专利名称：一种固相制备戈舍瑞林的方法
技术领域：
本发明涉及ー种多肽药物的制备方法，尤其涉及一种固相制备戈舍瑞林的制备方法。
背景技术：
前列腺癌在欧美是男性癌死亡的主要原因之一。发病率随年龄增长，前列腺癌发病有明显的地区和种族差异，据统计中国人最低，欧洲人最高，非 洲和以色列居间，我国及日本等国家为前列腺癌低发地区，因此有人认为东方人癌细胞生长比西方人缓慢，临床病例较少。另外前列腺癌与环境亦有关系。乳腺癌是人类最常见的ー种恶性肿瘤，各国因地理环境、生活习惯的不同，乳腺癌的发病率有很大差异。北美和北欧大多数国家是女性乳腺癌的高发区，南美和南欧ー些国家为中等，而亚洲、拉丁美洲和非洲的大部分地区为低发区。在北美、两欧等发达国家，女性乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤发病率的首位。乳腺癌在我国各地区的发病率也不相同，在世界上我国虽属女性乳腺癌的低发国。但近年来乳腺癌的发病率明显增高。尤其沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。常用的肿瘤药物主要是化学药物，但其化疗反应副作用大，所以寻找ー种高效、低度的生物药物是大势所趋，目前临床效果较好的是促性腺释放激素类似物(LHRH-a)。戈舍瑞林优点是副作用少，无心血管并发症。戈舍瑞林分子式为=Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。戈舍瑞林及其类似物的制备方法主要是液相合成エ艺，操作复杂，反应步骤多，纯化方法繁琐，不利于エ业生产，应用价值不高，例如美国药物化学杂志J. Med.Chem 121 (10)，1018-1024，1978采用的是4+6片断缩合法，首先采用液相合成法合成保护六肽 Z-Tyr-(Bzl)-D-Ser-Arg (NO2)-Pro-AzaGly-NH2,合成出四肽pGlu-His-Trp-Ser-OMe。将合成出来的四肽片段和六肽片段再次采用叠氮物法合成出戈舍瑞林。虽然在前面短肽的合成中解决了精氨酸保护的问题，但是在脱除六肽保护时将酪氨酸侧链酚羟基和精氨酸侧链胍基上的保护基也脱除掉，在最后ー步接肽时会产生大量副产物，而且副产物性质相差不大，很难分离。US4024248采用3+7片断缩合法。该路线中，首先，液相合成保护三肽pGlu-His-Trp-OMe。再合成七妝 Z-Ser-Tyr-D-Ser G3ut)-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2,分别将三肽片段pGlu-Hi s-Trp-OMe肼解，七肽片段除Z保护基后，采用叠氮法将三肽片段和七肽片段缩合，即得到戈舍瑞林。这种方法分段少，七肽逐步缩合产率很低，并且精氨酸侧链胍基未保护，导致每步缩合出现副产物，每步分离纯化很困难。波兰专利PL194997报道了ー种5+5片断缩合法，首先采用液相合成法，分别合成出ニ肽片段Z-Ser-Tyr-OMe和Z-Pro-AzaGly-NH2,然后分别采用碳链逐步增长法合成出五肽片段pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OMe和D-Ser(But)-Leu-Arg- Pro-AzaGly-NH2,最后将两个五肽片段采用叠氮物法合成出十肽目标化合物戈舍瑞林。由于氨基酸均未进行侧链保护，这样会导致在接下来的缩合过程中均会产生副产物，导致纯化困难。US2010311946A1采用的是2-CTC树脂或者Merrifield树脂，需固液结合法合成戈舍瑞林，并且最后要用到剧毒的试剂K0CN,对环境和药物造成风险；另外，Fmoc-Osu和水合肼合成Fmoc-NH-NH2,实验发现Fmoc-NH-NH2在DMF很难溶解，对固相合成造成很大困难。
发明内容
为了克服上述液相合成技术的缺陷，如反应周期长、副产物多、难以分离、不利于放大生产等等，本发明提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的戈舍瑞林的固相制备エ艺。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种制备戈舍瑞林的方法，其特征在于:
1)由N，N- ニ琥珀酰亚胺碳酸酯和替代度范围为0. 2-1. 2mmol/g的酸敏感性氨基树脂在有机弱碱性催化剂下偶联；
2)用水合肼与步骤I)所得树脂反应得到Azagly-Resin；
3)用Fmoc-Pro-OH 与 Azagly-Resin 在偶联剂的作用下得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin ；
4)将Fmoc-Pro-Azagly-Resin与Fmoc保护氨基酸和偶联剂按照戈舍瑞林肽序逐一偶联的方式合成得到戈舍瑞林-Resin ；
