作为补体激活的抑制剂的masp同种型的制作方法

专利名称：作为补体激活的抑制剂的masp同种型的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型ficolin-相关多肽，和衍生于这些ficolin-相关多肽的多肽，其用于治疗与炎症、凋亡、自体免疫性、凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的病症的治疗，以及用作生物标记。本发明还涉及识别所述新型ficolin-相关多肽和衍生于其的多肽的抗体、编码所述多肽的核酸分子、用于生产所述多肽的载体和宿主细胞。
背景技术：
补体系统(C)的激活通过三种不同的起始途径完成旁路途径(AP)，经典途径(CP)，或凝集素途径(LCP)。AP激活发生在外源表面上，并且由C3的缓慢自发性水解和因子备解素、因子B和因子D形成功能性C3转换酶C3bBb的活性引起。AP还作为另外两种途径的放大途径(amplification pathway)(放大环)起作用。最近，已经表明，备用的转换酶组装还可以通过将备解素非共价连接到一些靶标表面上而起始。另一方面，当Clq结合与 抗原复合的免疫球蛋白时起始CP激活，Clq同与抗原复合的免疫球蛋白的结合引发Clq-缔合的丝氨酸蛋白酶Clr和Cls的激活。Cls分裂并且激活C4和C2，从而形成CP C3转换酶C4b2a。当甘露糖-结合凝集素(MBL)或ficolins结合限制性模式的糖类(carbohydrate)或乙酰化的化合物时，例如，在微生物体表面上，或当暴露在濒死宿主细胞上时，激活LCP。当与配体结合时，缔合的丝氨酸蛋白酶MASP-2激活并且分裂C4和C2，从而形成LCP C3转换酶C4b2a。已经提议MASP-I的功能涉及C2的MASP-2分裂的稳定，并且还指导C3的低级分裂。然而，其它研究将MASP-I和MASP-2的功能和活性与涉及凝血酶原、纤维蛋白原和因子XIII的凝结系统交叉通讯(coagulation system cross-talk)相关。使用MASPI/3敲除小鼠，最近证明MASP-I事实上有助于补体活性。最近发现的MBL缔合的丝氨酸蛋白酶MASP-3的准确功能尚未得到阐明。已经报道了一些研究，其表明MASP-3与有限范围的MBL寡聚体缔合，并且MASP-3和小的MBL-缔合的蛋白(sMAP)参与MBL依赖性LCP补体激活的调节或抑制。MASP-I和-3通过不同的剪接来源于同一 MASP1/3基因(存在于染色体3q27_q28上)。它们包含相同的A链，不同的是15个C端残基。A链包括由EGF(表皮生长因子)结构域隔开的两个CUB (Clr/Cls，Urchin-EGF,骨形态生成蛋白)结构域，接着是两个CCP结构域(补体控制蛋白)。包括丝氨酸蛋白酶结构域的B链不同于MASP-I和MASP-3。MASP-2和sMAP也来源于相同的基因(存在于染色体Ip36-p36. 2上)，其中sMAP是缺少丝氨酸蛋白酶结构域和A链主要部分的截短形式。已经表明MASP1/3基因是多态性的，但是其功能重要性仍然所知甚少。然而，存在一些证据表明MASP2/sMAP基因中的多态性与增加的感染风险有关。MASPs的表达定位在肝脏的肝细胞，但是最近的研究记载人MASP-3 mRNA (唯一的MASP-mRNA)在宽泛范围的组织中表达。发明目的本发明实施方案的目的是提供适于治疗与炎症、凋亡、自体免疫性、凝结、和/或血栓形成或凝血病相关的疾病有关的病症的多肽。本发明的多肽可以进一步适于作为生物标记，用于诊断和/或预测这些适应证以及用于恶性病，如癌症。
发明概述本发明人已经发现与凝集素补体途径的识别分子相关的新型多肽以及诸如衍生于其的片段的多肽可以用于治疗与炎症、凋亡、自体免疫性、凝结、和/或血栓形成或凝血病相关的疾病有关的特定医学病症的治疗。因此，在第一方面，本发明涉及分离的ficolin-相关多肽。在第二方面，本发明涉及包括氨基酸序列SEQ ID NO :4的多肽或其变体或免疫学片段。在第三方面，本发明涉及特异性结合本发明的多肽的抗体。在第四方面，本发明涉及编码本发明的多肽的分离的核酸分子。在另一个方面，本发明涉及包含与SEQ NO :2的序列至少70%相同的核苷酸序列的分尚的核酸分子。在另一个方面，本发明涉及包含编码本发明的多肽的分离的核酸分子的载体。在另一个方面，本发明涉及包含含有编码本发明的多肽的分离的核酸分子的载体的宿主细胞。在另一个方面，本发明涉及产生本发明的多肽的方法，所述方法包括在允许多核苷酸构建体表达的条件下，在适合的生长培养基中培养本发明的细胞，并且从培养基中回收得到的多肽。在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的多肽的药物组合物。在另一个方面中，本发明涉及检测生物样品中的本发明的多肽的方法，所述方法包括a)获得生物学样品；b)使所述生物学样品与本发明的抗体接触；并且c)如果有的话，检测所述抗体与多肽的复合物；作为所述样品中存在所述多肽的指示。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用作药物。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽用于制备药物的用途。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的任意适应证。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用于预防在鉴定的高危患者中发生血栓栓塞并发症，所述鉴定的高危患者如经历手术的那些或患有充血性心力衰竭(congestive heart failure)的那些。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用于治疗与心脏相关的医学病症。 在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽，其用于治疗与ficolin-相关多肽缺乏有关的医学病症。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的任意适应证的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于预防在鉴定的高危患者中发生血栓栓塞并发症的方法，所述鉴定的高危患者如经历手术的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗与心脏相关的医学病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗与ficolin-相关多肽缺乏有关的医学病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的多肽。
在另一个方面中，本发明涉及能够在严格条件下与编码本发明的多肽的核酸序列杂交的核酸探针。在另一个方面中，本发明涉及检测生物学样品中存在编码本发明的多肽的核酸的方法，所述方法包括a)获得生物学样品；b)使所述生物学样品与本发明的核酸探针接触；并且c)如果有的话，检测所述核酸探针与编码多肽的核酸的复合物；作为在所述样品中存在所述编码多肽的核酸的指示。在另一个方面中，本发明涉及诊断与ficolin-相关多肽异常表达有关的病症的方法，所述方法包括获得来自患者的生物学样品，并且测量所述生物学样品中ficolin-相关多肽的表达，其中，与对照相比，ficolin-相关多肽增加或减少的表达表示患者患有与ficolin-相关多肽异常表达有关的病症。在另一个方面中，本发明涉及一种分离的组合物，其包括本发明的多肽以及选自Ficolin-l、2、3，甘露糖结合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CLL-Il的一种或多种蛋白的组合。在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物，其是一种药物组合物。在另一个方面中，本发明涉及本发明所述的药物组合物，其用作药物。在另一个方面中，本发明涉及本发明的组合物用于制备药物的用途。在另一个方面中，本发明涉及本发明的药物组合物，其用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证。在另一个方面中，本发明涉及本发明的药物组合物，其用于治疗本文定义的任意适应证。在另一个方面中，本发明涉及用于治疗本文定义的任意适应证的方法，所述方法包括同时或先后施用治疗或预防有效量的本发明的多肽和一种或多种选自Ficolin-l、2、3，和甘露糖结合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CLL-Il的蛋白。在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽作为血液和组织中的生物标记的用途，用于诊断和/或预测恶性疾病，诸如癌症疾病，诸如脑瘤、肝肿瘤和生殖道肿瘤。
在另一个方面中，本发明涉及本发明的多肽作为血液和组织中的生物标记的用途，用于诊断和/或预测本文定义的自体免疫、代谢和/或炎性病症。附例图I :MASP_1基因的可变转录。在肝脏cDNA中检测到MASP-1基因的可变转录。使用位于外显子6的通用正向引物和位于外显子12 (MASPl)、外显子11(MASP3)、和外显子8a(FAP)的特异性反向引物扩增MASP1，MASP3，和FAP转录物。MASPl产生500bp的片段，MASP3产生506bp的片段，FAP产生309bp的片段。图2 :MASP1基因的可变剪接。MASPl通过剪截掉8a和外显子11产生，二者均包含终止密码子序列(用黑框标记)。MASPl序列在外显子17中包含终止密码子。MASP3通过剪截掉外显子8a而产生，如果没有剪截掉外显子8a，则产生FAP。FAP蛋白包含两个CUB结构域，EFG结构域和第一 CCPl结构域。
图3 =FAP片段的组织表达。在来自Clontech的cDNA组中研究MASP_1、MASP3、和FAP基因的组织分布。使用通用正向引物和特异性反向弓I物扩增MASP-I、MASP-3、和FAP转录物。GADPH用作参照基因。所有三种基因在肝脏中高度表达，另外，FAP在心脏组织中强表达(用黑色箭头表示)。在脑、结肠、前列腺、骨骼肌、和小肠中检测到FAP基因的较少表达(用白色箭头表示)。图4 :MASP-1，MASPUP FAP 的比对。利用 BioEdit 软件比对 MASP-1，MASP-3，和FAP的蛋白序列。MASP-I和MASP-3包含不同的C端丝氨酸蛋白酶结构域，而FAP不包含任何丝氨酸蛋白酶结构域。相反，该蛋白在C端区域包含17个新的氨基酸。图5 =FAP的cDNA序列和相对应的蛋白序列。cDNA序列显示在上一行，相对应的蛋白序列显示在下。外显子区域被黑色竖直线分开。认为参与MBL/ficolins结合的氨基酸用浅黄色方框标记。图6 =MASP-I补体激活。将人MBL用增加量的MASP-1温育。MASP-1能够激活C3和C4两种补体蛋白。图7 MASP-2补体激活。将人MBL用增加量的MASP-2温育。MASP-2能够强烈激活C3和C4两种补体蛋白。图8 :补体的MASP-3抑制。将人MBL用增加量的MASP-3温育。MASP-3能够抑制C3和C4两种补体蛋白的激活。图9 :免疫沉淀。用 mAb 抗-MBL 131-11，抗-Ficolin-2 克隆 219，和抗-Ficolin-3克隆334免疫沉淀血清Ficolin/MBL。接着进行Dynal磁珠分离，SDS-PAGE，蛋白质印迹和生物素标记的抗-MASP-1/MASP-3克隆8B3作为信号抗体。

图10 =Ficolin与乙酰化的人血清白蛋白(AcHSA)结合时，FAP与Ficolin相互作用。洗脱的与AcHSA结合的血清Ficolin。蛋白质印迹使用生物素标记的抗-MASP-I/MASP-3克隆8B3作为信号抗体进行。图11 =MASP-I和MASP-3与rFicolin-2之间相互作用的动力学和解离常数Hummelshaj T 等，Mol. Immunol.(分子免疫学),2007)。图12 KULF和FAP的17个特有氨基酸的比对。图13 :在甘露聚糖/MBL ELISA测定中，C4的补体激活。将甘露聚糖包被的孔用或不用重组人MBL温育，然后用连续稀释的MBL纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图14 :在乙酰化的BSA/Ficolin-3 ELISA测定中，C4的补体激活。将AcBSA包被的孔用或不用重组人Ficolin-3温育，然后用连续稀释的Ficolin-3纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图15 :在甘露聚糖/MBL ELISA测定中，C4的补体激活。将甘露聚糖包被的孔用重组人MBL温育，然后在一个维度用rMASP-Ι连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的MBL纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图16 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA测定中，C4的补体激活。将AcBSA包被的孔用重组人Ficolin-3温育，然后在一个维度用rMASP-Ι连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的Ficolin-3纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图17 :在甘露聚糖/MBL ELISA中，C4的补体激活。将甘露聚糖包被的孔用重组人MBL温育，然后在一个维度用rMASP-2连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的MBL纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图18 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA测定中，C4的补体激活。将AcBSA包被的孔用重组人Ficolin-3温育，然后在一个维度用rMASP-2连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的Ficolin-3纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图19 :在甘露聚糖/MBL ELISA测定中，C4的补体激活。将甘露聚糖包被的孔用重组人MBL温育，然后在一个维度用rMASP-3连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的MBL纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图20 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA测定中，C4的补体激活。将AcBSA包被的孔用重组人Ficolin-3温育，然后在一个维度用rMASP-3连续稀释液作为不含血清的培养基培养物上清进行温育。随后在第二维度用连续稀释的Ficolin-3纯合子缺陷型血清温育。使用多克隆抗C4c抗体测量C4沉积。误差条表示曲线上每个点双重确定的标准误差的两倍。图21 FAP,MASPl和MASP3的组织分布。在心脏组织中，FAP表达较MASPI和MASP3高得多。与在肝脏中的FAP表达相比，FAP在心脏组织中的表达高三倍。此外，与在肝脏中的MASPl和MASP3表达相比，在肝脏中观察到更高的FAP表达。在脑、骨骼肌和前列腺组织中也检测到相当多的FAP表达。实验一式两份进行三次。显示平均值的标准误差。图22 :使用针对蛋白的17个FAP特异性C端残基的多克隆小鼠抗血清进行MAP-I的免疫组织化学肝脏定位。对照染色是阴性的。几种不同的针对FAP的多克隆抗体(兔和小鼠)表现出相同模式的染色。图23 =MAP-I组织定位的免疫组织化学分析(0M X10)。左图显示用针对MAP-I的 mAb(12Bll)染色。右图显示用不相关的IgGlk mAb的同种型对照染色。(A-B):心肌，(C-D)骨骼肌，(E-F):肝脏样品，(G-H):主动脉组织。所有载玻片上右下角刻度条表示50 μ m。
图24 =MAP-I和MASP-1/3血清复合物的免疫沉淀。(A)用mAb 20C4(抗MAP-1)和mAb 8B3 (抗MASP-1/3，具有在通用重链上的表位)从血清中免疫沉淀MAP-1和MASP-1/3。将还原的样品电印迹并且用针对MAP-I的PAb或针对Ficolin-3 (FCN334)和MBL (Hyb131-1)的生物素酰化的 mAbs 显色。(B)用针对 MBL(Hyb 131-11)，Ficolin-2 (FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs分别从1ml，300 μ I和100 μ I血清进行免疫沉淀(左侧)。对照为使用抗MAP-I mAb 20C4从血清沉淀的MAP-I (sMAP-Ι)和从培养物上清沉淀的rMAP-1 (rMAP-1)(右侧)。样品通过使用针对MAP-I的pAb探测的蛋白质印迹进行分析。图25 MASP-2和MAP-1对MBL和Ficolin-3介导的补体C4沉积的影响。C4沉积使用针对C4的多克隆抗体测量，并且作为0D490-650nm值给出。误差条表示双重确定的标准误差的两倍。在附图标记中给出rMBL，rFicolin-3，rMAP-1和rMASP-2的近似浓度。(A)使用MBL缺陷型血清，用400ng/ml的rMBL，重建在甘露聚糖包被的表面上的C4沉积。对照不加入rMBL。(B) rMASP-2对rMBL介导的C4沉积的剂量依赖性影响。(C) rMAP-Ι对rMBL介导的C4沉积的剂量依赖性影响。(D)使用Ficolin-3缺陷型血清，用400ng/ml的rFicolin-3,重建在AcBSA包被的表面上的C4沉积。(E)rMASP_2对rFicolin-3介导的C4
图26 :MASP-2和MAP-I对纯系统中补体C4沉积的影响。甘露聚糖表面上的rMBL在第一维度上用连续稀释的rMASP-2预先温育。然后在第二维度上应用连续修饰的rMAP-1，然后应用I μ g/ml的纯化的C4。使用针对C4的pAb测量C4沉积，并且作为0D490_650nm值给出。误差条表示双重确定的标准误差的两倍。在附图标记中给出rMAP-Ι和rMASP-2的近似浓度。图27 rMAP-Ι的SDS-PAGE分析。左手侧表示免疫印迹分析+/-N-糖苷酶F处理(ENDO-F)。右侧表示相对应的考马斯染色。Fig. 28A，B :校正曲线。A)通过mAb 20C4/mAb_8B3双侧ELISA产生的校正曲线，其使用应用到MAP-I耗尽的正常人血清库(PNHS)的两倍连续稀释的rMAP-Ι或稀释在PBS/0. 05%吐温/IOmM EDTA中的连续稀释的rMAP-Ι进行。误差条表示8次确定的标准误差的两倍。B)MAP-I耗尽的血清、正常人血清和掺加rMAP-Ι的MAP-I耗尽的血清的免疫印迹。图29A-C =MAP-I血清浓度。A)在100名丹麦献血者中的MAP-I血清浓度和分布。平均血清水平240ng/ml。范围115_466ng/ml· ;B)MASP_3和MAP-1血清水平之间的相关性；C)对血清冷冻和解冻的影响。将血清冷冻和解冻8轮，测量每轮的MAP-I水平。误差条表示双重确定的标准误差的两倍。图30 A)在100名丹麦献血者中，MAP-I与MBL，Ficolin-2和Ficolin-3之间各自的缔合水平(以相对O. D. 490-650nm单位表示)。P值通过非参数双尾t检验获得。B)在MAP-I血清水平和与MBL，Ficolin-2和Ficolin-3的相对缔合之间的相关性(左手侧)。MBL, Ficolin-2和Ficolin-3血清水平与同MAP-I的相对缔合之间的相关性(右手侧)。相关性P-和r-值使用非参数斯皮尔曼等级相关性检验计算。图31A-C :蔗糖梯度超离心。A)由进行10_30%蔗糖密度梯度的血清收集的级分(1-27)。级分通过针对MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和-3的特异性ELISA进行分析。血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰值表示在图的顶部。B)通过针对MAP-1，MASP-I, MASP-3,sMAP, MASP-2, MBL, Ficolin-2和Ficolin-3的免疫印迹分析编号8-23的级分。C)通过激活外源应用在固定的乙酰化BSA(—种Ficolin-3配体)或甘露聚糖(一种MBL配体)上的人C4的能力而分析级分1-27。发明的详细公开内容本发明已经发现一种与凝集素补体途径的识别分子相关的40kDa新型血浆蛋白，并且将其鉴定为MASP-1/MASP-3的新的可变转录变体，其又对应于该新发现的血浆蛋白。本发明人已经表明该新型蛋白(本发明人命名为FAP(Ficolin相关蛋白，FicolinAssociated Protein)或 MAP-1(MBL/Ficolin 相关蛋白-I, MBL/Ficolin associatedprotein-1))缺少酶结构域但是包含ficolin/MBL结合结构域,并且因此预测其通过MASPs的竞争和置换或备选地，但不相互排斥地，作为参与清除或信号传导功能的蛋白而参与补体和凝结功能的调控和抑制。补体系统和/或凝结级联的不可控激活强烈地与在系统性炎症和脓毒症、心肌梗 死和自体免疫性的范围内的各种疾病的致死性严重后果相关。已经表明，凝结和补体激活的抑制是一种有希望的治疗工具。本发明描述一种补体和凝结功能的可能的新型抑制剂。然而，本发明的多肽可以具有其它的功能，诸如清除和/或信号传导功能。此外，其可以在一些疾病情形中用作新的生物标记，所述疾病情形包括恶性疾病、自体免疫性、代谢和/或炎性病症。本发明的发明人已经发现一种称为Ficolin相关蛋白(FAP)的体内血存在的浆蛋白，并且表明，其主要与ficolins相缔合(图9)，但是其可能还与甘露糖结合凝集素相缔合。通过搜索NCBI核苷酸数据库，本发明的发明人发现一种对应于截短的MASP-I的可能的转录变体。基于这一序列，设计引物，从而扩增推定的新基因转录物。随后，使用人肝脏cDNA，鉴定了 MASP-I基因的新可变转录变体(图I)。对这一 mRNA链进行测序，并且确定氨基酸序列，其对应于分子量为40kDa的在血浆/血清中观察到的蛋白(图5)。该新型蛋白部分与MASP-I和MASP-3相同，但是缺少丝氨酸蛋白酶结构域，却包含在终止密码子前的编码17个氨基酸的新外显子。该外显子在MASPl和MASP3转录物中被剪截掉(图2)。通过使用一组mRNA表达文库，本发明人已经发现该蛋白在心脏和在肝脏中、其次在骨骼肌中强烈表达的证据(图3)。在脑、消化道、前列腺和在脾中观察到弱表达(图3)。Taqman分析证实在心脏和肝脏细胞中的表达。FAP较MASPl和MASP3在心脏组织中的表达高得多。与在肝脏中的FAP表达相比，FAP在心脏组织中的表达高三倍。并且，与在肝脏中的MASPl和MASP3表达相比，在肝脏中观察到更高的FAP表达。在脑、骨骼肌和前列腺组织中也检测到相当多的FAP表达。实验一式两份进行三次。在心脏中的高表达非常显著，并且使本发明人提议本发明的多肽作为自体免疫性、代谢和/或炎性病症(诸如与心脏相关的医学病症)中抗组织损伤的非常有用的保护剂的应用。本发明人已经建立评估由ficolins和甘露糖结合凝集素引发的补体活性的测定法，并且发明人因此已经能够表明FAP可能的功能性补体抑制作用。本发明人已经建立实时定量测定法来测量不同组织中准确的相对表达水平。本发明的多肽可以通过重组技术产生。可以用特有的17个氨基酸长的肽免疫兔或小鼠，从而分别获得FAP多克隆和单克隆特异性抗体。
特异性FAP抗体可以用于定量测量FAP和不同组织中的免疫组织化学检测。可以在ELISA中并且通过使用表面等离子体共振技术(Biacore)确定FAP和本文所述的不同结合配偶体之间的结合常数。FAP特异性接纳体蛋白，如特异性细胞表面结合的受体，可以通过本领域技术人员已知的标准测定法鉴定，所述测定法诸如其中蛋白直接结合到细胞上的测定法。新型蛋白Ficolin相关蛋白(FAP)是MASPl的可变剪接变体。该蛋白缺少丝氨酸蛋白酶结构域，但是仍然保留参与与补体系统的凝集素途径的起始剂结合的结构域。因此，本发明人预测该蛋白通过MASPs的竞争和置换参与MASP-I和MASP-3 (补体，凝结功能和其它酶底物)功能的调节和抑制。备选地，但是不相互排斥地，FAP可以作用为清除分子，促进去除与内源性废物物质或病原体结合的FAP/MBL/ficolin复合物。补体系统和凝结级联的不可控激活与不利的后果相关，并且功能性抑制剂，诸如本发明的多肽，可以非常有效地控制补体系统和凝结级联。另外，本发明的多肽可以用在其它情形中。另一个角度是可以将该蛋白用作不同疾病情形中的生物标记。所述蛋白是独特的，并且可以提供用于新药物和/或新诊断工具的基础。包含氨基酸序列SEQ ID NO :4或其免疫学片段或变体的本发明的多肽可以具有与该氨基酸序列相关的特定功能。本发明人提议，所述多肽可以具有与选自下列的一种或多种蛋白的活性相对应的功能或活性=DNMTl DNA (细胞因子_5_)-甲基转移酶I (DNMTl)，高尔基蛋白亚家族B成员I (GOLGBl) ,A-激酶锚定蛋白9 (AKAP9)，B_和T-淋巴细胞-相关蛋白)(⑶272抗原)，包含PTB结构域的吞没衔接蛋白I (⑶LP)，和包含MACRO结构域的蛋白2。在一些特别有意思的实施方案中，本发明的多肽具有与包含PTB结构域的吞没衔接蛋白I(GULP)的活性相对应的功能或活性。定义术语“ficolin相关多肽”用在本文中意指包含天然人ficolin相关多肽(FAP)(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列20-380或SEQ ID NO 9的氨基酸序列16-363的任意蛋白或多肽，其功能性变体、功能性截短版本以及功能性衍生物或缀合物，所述多肽不具有补体活性，但是具有与MASP-1，MASP-2，或MASP-3竞争与f icolin-3，MBL，Clq,肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D和/或CL-Ll (和其它胶原凝集素家族成员)结合的能力。这包括但不限于具有SEQ ID NO :I的人ficolin相关多肽(FAP)及其变体。术语“ficolin相关蛋白(FAP) ”用在本文中意指具有天然人FAP (SEQID NO I)的氨基酸序列1-380(有或无信号肽，诸如氨基酸序列20-380)的蛋白、其天然等位基因变体和同源物。其还包括具有略微修饰的氨基酸序列的蛋白，例如，包括N或C端氨基酸缺失或添加的修饰的N或C末端，只要这些蛋白基本上保留FAP活性。术语“ficolin相关蛋白(FAP) ”在本文中与术语“MAP-1”或“MBL/Ficolin相关蛋白-I”互换使用。在上述定义中的“FAP”还包括可能在一个个体到另一个个体之间存在并发生的天然等位基因变体。该术语还包括具有同源序列和相似功能的来源于除人外其它物种(诸如牛、猪、狗、马、大鼠、和小鼠)的蛋白。此外，取决于所选的宿主细胞和宿主细胞环境的性质，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可能不同。
