰、眼泪、黏液、唾液、精液、阴道分泌物、淋巴液、羊膜液、脊柱液或脑脊液、腹膜积液、胸腔积液、渗出物、穿刺液、上皮涂片、 活检、骨髓样品、囊肿或脓肿内容物流液、滑液、玻璃体液或房水、眼洗出物或抽吸物、肺灌洗液或肺抽吸物和器官及组织，包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心、肌肉、胰腺等等及其任何組合。在一些实施方案中，样品可为或可来自作为载体的生物体，例如蚊子或虱子或其它ー种或多种昆虫。包括移植材料、原代細胞、继代細胞系等等在内的组织培养細胞，以及自任何細胞获得的裂解物、勻浆、提取物或材料，亦在本文所用术语“生物样品”含义内。可存在于生物样品上或内的以下生物体亦在本发明范围内，正如自临床或法医环境获得的含有ー种或多种核酸的任何材料亦在本发明范围内一祥微生物(包括但不限于原核生物，例如古细菌和真細菌；蓝細菌；真菌、酵母、霉菌、放线菌；螺旋菌和支原体)；病毒(包括但不限于正嗜肝病毒属[包括例如甲、乙和丙型肝炎病毒]、人乳头瘤病毒、黄病毒属[包括例如登革病毒]、狂犬病毒属[包括例如狂犬病毒]、麻疹病毒属[包括例如麻疹病毒]、单纯病毒属 [包括例如单纯疱疹病毒]、多瘤病毒属、腮腺炎病毒属[包括例如腮腺炎病毒]、风疹病毒属[包括例如风疹病毒]、水痘病毒属[包括例如水痘病毒]、轮状病毒、冠状病毒、巨細胞病毒、腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒、细小病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒等等)、藻类、原生动物、原生生物、植物、苔藓类植物等等及任何前述任何組合。普通技术人员亦应理解，自任何以上例示性生物样品获得的裂解物、提取物或材料亦在本发明范围内。本文所用术语“缓冲剂”包括一种或多种组合物或其水溶液，其当将酸或碱加入到包含所述缓冲剂的溶液或組合物中吋，抵抗PH波动。这种对pH变化的抵抗是由于所述溶液的缓冲特性，其可以是包含在組合物中的ー种或多种特定化合物的功能。因而，表现出缓冲活性的溶液或其它组合物被称为缓冲剂或缓冲溶液。缓冲剂通常不具有无限保持溶液或組合物的PH的能力；更准确地说，它们通常能够保持pH在某些范围内，例如pH约5-7。本文所用术语“生物分子”是指在細胞中存在的或包括病毒在内的活生物体产生的任何分子。这可包括但不限于核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质。本文所用“細胞”是指能够独立发挥功能的生物体的最小结构单位，其由细胞质及由細胞膜包围的各种细胞器组成。这可包括但不限于独立起作用的細胞，例如細菌和原生生物；或生活在较大生物体内的細胞，例如白細胞及红細胞。本文所定义的細胞可不具有細胞核，例如成熟人红血細胞。本发明实施中的样品可新鮮使用，或可在储存一段时间或延长时期后使用，包括例如低温保存、冷冻或冷藏的样品等等，并可包括临床、兽医、环境或法医来源的材料，可分离自食品、饮料、给料、饮用水来源、废水流、エ业废物或废液、天然水来源、土壌、空中传播来源、大流行群或流行群、流行病学样品、研究材料、病理学样本、怀疑的生物恐怖活动制剂、犯罪现场证据等。本文所用术语“患者”(亦可互換称为“宿主”或“受试者”)，是指可作为本文所述的 ー种或多种生物样品或样本来源的任何宿主。在某些方面，供者为脊椎动物，其意在表示任何动物物种(并优选哺乳动物物种，例如人)。在某些实施方案中，“患者”是指任何动物宿主，包括但不限于人和非人灵长类、禽类、爬行动物、两栖动物、牛、犬、山羊(caprines)、 cavines、乌鸦、印ines、马、猫、山羊(hircines)、母兔(Iapines)、野兔、狼、鼠、绵羊、猪、 racines、狐狸等等，包括但不限于家畜、群畜或迁移动物或鸟类、外来动物(exotics)或动物学样本以及伴侣动物、宠物和在兽医从业人员照顾下的任何动物。本发明亦可用于对多种全球种群监测疾病爆发、进展及流行病学统计，包括但不限于有蹄类动物的消耗性疾病、 结核病、依波拉病、SARS和禽流感。