5)对戈舍瑞林-Resin进行裂解，脱除侧链保护，得到粗肽经过液相纯化、冻干得到戈舍瑞林。步骤1)，其中，所述的酸敏感性氨基树脂包括Sieber Resin、Sieber-AM Resin,树脂的替代度范围优选0. 3-0. 9mmol/g,更优选0. 4-0. 8 mmol/g ;由于戈舍瑞林具有D-Ser侧链tBu的结构，本发明的技术方案对树脂要求比较高，需要使用酸敏感性氨基树脂；如果使用其他类型的树脂，在裂解时D-Ser的侧链tBu容易受到破坏，不能实现本发明的目的。酸敏感性氨基树脂优选Sieber树脂、Sieber-AM树脂。本发明申请人发现，树脂的替代度低于0.2mmol/g时，需要的树脂量过大，大量的树脂应用使产品的成本提升；当树脂的替代度大于I. 2mmol/g时，偶联反应发生不完全，生成缺省肽，不仅使纯化工艺变得极为复杂，同时最终产物的纯度不高。经过申请人刻苦攻关，意外地发现当树脂的替代度为0. 2-1. 2mmol/g时，在产业化中可以满意的平衡产品的纯度与成本间的关系。申请人进ー步发现，当树脂的替代度范围为0. 3-0. 9mmol/g时产品纯度和成本更加符合产业化的要求；替代度在0. 4-0. 8 mmol/g时，更加理想。N，N - ニ琥珀酰亚胺碳酸酯的用量为3-10倍于酸敏感性氨基树脂；
申请人:意外地发现，当N，N - ニ琥珀酰亚胺碳酸酯用量少于3倍，会致使反应不完全，导致纯化难度加大，同时反应时间太长，致使产品成本升高；N，N - ニ琥珀酰亚胺碳酸酯用量高于10倍时，超出了反应所需要的用量，剰余的N，N - ニ琥珀酰亚胺碳酸酯増加了纯化的难度，使エ艺变得复杂。、
所述的催化剂是有机弱碱，优选三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP, DIPEA ;更优选是DMAP ；
申请人:发现，本发明对催化剂的碱性要求较为苛刻，需要在有机弱碱的条件下进行，意外地发现，三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP, DIPEA的碱性对本发明有良好的催化效果，使反应时间明显缩短，并提高了反应物的利用率，其中DMAP碱性最合适，催化效果最好。步骤2)用水合肼与步骤I)所得的树脂反应得到Azagly-Resin ；,反应时间为1-5小时，优选2-5小时。
申请人发现，反应时间小于I小时，反应物反应未充分造成原材料浪费，反应物难以纯化，不能得到理想的产业化结果；反应时间大于5小吋，比如6小吋、10小时等虽然可以实现发明目的，但其合成的效率并没有提高，反而增加了反应时间，使エ艺的时间延长，造成了能源与人力成本的浪费，使产品的成本増加。所以此反应步骤需要摸索最佳的反应时间，即需要平衡反应充分与产品成本之间的关系。经过技术攻关，申请人发现，反应时间为1-5小时是理想的产业化結果，更加优选在2-5小时，这个时间段内平衡反应充分与产品成本的效果更好。3)用 Fmoc-Pro-OH 与 Azagly-Resin 反应得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin,所使用的偶联剂为 DIC + A 或 B + A+C，其中 A 为 HOBt 或 HOAt，B 为 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 为DIPEA 或 TMP。步骤4)所述的 Fmoc 保护氨基酸是 Fmoc-Arg(R1)-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (R2) -OH, Fmoc-Trp (R3)-OH, Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His(Trt)-OH, Pyr-OH。 其中，R1=HCU NO2, H ；R2=H, 2-ClTrt, 4-N02Z, Bzl ；R3=H,
2-ClTrt ； R4=H, Trt。
其中，中氨基酸的偶联剂为DIC + A或B + A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU, TBTU 或 PyBOP，C 为 DIPEA 或 TMP。申请人:发现偶联剂对本发明有着关键的影响，有些偶联剂会产生消旋的现象，有些偶联剂收率不高。选择減少消旋同时偶联收率高的偶联剂是ー个需要解决的技术问题。经过发明人的研究，意外地发现偶联剂为DIC + A或B + A+C，其中A为HOBt或H0At，B为HBTU, HATU, TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP符合本发明的技术要求。步骤5)裂解试剂是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的体积比例(V:V)为1-15%，优选3-10% ;ニ氯甲烷的体积比例(V:V)为75-85%，优选80-85% ;水的体积比例(V:V)为1-5%，优选3-5% ;更优选TFA :ニ氯甲烷=H2O的体积比=10:85:5。脱除侧链其方法为氢化还原和氢转移的方法脱除侧链保护基，氢化还原采用钯碳，兰尼镍，Pt，Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3)3等；氢转移催化，參与反应的供氢体可以是环己烯、环己ニ烯、甲酸、甲酸铵、四氢化萘等。反应可以使用単一供氢体，也可以混合使用。在本发明的一较佳实施例中优选为甲酸铵，另ー实施例采用的是甲酸。与已有技术相比，本发明エ艺具有反应操作简单、后处理容易、原料简单易得、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
权利要求