术语“MBL-相关的丝氨酸蛋白酶-I”或“MASP-1”用在本文中意指具有天然人MASP-1 (SEQ ID NO :5)的氨基酸序列1-699 (有或无信号肽，诸如氨基酸序列20-699)的蛋白、其天然等位基因变体和同源物。应该理解，所述序列可以存在于一条或多条肽链中，诸如存在于两条链中，即，存在于天然人蛋白的重链和轻链中。术语“MBL-相关的丝氨酸蛋白酶-3”或“MASP-3”用在本文中意指具有天然人MASP-3 (SEQ ID NO 7)的氨基酸序列1-728 (有或无信号肽，诸如氨基酸序列20-728)的蛋白、其天然等位基因变体和同源物。应该理解，所述序列可以存在于一条或多条肽链中，诸如存在于两条链中，即，存在于天然人蛋白的重链和轻链中。术语“MBL-相关的丝氨酸蛋白酶-2”或“MASP-2”用在本文中意指具有天然人MASP-2 (SEQ ID NO 9)的氨基酸序列1-686 (有或无信号肽，诸如氨基酸序列16-686)的蛋白、其天然等位基因变体和同源物。应该理解，所述序列可以存在于一条或多条肽链中，诸如存在于两条链中，即，存在于天然人蛋白的重链和轻链中。术语“小的MBL相关蛋白”、“sMAP”、“19kD的MBL相关的血浆蛋白”或“MApl9”用 作本文中意指具有天然人sMAP (SEQ ID NO 11)的氨基酸序列1_185 (有或无信号肽，诸如氨基酸序列16-185)的蛋白、其天然等位基因变体和同源物。术语“变体”(“variant”或“variants”)用在本文中意欲指定具有序列SEQ IDNO :1的ficolin相关多肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO 4的多肽，其中一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸置换和/或其中一个或多个氨基酸已被删除和/或其中已经在多肽中插入一个或多个氨基酸和/或其中已向多肽添加一个或多个氨基酸。所述添加可以发生在N末端或在C末端或在两端。在该定义中的“变体”仍然具有功能性活性。在一些实施方案中，变体与序列SEQ ID NO :1具有70%的序列同一性。在一些实施方案中，变体与序列SEQ IDNO :1具有80%的序列同一性。在另一些实施方案中，变体与序列SEQ ID N0:1具有90%的序列同一性。在另一个实施方案中，变体与序列SEQ ID NO: I具有95%的序列同一性。在一些实施方案中，变体与序列SEQ ID NO: 4具有70%的序列同一性。在一些实施方案中，变体与序列SEQ ID NO :4具有80%的序列同一性。在另一些实施方案中，变体与序列SEQ ID NO :4具有90%的序列同一性。在另一个实施方案中，变体与序列SEQ ID NO:4具有95%的序列同一性。短语“功能性变体”、“功能性截短版本”和“功能性衍生物”用在本文中是指SEQ IDNO :1的变体、截短的版本以及衍生物，所述多肽包含SEQ ID NO: I的基本序列部分，并且至少具有与MASP-I或MASP-3竞争结合ficolins或MBL的能力而不具有补体活性和/或丝氨酸蛋白酶活性。应该理解，ficolin相关多肽可以具有选自作为变体、和/或截短体和/或衍生物的两个或三个特征。已经在相同细胞类型中产生了 ficolin相关多肽的功能性变体，包括在本文所述的测定法中检测时，表现出野生型FAP的至少约25%，诸如至少约50%，诸如至少约75%，诸如至少约90%的特异性活性的那些。术语“免疫学片段”用在本文中是指具有基本上相同的功能性活性和被抗体识别的相同空间方向的氨基酸序列的片段。相应地，特异性抗体结合多肽和其免疫学片段二者。术语“另一个氨基酸”用作本文中意指不同于在该位置天然存在的氨基酸的一个氨基酸。这包括但不限于可以由多核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，不同的氨基酸采用天然L形式，并且可以由多核苷酸编码。
术语“衍生物”用在本文中意欲指相对于野生型人FAP表现出基本上相同或提高的生物学活性的ficolin相关多肽，其中母本多肽的一个或多个氨基酸已被化学修饰，例如，通过烷基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等进行化学修饰。术语“补体活性”用在本文中意指激活补体系统的活性。补体活性可以用本文标题为“测定法”部分中所述的测定法进行测量。术语“甘露糖结合凝集素(MBL) ”用作本文中还意指甘露糖结合凝集素，甘露糖结合蛋白(MBPl)，和甘露糖结合蛋白，该术语可以互换使用。术语“能够缔合”用在本文中是指本发明的蛋白在溶液中特异性结合补体系统的凝集素途径的一个或多个起始剂或可能参与该多肽作用的其它蛋白的能力。术语“构建体”意欲指可能基于编码目的多肽的完整的或部分的天然存在的核苷酸序列的多核苷酸片段。构建体可以任选地包含其它多核苷酸片段。以相似的方式，术语“可以由多核苷酸构建体编码的氨基酸”包括可以由上文定义的多核苷酸构建体编码的氨基酸，即，诸如 Ala, Val, Leu, He, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 和 Gln 的氨基酸。术语“载体”用在本文中意指在宿主细胞中能够扩增的任意核酸实体。因此，载体可以是自发复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。备选地,载体可以是这样一种载体,即，当引入到宿主细胞中时,其整合到宿主细胞基因组中并且与其已经整合到其中的染色体一起复制。载体的选择通常取决于载体要被引入的宿主细胞。载体包括，但不限于，质粒载体、噬菌体载体、病毒或黏端质粒载体。载体通常包含复制起点和至少一个可选择基因，即，编码易于检测的产物的基因或该基因的存在对细胞生长是必需的基因。在另一个方面中，本发明提供包含所述多核苷酸构建体或载体的重组宿主细胞。在一个实施方案中，重组宿主细胞是真核细胞。在其它实施方案中，重组宿主细胞是哺乳动物来源的。在另一个实施方案中，重组宿主细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和BHK细胞组成的组。术语“宿主细胞”用在本文中表示任意细胞，包括杂交细胞，其中可以表达异源DNA0典型的宿主细胞包括，但不限于昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞，诸如BHK，CH0，HEKJP COS细胞。当实施本发明时，培育的宿主细胞优选是哺乳动物细胞，更优选是建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于，CH0(例如，ATCC CCL 61)，C0S-1(例如，ATCC CRL1650)，幼仓鼠肾(BHK)和 HEK293(例如，ATCC CRL1573 ;Graham 等，J. Gen. Virol.(基因病毒学杂志)36 :59-72,1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk- tsl3 BHK细胞系(Waechter和 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)79 :1106-1110,1982)，以下称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr. , Rockville, MD20852)获得，ATCC 保藏号为 CRL 10314。 tk- tsl3 BHK细胞系也可从ATCC获得，其保藏号为CRL 1632。其它适当的细胞系包括，但不限于，大鼠H印I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC1469 (ATCC CCL 9. I)和 DUKX细胞(Urlaub 和 Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)77 =4216-4220,
1980)。也可以使用3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合。
在另一个方面中，本发明提供包含并且表达所述多核苷酸构建体的转基因动物。在另一个方面中，本发明提供包含并且表达所述多核苷酸构建体的转基因植物。在另一个方面中，本发明涉及用于生产本发明的ficolin相关多肽的方法，所述方法包括在允许多核苷酸构建体表达的条件下在适合的生长培养基中培育包含所述多核苷酸构建体的细胞，并且从培养基中回收得到的多肽。当用于本文中时，术语“适合的生长培养基”意指包含细胞生长和编码本发明的ficolin相关多肽的核酸序列表达所需要的营养物和其它成分的培养基。在另一个方面中，本发明涉及用于生产ficolin相关多肽的方法，所述方法包括从由转基因动物产生的奶中回收所述多肽。在另一个方面中，本发明涉及用于生产ficolin相关多肽的方法，所述方法包括培育包含多核苷酸构建体的转基因植物的细胞，并且从得到的植物中回收所述多肽。 在本发明的上下文中，术语“治疗”意欲包括对预期涉及不适当的补体激活的病症(诸如炎症和再灌注损伤)的预防和对已经存在的病症(诸如心肌梗死和中风)的调节，目的是抑制或将组织损伤减至最少。因此，术语“治疗”包括预防性施用本发明的ficolin相关多肽。术语“受试者”用在本文中意欲指任何动物，特别是哺乳动物，诸如人，并且在适当时候可以与术语“患者”互换使用。术语“序列同一性”，如本领域已知的，是指两种或多种多肽分子或两种或多种核酸分子之间通过比较序列确定的关系。在本领域中，“同一性”还意指核酸分子之间或多肽之间的序列相关性的程度，根据具体情况而定，通过两个或多个核苷酸残基或两个或多个氨基酸残基的链之间的匹配数目而确定。“同一性”测量在两个或多个序列的较小者之间相同性匹配的百分数，其中通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)阐释缺口比对(如果存在的话)。术语“相似性”是相关的概念，但是与“同一性”相反，是指包括相同的匹配和保守置换匹配二者的序列关系。例如，如果两种多肽序列具有(分数(10/20))相同的氨基酸，并且其余的全部是非保守置换，则同一性和相似性百分数均为50%。如果，在同一实例中，存在另外5个具有保守置换的位置，则同一性百分数仍为50%，但是相似性百分数为75%(分数(15/20))。因此，在存在保守置换的情形中，两种多肽之间的相似性程度高于这两种多肽之间的同一性百分数。氨基酸序列SEQ ID NO 1的保守修饰(和对编码核苷酸的相对应修饰)将产生具有与天然存在的FAP的那些相似的功能性和化学特征的ficolin相关多肽。相反，在ficolin相关多肽的功能性和/或化学特征中的实质性修饰可以通过选择氨基酸序列SEQID N01中的置换实现，所述置换在它们保持(a)置换区域中的分子主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积的作用方面显著不同。例如，“保守氨基酸置换”可以包括用非天然残基置换天然氨基酸残基，以使对该位置氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。此外，多肽中任何天然的残基还可以用丙氨酸置换，如以前关于“丙氨酸扫描诱变”所述(参见，例如，MacLennan等，1998，ActaPhysiol. Scand. Suppl. 643 :55-67 ；Sasaki 等，1998, Adv. Biophys.(生物物理进展)35 1-24，其讨论了丙氨酸扫描诱变)。理想的氨基酸置换(不管是保守的还是不保守的)可以由本领域技术人员在需要所述置换时确定。例如，氨基酸置换可以用来鉴定ficolin相关多肽的重要残基，或增加或降低本文所述的ficolin相关多肽的亲和性。基于常见的侧链特性，天然存在的残基可以分成下述几类I)疏水性正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；2)中性亲水性Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；3)酸性Asp，Glu ;4)碱性His, Lys, Arg ；5)影响链方向的残基Gly, Pro ;和6)芳香的Trp, Tyr, Phe0例如，不保守置换可以包括这些种类中一类的一个成员与另一种类的一个成员交换。这样置换的残基可以引入到人ficolin相关多肽与非人ficolin相关多肽同源的区域 中，或引入到该分子的非同源区域中。在进行这样的变化时,可以考虑氨基酸的水性指数(hydropathic index)。基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每个氨基酸已被指定一个水性指数，其为异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1. 9);丙氨酸(+1. 8);甘氨酸(-0. 4);苏氨酸(-0. 7);丝氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3. 5);天冬酰胺(-3. 5);赖氨酸(-3. 9);和精氨酸(-4. 5)。本领域中知晓水性氨基酸指数对赋予蛋白相互作用生物学功能的重要性。Kyte等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，157 =105-131 (1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似水性指数或得分的另一些氨基酸置换并且仍然保留相似的生物学活性。在基于水性指数进行变化时，优选水性指数在±2之内的氨基酸置换，特别优选在±1之内的那些，并且甚至更特别优选在±0. 5之内的那些。本领域中还知晓可以基于亲水性有效进行相似氨基酸的置换，特别在意欲将由此产生的生物学功能等价蛋白或肽用于免疫学实施方案的情形中，如在本情形中一样。蛋白的最大局部平均亲水性，由其相邻的氨基酸的亲水性所控制，与其免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白的生物学特性相关。下述亲水性值已经分配给氨基酸残基精氨酸(+3. 0);赖氨酸('3. 0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2. 3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸(-3. 4)。在其余相似的亲水性值进行变化时，优选亲水性值在±2之内的氨基酸的置换，特别优选在±1之内的那些，甚至更特别优选在±0.5之内的那些。人们还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些表位还称为“表位核心区”。专业技术人员将能够利用公知的技术确定SEQ ID NO :I所示的多肽的适当的变体。为了鉴定该分子在不破坏活性的前提下可以被改变的适当区域，本领域技术人员可以靶向认为对活性不重要的区域。例如，当已知来自相同物种或来自其它物种具有相似活性的相似多肽时，本领域技术人员可以将ficolin相关多肽的氨基酸序列与所述相似多肽进行比较。利用这样的比较，人们可以鉴定在相似多肽之间保守的该分子的残基和部分。应该理解，在相对于所述相似多肽不保守的ficolin相关多肽的区域中的变化较不可能不利地影响ficolin相关多肽的生物学活性和/或结构。本领域技术人员还将知晓，甚至在相对保守的区域中，人们也可以用化学相似的氨基酸置换天然存在的残基，同时保留活性(保守氨基酸残基置换)。因此，甚至可能对生物学活性或对结构是重要的区域也可以进行保守氨基酸置换而不破坏生物学活性或不会不利地影响多肽结构。另外，本领域技术人员可以参阅鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。关于这样的比较，人们可以预测ficolin相关多肽中与相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以为ficolin相关多肽和本发明的其它多肽所述预测的重要氨基酸残基选择化学相似的氨基酸置换。本领域技术人员还可以相对于相似多肽的结构分析三维结构和氨基酸序列。参考所述信息，本领域技术人员可以关于ficolin相关多肽的三维结构预测ficolin相关多肽 的氨基酸残基的比对。本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白表面上的氨基酸残基带来根本变化，因为所述残基可以参与与其它分子的重要的相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个需要的氨基酸残基包含单个氨基酸置换的检测变体。然后，可以使用本文所述的活性测定法筛选所述变体。所述变体可以用来收集关于适当的变体的信息。例如，如果人们发现对特定氨基酸残基的改变导致破坏的、不理想地减少的、或不适当的活性，将避免具有这样的变化的变体。换言之，基于由这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应该避免单独的或与其它突变组合的其它置换的氨基酸。许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见Moult J. , Curr. Op. in Biotech.(现代生物技术观点杂志)，7(4) :422-427 (1996)，Chou等，Biochemistry (生物化学)，13(2) :222-245(1974) ;Chou 等，Biochemistry (生物化学)，113 (2) :211-222(1974) ；Chou等，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47 :45-148 (1978) ；Chou 等，Ann. Rev. Biochem.(生物化学年度综述)，47 =251-276和Chou等，Biophys. J.(生物物理学杂志)，26 :367-384(1979)。此外，目前可以用计算机程序来辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源性建模。例如，两种具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的多肽或蛋白通常具有相似的结构拓扑学。最近的蛋白质结构数据库(TOB)的增长已经提供了提高的二级结构预测性，包括在多肽或蛋白结构中折叠的潜在数目。参见Holm等，Nucl.Acid. Res.(核酸研究)，27 (I) :244-247 (1999)。已经提议(Brenner 等，Curr. Op. Struct.Biol.(现代结构生物学观点)，7(3) =369-376(1997))在给定的多肽或蛋白中存在有限数目的折叠，并且一旦已经解析了关键数目的结构，结构预测将获得显着的准确性。预测二级结构的其它方法包括"threading"(Jones, D. , Curr. Opin. Struct.Biol.(现代结构生物学观点)，7(3) :377-87(1997) ;Sippl 等，Structure (结构)，4 (I)15-9(1996))，"模式分析"(Bowie 等，Science (科学)，253 :164-170(1991) ；Gribskov等，Meth. Enzymol.(酶学方法)，183 146-159 (1990) ；Gribskov 等，Proc. Nat. Acad. Sci.(国家科学院学报)，84(13) :4355-4358(1987)),和"进化联系"(参见Home，同上，和Brenner,同上)。
相关多肽的同一性和相似性可以容易地通过已知的方法计算。所述方法包括，但不限于，Computational Molecular Biology (计算分子生物学)，Lesk, A. M.编，OxfordUniversity Press (牛津大学出版社)，纽约，1988 ；Biocomputing Informatics andGenome Pro jects (生物计算信息学和基因组工程)，Smith, D. W.编，Academic Press(学院出版社)，纽约，1993 ；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第 I 部分，Griffin, A. Μ.，和 Griffin, H. G.编，Humana Press,新泽西，1994 ；SequenceAnalysis in Molecular Biology (分子生物学中的序列分析)，von Heinje, G. , AcademicPress (学院出版社)，1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov,M.和Devereux, J.编，M. Stockton Press,纽约，1991 ;和 Carillo 等,SIAM J. Applied Math.，48 :1073(1988)中所述的那些。确定同一性和/或相似性的优选方法设计为给出检测序列之间的最大匹配。在公众可用的计算机程序中记述了确定同一性和相似性的方法。确定两种序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP (Devereux等，Nucl. Acid. Res.(核酸研究)，12 :387 (1984) ；Genetics Computer Group(遗传计算机 组)，University of Wisconsin (威斯康辛大学)，Madison, ffis.), BLASTP, BLASTN,和FASTA (Altschul 等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，215 :403-410 (1990))。BLASTX 程序是从 National Center for Biotechnology Information (NCBI,国立生物技术信息中心)和其它来源(BLAST Manual, Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul 等，同上)公众可用的。公知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一'丨生。用于比对两种氨基酸序列的特定的比对方案可能导致仅两条序列的较短区域匹配，并且该小的比对区域可能具有非常高的序列同一性，尽管在这两条全长序列之间没有显着的关系。因此，在优选的实施方案中，所选的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶多肽至少50个连续的氨基酸的比对。例如,使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group (遗传计算组)，Universityof Wisconsin (威斯康辛大学)，Madison, Wis.),比对要确定序列同一1丨生百分数的两种多肽，以最佳匹配它们各自的氨基酸(“匹配的跨度”，如由该算法确定的)。缺口开口罚分(其计算为平均对角线的3倍；“平均对角线(average diagonal) ”是使用的比较矩阵的对角线的平均数；“对角线”是通过特定的比较矩阵分配给每个最佳氨基酸匹配的得分或数字)和缺口延伸罚分(其通常是缺口开口罚分的{分数(1/10)}倍)，以及比较矩阵，如PAM 250或BLOSUM 62与该算法联合使用。该算法也使用标准的比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure,卷 5, supp. 3 (1978);关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等，Proc. NatI. Acad. Sci USA (美国国家科学院学报)，89 :10915-10919(1992)) ο用于多肽序列比较的优选参数包括下述 算法Needleman等，J. Mol. Biol (分子生物学杂志)，48 :443-453 (1970)；比较矩阵来自Henikoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)，89 :10915-10919(1992)的BLOSUM 62 ;缺口罚分12，缺口长度罚分4，相似性阈值0。GAP程序使用上述参数。前述参数是使用GAP算法进行多肽比较的默认参数(与其一起对末端缺口没有罚分)。
用于核酸分子序列比较的优选参数包括下述算法Needleman等，J. Mol Biol.(分子生物学杂志)，48 :443_453 (1970);比较矩阵匹配=+10，不匹配=0，缺口罚分50，缺口长度罚分3。GAP程序也使用上述参数。前述参数是用于核酸分子比较的默认参数。可以使用其它示例性的算法，缺口开口罚分，缺口延伸罚分，比较矩阵，相似性阈值等，包括在Program Manual (程序手册),WisconsinPackage,第9版，1997年9月中所述的那些。要进行的特定选择对于本领域技术人员是显而易见的，并且将取决于要进行的具体比较，诸如DNA与DNA比较，蛋白与蛋白比较，蛋白与DNA比较；另外，不管比较是在给定的序列对之间(在该情形中，通常优选GAP或BestFit)还是在一个序列和大的序列数据库之间(在该情形中，优选FASTA或BLASTA)。制备本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽
本发明还涉及制备上述本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的方法。本文所述的本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽可以通过重组核酸技术产生。通常，修饰克隆的野生型FAP核酸序列来编码需要的蛋白。然后，将该修饰的序列插入到表达载体中，其又转化或转染到宿主细胞中。高等真核细胞，特别是培养的哺乳动物细胞，优选作为宿主细胞。关于人FAP的完整的氨基酸和核苷酸序列通过SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2给出。氨基酸序列变化可以通过多种技术实现。核酸序列的修饰可以通过位点特异性诱变进行。关于位点特异性诱变的技术在本领域中是公知的，并且例如，记述在Zoller和Smith (DNA 3:479-488,1984)或"Splicing by extension overlap (通过延长重叠剪接)"，Horton等，Gene (基因)77，1989，第61-68页。因此，利用FAP的核苷酸和氨基酸序列，人们可以引入选择的变化。同样地，关于使用特异性引物利用聚合酶链式反应制备DNA构建体的方法是本领域技术人员公知的(参见PCR Protocols (PCR流程),1990, AcademicPress (学院出版社),San Diego, California,美国)。本发明的多肽还可以包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，丙氨酸，去氨基组氨酸，反式-3-甲基脯氨酸，2，4_甲醇基脯氨酸，顺式-4-羟基脯氨酸，反式-4-羟基脯氨酸，N-甲基甘氨酸，别-苏氨酸，甲基苏氨酸，羟基乙基半胱氨酸，羟基乙基高半胱氨酸，硝基谷氨酰胺，高谷氨酰胺，哌可酸，噻唑烷羧酸，脱氢脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，3，3- 二甲基脯氨酸，叔-亮氨酸，正-缬氨酸，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。本领域已知一些用于将非天然存在的氨基酸残基结合到多肽中的方法。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨基酰化的阻抑物tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法在本领域中是已知的。在不含细胞的系统中进行包含无义突变的质粒的转录和翻译，所述不含细胞的系统包括大肠杆菌(E. coli) S30提取物和商购的酶和其它试剂。通过层析纯化多肽。参见，例如，Robertson 等，J. Am. Chem. Soc.(美国化学学会杂志)113 :2722,1991 ；Ellman 等，MethodsEnzymol.(酶学方法)202 301,1991 ;Chung 等，Science (科学)259 :806-9,1993 JPChung等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)90 :10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的阻抑物tRNAs在爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)271 :19991-8，1996)。在第三种方法中，将大肠杆菌细胞在缺乏要被替代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在需要的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸，或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养。所述非天然存在的氨基酸结合到多肽中替换其天然负体。参见，Koide等，Biochem.(生物化学)33 :7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合，以进一步扩大置换的范围(Wynn和 Richards，Protein Sci.(蛋白质科学)2 :395_403，1993)。编码本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽的核酸构建体可以适当地是基因组或cDNA来源的，例如，通过制备基因组或cDNA文库并且通过按照标准技术(参见Samtoook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第 2 版· ColdSpring Harbor Labora-tory (冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，纽约，1989)使用合成的寡核苷酸探针杂交来筛选编码该多肽的全部或部分的DNA序列而获得。编码Ficolin相关多肽的核酸构建体还可以通过建立的标准方法合成制备，所述建立的标准方法，例如，Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters (四面体通信)22(1981) ,1859-1869 所述的磷酰亚胺法，或 Matthes 等，EMBO Journal (ΕΜΒ0 杂志)3 (1984)，801-805所述的方法。按照磷酰亚胺方法，合成寡核苷酸，例如，在自动化DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接并且克隆到适当的载体中。编码本发明的人Fi Co I in相关多肽和其它多肽的DNA序列还可以通过使用特定引物的聚合酶链式反应制备，例如，如在下述中所述US 4,683,202，Saiki 等，Science (科学)239 (1988)，487-491，或 Sambrook等，同上。此外，核酸构建体可以是按照标准技术通过连接合成的、基因组或cDNA来源的片段(适当地)而制备的混合的合成的和基因组、混合的合成的和cDNA或混合的基因组和cDNA来源的，所述片段对应于完整核酸构建体的不同部分。核酸构建体优选地是DNA构建体。用于产生本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列典型地编码在FAP氨基端的前-原多肽，从而获得正确的翻译后加工和从宿主细胞分泌。编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列通常插入到重组载体中，其可以是任何载体，其可以便利地进行重组DNA步骤，并且载体的选择通常取决于要引入载体的宿主细胞。因此，载体可以是自发复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。备选地，载体可以是这样一种载体，即，当引入到宿主细胞中时，其整合到宿主细胞基因组中并且与其已经整合到其中的染色体一起复制。载体优选是表达载体，其中编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列可操作地连接到该DNA转录所需要的另外的片段上。通常，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或可以包含二者的组件。术语“可操作地连接”表示所述片段这样排列，以使它们按照它们需要的目的行使功能，例如，转录由启动子起始并且沿着编码多肽的DNA序列进行。用于表达本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽的表达载体包含能够指导克隆的基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是任意DNA序列，其在选择的宿主细胞中表现出转录活性，并且可以来源于对所述宿主细胞来说是同源或异源的编码蛋白的基因。在哺乳动物细胞中指导编码人Ficolin相关多肽的DNA的转录的适当的启动子的 实例是 SV40 启动子(Subramani 等，Mo I. Cell Biol.(分子细胞生物学)I (1981)，854-864)，MT-I (金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter 等，Science (科学)222 (1983)，809-814)，CMV启动子(Boshart等，Cell (细胞)41 =521-530,1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和 Sharp, Mol. Cell. Biol (分子细胞生物学)，2 :1304-1319，1982)。用于昆虫细胞的适当的启动子的实例是多角体蛋白启动子(US4，745，051 ；Vasuvedan 等，FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), PlO 启动子(J. M. Vlak 等，J. Gen. Virology (基因病毒学杂志)69，1988，第765-776页)，苜蓿银纹夜蛾多角体病毒基本蛋白启动子(Autographa californica polyhedrosis virus basic protein promoter)(EP 397485)，杆状病毒即时早期基因I启动子(US 5, 155,037 ；US 5，162，222)，或杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US 5，155，037 ；US 5，162，222)。用于酵母宿主细胞中的适当的启动子的实例包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)255 (1980)，12073-12080 ;Alber 和 Kawasaki, J. Mol.Appl. Gen.(分子应用遗传学杂志)I (1982)，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，在Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (关于化学的微生物遗传学改造)(HoiIaender 等编)，Plenum Press,纽约，1982)的启动子，或 TPIl (US 4, 599, 311)或ADH2-4c (Russell 等，Nature (自然)304 (1983)，652-654)启动子。 用于丝状真菌宿主细胞的适当的启动子的实例为，例如，ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J. (ΕΜΒ0杂志)4(1985) ,2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的实例是来源于编码米曲霉(A. oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α -淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A. nidulans)乙酰胺酶的基因。优选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。适当的启动子例如在EP 238023和EP 383 779中提及。如果需要，编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列还可以可操作地连接到适当的终止子上,诸如人生长激素终止子(Palmiter等，Science (科学)222,1983，第 809-814 页)或 TPIl (Alber 和 Kawasaki，J. Mol. Appl. Gen.(分子应用遗传学杂志)1，1982，第 419-434 页)或 ADH3 (McKnight 等，The EMBO J. (ΕΜΒ0 杂志)4，1985，第2093-2099页)终止子。表达载体还可以包含位于启动子下游和FAP序列本身插入位点的上游的一组RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因获得。表达载体中还包含位于插入位点下游的多腺苷化信号。特别优选的多腺苷化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷化信号(Kaufman和Sharp，同前)，来自腺病毒5Elb区的多腺苷化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto等Nucl. Acids Res.(核酸研究)9 :3719_3730，
1981)或来自人FAP基因或牛FAP基因的多腺苷化信号。表达载体还可以包括非编码的病毒前导序列，诸如腺病毒2三联前导序列，其位于启动子和RNA剪接位点之间；和增强子序列，诸如SV40增强子。为了将本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽导向宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也已知为前导序列，前原序列或前序列)。将分泌信号序列与编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列在正确的阅读框中连接。分泌信号序列通常位于编码所述肽的DNA序列的5'。分泌信号序列可以通常与所述蛋白相关或可以来自于编码另一种分泌的蛋白的基因。对于从酵母细胞中分泌，分泌信号序列可以编码任意信号肽，其确保将所表达的本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽有效导向细胞的分泌途径。信号肽可以是天然存在的信号肽，或其功能部分，或其可以是合成的肽。已经发现适当的信号肽为α因子信号肽(参见US 4，870，008)，小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O. Hagenbuchle等，Nature (自然)289，1981，第643-646页)，修饰的羧肽酶信号肽(参见L. A. Valls等，Cell (细胞)48，1987，第887-897页)，酵母BARl信号肽(参见WO 87/02670)，或酵母天冬氨酸蛋白酶3 (YAP3)信号肽(参见 M. Egel-Mitani 等，Yeast 6，1990，第 127-137 页)。对于在酵母中的有效分泌，还可以将编码前导肽的序列插入在信号序列的下游且在编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列的上游。前导肽的功能是允许所表达的肽被从内质网导向高尔基体并且进一步至分泌小泡，从而分泌到培养基中(即，将本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽输出到细胞壁外或至少通过细胞膜进入到酵母细胞的周质空间)。前导肽可以是酵母α因子前导(其应用记述在例如US 4，546，082，US 4,870，008，EP 16 201，EP 123 294，EP 123 544 和 EP 163 529 中)。备选地，前导肽可以是合成的前导肽，认为其不是天然存在的前导肽。合成的前导肽可以，例如，如WO89/02463 或 WO 92/11378 中所述构建。 对于在丝状真菌中的应用，信号肽可以便利地来源于编码曲霉属淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信号肽优选地来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。适当的信号肽公开在例如EP 238 023和EP215 594 中。对于在昆虫细胞中的应用，信号肽可以便利地来源于昆虫基因(参见WO90/05783)，诸如鳞翅类烟草天蛾(Manduca sexta)脂肪动员激素前体信号肽(参见US5，023，328)。用于分别连接编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列，并将它们插入到包含复制所必需的信息的适当的载体中的步骤，是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，纽约，1989)。转染哺乳动物细胞并且表达引入到细胞中的DNA序列的方法记述在，例如Kaufman 和 Sharp, J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)159 (1982)，601-621 ；Southern 和Berg, J. Mol. Appl. Genet.(分子应用遗传学杂志)I (1982)，327-341 ； Loyter 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)79 (1982)，422-426 ；ffigler 等，Cell (细胞)14 (1978), 725 ;Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics (体细胞遗传学)7 (1981),603, Graham和 van der Eb, Virology (病毒学)52 (1973), 456 ;和 Neumann 等，EMB0J. (ΕΜΒ0 杂志)1(1982)，841-845 中。克隆的DNA序列通过例如，磷酸I丐介导的转染(Wigler等，Cell (细胞)14 :725-732，1978 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (体细胞遗传学)7 :603-616,1981 ;Graham 和 Van der Eb, Virology (病毒学)52d :456-467,1973)或电穿孔(Neumann等，EMBO J. (ΕΜΒ0杂志)1 =841-845,1982)引入到培养的哺乳动物细胞中。为了鉴定并且选择表达外源DNA的细胞，通常将赋予可选择表型的基因(可选择的标记)与目的基因或cDNA—起引入到细胞中。优选的可选择标记包括赋予药物(诸如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的基因。可选择的标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增的选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。可选择的标记由Thilly综述(Mammalian Cell Technology (哺乳动物细胞技术)，Butterworth Publishers, Stoneham, MA,通过引用结合在本文中)。本领域技术人员将容易的能够选择适当的可选择标记。可选择的标记可以在分离的质粒上与目的基因同时引入到细胞中，或者它们可以在同一质粒上引入到细胞中。如果在同一质粒上，所述可选择的标记和目的基因可以处在不同启动子或相同启动子的控制之下，后一种排列产生双顺反子信使。这种类型的构建体在本领域中是已知的(例如，，Levinson和Simonsen,U. S. 4, 713, 339)。也可以有利地将另外的DNA (已知为“载体DNA ” )添加到引入到细胞中的混合物中。在细胞已经摄入该DNA后，它们在适当的培养基中生长，典型地生长1-2天，开始表达目的基因。当用在本文中时，术语“适当的生长培养基”意指包含细胞生长和目的人Ficolin相关多肽表达所需要的营养物和其它成分的培养基。培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐、磷脂、蛋白和生长因子。然后，应用药物选择来选择以稳 定方式表达所述可选择标记的细胞的生长。对于已经转染了可扩增的选择标记的细胞，可以增加药物浓度，以选择增加拷贝数目的克隆序列，由此增加表达水平。然后筛选稳定转染的细胞的克隆对目的人Ficolin相关多肽的表达。引入编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列的宿主细胞可以是任何细胞，其能够产生翻译后修饰的人多肽，并且包括酵母、真菌和高等真核细胞。用于本发明的哺乳动物细胞系的实例为COS-UATCC CRL 1650)，幼仓鼠肾(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等，J. Gen. Virol.(遗传病毒学杂志)36 :59-72,1977)细胞系。优选的 BHK 细胞系是 tk_tsl3 BHK 细胞系(Waechter 和 Baserga,Proc. Natl. Acad.Sci. USA (美国国家科学院学报)79 :1106-1110，1982，其通过弓I用结合于此)，以下称为BHK570细胞。BHK 570细胞系已经保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr.，Rockville，Md. 20852)，ATCC 保藏号为 CRL 10314。。tk-tsl3 BHK细胞系也可从ATCC获得，其保藏号为CRL 1632。另外，多种其他细胞系可以用在本发明中，包括大鼠H印I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印11(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)，CHO (ATCC CCL 61)和 DUKX 细胞(Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)77 =4216-4220,1980)。适当的酵母细胞的实例包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosac-charomyces spp.)的细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或Saccharomyces kluyveri的菌株。用异源DNA转化酵母细胞并且由其生产异源多肽的方法记述在，例如，US 4, 599, 311,US 4, 931, 373,US 4，870，008，5，037，743，和 US 4, 845, 075中，所有这些通过引用结合于此。转化的细胞通过可选择的标记确定的表型进行选择，所述表型通常是药物抗性或在缺乏特定营养物(例如亮氨酸)的条件下生长的能力。用在酵母中的优选载体是US 4，931，373中公开的POTl载体。编码本发明的人Ficolin相关多肽和其它多肽的DNA序列可以在信号序列之后，并且任选在前导序列之后，例如，如上述。适当的酵母细胞的其他实例为克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株,诸如乳酸克鲁维酵母(K. lactis),汉逊酵母属(Hansenula),例如多形汉逊酵母(H. poIymorpha),或毕赤酵母属(Pichia),例如巴斯德毕赤酵母(P. pastor is)(参见 Gleeson 等,J. Gen. Microbiol.(遗传微生物学杂志)132，1986，第 3459-3465 页；US 4，882，279)。其他真菌细胞的实例是丝状真菌的细胞,例如，曲霉属(Aspergillus spp.),链孢霉属(Neurospora spp·),键刀菌属(Fusarium spp.)或木霉属(Trichoderma spp·),特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉的菌株。应用曲霉属进行蛋白表达记述在，例如EP 272 277，EP 238 023, EP 184 438 中。尖孢镰刀菌(F. oxysporum)的转化,例如，如 Malardier 等，1989，Gene (基因)78 :147-156所述进行。例如，木霉属的转化可以如EP 244 234所述进行。当使用丝状真菌作为宿主细胞时，其可以转化本发明的DNA构建体，便利地通过将DNA构建体整合到宿主染色体中而获得重组宿主细胞。该整合通常认为是有利的，因为DNA序列更可能稳定地保持在细胞中。将DNA构建体整合到宿主染色体中可以按照常规方法进行，例如，通过同源或异源重组进行。昆虫细胞的转化和其中异源多肽的产生可以如US 4，745，051 ；US4, 879，236 ；US
5,155,037 ；5, 162, 222 ；EP 397，485所述进行，所有这些通过引用结合于此。用作宿主的昆虫细胞系可以适当地为鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(参见US 5,077,214)。培养条件可以适当地如例如WO 89/01029或WO 89/01028中所述，或前文提及的任意参考文献中所述。然后，在允许人Ficolin相关多肽表达的条件下，在适当的营养培养基中培养上述转化的或转染的宿主细胞，之后可以从培养物中回收全部或部分得到的肽。用于培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任意常规培养基，诸如最小培养基或包含适当的补充物的复杂培养基。适当的培养基可从商业供应商获得，或可以按照公布的配方制备(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。然后，可以通过常规步骤从培养基中回收由所述细胞产生的人Ficolin相关多肽，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过盐(例如硫酸铵)沉淀上清或滤过物的蛋白质样成分，通过各种层析方法纯化，例如离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等，这取决于所讨论的多肽的类型。可以利用转基因动物技术来生产本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽。优选地在雌性哺乳动物宿主的乳腺中产生所述蛋白。在乳腺中表达随后将目的蛋白分泌到乳中克服了从其它来源分离蛋白所遇到的许多困难。乳容易收集，可以大量获得，并且生物化学充分表征。此外，主要的乳蛋白以高浓度存在于乳中(典型地约I至15g/l)。从商业观点来看，清楚地，优选使用具有高的乳产率的物种作为宿主。尽管可以使用较小的动物，如小鼠和大鼠(并且在验证证据阶段是优选的)，但是优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于，猪、山羊、绵羊和牛。特别优选绵羊，原因在于诸如这一物种先前的转基因史、乳产率、成本和用于收集绵羊奶的设备的容易获得性的因素(参见，例如，W088/00239，关于影响宿主物种选择的因素的比较)。通常理想地选择已经关于乳业用途育种的宿主动物品种，诸如东弗里斯兰绵羊(East Friesland sheep),或近来通过转基因品 系育种引入奶场中的牛羊。在任一种事件中，应该使用已知的、健康状况良好的动物。