在某些实施方案中，样品优选为哺乳动物来源，更优选人来源。本文所用术语“离液剂(chaotrope或chaotropic agent) ”，包括如下在蛋白质或核酸中引起混乱的物质通过例如但不限于改变蛋白质或核酸的ニ级、三级或四级结构同时保留ー级结构的完整。本文所用术语“例如”仅当作举例使用，没有限制目的，不应该解释为仅提及明确列举的那些项目。本文所用术语“基本上不含”或“本质上不含”，通常意味着組合物含有小于约10% 重量，优选小于约5%重量，更优选小于约重量的化合物。在优选实施方案中，这些术语是指小于约0. 5%重量，更优选小于约0. 重量或甚至小于约0. 01%重量。所述术语也包括完全不含化合物或其它规定性质的组合物。关于降解或变质，术语“基本上”亦可指上述重量百分比，使得防止基本上的降解应指小于约15%重量、小于约10%重量、优选小于约5%重量等因降解而损失。在其它实施方案中，这些术语仅指百分比而不是重量百分比，例如关于术语“基本上非致病的”，其中术语“基本上”是指留下小于约10%、小于约5%等致病活性。本文所用术语“异源的”是就与预定參考核酸序列的关系来定义。例如，关于结构基因序列，将异源启动子定义为天然不存在于參考结构基因邻近但以ー种或多种实验室操作人工放置的启动子，所述操作为由分子生物学领域普通技术人员常规采用的操作。同样， 将异源基因或核酸区段定义为天然不存在于參考序列、启动子和/或增强子元件等邻近的基因或核酸区段。本文所用术语“同源性”是指两个或更多个多核苷酸或多肽序列之间的互补性程度。当第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列具有确切相同的ー级序列吋，措辞 “同一性”可取代措辞“同源性”。可通过用本领域已知的算法及计算机程序分析两种或多种序列来測定序列同源性和序列同一性。可用所述方法来评估给定序列是否与另一所选的序列同一或同源。本文所用“同源的”当提及多核苷酸时意指尽管由不同来源产生但具有基本上相同的核苷酸序列的序列。通常同源核酸序列起源于拥有ー个或多个基本上相似的基因组序列的紧密相关基因或生物体。相比之下，“同功的”多核苷酸为与来自不同物种或生物体的多核苷酸共有相同的功能的多核苷酸，但其可具有显著不同的一级核苷酸序列，所述ー级核苷酸序列编码实现相似功能或具有相似生物学活性的ー种或多种蛋白质或多肽。同功多核苷酸通常可源自非紧密相关(例如遗传或系统发生上)的两种或更多种生物体。在两种或更多种核酸或多核苷酸序列情境中术语“同一的”或“同一性”百分比，指以下两个或更多个序列或子序列，其当在比较窗口内比较并比对最大一致性时，为相同的或具有规定百分比的相同核苷酸，如用序列比较算法或通过手工比对和目视检查来測定。“引物”或“引物序列”可包括与互补模板核酸链(“靶标序列”)选择性杂交并用作添加核苷酸的起始点以复制模板链的任何核酸序列或区段。本发明引物序列可被标记或含有其它修饰，这使得可检测和/或分析扩增产物。除了充当靶标DNA序列的聚合酶介导复制的起始物外，还可将引物序列用于将模板RNA逆转录为相应的DNA。 本文所用“靶标序列，，或“靶标核苷酸序列，，包括在以下条件下所述弓I物序列之一与其杂交的任何核苷酸序列，所述条件允许具有聚合酶活性的酶延伸引物序列并藉此复制互补链。本文所用术语“可操作地连接的”是指呈功能关系的两种或更多种多核苷酸或两个或更多个核酸序列的连接。当将核酸置于另ー核酸序列的功能关系中时其为“可操作地连接的”。例如，启动子或增强子如果影响编码序列的转录，则为可操作地连接所述编码序列。“可操作地连接的”意指连接的核酸序列通常邻接或基本上邻接，并在需要将两个蛋白质编码区连接时，为相邻的且在读框中。因为增强子通常在与启动子相隔几千个碱基时起作用，并且内含子序列长度可变化；所以另ー方面，一些多核苷酸元件可可操作地连接但不相邻。“转录単元”是指包含至少第一结构基因和至少第一远端调控元件以及任何另外的顺式序列的多核苷酸序列，所述至少第一结构基因与至少第一顺式作用启动子序列可操作地连接并任选与对有效转录结构基因序列所必需的ー种或多种其它顺式作用核酸序列可操作地连接，所述至少第一远端调控元件可能需要用于可操作地位于启动子和/或增强子元件控制下的结构基因序列的适当组织特异性和发育转录，所述任何另外的顺式序列对有效转录和翻译所必需(例如ー个或多个聚腺苷酸化位点、ー个或多个mRNA稳定控制序列等)。