1.一种制备戈舍瑞林的方法，包含以下步骤 1)由N，N-ニ琥珀酰亚胺碳酸酯和替代度范围为0. 2-1.2mm0l/g的酸敏感性氨基树脂在有机弱碱性催化剂下偶联；其中酸敏感性氨基树脂为Sieber Resin、Sieber-AM Resin ； 2)用水合肼与步骤I)所得的树脂反应得到Azagly-Resin； 3)用Fmoc-Pro-OH 与 Azagly-Resin 在偶联剂的作用下得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin ； 4)将Fmoc-Pro-Azagly-Resin与Fmoc保护氨基酸和偶联剂按照戈舍瑞林肽序逐一偶联的方式合成得到戈舍瑞林-树脂； 5)对戈舍瑞林-Resin进行裂解，脱除侧链保护，得到粗肽经过纯化得到戈舍瑞林。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤I)所述的有机弱碱性催化剂是三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP或DIPEA。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述的“反应”的反应时间为1-5小时。
4.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于步骤3)或步骤4)所述的偶联剂为 DIC + A 或 B + A+C，其中 A 为 HOBt 或 HOAt，B 为 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 为DIPEA 或 TMP。
5.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述的Fmoc保护氨基酸是 Fmoc-Arg (R1) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (R2) -OH, Fmoc-Trp(R3)-OH,Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His (Trt) -OH,Pyr-OH ;其中，R1=HChNOpH ；R2=H, 2-ClTrt,4-N02Z, Bzl ； R3=H, 2-ClTrt ； R4=H, Trt0
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述的Fmoc保护氨基酸是 Fmoc-Arg(R1)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(R2) -OH, Fmoc-Trp(R3)-OH,Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His (Trt) -OH,Pyr-OH ;其中，R1=HChNOpH ；R2=H, 2-ClTrt,4-N02Z, Bzl ； R3=H, 2-ClTrt ； R4=H, Trt0
7.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述的裂解试剂是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的体积比例为1_15%，ニ氯甲烷的体积比例为75-85%，水的体积比例为1-5%。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述的裂解试剂是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的体积比例为1_15%，ニ氯甲烷的体积比例为75-85%，水的体积比例为1_5%。
9.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述的脱除侧链保护，其中脱除侧链其方法为氢化还原以及氢转移的方法脱除侧链保护基，氢化还原采用钯碳，兰尼镍，Pt，Pt/C，PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3)3 ;氢转移催化，參与反应的供氢体是环己烯、环己ニ烯、甲酸、甲酸铵、四氢化萘，供氢体使用単一供氢体活混合使用供氢体。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述的脱除侧链保护，其中脱除侧链其方法为氢化还原以及氢转移的方法脱除侧链保护基，氢化还原采用钯碳，兰尼镍，Pt，Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3) 3 ;氢转移催化，參与反应的供氢体是环己烯、环己ニ烯、甲酸、甲酸铵、四氢化萘，供氢体使用单ー供氢体活混合使用供氢体。
全文摘要
本发明公开了一种固相合成戈舍瑞林的方法，本发明的技术方案包括以下步骤由N，N-二琥珀酰亚胺碳酸酯和Sieber Resin偶联；用水合肼反应得到Azagly-sieberResin；用Fmoc-Pro-OH与Azagly-Sieber Resin偶联；其他氨基酸逐一偶联得到戈舍瑞林-树脂；对戈舍瑞林-SieberResin进行裂解，脱除侧链保护，得到的粗肽经过纯化得到戈舍瑞林。本发明具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
文档编号C07K1/04GK102653555SQ20121015536
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者潘俊锋, 袁建成, 赵忠卫, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司