为了获得在乳腺中的表达，使用来自乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括编码酪蛋白(参见U. S. 5，304，489)、β乳球蛋白、a乳清蛋白、和乳清酸性蛋白的那些基因。β乳球蛋白(BLG)启动子是优选的，在绵羊β乳球蛋白基因的情形中，通常使用该基因5'侧连序列至少最近的406bp的区域，尽管优选较大的5'侧连序列部分，至多约5kbp，如包含5'侧连启动子和β乳球蛋白基因的非编码部分的 4. 25kbp DNA片段(参见Whitelaw等，Biochem. J.(生物化学杂志)286 :31 39(1992))。来自其他物种的相似的启动子DNA片段也是合适的。β乳球蛋白基因的其他区域也可以结合到构建体中，待表达的基因的基因组区域也可以结合到构建体中。在本领域中通常接受的是，缺少内含子的构建体，例如，与包含所述DNA序列的那些相比,表达很差(参见，Brinster等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)85 :836 840(1988) ;Palmiter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)88:478 482(1991) ;Whitelaw 等，Transgenic Res.(转基因研究)1:3 13(1991)；WO 89/01343 ;和冊91/02318，它们分别通过引用结合于此)。在这一点上，通常优选的是，在可能时，使用包含编码目的蛋白或多肽的基因的全部或一些天然内含子，因此优选进一步包含至少一些来自例如β乳球蛋白基因的内含子。一个这样的区域是来自绵羊β乳球 蛋白基因的3'非编码区的提供内含子剪接和RNA多腺苷化的DNA序列。当置换基因的天然3'非编码序列时，该绵羊β乳球蛋白片段可以提高并且稳定目的蛋白或多肽的表达水平。在其他实施方案中，在FAP序列的起始ATG周围的区域用来自乳特异性蛋白基因的相对应序列替换。这样的替换提供推定的组织特异性起始环境，从而增强表达。尽管可以替换较小的区域，但是便利地用例如BLG基因替换完整的FAP前原和5'非编码序列。对于在转基因动物中表达本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽，将编码FAP的DNA片段可操作地连接到其表达所需要的另外的DNA片段上，从而产生表达单位。所述另外的片段包括上文提及的启动子，以及为转录终止和mRNA多腺苷化提供的序列。表达单位另外包括编码分泌信号序列的DNA片段，其可操作地与编码修饰的FAP的片段连接。分泌信号序列可以是天然FAP分泌信号序列或可以是另一种蛋白(如乳蛋白)的分泌信号序列(参见，例如，von Heijne, Nucl. Acids Res.(核酸研究)14 :4683 4690 (1986);和 Meade等，U. S. 4，873，316，其通过引用结合于此)。尽管表达单位可以基本上通过任意序列连接而构建，但是用于转基因单位的表达单位的构建便利地通过将FAP序列插入到包含另外的DNA片段的质粒或噬菌体载体中进行。特别便利地提供包含编码乳蛋白的DNA片段的载体，并且用FAP变体的编码区替换乳蛋白的编码区；由此产生包括乳蛋白基因的表达控制序列的基因融合体。在任意情形中，表达单位克隆到质粒或其他载体中促进FAP序列的扩增。扩增便利地在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中进行，由此该载体典型地包括在细菌宿主细胞中起作用的复制起点和可选择的标记。然后，将表达单位引入到所选宿主物种的受精卵(包括早期阶段的胚胎)中。异源DNA的引入可以通过数种途径中的一种完成，所述途径包括显微注射(例如美国专利号 4，873，191)，反转录病毒感染(Jaenisch, Science (科学)240 1468 1474 (1988))或使用胚胎干(ES)细胞的位点定向整合(由Bradley等，Bio/Technology (生物技术)10 534 539(1992)综述)。然后，将卵植入到假孕雌性中的输卵管或子宫中，并且允许发育成至足月。在其种系中携带引入的DNA的后代可以将该DNA以正常的、孟德尔方式传递给它们的后代，允许转基因群体的发育。用于产生转基因动物的通用方法在本领域中是已知的(参见，例如，General procedures for producing transgenic animals are known inthe art(see, for example, Hogan Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual (操作小鼠胚胎实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实验室),1986 ；Simons 等，Bio/Technology(生物技术)6 :179 183(1988) ；ffall 等，Biol.Reprod.(生物学繁殖)32 :645 651 (1985) ；BuhIer 等，Bio/Technology (生物技术)8 140143 (1990) ;Ebert 等,Bio/Technology (生物技术)9 :835 838(1991) ;Krimpenfort 等，Bio/Technology (生物技术)9 :844 847(1991) ;Wall 等，J. Cell. Biochem.(细胞生物化学杂志)49:113 120(1992) ；U. S. 4, 873, 191 ；U. S. 4, 873, 316 ；W0 88/00239,WO 90/05188,WO92/11757 ;和GB87/00458)。用于将外源DNA序列引入到哺乳动物和它们的种系细胞中的技术最初在小鼠中开展(参见，例如，Gordon等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)77:7380 7384(1980) ;Gordon 和 Ruddle，Science (科学)214 :1244 1246(1981)；Palmiter 和 Brinster, Cell (细胞)41 :343345 (1985) ；Brinster 等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美国国家科学院学报)82 :4438 4442(1985);和Hogan等(同前))。这些技术随后适用于更大的动物，包括家畜物种(参见，例如，WO 88/00239，WO 90/05188，和W092/11757 ； 和Simons等,Bio/Technology (生物技术)6 :179 183(1988))。总结来说，目前用于产生转基因小鼠或家畜的最有效的途径中，按照建立的技术，将数百个线性目的DNA分子注射到受精卵的一个前核中。也可以使用将DNA注射到合子的细胞质中。还可以利用在转基因植物中的生产。表达可以是普遍的或导向特定的器官，诸如块莖(参见，Hiatt, Nature (自然)344 :469 479(1990) ;Edelbaum 等，J. Interferon Res.(干扰素研究杂志)12 :449 453(1992) ;Si jmons 等，Bio/Technology (生物技术)8 :217221(1990) JPEP O 255 378)FAP 纯化本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽可以从细胞培养基或乳中回收。本发明的Ficolin相关多肽和其它多肽可以通过本领域已知的多种方法纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换，亲和性，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备级等电聚焦(IEF),差别性溶解性(例如,硫酸铵沉淀)，或提取(参见,例如,Protein Purification (蛋白纯化)，J.-C. Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers,纽约，1989)。优选地，它们可以通过在抗-FAP抗体柱上的亲和层析进行纯化。另外的纯化可以通过常规化学纯化手段实现，诸如高效液相色谱。其他纯化方法，包括柠檬酸钡沉淀，是本领域中已知的，并且可以应用于纯化本文所述的新型Ficolin相关多肽和其他多肽(参见,例如，Scopes, R. , ProteinPurification (蛋白纯化)，Springer-Verlag, N. Y.，1982)。为了治疗目的，优选本发明的Ficolin相关多肽和其他多肽是基本上纯的。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的(Ficolin相关多肽)和其他多肽纯化至至少约90-95 %的均质性，优选至至少约98 %的均质性。纯度可以通过例如凝胶电泳和氨基端氨基酸测序评估。术语“分离的多肽”是指本发明的多肽⑴已经与其天然相关的至少约50%的多核苷酸、脂质、糖类或其他物质(即污染物)分离。优选地，所述分离的多肽基本上不含任意其他污染多肽或其他在其天然环境中存在的污染物，其将干扰其治疗、诊断、预防或研究应用。术语“微生物”用在本文中是指细菌、真菌、古细菌、原生生物；微型植物和动物(诸如绿藻或浮游生物)，涡虫和变形虫。该定义包括病原体微生物。测定法关于SDS-PAGE和蛋白质印迹的通用步骤如供应商推荐，使用NuPAGE 系统(Invitrogen)，用不连续的缓冲液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。蛋白质印迹使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GE-healthcare，Hilleroed，丹麦，货号 RPN303F)，2 μ g/ml 生物素标记的一级单克隆抗体和通过在PBS，0. 05%吐温20中I : 1500稀释的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(P0397，Dako, Glostrup，丹麦)进行二级显现而进行。将膜用在丙酮和在50mM柠檬酸钠缓冲液pH 5中的O. 015% H2O2中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-aldrich,fcoenby，丹麦，货号 A5754-100G)显影。共免疫沉淀甘露糖结合凝集素(MBL)血清复合物的免疫沉淀将Iml正常人血清I : I稀释在TBS (IOmM Tris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg MBL特异性小鼠单克隆抗体 Hyb 131-11 (Bioporto, Gentoffe,丹麦)颠倒温育 I 小时。Ficolin-2血清复合物的免疫沉淀将O. 5ml正常人血清I : I稀释在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg Ficolin-2特异性小鼠单克隆抗体Hyb219 (Munthe-Fog L,等)颠倒温育I小时。
Ficolin-3血清复合物的免疫沉淀将O. 2ml正常人血清I : I稀释在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg Ficolin-3特异性小鼠单克隆抗体Hyb334 (Munthe-Fog L,等)颠倒温育I小时。免疫复合物沉淀用绵羊抗小鼠IgG缀合的磁dynal珠(Dynal-Invitrogen,货号112. 02D)进行在用血清和一级抗体(如上文)温育后，添加5xl07个绵羊抗小鼠缀合的磁dynal珠，并且在4°C温育30分钟。将珠子磁力分离并且用TBS-吐温-Ca2+(10mM Tris,140mM NaCl，0. 05%吐温，5mM CaCl2, pH 7.5)洗涤3次，最后在SDS-上样缓冲液中煮沸，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析，蛋白质印迹使用生物素标记的单克隆抗体mAb-8B3 (与MASP-I和-3共有的重链/A链上的表位反应)进行。FAP的免疫亲和纯化按供应商推荐，将IOmg mAb_8B3 (与FAP、MASP-I和-3共有的重链/A链上的表位反应)或IOmg兔多克隆抗FAP抗体缀合到CNBr活化的琼脂糖(GE-healthcare，Hilleroed，丹麦，货号17-0430-01)上并且填充到柱子上。从血清纯化将150ml正常人血清的汇聚液用TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA(IOmMTris,640mM NaCl,10mM EDTA，pH 7.5)1 I稀释，并且上样到上述柱上。将该柱用11TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗涤，并且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脱Iml级分，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,蛋白质印迹使用生物素标记的单克隆抗体mAb-8B3进行。重组FAP的纯化将来自表达重组FAP (rFAP)的中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)的
2-3 I培养物上清(来自CHO无血清培养基/Gibco-Invitrogen，货号12651-014)上样到上述抗体柱上。将该柱用I. 5 1TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗涤，并且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脱Iml级分。洗脱的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色进行分析。
FAP 的重组表达从Genscript (Genscript,New Jersey,美国)定购插入全长cDNA的 pcDNA5/FRT 载体(Invitrogen,货号 V6010-20),并且与 pOG44 载体(Invitrogen,货号V6005-20)共转染到CHO Flp-In细胞系(Invitrogen，货号R758-07)中，并且按供应商推荐(Invitrogen)进行选择和克隆。将细胞生长在Freestyle CHO无血清培养基(Invitrogen,货号12651-014)中，收集培养物上清并且进行分析。单克隆和多克隆抗体的产生按供应商推荐(Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois,美国),使用半胱氨酸偶联方法,用间-马来酰亚胺苯甲酰基_N_轻基琥拍酰亚胺酯，将FAP特异性17个C-端残基的肽构建体(定购自Genscript, New Jersey,美国)偶联到破伤风和白喉的类毒素形式上。6只小鼠和2只兔每只用吸附到Al (OH) 3和弗氏不完全佐剂上的25 μ g抗原免疫3次(间隔14天)。利用ELISA，使用偶联到蛋白载体上的不同FAP肽，评估多克隆抗体滴度。
在第一次、第二次和第三次免疫后14天收集多克隆兔抗血清( IOml)。两只小鼠用于生产单克隆抗体。在融合前4天，小鼠接受静脉内注射25 μ g抗原。融合按他处所述进行(Kohler, G.和 C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fusedcells secreting antibody of predefined specificity(分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养)· Nature (自然)256 =495-497)。克隆通过针对偶联到不同蛋白载体上的肽的差别性ELISA筛选进行选择。功能性补体测定法使用Ficolin-3和MBL纯合子缺陷型血清来研究FAP功能。Ficolin-3 测定法将 Maxisorp 平板(NUNC，Roskilde，丹麦，货号 439454)在 4°C在包被缓冲液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用5 μ g/ml乙酰化的牛血清白蛋白包被12小时。在巴比妥/吐温缓冲液(4mM巴比妥，145mM NaCl, 2mM CaCl2, ImM MgCl2, pH
7.4+0. 05%吐温)中封闭/洗涤4次后，加入在巴比妥/吐温缓冲液中500ng/ml的重组人Ficolin-3，并且在20°C摇动温育I. 5小时。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板两次后，在分离的平板的第一维度上，加入连续稀释的作为无血清培养基培养物上清的重组FAP，人MASP-1,-2或-3，并且在20°C摇动温育I小时。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板两次后，在平板的第二维度上，加入连续稀释的Ficolin-3或MASP-2缺陷型血清，并且在37°C温育30分钟。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板四次后，通过在20°C用I : 2000稀释的针对人C4c的多克隆兔抗体(Dako，Glostrup，丹麦货号Q0369)温育I小时，然后4次洗涤步骤，并且在20°C用辣根过氧化物酶缀合的猪抗兔抗体(Dako，Glostrup，丹麦货号P0399)温育45分钟而测量补体因子C4的沉积。通过将平板用100 μ I/孔溶解在具有0. 12%。(ν/V) H2O2的柠檬酸缓冲液(35mM柠檬酸，65mM Na2PO4, pH 5)中的邻-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)显色而获得信号。用IM H2SO4终止酶反应，并且使用V-max动力学-读数仪(分子装置(Molecular Devices))在 490nm-650nm 测量光学密度(OD)水平。甘露糖结合凝集素测定法将Maxisorp平板(NUNC，Roskilde,丹麦，货号439454)在 4°C在包被缓冲液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用 10 μ g/ml 甘露聚糖(Sigma-aldrich,Broenby,丹麦,货号M7504-1G)包被12小时。在巴比妥/吐温缓冲液(4mM 巴比妥，145mMNaCl，2mM CaCl2, ImM MgCl2,pH 7.4+0. 05%吐温)中封闭 /洗涤4次后，加入在巴比妥/吐温缓冲液中0. 5 μ g/ml的重组人甘露糖结合凝集素，并且在20°C摇动温育I. 5小时。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板两次后，在分离的平板的第一维度上，加入连续稀释的作为无血清培养基培养物上清的重组FAP，人MASP-I，-2或-3，并且在20°C摇动培养I小时。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板两次后，在平板的第二维度上，加入连续稀释的MBL或MASP-2缺陷型血清，并且在37°C温育45分钟。在巴比妥/吐温缓冲液中洗涤平板四次后，通过在20°C用I : 2000稀释的针对人C4c的多克隆兔抗体(Dako，Glostrup，丹麦货号Q0369)温育I小时，然后4次洗涤步骤，并且在20°C用辣根过氧化物酶缀合的猪抗兔抗体(Dako，Glostrup，丹麦货号P0399)温育45分钟而测量补体因子C4的沉积。通过将平板用100 μ I/孔溶解在具有O. 12%。(ν/ν)Η202的柠檬酸缓冲液(35mM柠檬酸，65mMNa2PO4,pH 5)中的邻-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)显色而获得信号。用IM H2SO4终止酶反应，并且使用V-max动力学-读数仪(分子装置(Molecular Devices))在490nm-650nm测量光学密度(OD)水平。基因分型测定法可以进行不同的基因分型测定法，其中使用生物学测定法确定个体中的基因型。可以使用不同种类的测定法，诸如 基于杂交的方法O动态等位基因特异性杂交O分子指示标ο SNP 微阵列·基于酶的方法ο限制性片段长度多态性ο基于PCR的方法ο Flap内切核酸酶ο引物延伸。5’_ 核酸酶ο寡核苷酸连接酶测定法·基于DNA物理特性的其它扩增后方法ο单链验证多态性ο温度梯度凝胶电泳ο变性高效液相色谱O完整扩增子的高分辨率解链ο SNPlex·测序施用和药物组合物组合治疗 本说明书中定义的ficolin相关多肽可以与选自Ficolin_l、2、3,和甘露糖结合凝集素(MBL)的一种或多种蛋白同时或先后施用。因子可以提供在单一剂型中，其中所述单一剂型包含两种化合物，或以部件试剂盒的形式提供，所述部件试剂盒包括作为第一单位剂型的ficolin相关多肽制剂和作为第二单位剂型的所述一种或多种其它化合物的制齐U。不管在整个说明书中何时提及第一或第二或第三单位剂量等，这不表示施用的优选次序，而是仅为了便利的目的这样提及。
ficolin相关多肽制剂和一种或多种其它化合物的制剂“同时”给药意指施用处在单一剂型中的化合物，或施用第一药剂，然后施用第二药剂，时间间隔不超过15分钟，优选10分钟，更优选5分钟，更优选2分钟。任何一种因子可以最先施用。“先后”给药意指施用第一药剂，然后施用第二药剂，时间间隔超过15分钟。两种单位剂型中的任一种可以最先施用。优选地，两种产物通过相同的静脉内途径注射。本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，其包含以Omg/ml至lmg/ml的血清/血浆浓度存在的ficolin相关多肽，并且其中所述制剂具有2. 0-10. O的pH。所述制剂可以进一步包含缓冲剂系统、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一些实施方案中，所述药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂。所述制剂典型地是溶液或混悬液。在本发明的另一个实施方案中，所述药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”定义为包含至少50% w/w的水的制剂。同样地，术语“水溶液”定义为包含至少50% w/w的水的溶液，术语“水性混悬液”定义为包含至少50% w/w的水的混悬液。在其它实施方案中，所述药物制剂是冷冻干燥的制剂，在使用前医师或患者向其 中加入溶剂和/或稀释剂。在其它实施方案中，所述药物制剂是不需要预先溶解即时使用的干燥的制剂(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。在另一个方面中，本发明涉及包含ficolin相关多肽的水溶液、和缓冲剂的药物制剂，其中ficolin相关多肽以Ο-lmg/ml或以上的血清/血浆浓度存在，并且其中所述制剂具有约2. O-约10. O的pH。在本发明的其它实施方案中，制剂的pH选自由下列组成的列表2. 0，2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. I,4. 2，4. 3，4. 4，4. 5，4. 6，4. 7，4. 8，4. 9，5. 0，5. I，5. 2，5. 3，5. 4，5. 5，5. 6，5. 7，5. 8，5. 9，6. 0，
6.I，6. 2，6. 3，6. 4，6. 5，6. 6，6. 7，6. 8，6. 9，7. 0，7. I，7. 2，7. 3，7. 4，7. 5，7. 6，7. 7，7. 8，7. 9，
8.O，8. I，8. 2，8. 3，8. 4，8. 5，8. 6，8. 7，8. 8，8. 9，9. O，9. I，9. 2，9. 3，9. 4，9. 5，9. 6，9. 7，9. 8，
9.9，和 10. O0在本发明的另一个实施方案中，缓冲剂选自由下列组成的组乙酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，甘氨酰甘氨酸，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三羟甲基氨基甲烷，N-二(羟乙基)甘氨酸，三(羟甲基)甲基甘氨酸，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，延胡索酸，酒石酸，天冬氨酸或它们的混合物。这些具体缓冲液中的每一种组成本发明的备选实施方案。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含药用防腐剂。在本发明的另一个实施方案中，所述防腐剂选自由下列组成的组苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯代丁醇，和thiomeiOsal，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪脲，氯己定，脱氢乙酸钠，氯甲酚，对羟苯甲酸乙酯，节索氯铵(benzethonium chloride),氯苯甘醚(chlorphenesine, 3p-(氯苯氧基丙烷)-1，2_ 二醇)或它们的混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0. lmg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0. lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体的防腐剂中的每一种组成本发明的一个备选实施方案。防腐剂在药物组合物中的应用对于专业人员来说是公知的。为方便，参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)，第19版，1995。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含等渗剂。在本发明的另一个实施方案中，所述等渗剂选自由下列组成的组盐(例如氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如L-甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，糖醇(例如甘油(丙三醇)，1，2_丙二醇(丙二醇)，1，3_丙二醇，1，3_ 丁二醇)，聚乙二醇(例如PEG400)，或它们的混合物。可以使用任意的糖，诸如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括，例如，果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，芽霉菌糖，糊精，环糊精，可溶淀粉，羟乙基淀粉和羧甲纤维素钠。在一些实施方案中，糖添加物是鹿糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8碳水化合物(hydrocarbon),并且包括，例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一些实施方案中，所述糖醇是甘露醇。上文提及的糖或糖醇可以单独或组合使用。对所用的量没有固定的限制，只要所述糖或糖醇在液体制剂中可溶并且没有不利地影响使用本发明的方法所获得的稳定作用。在一些实施方案中，糖或糖醇浓度为约lmg/ml至约150mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以lmg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等 渗剂以lmg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体的等渗剂中的每一种组成本发明的备选实施方案。等渗剂在药物组合物中的应用对于专业人员来说是公知的。为方便,参考Remington :The Science and Practiceof Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)，第19版，1995。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、和天冬氨酸的盐，以及它们的混合物。