短语“分离的，，或“生物学纯的，，是指基本上或大体上不含以下组分的材料，所述组分通常伴随所述材料，如在其天然状态中发现该材料吋。因而，本发明的分离多核苷酸优选不含通常在其天然或原位环境中与那些多核苷酸伴随的材料。“连接”或“结合”是指本领域已知的用于功能连接ー种或多种蛋白质、肽、核酸或多核苷酸的任何方法，包括但不限于重组融合、共价键合、ニ硫键键合、离子键合、氢键合、 静电键合等等。术语“病原体”本文定义为任何种类的传染原，包括例如病毒、感染性蛋白质、原生动物、寄生虫以及微生物，例如細菌、酵母、霉菌、真菌等等。本文所用术语“质粒”是指由遗传材料(即核酸)組成的遗传构建体。通常质粒含有复制起始点和选择标记，所述复制起始点在細菌宿主細胞例如大肠杆菌中起作用，所述选择标记用于检测包含质粒的細菌宿主細胞。本发明质粒可包括遗传元件，其如本文所述安排使得插入的编码序列可在真核細胞中转录及翻译。另外，质粒可包括源自天然或人 エ来源的ー种或多种核酸。本文所用术语“多肽”意在包括単数“多肽”以及复数“多肽”，并包括两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链。因而，包括但不限干“肽”、“ニ肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、 “氨基酸链”和“邻接氨基酸序列”的本文所用术语，全部包括在“多肽”定义中，术语“多肽” 可用于取代任何这些术语或与其互換使用。所述术语进ー步包括业已经受ー种或多种翻译后修饰的多肽，所述修饰包括例如但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、翻译后加工或通过包含ー种或多种非天然存在的氨基酸来修饰。在多核苷酸和多肽结构领域存在常规命名。例如，广泛采用ー个字母和三个字母縮写来阐述氨基酸丙氨酸 (A ；Ala)、精氨酸(R ；Arg)、天冬酰胺(N ；Asn)、天冬氨酸(D ；Asp)、半胱氨酸(C ；Cys)、谷氨酰胺(Q ；Gln)、谷氨酸(E ；Glu)、甘氨酸(G ；Gly)、组氨酸(H ；His)、异亮氨酸(I ；lie)、亮氨酸(L ；Leu)、甲硫氨酸(M ；Met)、苯丙氨酸(F ；Phe)、脯氨酸(P ；Pro)、丝氨酸(S ；Ser)、苏氨酸(T ；Thr)、色氨酸(W ；Trp)、酪氨酸(Y ；Tyr)、缬氨酸(V ；Val)和赖氨酸(K ；Lys)。本文所述氨基酸残基优选呈“L”异构形式。然而，“D”异构形式的残基可取代任何L-氨基酸残基， 前提为保留所期需的多肽性质。“蛋白质”在本文中可与“肽”和“多肽”互換使用，既包括合成、重组或体外产生的肽及多肽，又包括在给予宿主动物或人受试者核酸序列后体内表达的肽及多肽。术语“多肽”优选意指所有氨基酸链长度，包括约2-约20个氨基酸残基长的那些短肽、约10-约100 个氨基酸残基长的寡肽和包括约100个氨基酸残基长或更长的多肽。术语“序列”当指氨基酸时，涉及给定氨基酸链例如多肽或蛋白质内的线性N-末端到C-末端次序的全部或部分氨基酸；“子序列"意指序列内任何连续的氨基酸段，例如给定蛋白质或多肽序列内的至少3个连续氨基酸。关于核苷酸和多核苷酸链，“序列”和“子序列”具有涉及核苷酸的 5' -3'次序的相似含义。本文所用术语“基本上同源的”，包括在一级核苷酸序列水平上彼此显著相似的两个或更多个生物分子序列。例如，在两个或更多个核酸序列情境中，“基本上同源的”可指至少约75%、优选至少约80%和更优选至少约85%或至少约90%同一性，甚至更优选至少约 95%、更优选至少约97%同一，更优选至少约98%同一、更优选至少约99%同一、甚至更优选至少基本上或完全100%同一(即“不变的”)。同样，本文所用术语“基本上同一的”包括在核苷酸水平上彼此表现高度同一性的两个或更多个生物分子序列(特別是多核苷酸序列)。例如，在两个或更多个核酸序列情境中，“基本上同一的”可指彼此至少约80%、更优选至少约85%或至少约90%同一的序列， 甚至更优选至少约95%、更优选至少约97%同一、更优选至少约98%同一、更优选至少约 99%同一和甚至更优选至少基本上或完全100%同一(即“非简并的”)。术语“重组体”表示业已通过人为干预人工或合成(非天然)改变材料(例如多核苷酸或多肽)。可对在其天然环境或状态内或从其天然环境或状态中移出的材料实施改变。 具体地，例如当启动子序列由通过人工工程改造的核酸区段表达产生吋，其为“重组体”。例如，“重组核酸”为通过例如在克隆、DNA改組或其它程序期间重组核酸来制备的核酸，或通过化学或其它诱变而制备的核酸；“重组多肽”或“重组蛋白质”为通过重组核酸的表达而产生的多肽或蛋白质；“重组病毒”例如重组流感病毒通过重组核酸的表达而产生。根据本发明，多核苷酸、核酸区段、核酸序列等等包括但不限干DNA(包括且不限于基因组或基因组外DNA)、基因、肽核酸(PNA)、RNA(包括但不限于rRNA、mRNA和tRNA)、核苷和合适核酸区段，它们自天然来源获得、是化学合成的、经修饰的或由人工全部或部分以其它方式制备或合成。同样，按照长期使用的专利法律惯例，当用于包括权利要求在内的本申请中吋，措辞“ー个”和“ー种”表示“ー种或多种”。
实施例包括以下实施例以阐明本发明阐述性实施方案。本领域普通技术人员应该理解， 以下实施例中掲示的技术代表经发现在实施本发明中很好地起作用的技木，因此，可认为构成其实施的优选方式。然而，本领域普通技术人员应该理解，根据本公开内容，可在已揭示的具体实施方案中进行很多变化，仍获得类似或相似結果，而不会背离本发明精神和范围。实施例1-例示性储存溶液配方本实施例提供本发明PSS(PanFlu)組合物的通用配方。PSS組合物的另外的配方亦举例于实施例2到实施例5中材料硫氰酸胍、柠檬酸钠、Antifoam A 浓缩液和N-十二烷酰肌氨酸钠盐全都购自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。三羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)自 Soltec Ventures Inc. (Beverly, MA, USA)获得。2_ 氨基 _2_ 羟基甲基-丙烷 _1，3_ ニ醇(TRIS) 自 Applied Biosystems/Ambion (Austin,TX,USA)获得。2-[2-(双(羧基甲基)氨基)乙基-(羧基甲基)氨基]乙酸(EDTA)GIBCO Ultra Pure 自 hvitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA)获得。所有其它试剂可市购自Sigma-Aldrich或USB Corporation。表 1
用于制备PRIMEST0RE 組合物的例示性组分的配方范围
化合物最终浓度范围
1.离液剂，例如
碗氰酸胍约0.5 M-约6 M
或盐酸胍约0.5 M-约6 M
或异氰酸胍约0.5 M-约6 M
2.阴离子洗涤剂，例如
从十二烷醜肌I酸(尤其是Na盐) 约0.15%-约1% (重量/体积)
或十二烷基硫酸钠，相同
十二燒基较。酸锂，相同
甘氨胆酸钠，相同
脱氧胆酸钠，相同
牛磺脱氧胆酸钠，或相同
胆酸钠約0.1%-约1% (重量/体积)
3.还原剂，例如
TCEP约 0.5 mM-约 30 mM
或β-ΜΕ、DTT、甲酰胺或 DMSO 约 0.05 M-约 0.3 M
4.螫合剂，例如/
柠檬酸钠约0.5 mM-约50 mM
或 EGTA、HEDTA, DTPA, NTA、APCA 等约 0.01 mM-约 1 mM
5.缓冲剂(例如TRIS、HEPES, Bis-Tris 等)约 1 mM-约 1 M
6.酸(例如HCl或柠檬酸)适量调整到pH约6-7，优选6.4-6.8
7.无核酸酶水任选以下ー种或多种
8.表面活性剂/消泡剂，例如: Antifoam A 或 Tween
9.烷醇
(例如曱醇、乙醇、丙醇等) 10.栽体/IPC RNA 或 DNA