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以O. lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以O. lmg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些具体的螯合剂中的每一种组成本发明的备选实施方案。螯合剂在药物组合物中的应用对于专业人员来说是公知的。为方便，参考Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)，第 19 版，1995。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用对于专业人员来说是公知的。为方便,参考Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)，第19版，1995。更具体地，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性成分包括在以液体药物制剂存储过程中可能表现出聚集物形成的多肽。“聚集物形成”意指多肽分子之间的物理相互作用，其导致形成可能保持可溶的寡聚物，或形成从溶液中沉淀下来的大的可见的聚集物。“在存储过程中”意指液体药物组合物或制剂在制备后不立即施用给受试者。相反，在制备后，将其包装进行存储，以液体形式、以冷冻状态、或以干燥形式存储，之后重构成液体形式或其它适于施用给受试者的形式。“干燥形式”意指液体药物组合物或制剂通过冷冻干燥(即，冻干；参见，例如，Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci.Technol.(肠胃外科学技术杂志)38 48-59)、喷雾干燥(参见Masters (1991) Spray-DryingHandbook (喷雾干燥手册)(第 5 版；Longman Scientific and Technical (朗曼科学技术)，Essez,英国)，第 491-676 页；Broadhead 等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;和 Mumenthaler 等(1994) Pharm. Res.(药物研究)11 12-20)、或空气干燥(Carpenter 和Crowe (1988) Cryobiology (低温生物学)25 :459-470 ;和 Roser (1991) Biopharm.(生物制药)4 47-53)进行干燥。在液体药物组合物存储过程中多肽形成聚集物可以不利地影响所述多肽的生物学活性，导致药物组合物的治疗功效损失。此外，聚集物形成可以引起其它问题，诸如当使用输注系统施用含有多肽的药物组合物时，引起输液管、膜或泵的堵塞。本发明的药物组合物可以进一步包含足以减少组合物存储过程中多肽的聚集物形成的量的氨基酸碱。“氨基酸碱”意指氨基酸或氨基酸组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或以其盐形式存在。当使用氨基酸组合时，所有的氨基酸可以以其游离碱形式存在，所有可以以其盐形式存在，或一些可以以其游离碱形式存在而另一些以其盐形式存在。在一些实施方案中，用于制备本发明的组合物的氨基酸是携带带电荷侧链的那些，诸如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。在本发明的药物组合物中可以存在特定氨基酸(例如，甘氨酸，甲硫氨酸，组氨酸，咪唑，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸以及它们的混合物)的任意立体异构体(即，L，D，或DL异构体)或这些立体异构体的组合， 只要所述特定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。在一些实施方案中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可以用这些氨基酸的类似物配制。“氨基酸类似物”意指在本发明的液体药物组合物存储过程中导致减少多肽的聚集物形成的理想作用的天然存在氨基酸的衍生物。适当的精氨酸类似物包括，例如，氨基精氨酸、鸟氨酸和N-单以及L-精氨酸，适当的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，适当的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如使用其它氨基酸一样，氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式结合在组合物中。在本发明的另一个实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物组合使用，其足以防止或延迟蛋白的聚集。在本发明的另一个实施方案中，为了抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜，当作用为治疗剂的多肽为包含至少一个易于发生这样的氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，可以添加甲硫氨酸(或其它硫氨基酸或氨基酸类似物)。“抑制”意指甲硫氨酸氧化的种类随时 间的积聚最少。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更多保持为其正确的分子形式。可以使用甲硫氨酸(L，D，或DL异构体)的任意立体异构体或它们的组合。加入的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，从而使甲硫氨酸亚砜的量对于管理结构来说是可以接受的。典型地，这意指所述组合物包含不超过约10%至约30%的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过添加甲硫氨酸实现，从而使添加的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比例在约I : I至约1000 I的范围内，诸如10 I至约100 I的范围内。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含稳定剂，所述稳定剂选自高分子量聚合物或低分子量化合物的组。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基-/羟基纤维素或它们的衍生物(例如HPC，HPC-SL, HPC-L和HPMC)，环糊精，含硫物质，如单硫甘油，巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体的稳定剂中的每一种组成本发明的备选实施方案。所述药物组合物还可以包含另外的稳定试剂，其进一步增强其中的治疗活性多肽的稳定性。本发明特别感兴趣的稳定试剂包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽抗甲硫氨酸氧化，和非离子表面活性剂，其保护多肽抗与冻融或机械剪切相关的聚集。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，所述表面活性剂选自去污剂，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙酰化甘油单酯，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆如Pluronic F68,泊洛沙姆188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物，如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如吐温-20，吐温-40，吐温-80和Bri j-35)，单甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸，磷酯酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，双磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如，二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如，棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的I-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧(烷基醚)_衍生物，例如，溶血磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物，二棕榈酰磷脂酰胆碱，和极性头基团的修饰，其为胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、和带正电荷的DODAC，DOTMA, DCP, BISHOP,溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油磷脂(例如，脑磷脂)，甘油糖脂(例如， galactopyransoide),神经鞘氨糖脂(例如，神经酰胺，神经节苷脂)，十二烧基磷酸胆碱，母鸡卵溶血卵磷脂，梭链孢酸衍生物-(例如牛磺-二氢梭链孢酸钠等)，长链脂肪酸和它们的C6-C12盐(例如，油酸和辛酸)，酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N° -酰化衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的的任意组合的二肽的N°-酰化衍生物，包含中性氨基酸和两个带电荷氨基酸的任意组合的三肽的N°-酰化衍生物，DSS(多库酯钠，CAS注册号[577-11-7])，多库酯钙，CAS注册号[128-49-4])，多库酯钾，CAS注册号[7491-09-0])，SDS (十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)，辛酸钠，胆酸或它们的衍生物，胆汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物，乌索脱氧胆酸，胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘胆酸钠，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-I-丙烷磺酸酯，阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂，两性离子表面活性剂(例如，N-烧基-N, N-二甲基铵基-I-丙烧横酸酯(N-alkyl-N, N-dimethylammonio-1-propanesulfonates) ,3-胆胺酸-I-丙基二甲基铵基-I-丙烧横酸酯(3-cholamido-l-propyIdimethylammonio-1-propanesulfonate),阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如，十六烧基-三甲基溴化铵，十六烷基氯化吡啶鐵)，非离子表面活性剂(例如，十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)，poloxamines (例如，Tetronic’ s),其是通过向乙二胺连续添加环氧丙烧和环氧乙烷衍生的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性剂可以选自咪唑衍生物或其混合物的组。这些具体的表面活性剂中的每一种组成本发明的备选实施方案。表面活性剂在药物组合物中的应用对于专业人员来说是公知的。为方便，参考Remington The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药科学和实践)，第 19版，1995。可能的是，在本发明的肽药物制剂中可以存在其它成分。所述另外的成分可以包括湿润剂，乳化剂，抗氧化剂，填充剂，张力改性剂，螯合剂，金属离子，油状赋形剂，蛋白(例如，人血清白蛋白，明胶或蛋白)和两性离子(例如，氨基酸，如甜菜碱，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，赖氨酸和组氨酸)。当然，所述另外的成分，不应该不利地影响本发明的药物制剂的整体稳定性。本发明的包含ficolin相关多肽的药物组合物可以在数个位点施用给需要所述治疗的患者，例如，在局部位点，例如，皮肤和黏膜位点，在旁路吸收的位点，例如，在动脉、静脉、在心脏施用，和在涉及吸收的位点，例如，在皮肤中、在皮肤下、在肌肉中或在腹部施用。局部施用可以特别有利于治疗与局部炎症相关的病症，诸如治疗与烧伤相关的炎症或与皮肤相关的其它病症。因此，在一些实施方案中，施用通过局部施用进行。在一些具体的实施方案中，眼用滴剂可以用于与眼睛有关的病症，如角膜炎(keratitis)，如弥散性薄层状角膜炎(diffuse lamellar keratitis, DLK)。
本发明的药物组合物的施用可以通过数种施用途径，例如，舌部，舌下，含服，口腔中，口服，在胃和肠中，鼻部，肺部，例如，通过细支气管和肺泡或它们的组合，表皮，皮肤，经皮，阴道，直肠，眼睛，例如，通过结膜，输尿管，和肠胃外施用给需要所述治疗的患者。本发明的组合物可以以数种剂型施用，例如，作为溶液，混悬液，乳液，微乳液，多层乳液，泡沫剂，软膏，糊剂，膏药，油膏，片剂，包衣片剂，清洗剂(rinses),胶囊,例如,硬明胶胶囊和软明胶胶囊，栓剂，直肠胶囊，滴剂，凝胶，喷雾剂，粉剂，气雾剂，吸入剂，眼用滴齐U，眼用软膏，眼用清洗剂，阴道子宫托，阴道环，阴道药膏，注射液，原位转化溶液，例如原位胶化，原位固定，原位沉淀，原位结晶，输注溶液，和植入物。本发明的组合物可以进一步混合在、或附着到药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统上，例如，通过共价、疏水和静电相互作用混合或附着，从而进一步增加ficolin相关多肽的稳定性，增加生物利用度，增加溶解性，减少副作用，实现本领域技术人员公知的择时疗法，并且增加患者的依从性或任意这些的组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括，但不限于，聚合物，例如纤维素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，淀粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和它们的嵌段共聚物，聚乙二醇，载体蛋白，例如白蛋白，凝胶，例如热胶化系统，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚合系统，胶束，脂质体，微球体，纳米颗粒，液态晶体和其分散液，L2相和其分散液，其为本领域技术人员公知的脂质-水系统中的相变行为，聚合胶束，多层乳液，自乳化，自微乳化，环糊精及其衍生物，和树状聚体。本发明的组合物用在适于肺部施用ficolin相关多肽的固体、半固体、粉末和溶液制剂中，例如，使用测定的剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器施用，所有这些都是本领域技术人员公知的装置。本发明的组合物特别用在可控释放、缓释、延长释放、延迟释放和缓慢释放药物递送系统的制剂中。更具体地，但是不限于，组合物用在肠胃外可控释放和缓释系统(两个系统导致给药次数的多倍减少)的制剂中，这是本领域技术人员公知的。甚至更优选的是皮下施用的可控释放和缓释系统。不限制本发明的范围，有用的控制释放系统和组合物的实例是水凝胶、油状凝胶、液态晶体、聚合胶束、微球体、纳米颗粒。产生用于本发明的组合物的可控释放系统的方法包括，但不限于，结晶，缩合，共结晶，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高压均化，包封，喷雾干燥，微型包封，凝聚，溶剂蒸发以产生微球体，挤出和超临界流体工序。通用参考文献参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release (药物控制释放手册)(Wise, D. L.编· Marcel Dekker,纽约，2000)和 Drug and the Pharmaceutical Sciences (药物和制药科学)第 99 卷ProteinFormulation and Delivery (蛋白配制和递送)(MacNally,E. J.编· Marcel Dekker,纽约,2000)。药物施用可以通过利用注射器、任选笔式注射器的皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射进行。备选地，肠胃外施用可以通过输注泵进行。另一种选择是可以是用于以鼻或肺部喷雾形式施用ficolin相关多肽的溶液或混悬液的组合物。还有另一个选择，本发明含有ficolin相关多肽的药物组合物还可以适于经皮施用，例如，通过无针注射或从贴片，任选离子电渗疗法贴片施用，或经黏膜施用，例如口腔施用。术语“稳定的制剂”是指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性的制剂。术语蛋白制剂的“物理稳定性”用在本文中是指蛋白因所述蛋白暴露于热-机械压力和/或与不稳定界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成无生物学活性和/或不溶聚集物的倾向性。水性蛋白制剂的物理稳定性在将填装在适当容器(例如，筒或小 瓶)中的制剂在不同温度暴露于机械/物理压力(例如，振荡)不同时间期间后通过视觉检验和/或浊度测量评估。制剂的视觉检验以具有黑暗背景的清晰聚焦光进行。制剂的浊度通过排序浑浊程度的视觉得分表征，例如，以0-3的等级进行(没有表现出浑浊的制剂对应于视觉得分0，在日光下表现出可见浑浊的制剂对应于视觉得分3)。相对于蛋白聚集，当制剂在日光下表现出可见浑浊时，制剂分类为物理不稳定的。备选地，制剂的浊度可以通过本领域技术人员公知的简单浊度测量进行评估。水性蛋白制剂的物理稳定性还可以使用分光镜试剂或蛋白构象状态的探针进行评估。探针优选是优先结合蛋白的非天然构象异构体的小分子。蛋白结构的小分子分光镜探针的一个实例是Thioflavin T。Thioflavin T是一种荧光染料，其广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维。存在原纤维以及可能的其它蛋白构型时，Thioflavin T在与原纤维蛋白形式结合时产生在约450nm的新激发最大值和在约482nm的增强的发射。未结合的Thioflavin T在所述波长基本上没有荧光。其它小分子可以用作蛋白结构从天然状态到非天然状态变化的探针。例如，“疏水片(hydrophobic patch) ”探针优先结合蛋白暴露的疏水片。疏水片通常包埋在天然状态的蛋白的三级结构中，但是当蛋白开始解折叠或变性时暴露出来。这些小分子、分光镜探针的实例是芳香、疏水染料，诸如antrhacene，吖啶，菲咯啉等。其它分光镜探针是金属-氨基酸复合物，如疏水氨基酸(如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸等)的钴金属复合物。术语蛋白制剂的“化学稳定性”用在本文中是指与天然蛋白结构相比，导致形成具有潜在较小的生物学功效和/或潜在增加的免疫原特性的化学降解产物的蛋白结构的化学共价变化。取决于天然蛋白的类型和性质以及所述蛋白暴露的环境，可以形成多种化学降解产物。化学降解的消除可能是最不可能完全避免的，并且本领域技术人员公知，在存储和使用蛋白制剂的过程中，通常观察到增加量的化学降解产物。大部分蛋白倾向于脱酰胺，其为谷氨酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基团水解形成游离羧酸的过程。其它降解途径涉及形成高分子量转化产物，其中两种或多种蛋白分子通过转酰胺和/或二硫化物相互作用彼此共价结合，导致形成共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物(Stabilityof Protein Pharmaceuticals (蛋白质制药的稳定性)，Ahern. T. J. & Manning M. C.，Plenum Press,纽约1992)。氧化(例如，甲硫氨酸残基的氧化)可能是所提到的另一种蛋白降解变化。蛋白制剂的化学稳定性可以通过在暴露于不同环境条件(例如，通常通过升高温度而加速降解产物形成)后测量不同时间点的化学降解产物的量而评估。每种个体降解产物的量通常通过分离该降解产物而确定，降解产物的分离依赖于分子大小和/或电荷利用各种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)进行。因此，如上文所述，“稳定的制剂”是指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性的制剂。通常，制剂必须在使用和存储过程中直至达到产品有效期时是稳定的(按照推荐使用和存储条件)。在本发明的一些实施方案中，包含ficolin相关多肽的药物制剂超过6周使用和超过3年存储是稳定的。在本发明的其它实施方案中，包含ficolin相关多肽的药物制剂超过4周使用和超过3年存储是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，包含ficolin相关多肽的药物制剂超过4周使用和超过两年存储是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，包含ficolin相关多肽的药物制剂超过2周使用和超过两年存储是稳定的。
本发明的具体实施方案如上述，本发明涉及分离的ficolin相关多肽以及包含氨基酸序列SEQID N0:4的多肽或其变体或免疫学片段。在一些实施方案中，本发明的多肽是基本上纯的。在一些实施方案中，本发明的多肽能够与甘露糖结合凝集素(MBL)缔合。在一些实施方案中，本发明的多肽能够与ficolin-1, ficolin-2,或ficolin-3中的任一种相缔合。 在一些实施方案中，本发明的多肽能够与Clq，肺表面活性蛋白SP_A和/或SP_D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CLL-Il中的任一种相缔合。在一些实施方案中，本发明的多肽能够与特异性接受体蛋白，诸如特异性受体相
鋪A
φ π O在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ NO 3的氨基酸序列20-297、或其功能性变体。在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ NO 1的氨基酸序列20-380、或其功能性变体。在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列16-296或其功能性变体。在一些实施方案中，本发明的多肽在非还原条件下在SDS-PAGE上具有约40kDa的
分子量。在一些实施方案中，本发明的多肽在与选自SEQ NO :1的49和178的位置相对应的一个或两个氨基酸处被N-连接糖基化。在一些实施方案中，本发明的多肽是重组蛋白。在一些实施方案中，本发明的多肽是同型二聚体形式的。在一些实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO I的氨基酸序列20-380组成。在一些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其变体或免疫学片段。