足量到期需最终体积
约0.0001%-约0.3% (重量/体积) 约1%-约25% (体积/体积)
约 1 pg-约 1 pg/mL
实施例2-例示性储存溶液制剂本实施例阐述本发明组合物的第一种例示性制剂。该制剂亦由本发明人另外称为 “Prim必tore 溶液”或“PSS，，1 型。表2PRIMEST0RE 组合物(1型)的制备
化合物终浓度
石充氰酸胍4 M
柠檬酸钠30 mM
十二烷基ぶ直酸钠0.25% (重量/体积)
ガ-十二烷酰カ几氨酸钠盐 0.25% (重量/体积) 2-疏基乙醇(β-ΜΕ)0.1 M
Antifoam A0.1 % (重量/体积、
柠檬酸适量调整到ρΗ6.5
无核酸酶水11,82 mL实施例3-第二种例示性储存溶液的制备本实施例阐述本发明另一例示性储存溶液的制备。该制剂亦由本发明人另外称为 PrimeStore 2 型。表3PrimeStore 组合物Q型)的制备
化合物量终浓度
硫氰酸胍35.488 gm3 M
TCEP0.02867 gm1 mM
柠檬酸钠0.2931 gmIOmM
が-十二烷酰肌氨酸钠盐(NLS) 0.5 gm0.5%
Antifoam A (10%溶液)200 μ 0.002%
TRIS(IM)IOmLIOOmM
EDTA (0.5 Μ)20 ル0.1 mM
盐酸(HCl)适量调整到pH6.7-
无核酸酶水足量到IOOmL--实施例4-第三种例示性储存溶液的制备
本实施例阐述本发明另一例示性储存溶液的制备。该制剂亦由本发明人另外称为 PSS 2. 2 型。表 4PrimeStore 组合物(2· 2 型)的制备
权利要求
1.--种组合物，其包含a)-一种或多种离液剂；b)-一种或多种洗涤剂；C)-一种或多种还原剂；d)-一种或多种螯合剂；e)-一种或多种缓冲剂；f)约60-500个核苷酸长的分离的单链核酸分子，所述单链核酸分子包含以下核酸区段，其包含(1)与约12-约40个核苷酸长的标记探针特异性结合的第一序列域，所述标记探针对检测所述核酸区段特异；(2)与约20-约40个核苷酸长的正向PCR扩增引物特异性结合的第二序列域；(3)与约20-约40个核苷酸长的反向PCR扩增引物特异性结合的第三序列域；其中所述第二和第三序列域可操作地定位，以促进在有效扩增所述核酸区段的至少第一部分的条件下自所述正向和反向引物进行所述至少第一部分的PCR引导扩增；其中在严格杂交条件下所述分子基本上不与哺乳动物基因组或对哺乳动物致病的细菌、真菌或病毒基因组结合；和另外其中(a)-(e)以以下量存在于所述组合物中，当怀疑含有核酸群的样品与所述组合物接触时，所述量足以使所述样品中的一种或多种蛋白质变性，使所述样品中的一种或多种核酸酶灭活，杀死所述样品中的一种或多种病原体，或防止所述样品中的一种或多种核酸不被降解。
2.权利要求1的组合物，其中(a)-(e)中的每一种以以下量存在于所述组合物中，所述量足以抑制或防止包含所述单链核酸分子的核苷酸群当在约10°C -约40°C温度下储存约 1天-约90天的时间时大量降解。
3.前述权利要求中任一项的组合物，其中a)所述一种或多种离液剂各自以约0.5M-约6M的量存在；b)所述一种或多种洗涤剂各自以约0.1 % -约1 % (重量/体积)的量存在；c)所述一种或多种还原剂各自以约0.05M-约0. 3M的量存在；d)所述一种或多种螯合剂各自以约0.OlmM-约ImM的量存在；和e)所述一种或多种缓冲剂各自以约ImM-约IM的量存在。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述标记探针包含至少第一小沟结合剂、放射性标记、发光标记、化学发光标记、荧光标记、酶标记、磁性标记或自旋共振标记或其组I=I ο
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中a)所述一种或多种离液剂包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或其任何组合；b)所述一种或多种洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-十二烷酰肌氨酸或其任何组合；c)所述一种或多种还原剂包括2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲亚砜或其任何组合；d)所述一种或多种螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N，N-双(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或其任何组合；或e)所述一种或多种缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3_双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷、 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐或其任何组合。
6.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物进一步包含以下一种或多种g)一种或多种选自硅酮聚合物、聚山梨醇酯及其任何组合的表面活性剂；h)一种或多种选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇及其任何组合的短链烷醇；和i)一种或多种选自硅酮聚合物、聚山梨醇酯及其任何组合的消泡剂；和其任何组合。
7.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物a)被缓冲到pH约6.0-7. 0 ；b)基本上没有RNA酶或DNA酶活性；或c)进一步包含细菌、病毒或真菌来源的分离的多核苷酸群，所述多核苷酸群包括RNA、 DNA、PNA或其任何组合。
8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含a)约4M硫氰酸胍；约30mM柠檬酸钠；约0.25% (重量/体积)十二烷基硫酸钠；约 0. 25% (重量/体积)N-十二烷酰肌氨酸钠盐；(ν)约0. IM 2-巯基乙醇；和约0. 硅酮聚合物(重量/体积)；b)约3M硫氰酸胍；约ImMTCEP ；约IOmM柠檬酸钠；约0. 5% N-十二烷酰肌氨酸；约 0.0002%硅酮聚合物；约IOOmM 2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1，3-二醇(TRIS)；和约0. ImM EDTA ；c)约IM-约4M硫氰酸胍；约0.5mM-10mM TCEP ；约ImM-IOOmM柠檬酸钠；约0. 1 % -约 SDS 或NLS ；约 0. 001% -约 0. 0001%硅酮聚合物、约 IOmM-约 500mM TRIS、约 0. ImM-约lmMAPCA, EDTA, EGTA, HEDTA, DTPA, NTA 或柠檬酸盐；和约 10% -约 25% 乙醇(体积 / 体积)；或d)约3M硫氰酸胍；ImMTCEP ；约IOmM柠檬酸钠；约0. 5% N-十二烷酰肌氨酸钠盐；约 0. 0002%硅酮聚合物；约IOOmM TRIS ；约0. ImM EDTA ；和约10% -约25%乙醇(体积/体积)。
9.前述权利要求中任一项的组合物，其中将所述核酸群采集并保存在包含所述组合物的单一反应容器中。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述样品为临床、兽医、流行病学、环境、法医或病理来源的生物样品；或其中所述样品含有或怀疑含有病毒、细菌、真菌或哺乳动物来源的一种或多种多核苷酸。
11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述分离的单链核酸分子包含来自以下序列的至少 20 个邻接核苷酸5 ‘ -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGA CA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCAGUU-3‘ (SEQ ID NO 2)。