在一些实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO :4、或其变体或免疫学片段组成。在一些实施方案中，本发明的多肽介导濒死细胞或死亡细胞、和/或细胞碎片的吞噬，所述濒死细胞或死亡细胞诸如凋亡细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽介导微生物的吞噬。在一些实施方案中，特异性结合本发明的多肽的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，特异性结合本发明的多肽的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的多肽具有与具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述具有序列同源性的其它蛋白如吞没衔接蛋白(GULP)。在一些实施方案中，编码本发明的多肽的分离的核酸分子包含与SEQ NO 2的序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列。 在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是真核细胞。 在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和BHK细胞组成的组。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗任意自体免疫性病症，诸如艾迪生病(Addison, s disease),自体免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia),自体免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis),局限性回肠炎(Crohn' s disease),格雷夫斯病(Graves' disease),吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome),系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE),狼疮性肾炎(lupus nephritis),多发性硬化病(multiple sclerosis),重症肌无力(myasthenia gravis),银屑病(psoriasis),原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis),类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和葡萄膜炎(uveitis),哮喘(asthma),动脉粥样硬化(atherosclerosis), I型糖尿病(TypeI diabetes),银屑病(psoriasis),各种过敏症(allergies)。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗选自由下列组成的组的任意炎性病症阑尾炎(appendicitis),消化性溃瘍(peptic ulcer),胃溃瘍(gastric ulcer),十二指肠溃瘍(duodenal ulcer)，腹膜炎(peritonitis)，胰腺炎(pancreatitis)，溃瘍性结肠炎(ulcerative colitis)，假膜性结肠炎(pseudomembranous colitis),急性结肠炎(acute colitis),缺血性结肠炎(ischemic colitis),憩室炎(diverticulitis),会厌炎(epiglottitis),失弛缓症(achalasia),胆管炎(cholangitis),胆囊炎(cholecystitis),月干炎(hepatitis),局限性回肠炎(Crohn 丨 s disease),肠炎(enteritis),惠普尔病(Whipple' sdisease),过敏症(allergy),免疫复合物病(immunecomplex disease)，器官缺血(organ ischemia)，再灌注损伤(reperfusion injury)，器官坏死(organ necrosis),花粉症(hay fever),脓毒症(sepsis),败血病(septicemia),内毒素性休克(endotoxic shock),恶病质(cachexia),高烧(hyperpyrexia),嗜酸性肉芽肿(eosinophilic granuloma),肉芽肿病(granulomatosis),肉瘤样病(sarcoidosis),感染性流产(septic abortion)，附睾炎(epididymitis)，阴道炎(vaginitis)，前列腺炎(prostatitis),尿道炎(urethritis),支气管炎(bronchitis),肺气肿(emphysema),鼻炎(rhinitis)，月市炎(pneumonitis)，月市尘病(pneumotransmicroscopicsiIicovolcanoconiosis)，肺泡炎(alvealitis)，毛细支气管炎(bronchiolitis)，咽头炎(pharyngitis)，胸膜炎(pleurisy)，窦炎(sinusitis)，流感(influenza)，呼吸道合胞病毒感染(respiratory syncytial virus infection)，HIV 感染，乙型月干炎病毒感染(hepatitisB virus infection)，丙型肝炎病毒感染(hepatitis C virus infection)，弥散性菌血症(disseminated bacteremia)，登革热(Dengue fever)，念珠菌病(candidiasis)，症疾(malaria)，丝虫病(filariasis)，阿米巴病(amebiasis)，包虫囊肿(hydatidcysts)，烧伤，皮炎(dermatitis)，皮肌炎(dermatomyositis)，晒伤(sunburn)，荨麻疫(urticaria)，抚(warts)，风疫块(wheals)，血管炎(vasulitis)，脉管炎(angiitis)，心内膜炎(endocarditis)，动脉炎(arteritis)，动脉粥样硬化(atherosclerosis)，血栓性静脉炎(thrombophlebitis)，心包炎(pericarditis)，心肌炎(myocarditis),心肌缺血(myocardial ischemia)，结节性动脉周围炎(periarteritis nodosa)，风湿热(rheumatic fever)，阿尔茨海默病(Alzheimer ' s disease)，腹腔病(coeliacdisease)，充血性心力衰竭(congestive heart failure)，成人呼吸窘迫综合征(adultrespiratory distress syndrome)，脑膜炎(meningitis)，脑炎(encephalitis)，多发性 硬化病，脑梗死(cerebral infarction)，脑栓塞(cerebral embolism)，吉兰-巴雷综合征(Guillame-Barre syndrome)，神经炎(neuritis)，神经痛(neuralgia)，脊髓损伤(spinal cord injury)，瘫痪(paralysis)，葡萄膜炎(uveitis)，关节炎(arthritides)，关节痛(arthralgias)，骨髓炎(osteomyelitis)，筋膜炎(fasciitis)，佩吉特病(Paget' sdisease)，痛风(gout)，牙周病(periodontal disease)，类风湿性关节炎，滑膜炎(synovitis)，重症肌无力(myasthenia gravis)，甲状腺炎(thyroiditis)，系统性红斑性狼疮(systemic lupus erythematosis)，肺出血肾炎综合征(Goodpasture' s syndrome),贝赫切特综合征(Behcet, s syndrome)，同种异体移植排斥(allograft rejection)，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，I型糖尿病，强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)，贝格尔病(Berger' s disease)，莱特尔综合征(Reiter' s syndrome)和霍奇金病(Hodgkin, s disease)，角膜炎(keratitis)，2型糖尿病，囊性纤维化(cysticfibrosis)，心肌梗死(myocardial infarction)，再灌注损伤，中风(stroke)，皮肌炎，代谢综合征(metabolic syndrome)，系统性炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome)，脓毒症，多器官功能衰竭(multiple organ failure)，弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation)，过敏性休克(anaphylacticshock)，血管并发症(Vascular complication)和与I型和/或2型糖尿病相关的肾病(nephropathy associated with type I 和 / 或 type 2 diabetes)，脑膜炎，细菌性败血病(bacterial septicaemia)，并发性症疾(complicated malaria)，非典型的溶血性尿毒症综合征(atypic haemolytic uremic syndrome)，溶血性尿毒症综合征(haemolyticuremic syndrome)，年龄相关的黄斑变性(age related macular degeneration)，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)，蛇毒咬伤(snake venombite)，烧伤，和器官移植并发症。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗选自由下列组成的组的任意炎性病症器官缺血(organ ischemia)，再灌注损伤，器官坏死，血管炎，心内膜炎(endocarditis),动脉粥样硬化,血栓性静脉炎(thrombophlebitis),心包炎,心肌炎,心肌缺血，结节性动脉周围炎，风湿热，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合征，脑梗死，脑栓塞，血管并发症和与I型和/或2型糖尿病相关的肾病。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的任意适应证。在一些实施方案中，本发明的多肽治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病或病症有关的适应证，包括炎性反应和与纤维蛋白形成有关的慢性血栓栓塞疾病或病症，包括血管病症，如血栓形成(thrombosis)，诸如深静脉血栓形成，动脉血栓形成，术后血栓形成，冠状动脉旁路移植(CABG),经皮透皮冠状血管成形(percutaneous transdermalcoronary angioplastry, PTCA),血小板沉积中风，肿瘤生长，肿瘤转移，血管发生，血栓溶解，动脉粥样硬化，再狭窄(restenosis)，如动脉硬化和/或血管成形后的再狭窄，急性和慢性适应证，如炎症，脓毒症(sepsis),脓毒性休克(septic chock),败血病(septicemia),低血压，成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome,ARDS),系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),弥散 性血管内凝血病(disseminated intravascular coagulopathy, DIC),肺栓塞(pulmonaryembolism),病理性血小板沉积(pathological platelet deposition),心肌梗死，或用于预防性治疗具有动脉粥样硬化血管的哺乳动物，所述哺乳动物有风险患有血栓形成，外周血祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞病，溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremicsyndrome, HUS),和血栓性血小板减少性紫癒(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)，和风湿热。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病或病症有关的适应证，包括炎性反应和与纤维蛋白形成有关的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,诸如深静脉血栓形成,动脉血栓形成,术后血栓形成，冠状动脉旁路移植(CABG)，经皮透皮冠状血管成形(PTCA)，血小板沉积中风，肿瘤生长，肿瘤转移，血管发生，血栓溶解，动脉粥样硬化，再狭窄，如动脉硬化和/或血管成形后的再狭窄，急性和慢性适应证如炎症，病理性血小板沉积，心肌梗死，或用于预防性治疗具有动脉粥样硬化血管的哺乳动物，所述哺乳动物有风险患有血栓形成，外周血祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞病，溶血性尿毒症综合征(HUS)，和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，和风湿热。
在一些实施方案中，本发明的多肽用于预防在鉴定的高危患者中发生血栓栓塞并发症，所述鉴定的高危患者如经历手术的那些或患有充血性心力衰竭的那些。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗与心脏相关的医学病症。在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗与ficolin-相关多肽缺乏有关的医学病症。实施例I检测MASPl基因的可变剪接转录物方法为了检测MASPl的三种转录物MASP1，MASP3和FAP，设计用于每种变体的特异性引物。PCR使用在外显子6中的通用正向引物(5' -gcacccagagccacagtg-3')和特异性反向引物MASP1在外显子12中(5' -gccttccagtgtgtgggc-3' ) ,MASP3在外显子11中(5_gccttccagagtgtggtca_3/ )和 FAP 在外显子 8a 中(5' -cgatctggagagcgaactc-3')进行(图I)。PCR扩增在20-μ I体积中进行，其包含:50ng肝脏cDNA (Clontech)，O. 25 μ M每种引物，2. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8.4，和 0.4 单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反应按照下述循环参数进行10min 94 °C,30 或 40 个循环(30sec 94°C，50sec 58°C，90sec72°C )，IOmin 72。。。样品在 2%琼脂糖凝胶上分析。结果在肝脏cDNA中检测到MASPl基因的可变转录。使用位于外显子6的通用正向引物和位于外显子12 (MASPl)、外显子11(MASP3)、和外显子8a(FAP)的特异性反向引物扩增MASP1，MASP3，和FAP转录物。MASPl产生500bp的片段，MASP3产生506bp的片段，FAP产生309bp的片段。FAP片段的组织表达方法使用如上述相同的PCR测定法，研究商购人组织cDNA组(Clontech)的MASPI, MASP3，和FAP表达。样品在2%琼脂糖凝胶上分析。结果在来自Clontech的cDNA组中研究MASP1，MASP3,和FAP基因的组织分布(图2)。使用通用正向引物和特异性反向引物扩增MASP1，MASP3，和FAP转录物。GADPH用作参照基因。所有三种基因在肝脏中高度表达，另外，FAP在心脏组织中强表达(用黑色箭头表示)。在脑、结肠、前列腺、骨骼肌、和小肠中检测到FAP基因的较少表达(用白色箭头表不)。100个个体的FAP外显子8a的DNA测序方法在来自100名健康白种人个体的基因组DNA模板上进行外显子8a的直接测序，包括相对于翻译ATG起点跨越位置+44，083至+44，431的MASP1/MASP3/FAP基因的内含子-外显子边界。通过使用单一引物组(正向5' -ctgttcttcacactggctg-3 ',反向5' -ctgctgagatcatgttgttc-3 ')扩增该片段，其中正向引物包含5 ' -T7序列(5' -ttatacgactcacta-3' )。PCR扩增在20-μ I体积中进行，其包含50ng基因组DNA，0.25“] 每种引物，2.5111^%(12，0.21111 dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8· 4，和 O. 4单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反应按照下述循环参数进行2min94°C，15 个循环(30sec 94°C，60sec 64°C，60sec 72°C)，15 个循环(30sec 94°C，60sec58°C,60sec 72°C ), 5min 72°C，并且使用ABIBigDye循环测序终止子试剂盒(AppliedBiosystems (应用生物系统)，Foster City, CA)按流程使用5'-生物素酰化的测序引物在正向方向上测序。测序反应使用链霉抗生物素蛋白珠(Geno Vision)在PyroMark VacuumPrep Workstation (Biotage)上纯化。序列分析在 ABI Prism 3100 基因分析仪(AppliedBiosystems (应用生物系统))上进行。得到的DNA序列用BioEdit软件比对,并且从序列电泳图上视觉验证DNA的多态性。结果所有序列使用BioEdit软件比对。在100名健康个体中没有观察到外显子8a或外显子-内含子区域中的遗传变异。实施例2免疫沉淀来自血清的MAP-I特异性免疫沉淀使用MAP-I特异性mAb 20C4(针对17 MAP-I 特异性C-端肽产生)或mAb 8B3进行，mAb 8B3是一种针对MASP-1/3的共有重链反应的单克隆抗体，其用作对照沉淀抗体。允许总共10 μ g抗MAP-I或MASP-1/3抗体与绵羊或小鼠或兔 IgG Dyna 珠(M-280，货号 112. 02D/112. 04D, Dynal/Invitrogen)结合。在洗涤步骤后，将珠子用于正常人血清汇聚液(I I稀释在TBS中)，并且在4°C颠倒温育I小时。在最后的洗涤步骤和磁力分离后，将珠子在SDS上样缓冲液中煮沸，并进行SDS-PAGE和蛋白质印迹，蛋白质印迹使用针对MAP-UMBLjP Ficolin-3的抗体进行探测。使用针对MBL(Hyb 131-11, Bioporto,丹麦)，Ficolin-2(FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs进行上述相同的沉淀步骤。为了补偿MBL、Ficolin_2和-3血清浓度的差异，它们分别从lml、300 μ I和100 μ I血清中沉淀。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析样品，蛋白质印迹使用针对MAP-I的pAb进行。免疫组织化学在培养瓶中在RPMI+10%中生产表达rMAP-Ι的CHO细胞。在80_90%汇聚收集细胞，将细胞收集并且在4%甲醛-PBS中固定24小时，随后包埋在石蜡中。还对六种不同的人肝脏组织和来自两种不同的心肌组织、两种骨骼肌组织的样品和两份获自人主动脉的样品进行上述固定和石蜡包埋。使用Leitz Wetzlar切片机获得5 μ m薄片的切片，并且置于 玻璃载玻片上，并且在4°C保存直至测定。按前述进行预处理和分析。一级抗体是MAP-I特异性单克隆抗体mAb 12B11或亲和纯化的、单特异性兔抗所有均稀释至5 μ g/ml。同种型抗体对照以相同的浓度应用到组织。二级抗体是EnVision 抗体(HRP-抗小鼠或HRP-抗兔，Dako, Glostrup,丹麦)。在Leica DMLB2显微镜下进行染色模式分析。SDS-PAGE和蛋白质印迹基本上按照供应商所述，使用NuPAGE 系统(Invitrogen),用不连续的缓冲液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。蛋白质印迹使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 μ g/ml 一级 mAbs 和通过在 PBS, 0· 05% 吐温20中I : 1500稀释的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(Ρ0397，Dako)或I : 1000稀释的HRP-兔抗小鼠IgG (Ρ0260，Dako)进行二级显影而进行。膜使用在50mM乙酸钠缓冲液pH 5中的3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)(在丙酮中O. 04% )和O. 015% H2O2进行显影。补体激活测定基本上如前述评估MAP-I对MBL和Ficolin_3介导的补体因子C4沉积的影响。简言之，将甘露聚糖(MBL配体)(Sigma-Aldrich M7504)或乙酰化的牛血清白蛋白(Ficolin-3配体)以10 μ g/ml固定到Maxisorp ELISA平板(Nunc,丹麦)上。洗漆后，添加rMBL或rFicolin-3 (O. 4 μ g/ml)并且温育I. 5小时。在第一维度上以两倍的连续稀释应用rMAP-Ι或rMASP-2 I小时，然后在第二维度上，在37°C用缺乏MBL或Ficolin-3的血清连续稀释液温育45分钟。C4沉积使用针对C4c的pAb (Q0369, Dako, Glostrup/丹麦)进行测量。另外，我们使用纯系统评估MAP-I对MASP-2的置换。如前述，在rMBL/甘露聚糖矩阵中，在第一维度上，将rMASP-2在连续稀释液中在20°C预先温育45分钟，然后在第二维度上，在20°C用rMAP-Ι稀释液温育45分钟。纯化的C4(来自Quidel，CA，USA)以I μ g/ml的浓度加入，并且在37°C温育45分钟。检测如上述进行。结果MAP-I 与 Ficolin-2、Ficolin-3 和 MBL 共沉淀为了研究MAP-I与MBL和Ficolin-3的可能的缔合，我们使用抗MAP-1 mAb20C4与针对MASP-I和MASP-3共有重链的mAb (mAb8B3) 二者来沉淀血清复合物。随后通过蛋白质印迹分析沉淀物，所述蛋白质印迹分别用针对MAP_1、MBL、和Ficolin-3的抗体探测。我们观察到Ficolin-3共沉淀条带，但是也观察到具有MBL的较弱条带(图24A)。样品不使用针对Ficolin-2的抗体探测，因为它们在蛋白质印迹中不作用。然后，我们使用针对MBL、Ficolin-2和Ficolin-3的mAbs来分别沉淀1ml、300 μ I和100 μ I血清(进行其来分别调^ MBL (2 μ g/ml) >Ficolin-2 (5 μ g/ml)和 Ficolin-3 (20 μ g/ml)血清浓度的差异)来倒转免疫沉淀。随后，通过用针对MAP-I的抗体探测的蛋白质印迹分析样品。在来自Ficolin-2和_3的沉淀物中观察到明显的MAP-I条带，在MBL沉淀物中显现更弱得多的条带，其中免疫沉淀的rMAP-Ι和血清MAP-I作为对照(图24B)。MAP-I抑制凝集素途径的补体活性使用缺乏MBL和Ficolin-3的血清与rMBL和rFicolin_3组合来重构MBL和Ficolin-3的补体C4激活活性。甘露聚糖和乙酰化的BSA分别作为MBL和Ficolin-3的配体。rMBL和rFicolin-3 二者都能够分别起始MBL和Ficolin-3缺陷型血清中的C4沉积(图25A和25D)。应用rMASP-2导致通过Ficolin-3和MBL两种激活途径的C4沉积的强 阳性剂量依赖性增加(图25B和25E)，而应用rMAP-Ι导致通过两种途径的对C4沉积的明显剂量依赖性抑制(图25C和25F)。另外，我们使用仅包含rMBL，rMASP-2, rMAP-1和纯化的C4的纯组分系统来解决MAP-I对MASP-2的可能的置换。将rMASP-2用连续稀释的甘露聚糖/rMBL复合物预先温育。然后，加入变化浓度的rMAP-Ι，然后加入纯化的C4。向该系统应用rMAP-Ι明显导致C4沉积的剂量依赖性抑制(图26)。实施例3确定新型MBL/Ficolin相关蛋白I(MAP-I)的血清浓度和缔合特异性在CH0-DG44细胞中产生并且稳定表达MAP-I的全长无标记的重组构建体。产生针对MAP-I的特异性单克隆抗体。还建立关于MAP-I血清测量的定量ELISA，并且通过ELISA和密度梯度分级来检验血清MAP-I与Ficolin-2、-3和MBL之间的缔合。重组蛋白如其它地方所述(Hummelshoj等，Mol Immunol (分子免疫学)44,401-11, 2007 ；Larsen等，J Biol Chem(生物化学杂志)279，21302-11，2004 ;Ma等，2009 J Biol Chem(生物化学杂志)，Oct 9 ;284(41))，改进之处在于使用PowerCHOl无血清培养基(Lonza，Vallensbaek/丹麦，www. lonza. com)作为表达培养基，在CH0-DG44细胞中表达无标记的人MAP-I的全长构建体。如前述，我们利用抗体亲和纯化来纯化rMAP-1 (Skjoedt等，2009 ；Immunobiology (免疫生物学)，Nov 23)。简言之,基本上按照Pfeiffer等所述(Pfeiffer等,J Immunol Methods (免疫学方法杂志)97,1-9,1987),将 15mg抗MAP-1 抗体(mAb 20C4)共价偶联到CNBr活化的琼脂糖上，并且用作纯化基质。还使用抗-MAP-I柱来耗尽血清中的 MAP-I。单克隆抗体的产生按前述进行(Skjoedt等，J Biol Chem(生物化学杂志)285,8234-43,2010)。使用NuPAGE 系统(Invitrogen),按推荐,用不连续缓冲液,在10%或4-12%(w/ν) Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GEHealthcare)进行蛋白质印迹。将膜用2 μ g/ml 一级抗体显影,二级显现通过用在50mM乙酸钠缓冲液pH5中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-Aldrich,Broendby/丹麦,www.sigmaaldrich. com) +0. 015% H202作为底物，用I : 1500稀释的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白或 HRP-兔抗小鼠 IgG(P0397/P0260, Dako, Glostrup/ 丹寿，www. dako. com)进行。按推荐和先前所述(Skjoedt等，2009)，将rMAP_l用N-糖苷酶-F/END0_F(N-糖苷酶-F去糖基化试剂倉，Roche,Mannheim/Germany,www. roche. com)处理。产物通过在还原条件下的SDS-PAGE然后考马斯染色或蛋白质印迹进行分析。先前已经证实了抗-MAP-1 mAb 20C4的特异性(Skjoedt等，2010)。在定量MAP-1ELISA中，mAb 20C4用作捕获抗体，其以6 μ g/ml固定在Maxisorb ELISA平板上(NUNC ，Roskilde/丹麦，www. nuncbrand. com)。校正剂(惨加在MAP-I耗尽血清中的rMAP-1或rMAP-Ι)的连续稀释液或捐献者血清样品应用在PBS+0. 05 %吐温20+0. 5 %牛血清和IOmMEDTA中。检测抗体是以3 μ g/ml使用的生物素标记的mAb 8B3，其如前述与MASP_1、_3和 MAP-I 的共有链反应(Skjoedt 等，2010 ；Skjoedt 等，2009)。 Ficolin-2 和 _3 血清浓度如 Munthe-Fog 等和 Hummelshoj 等(Hummelshoj 等，Hum Mol Genet (人类分子遗传学)14, 1651-8, 2005 ;Munthe_Fog 等，Scand J Tmmunol 65,383-92,2007 ;Munthe_Fog 等，MolImmunol (分子免疫学)45，2660-6，2008)所述确定，MBL和MASP-3血清浓度如前述确定(Skjoedt等，2009)。显色使用邻苯二胺(Dako,Glostrup/丹麦)获得，并且按推荐，用1MH2S04终止酶反应。使用 V-max 动力学-读数仪(分子装置(Molecular Devices), Sunnyvale/CA/U. S)测量光学密度(0D490nm-650nm)水平。MAP-I与MBL、Ficolin-2和_3之间的相对缔合基本上如前述测定(Skjoedt等，2009)，改进之处在于，使用MAP-I特异性mAb 20C4作为捕获抗体(以6 μ g/ml包被)。检测mAbs是生物素标记的FCN-219 (Ficolin-2特异性)或FCN-334 (Ficolin-3特异性)(24-25)、或Hyb 131-11，全部以2 μ g/ml应用。分析来自如上述相同的100名丹麦献血者
的血清样品。将正常人血清进行蔗糖梯度分离。将O. 75ml血清上样到40ml离心柱上，该离心柱由缓冲在IOmM Tris,145mM NaCl, 3mM CaCl2和30 μ g/ml的人血清白蛋白中的10-30%蔗糖梯度组成。在L70 Beckmann超离心机中，使用SW28转头，将上样的柱在4°C以150. OOOxg真空离心24小时。从底部收集I. 5ml级分，并且通过针对下述抗原的特异性ELISA或免疫印迹进行分析MAP-1，MASP-I，MASP-2，MASP-3, sMAP, MBL, Ficolin-2 和 Ficolin-3。也评估血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰，表明分子表面与质量的比率。另外，分析级分激活外源应用的C4的能力。简言之，如前述(Skjoedt等，2010)，将级分以连续稀释液应用到用乙酰化BSA(Ficolin-3配体)或甘露聚糖(MBL配体)包被的ELISA平板上，然后在4°C摇动温育I小时。然后，洗涤平板，并且在37°C用I μ g/ml纯化的C4温育I小时。随后用针对C4c的多克隆抗体(Q 0369，Dako, Glostrup，丹麦)测量C4沉积。统计学分析使用Prism4 软件(GraphPad Software, Inc. , La Jolla/CA/US, www. Rraphpad.com)，计算统计学(Spearman non-parametric correlation (Spearman 非参数相关性)，non-parametric two-tailed t-test (非参数双尾 t 检验))和MAP-l,MBL,Ficolin_2 与 _3血清水平。结果rMAP-Ι的纯化和表征rMAP-Ι在CHO DG44中的表达导致在存在150nM甲氨蝶呤的条件下的高产率(在无血清培养基中的产率10-20 μ g/ml)。纯化后，在SDS-PAGE中，然后考马斯亮蓝染色或免疫印迹，分析rMAP-Ι。SDS-PAGE/考马斯染色分析显现具有 45kDa的估算还原分子量的条带(图27)。用N-糖苷酶F对rMAP-Ι去糖基化导致分子量变化为 40kDa，这对应于没有信号肽的理论质量。该模式也在使用针对MAP-I的特异性抗体的免疫印迹中观察到。MAP-I血清水平我们开发了定量ELISA来确定MAP-I的血清水平。该测定法基于作为捕获抗体的MAP-I特异性mAb 20C4和识别MASP-I、_3和MAP-I的共有重链的检测抗体(mAb 8B3)。在纯化的rMAP-Ι校正剂和以标准曲线的已知浓度掺加纯化的MAP-I的MAP-I耗尽血清之间观察到极好的平行性(图28A)。我们分析100名丹麦献血者中的MAP-I血清水平，并且发现平均值为240ng/ml，其范围为115_466ng/ml (图29A)。如前述，我们测量同一组中的MASP-3血清水平(Skjoedt等，2009)，并且绘制MAP-1和MASP-3浓度(图29B)。我们发现在MAP-I和MASP-3血清浓度之间没有相关性，尽管它们代表来自同一基因的可变转录物。我们评估了抗原和测定法在血清和在冻融循环中的稳定性(图29C)。我们观察到MAP-I的评估非常稳健，与冻融循环无关。MAP-I 与 Ficolin-2，_3 和 MBL 之间的缔合为了测量MAP-I与MBL，Ficolin-2和_3之间的相互作用，我们开发了三种不同的ELISAs，使用mAb 20C4作为捕获抗体，并用下列生物素标记的mAbs探测FCN-219 (Ficolin-2 特异性)，FCN-334 (Ficolin-3 特异性)或Hyb 131-11 (MBL特异性)。我们分析与用于MAP-I确定相同的100份捐献者血清样品，并且评估MAP-I与Ficolin-2，-3和MBL之间的血清缔合水平，以相对O.D. 490-650nm给出(图30A)。另外，我们按前述(Skjoedt 等，2009)测量了 MBL, Ficolin-2 和-3 的血清浓度。我们发现MAP-I以与MBL，Ficolin-2和-3复合存在。然而，似乎MAP-I的主要部分与ficolins、且特别是Ficolin-3 (P < O. 0001)缔合，该模式先前关于MASP-3也已经观察到过(Skjoedt 等，2009)。我们针对相对缔合水平绘制MAP-1，MBL, Ficolin-2和_3的血清浓度，并且发现MAP-I与MBL之间的缔合与MBL水平高度相关(Spearman r :0. 92，p < O. 0001)(图30B,顶部右手侧)。与这相反，与Ficolin-2和-3的相对MAP-I缔合与MAP-I血清水平相关(Spearman r :分别为O. 45和O. 61，p < O. 0001，图30B左手侧)。尽管我们观察到在MAP-1浓度和同MBL的相对缔合以及Ficol in-3浓度之间的某种相关性，但是这种趋势较不明显。 密度梯度分级为了研究MAP-I关于缔合的分子的分布和检验有多少表现为不缔合的，我们将正常的人血清使用10-30%蔗糖梯度和超离心进行密度分级。随后，通过ELISA分析收集的级分的MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和_3 (图31A)，通过蛋白质印迹分析收集的级分的獻？-1，嫩5 -1，-2和-3，8嫩卩，]\^1^卩化01111-2和-3(图31B)。结果显示，血清MAP-1仅存在于具有ficolins和MBL的级分中，这表明MAP-I不作为未缔合的分子存在。对于sMAP，MASP-1, -2和-3观察到相同的模式。另外，数据表明，MAP-1, sMAP和MASP-1，-2和-3的大部分共同定位在Ficolin-3的峰值级分中。这种分布还通过在sephadex_200柱上的大小排阻层析进行分析。观察到分子的等价分布模式(数据未显示)。最后，我们评估蔗糖梯度级分激活外源应用的C4的能力。使用固相甘露聚糖和乙酰化的BSA分别作为关于MBL和Ficolin-3的配体。我们观察到两条不同的C4沉积曲线，这反映通过蔗糖梯度分离的Ficolin-3和MBL复合物的峰(图31C)。讨论为了研究结构方面和确定新型MBL/Ficolin相关蛋白I(MAP-I)的血清水平，我们表达了无标记的重组MAP-I，并且产生针对其的特异性抗体。N-糖苷酶F处理和SDS-PAGE分析表明MAP-I被糖基化，这产生具有N-聚糖的 45kDa的分子量，并且在去糖基化后分子量为 40kDa，这等价于由不具有信号肽的推定氨基酸序列计算的分子量。
我们使用针对MAP-I特异性C末端产生的单克隆抗体来建立定量MAP-1 ELISA，并且确定100名健康丹麦献血者中的血清浓度范围。在捐献者组中，我们发现较MASP-3浓度(平均6500ng/ml)相对低的血清浓度(平均240ng/ml,范围115_466ng/ml)。另外,在两种蛋白的血清浓度之间没有相关性，这表明，尽管这两种分子是同一基因的不同剪接变体，但是表达调控是不同的。近来，记述了 MASP-1，-3和MAP-I组织分布的显著不同(Degn等，2009 ；Skjoedt等，2010)。在MASP-3和MAP-I之间血清浓度的主要差异的发现进一步支持来源于MASPl基因的转录变体的调控机制不同的观点。我们开发了基于ELISA的测定法来分别评估血清MAP-1与MBL，Ficolin-2和_3之间的相对缔合。另外，我们确定Ficolin-2，-3和MBL的血清浓度，从而使其与相对缔合水平相关。结果表明，MAP-I主要与Ficolin-3和Ficolin-2缔合，与MBL的相对缔合表现得较不明显。可以争辩说这种分布反映MBL，Ficolin-2和-3平均血清浓度的差异。然而，尽管MBL-MAP-I缔合与MBL浓度相关，对于Ficolin-2，其中MAP-I血清浓度与同Ficolin-2的缔合水平相关，同样不明显。Ficolin-3和MAP-I之间的相对缔合与MAP-I血清浓度高度相关，而与Ficolin-3血清水平的正相关性很弱。上述发现表明，MAP-I与Ficolin-2和-3之间的主要缔合不仅仅是由于相对较高的Ficol in-2和-3浓度。通过分析进行密度梯度分 离的血清，进一步证实了这种分布模式。我们发现一种清楚的趋势不仅MAP-1，而且sMAP，MASP-I，-2和-3与Ficol in-3峰值级分共同定位。这是我们先前对于MASP-3所观察到的现象(Skjoedt等,2009)。Ficolin-3和MBL峰值级分的分离还通过在乙酰化BSA (Ficolin-3配体)和甘露聚糖(MBL配体)上激活外源加入的C4的能力进行评估。在这两种不同的活化表面上的C4沉积清楚地表明包含MBL或Ficolin-3复合物的不同的峰值级分。蔗糖梯度密度分析的数据还表明，对于MBL的表面与质量比率高于Ficolin-2和Ficolin-3的，这支持最近的研究的观察结果，其表明MBL在四级结构中具有非常松散和开放的构象(Jensenius等,2009)。然而，ficolins的较小的表面与质量比率也可能反映具有缔合的分子如MAP-1、sMAP和MASPs的分子分布。在这一方面，与MAP-1/sMAP/MASPs缔合越多可能导致更高的质量和通过密度梯度的进一步迁移。总之，我们已经表明，与MASP-3相比，MAP-I以低血清浓度存在，并且MAP-I主要以与ficolins的复合物进行循环，但是在某种程度上也与MBL的复合物进行循环。此外，我们可能证明，在LCP识别分子中，Ficolin-3似乎是主要的MAP-I缔合分子。
SEQ ID NO :1.人FAP的完整的380个氨基酸的序列。(突出显示了在氨基酸位置49和178鉴定的两个潜在的糖基化位点)。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYF 320FKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO :2.人FAP的完整的cDNA核苷酸序列。atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagο βββοββ βtgtttggccagatccagtcgcctggttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtcccagatgggtttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttggaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaaggtagaaactgaggaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggaggtggtcctctcccctggctccttcatgtccatcactttccggtcagatttctccaatgaggagcgtttcacaggctttgatgcccactacatggctgtggatgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccacaactacattggcggctactactgctcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagtgcagtgacaacctcttcactcaaaggactggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctgaatgcctgtataccatcgagctggaggagggtttcatggtcaacctgcagtttgaggacatatttgacattgaggaccatcctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatcaaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaagccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgatcctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctggaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctacagcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaagccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggctacaaagtgctgaaggataatgtggagatggacacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcccacctgtaaaaaaaatgaaatcgatctggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtgaSEQ NO :3.包含CUB1-EGF-CUB2结构域的ficolin相关多肽的最小序列，其包含氨基酸1-19的信号肽。该序列对应于外显子2至外显子6。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFE DIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAASEQ ID NO :4. FAP特有的末端17个氨基酸KNEIDLESELKSEQVTESEQ ID NO :5 人 MASP-1 的蛋白质序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKM.NNNTGIYTCSAQGVWMNKVLGRSLPTCLPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPffIAM,Sffl,NGQPFCGGSLLGSSffIVTAAHCLHQSLDPEDPTLRDSDLLSPSDFKIILGKHffRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGPQQEGAMVIVSGWGKQFLQRFPETLNEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGGPMVTLNRERGQWYLVGTVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRNSEQ ID NO :6 人 MASP-1 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTCCMTGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGGGAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACMCTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACATCCTCCACACAGACMCAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAMCCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC
GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCMGATCAAAGTTGGTCCAAMGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGMAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACMCTCGGGAGAGAACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAMTGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATGGGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCMGTATTTCTTCAMGACCMGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGMGGATGGGACGTGGAGTAACMGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGMCACGGGCTGATCACCTTCTCTACMGGMCAACCTCACCACATACMGTCTGAGATCAMTACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACM GATGCTCMCAATMCACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGGAGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCTTCAATGGACGCCCAGCCCAGAMGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCCCTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGATCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTCGATCCGGMGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGACTTCAAMTCATCCTGGGCAAGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAMCACACCACTCTCCACCCCCAGTATGATCCCAACACATTCGAGAATGACGTGGCTCTGGTGGAGCTGTTGGAGAGCCCAGTGCTGMTGCCTTCGTGATGCCCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGMGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGGGGAAGCAGTTCTTGCAAAGGTTCCCAGAGACCCTGATGGAGATTGAMTCCCGATTGTTGACCACAGCACCTGCCAGMGGCTTATGCCCCGCTGMGAAGAAAGTGACCAGGGACATGATCTGTGCTGGGGAGMGGMGGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATAGAGAAAGAGGCCAGTGGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGMGGACCGCTACGGAGTATACTCTTACATCCACCACAACMGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGMCTGAATTTGGCTCCTCAGCCCCAGCACCACCAGCTGTGGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCTTTCCTTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATCCATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTCACTCTCTTTAAAGAGATGGAGCAAGAGAGTGGTCAGMCACAGGCCGAATCCAGGCTCTATCACTTACTAGTTTGCAGTGCTGGGCAGGTGACTTCATCTCTTCGAACTTCAGTTTCTTCATMGATGGAMTGCTATACCTTACCTACCTCGTAAAAGTCTGATGAGGAAMGATTAACTAATAGATGCATAGCACTTAACAGAGTGCATAGCATACACTGTTTTCMTAMTGCACCTTAGCAGMGGTCGATGTGTCTACCAGGCAGACGAAGCTCTCTTACAAACCCCTGCCTGGGTCTTAGCATTGATCAGTGACACACCTCTCCCCTCMCCTTGACCATCTCCATCTGCCCTTAMTGCTGTATGCTTTTTTGCCACCGTGCAACTTGCCCMCATCMTCTTCACCCTCATCCCTAAAAMGTAAMCAGACAAGGTTCTGAGTCCTGTGGTATGTCCCCTAGCAAATGTMCTAGGAACATGCACTAGATGACAGATTGCGGGAGGGCCTGAGAGMGCAGGGACAGGAGGGAGCCTGGGGATTGTGGTTTGGGMGGCAGACACCTGGTTCTAGAACTAGCTCTGCCCTTAGCCCCCTGTATGACCCTATGCMGTCCTCCTCCCTCATCTCAMGGGTCCTCAAAGCTCTGACGATCTAAGATACMTGMGCCATTTTCCCCCTGATAAGATGAGGTAAAGCCMTGTAACCAAAAGGCAAAMTTACMTCGGTTCAMGGMCTTTGATGCAGACAAMTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGAAATACCCACCCCTTTCCACTACGGGTGGGTTCCCMGGACATGGGACAGGCAAAGTGTGAGCCAAAGGATCCTTCCTTATTCCTMGCAGAGCATCTGCTCTGGGCCCTGGCCTCCTTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGTGGGCCCTGGTAGTTTGTACCCCAGGCCCCTATACTCTTCCTTCCTATGTCCACAGCTGACCCCMGCAGCCGTTCCCCGACTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAACTCCCTCATCTTGCMGGCCATMGTGTTTTCCAAGCAAMTGCCTCTCCCATCCTCTCTCAGGAAGCTTC
TAGAGACTTTATGCCCTCCAGAGCTCCMGATATMGCCCTCCAAGGGATCAGAAGCTCCMGTTCCTGTCTTCTGTTTTATAGAMTTGATCTTCCCTGGGGGACTTTAACTCTTGACCTGTATGCAGCTGTTGGAGTAATTCCAGGTCTCTTGAAAAAAMGAGGMGATAATGGAGAATGAGAACATATATATATATATATTAAGCCCCAGGCTGAATACTCAGGGACAGCAATTCACAGCCTGCCTCTGGTTCTATAAACMGTCATTCTACCTCTTTGTGCCCTGCTGTTTATTCTGTMGGGGMGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATCAGACACTTGTCAAGCTAGCAGAAACTCCATTTTCAATGCCAMGAAGMCTGTAATGCTGTTTTGGMTCATCCCAAGGCATCCCMGACACCATATCTTCCCATTTCAAGCACTGCCTGGGCACACCCCMCATCCCAGGCTGTGGTGGCTCCTGTGGGAACTACCTAGATGMGAGAGTATCATTTATACCTTCTAGGAGCTCCTATTGGGAGACATGAAACATATGTAATTGACTACCATGTMTAGAACAAACCCTGCCAAGTGCTGCTTTGGAMGTCATGGAGGTAMAGAAAGACCATTCSEQ ID NO :7 人 MASP-3 的蛋白质序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKTKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGTYTCSAQGVWMNKVL GRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRNAEPGLFPWQALIVVEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRRDTTVIPVSKEHVTVYLGLHDVRDKSGAVNSSAARVVLHPDFNIQNYNHDTALVQLQEPVPLGPHVMPVCLPRLEPEGPAPHMLGLVAGffGISNPNVTVDETISSGTRTLSDVLQYVKLPVVPHAECKTSYESRSGNYSVTENMFCAGYYEGGKDTCLGDSGGAFVIFDDLSQRffVVQGLVSWGGPEECGSKQVYGVYTKVSNYVDWVWEQMGLPQSVVEPQVERSEQ ID NO :8 人 MASP-3 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC6b
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GAAAAAGAAMGACCCACACTGTGTCCTGCTGTGCTTTTGGGCAGGAAMTGGAAGAAAGAGTGGGGTGGGCACATTAGMGTCACCCAMTCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAGMTCCACCCCGCAGGATGTTCAGAGGGACCCACTCCTTCATTTTTCAGAGTCAAAGGAATCAGAGGCTCACCCATGGCAGGCAGTGAAAAGAGCCAGGAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCCCAACTGGCTGTATAACCTTTGAAAAATCATTTTCTTTGTCTGAGTCTCTGGTTCTCCGTCAGCAACAGGCTGGCATMGGTCCCCTGCAGGTTCCTTCTAGCTGGAGCACTCAGAGCTTCCCTGACTGCTAGCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGCTGATTGTTCTCCTTCTCCCTGGAGCTCTCTCTCCTGAAMTCTCCATCAGAGCAAGGCAGCCAGAGMGCCCCTGAGAGGGMTGATTGGGMGTGTCCACTTTCTCAACCGGCTCATCAMCACACTCCTTTGTCTATGAATGGCACATGTAMTGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATATGCTTCACCATTCTGTAAAGGGCCTCTGCATTGTTGCTCCCATCAGGGGTCTCMGTGGAMTAMCCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAMAAAAAMSEQ ID NO :9人MASP-2的蛋白质序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl.CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGFAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQTDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGYELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCEPVC GLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTMGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRLSPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNMVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWFVGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIENIISDF
SEQ ID NO : 10 人 MASP-2 的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGCCCTGTGCTCCGGCCAGGTCTTCACCCAGAGGTCTGGGGAGCTCAGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAACTCTCCAGTTGCACTTACAGCATCAGCCTGGAGGAGGGGTTCAGTGTCATTCTGGACTTTGTGGAGTCCTTCGATGTGGAGACACACCCTGAMCCCTGTGTCCCTACGACTTTCTCAAGATTCAAACAGACAGAGAAGMCATGGCCCATTCTGTGGGMGACATTGCCCCACAGGATTGAMCAAAMGCMCACGGTGACCATCACCTTTGTCACAGATGMTCAGGAGACCACACAGGCTGGMGATCCACTACACGAGCACAGCGCAGCCTTGCCCTTATCCGATGGCGCCACCTAATGGCCACGTTTCACCTGTGCMGCCAMTACATCCTGAAAGACAGCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTGGCTATGAGCTTCTGCAAGGTCACTTGCCCCTGAAATCCTTTACTGCAGTTTGTCAGAMGATGGATCTTGGGACCGGCCAATGCCCGCGTGCAGCATTGTTGACTGTG
GCCCTCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTGGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAMGCTGTGATTCAGTACAGCTGTGAAGAGACCTTCTACACMTGAAAGTGMTGATGGTAMTATGTGTGTGAGGCTGATGGATTCTGGACGAGCTCCAMGGAGAAAMTCACTCCCAGTCTGTGAGCCTGTTTGTGGACTATCAGCCCGCACAACAGGAGGGCGTATATATGGAGGGCAAMGGCAAAACCTGGTGATTTTCCTTGGCMGTCCTGATATTAGGTGGMCCACAGCAGCAGGTGCACTTTTATATGACMCTGGGTCCTAACAGCTGCTCATGCCGTCTATGAGCAAAAACATGATGCATCCGCCCTGGACATTCGMTGGGCACCCTGAAAAGACTATCAC
CTCATTATACACAAGCCTGGTCTGAAGCTGTTTTTATACATGMGGTTATACTCATGATGCTGGCTTTGACMTGACATAGCACTGATTAAATTGMTAACAAAGTTGTAATCAATAGCAACATCACGCCTATTTGTCTGCCAAGAAMGAAGCTGAATCCTTTATGAGGACAGATGACATTGGMCTGCATCTGGATGGGGATTAACCCAMGGGGTTTTCTTGCTAGAAATCTMTGTATGTCGACATACCGATTGTTGACCATCAAAMTGTACTGCTGCATATGAAAAGCCACCCTATCCAAGGGGAAGTGTMCTGCTAACATGCTTTGTGCTGGCTTAGAMGTGGGGGCAAGGACAGCTGCAGAGGTGACAGCGGGGGGCACTGGTGTTTCTAGATAGTGAMCAGAGAGGTGGTTTGTGGGAGGMTAGTGTCCTGGGGTTCCATGAATTGTGGGGAAGCAGGTCAGTATGGAGTCTACACAAAAGTTATTAACTATATTCCCTGGATCGAGMCATMTTAGTGATTTTTMCTTGCGTGTCTGCAGTCAAGGATTCTTCATTTTTAGAMTGCCTGTGMGACCTTGGCAGCGACGTGGCTCGAGMGCATTCATCATTACTGTGGACATGGCAGTTGTTGCTCCACCCAAAAAAACAGACTCCAGGTGAGGCTGCTGTCATTTCTCCACTTGCCAGTTTMTTCCAGCCTTACCCATTGACTCAAGGGGACATAMCCACGAGAGTGACAGTCATCTTTGCCCACCCAGTGTAATGTCACTGCTCAAATTACATTTCATTACCTTAAAMGCCAGTCTCTTTTCATACTGGCTGTTGGCATTTCTGTAAACTGCCTGTCCATGCTCTTTGTTTTTAMCTTGTTCTTATTGAAAAAMAAAAAAAAAASEQ ID NO :11 人 sMAP(MApl9)的蛋白质序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl,CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSEQSLSEQ ID NO :12 人 sMAP(MApl9)的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGAGCAGAGCCTCTAGCCTCCCCTGGAGCTCCGGCCTGCCCAGCAGGTCAGMGCCAGAGCCAGCCTGCTGGCCTCAGCTCCGGGTTGGGCTGAGATGGCTGTGCCCCAACTCCCATTCACCCACCATGGACCCAATAATAAACCTGGCCCCACCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAADNA 引物SEQ ID NO :13 :5' -gcacccagagccacagtg-3'SEQ ID NO :14 :5' -gccttccagtgtgtgggc-31
SEQ ID NO : 15 :5_gccttccagagtgtggtca_3'SEQ ID NO :16 :5' -cgatctggagagcgaactc-3!SEQ ID NO :17 5f -ctgttcttcacactggctg-3fSEQ ID NO :18 :5' -ctgctgagatcatgttgttc-3f SEQ ID NO :19 :5' -TTATACGACTCACTA-3'
权利要求
1.分离的ficolin-相关多肽。
2.按照权利要求I的多肽，其基本上是纯的。
3.按照权利要求I或2的多肽，其中所述多肽能够与甘露糖结合凝集素(MBL)缔合。
4.按照权利要求1-3中任一项的多肽,其中所述多肽能够与ficolin-1,ficolin-2,或ficolin-3中的任一种相缔合。
5.按照权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述多肽能够与Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CL-Ll中的任一种相缔合。
6.按照权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述多肽能够与特异性接受体蛋白，诸如特异性受体相缔合。
7.按照权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 3的氨基酸序列20-297、或其功能性变体。
8.按照权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 1的氨基酸序列20-380、或其功能性变体。
9.按照权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO 9的氨基酸序列16-296或其功能性变体。
10.按照权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述多肽在非还原条件下在SDS-PAGE上具有约40kDa的分子量。
11.按照权利要求1-8或10中任一项的多肽，其中所述多肽在与选自SEQNO 1的49和178的位置相对应的一个或两个氨基酸处被N-连接糖基化。
12.按照权利要求1-11中任一项的多肽，其中所述多肽是重组蛋白。
13.按照权利要求1-12中任一项的多肽，其中所述多肽是同型二聚体形式的。
14.按照权利要求1-8、10-13中任一项的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO I的氨基酸序列20-380组成。
15.按照权利要求1-14中任一项的多肽，其包含SEQID NO 4的氨基酸序列或其变体或免疫学片段。
16.包含SEQID NO 4的氨基酸序列或其变体或免疫学片段的多肽。
17.按照权利要求16的多肽，其由SEQID NO :4、或其变体或免疫学片段组成。
18.按照权利要求1-17中任一项的多肽，其中所述多肽介导濒死细胞或死亡细胞、和/或细胞碎片的吞噬，所述濒死细胞或死亡细胞诸如凋亡细胞。
19.按照权利要求1-18中任一项的多肽，其中所述多肽介导微生物的吞噬。
20.按照权利要求1-19中任一项的多肽，其中所述多肽具有与具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述其它蛋白如吞没衔接蛋白(GULP)。
21.特异性结合按照权利要求1-20中任一项的多肽的抗体。
22.编码权利要求1-20中任一项的多肽的分离的核酸分子。
23.包含与SEQNO :2的序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的分尚的核酸分子。
24.包含按照权利要求22-23中任一项的分离的核酸分子的载体。
25.包含按照权利要求24的载体的宿主细胞。
26.按照权利要求25的宿主细胞，其是真核细胞。
27.按照权利要求26的宿主细胞，其是哺乳动物来源的。
28.按照权利要求27的宿主细胞，其中所述细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和BHK细胞组成的组。
29.产生如权利要求1-20中任一项定义的多肽的方法，所述方法包括在允许多核苷酸构建体表达的条件下在适合的生长培养基中培养如权利要求25-28中任一项定义的细胞，并且从所述培养基中回收得到的多肽。
30.包含如权利要求1-20中任一项定义的多肽的组合物。
31.包含如权利要求1-20中任一项定义的多肽的药物组合物。
32.检测生物学样品中的如权利要求1-20中任一项定义的多肽的方法，所述方法包括 a)获得生物学样品； b)使所述生物学样品与按照权利要求21的抗体接触；并且 c)如果有的话，检测所述抗体与所述多肽的复合物； 作为所述样品中存在所述多肽的指示。
33.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用作药物。
34.如权利要求1-20中任一项定义的多肽用于制备药物的用途。
35.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证。
36.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗任意自体免疫性病症，诸如艾迪生病，自体免疫性溶血性贫血，自体免疫性甲状腺炎，局限性回肠炎，格雷夫斯病，吉兰-巴雷综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，多发性硬化病，重症肌无力，银屑病，原发性胆汁性肝硬变，类风湿性关节炎和葡萄膜炎，哮喘，动脉粥样硬化，I型糖尿病，银屑病，各种过敏症。
37.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗选自由下列组成的组的任意炎性病症阑尾炎，消化性溃疡，胃溃疡，十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃疡性结肠炎，假膜性结肠炎，急性结肠炎，缺血性结肠炎，憩室炎，会厌炎，失弛缓症，胆管炎，胆囊炎，肝炎，局限性回肠炎，肠炎，惠普尔病，过敏症，免疫复合物病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉症,脓毒症,败血病，内毒素性休克,恶病质,高烧,嗜酸性肉芽肿，肉芽肿病，肉瘤样病,感染性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道炎，支气管炎，肺气肿，鼻炎，肺炎，肺尘病，肺泡炎，毛细支气管炎，咽头炎，胸膜炎，窦炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，弥散性菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，包虫囊肿，烧伤，皮炎，皮肌炎，晒伤，荨麻疫，抚，风疹块，血管炎，脉管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉粥样硬化，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，结节性动脉周围炎，风湿热，阿尔茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合征，脑膜炎，脑炎，多发性硬化病，脑梗死，脑栓塞，吉兰-巴雷综合征，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，葡萄膜炎，关节炎，关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛风，牙周病，类风湿性关节炎，滑膜炎，重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑性狼疮，肺出血肾炎综合征，贝赫切特综合征，同种异体移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，强直性脊柱炎，贝格尔病，莱特尔综合征和霍奇金病，角膜炎，2型糖尿病，囊性纤维化，心肌梗死，再灌注损伤，中风，皮肌炎，代谢综合征，系统性炎症反应综合征，脓毒症，多器官衰竭，弥漫性血管内凝血，过敏性休克，血管并发症和与I型和/或2型糖尿病相关的肾病，脑膜炎，细菌性败血病，并发性疟疾，非典型的溶血性尿毒症综合征，溶血性尿毒症综合征，年龄相关的黄斑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，蛇毒咬伤，烧伤，和器官移植并发症。
38.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗选自由下列组成的组的任意炎性病症器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，血管炎，心内膜炎，动脉粥样硬化，血栓性静脉炎,心包炎,心肌炎,心肌缺血,结节性动脉周围炎，风湿热，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合征，脑梗死，脑栓塞，血管并发症和与I型和/或2型糖尿病相关的肾病。
39.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的任意适应证。
40.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病或病症有关的适应证，包括炎性反应和与纤维蛋白形成有关的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,诸如深静脉血栓形成,动脉血栓形成,术后血栓形成，冠状动脉旁路移植(CABG)，经皮透皮冠状血管成形(PTCA)，血小板沉积中风，肿瘤生长，肿瘤转移，血管发生，血栓溶解，动脉粥样硬化，再狭窄，如动脉硬化和/或血管成形后的再狭窄，急性和慢性适应证，如炎症，脓毒症，脓毒性休克，败血病，低血压，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，系统性炎症反应综合征(SIRS)，弥散性血管内凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉积，心肌梗死，或用于预防性治疗具有动脉粥样硬化血管的哺乳动物，所述哺乳动物有风险患有血栓形成,外周血祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞病，溶血性尿毒症综合征(HUS)，和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，和风湿热。
41.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病或病症有关的适应证，包括炎性反应和与纤维蛋白形成有关的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,诸如深静脉血栓形成,动脉血栓形成,术后血栓形成，冠状动脉旁路移植(CABG)，经皮透皮冠状血管成形(PTCA)，血小板沉积中风，肿瘤生长，肿瘤转移，血管发生，血栓溶解，动脉粥样硬化，再狭窄，如动脉硬化和/或血管成形后的再狭窄，急性和慢性适应证如炎症，病理性血小板沉积，心肌梗死，或用于预防性治疗具有动脉粥样硬化血管的哺乳动物，所述哺乳动物有风险患有血栓形成，外周血祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞病，溶血性尿毒症综合征(HUS)，和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，和风湿热。
42.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于预防在鉴定的高危患者中发生血栓栓塞并发症，所述鉴定的高危患者如经历手术的那些或患有充血性心力衰竭的那些。
43.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与心脏相关的医学病症。
44.如权利要求1-20中任一项定义的多肽，其用于治疗与ficolin-相关多肽缺乏有关的医学病症。
45.用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
46.用于治疗任意自体免疫性疾病或与自体免疫性表现有关的疾病的方法，所述疾病如艾迪生病，自体免疫性溶血性贫血，自体免疫性甲状腺炎，局限性回肠炎，格雷夫斯病，吉兰-巴雷综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，多发性硬化病，重症肌无力，银屑病，原发性胆汁性肝硬变，类风湿性关节炎和葡萄膜炎，哮喘，动脉粥样硬化，I型糖尿病，银屑病，和各种过敏症，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求.1-20中任一项定义的多肽。
47.用于治疗选自由下列组成的组的任意炎性病症的方法阑尾炎，消化性溃疡，胃溃疡，十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃疡性结肠炎，假膜性结肠炎，急性结肠炎，缺血性结肠炎，憩室炎，会厌炎，失弛缓症，胆管炎，胆囊炎，肝炎，局限性回肠炎，肠炎，惠普尔病，过敏症,过敏性休克,免疫复合物病,器官缺血,再灌注损伤,器官坏死,花粉症,脓毒症,败血病，内毒素性休克，恶病质，高烧，嗜酸性肉芽肿，肉芽肿病，肉瘤样病，感染性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道炎，支气管炎，肺气肿，鼻炎，肺炎，肺尘病，肺泡炎，毛细支气管炎，咽头炎，胸膜炎，窦炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，弥散性菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，包虫囊肿，烧伤，皮炎，皮肌炎，晒伤，荨麻疹，疣，风疹块，血管炎，脉管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉粥样硬化，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，结节性动脉周围炎，风湿热，阿尔茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合征，脑膜炎，脑炎，多发性硬化病，脑梗死，脑栓塞，吉兰-巴雷综合征，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，葡萄膜炎，关节炎，关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛风，牙周病，类风湿性关节炎，滑膜炎，重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑性狼疮，肺出血肾炎综合征，贝赫切特综合征，同种异体移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，强直性脊柱炎，贝格尔病，莱特尔综合征和霍奇金病；所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
48.用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的任意适应证的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
49.用于治疗与凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病或病症有关的适应证，或用于预防性治疗具有动脉粥样硬化血管有风险患有血栓形成、外周血祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞病、溶血性尿毒症综合征(HUS)、和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的哺乳动物的方法，所述适应证包括炎性反应和与纤维蛋白形成有关的慢性血栓栓塞疾病或病症，包括血管病症,如血栓形成,诸如深静脉血栓形成,动脉血栓形成,术后血栓形成,冠状动脉旁路移植(CABG)，经皮透皮冠状血管成形(PTCA)，血小板沉积中风，肿瘤生长，肿瘤转移，血管发生，血栓溶解，动脉粥样硬化，再狭窄，如动脉硬化和/或血管成形后的再狭窄，急性和慢性适应证，如炎症，脓毒症，脓毒性休克，败血病，低血压，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，系统性炎症反应综合征(SIRS)，弥散性血管内凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉积，心肌梗死，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
50.用于预防在鉴定的高危患者中发生血栓栓塞并发症的方法，所述高危患者如经历手术的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
51.用于治疗与心脏相关的医学病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
52.用于治疗与ficolin-相关多肽缺乏有关的医学病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽。
53.在严格条件下能够与权利要求22-23中任一项的核酸序列杂交的核酸探针。
54.检测生物学样品中存在编码权利要求1-20中任一项定义的多肽的核酸的方法，所述方法包括 a)获得生物学样品； b)使所述生物学样品与权利要求53的核酸探针接触；并且 c)如果有的话，检测所述核酸探针与编码所述多肽的所述核酸的复合物； 作为在所述样品中存在编码所述多肽的所述核酸的指示。
55.诊断与ficolin-相关多肽异常表达有关的病症的方法，所述方法包括获得来自患者的生物学样品，并且测量所述生物学样品中所述ficolin-相关多肽的表达，其中，与对照相比，所述生物学样品中所述ficolin-相关多肽增加或减少的表达表示所述患者患有与ficolin-相关多肽异常表达有关的病症。
56.分离的组合物，其包括如权利要求1-20中任一项定义的多肽与选自下列的一种或多种蛋白的组合Ficolin-l、2、3，甘露糖结合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CL-Ll。
57.按照权利要求56的组合物，其是药物组合物。
58.如权利要求57定义的药物组合物，其用作药物。
59.如权利要求56定义的组合物用于制备药物的用途。
60.如权利要求57定义的药物组合物，其用于治疗与炎症、凋亡和/或自体免疫性相关的任意适应证。
61.如权利要求57定义的药物组合物，其用于治疗如权利要求36-44中任一项定义的任意适应证。
62.用于治疗如权利要求35-44中任一项定义的任意适应证的方法,所述方法包括同时或顺次施用治疗或预防有效量的如权利要求1-20中任一项定义的多肽和一种或多种选自Ficolin-l、2、3，和甘露糖结合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和细胞内胶原样防御分子，诸如CL-Ll的蛋白。
63.如权利要求1-20中任一项定义的多肽作为血液和组织中的生物标记的用途，用于恶性疾病，诸如癌症疾病，诸如脑瘤、肝肿瘤和生殖道肿瘤的诊断和/或预后。
64.如权利要求1-20中任一项定义的多肽作为血液和组织中的生物标记的用途，用于如权利要求35-44中任一项定义的自体免疫、代谢和/或炎性病症的诊断和/或预后。
全文摘要
本发明涉及新型ficolin-相关多肽，和衍生于这些ficolin-相关多肽的多肽，其用于治疗与炎症、凋亡、自体免疫性、凝结、血栓形成或凝血病相关的疾病有关的病症的治疗，以及用作生物标记。本发明还涉及识别所述新型ficolin-相关多肽和衍生于其的多肽的抗体、编码所述多肽的核酸分子、用于生产所述多肽的载体和宿主细胞。
文档编号C07K14/47GK102712687SQ201080041321
公开日2012年10月3日 申请日期2010年7月16日 优先权日2009年7月17日
发明者彼得·加雷尔, 米克尔-奥勒·舍尔德, 蒂娜·胡梅尔肖伊·格卢 申请人:丹麦国家医院, 南丹麦大学, 哥本哈根大学