12.用于诊断或治疗微生物、真菌或病毒感染的权利要求1-11中任一项的组合物。
13.权利要求1-11中任一项的组合物在制备用于诊断或治疗微生物感染或其一种或多种症状的药物中的用途。
14.用于诊断或治疗细菌、病毒或真菌感染或其一种或多种症状的权利要求13的用途。
15.一种诊断试剂盒或样品采集系统，所述诊断试剂盒或样品采集系统包括a)权利要求1-11中任一项的组合物；和b)使用所述组合物诊断或治疗微生物感染的使用说明。
16.一种用于提高自怀疑含有多核苷酸的生物样品获得纯化的这类多核苷酸群的效率的方法，所述方法包括让所述样品与包含权利要求1-11中任一项的分离的单链核酸分子的组合物接触，所用量和接触时间足以提高自所述生物样品获得纯化的多核苷酸群的效率。
17.权利要求16的方法，其中当包含所述样品的组合物在约10°C-约40°C温度下储存 (a)约7-约14天的时间或(b)约14-约30天的时间时，所述生物样品中的多核苷酸群的完整性或所述多核苷酸之一的至少第一序列的保真度得到至少基本上保持。
18.权利要求16或权利要求17的方法，其中(a)包含所述样品的组合物基本上从采集时间到分离、纯化或表征其中的多核苷酸群的时间储存在约10°C -约40°C温度下；或(b) 在包含所述样品的组合物在约10°C -约40°C温度下储存约7-约30天的时间后，所述样品中含有的不到约5%的多核苷酸群被降解。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中包含所述样品的组合物在(a)约10°C-约 400C的温度下储存约24-约96小时；或在(b)约10°C -约30°C的温度下储存约7天-约 30天。
20.权利要求16-19中任一项的方法，所述方法进一步包括分析或定量测定自所述纯化的样品获得的多核苷酸群的步骤。
21.权利要求20的方法，其中所述定量测定步骤包括测定所述分子的PCR循环阈值 (Ct) ο
22.—种从怀疑含有核酸的生物样品获得多核苷酸群的方法，所述方法包括让所述样品与一定量的以下组合物接触，所述组合物包含约IM-约4M硫氰酸胍； 约 0. 5mM-约 IOmM TCEP ； 约ImM-约IOOmM柠檬酸钠； 约0. 1 % -约1 % N-十二烷酰肌氨酸钠盐； 约 0. 001% -约 0. 010% 的 10% antifoam A 溶液； 约 IOmM-约 500mM Tris ； 约 0. ImM-约 ImM EDTA ； 约10% -约25%乙醇(体积/体积)；和具有以下序列的核酸分子5 ‘ -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAG CGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3 ‘ (SEQ ID NO :2)，其以足以稳定所述多核苷酸群的量存在，使得在包含所述样品的组合物在约 IO0C -约40°C温度储存至少约7天-约30天后，所述样品中含有的不到约30%的多核苷酸群被降解。
全文摘要
本发明揭示用于采集、储存和运输来自生物样本和临床、法医或环境样品的核酸群的组合物。亦揭示用于用这些组合物作为一步制剂杀死样品中的病原体、使样品中的核酸酶灭活及从样品中的其它细胞组分释放多核苷酸并在进一步处理或测定前稳定核酸的方法。在特定实施方案中，本发明提供含有已知量的非基因组核酸载体分子的单一一步样品采集/运输/储存制剂，所述核酸载体分子起内部参考对照的作用，以监测采集/运输介质的保真度，并测量随后自处理的样品分离和纯化的核酸的完整性。
文档编号C07H21/00GK102575286SQ201080028416
公开日2012年7月11日 申请日期2010年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者G·W·费希尔, L·T·道姆 申请人:长角牛疫苗和诊断有限责任公司