专利名称：蓖麻蛋白的生物改性工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蓖麻蛋白的生物改性工艺。
背景技术：
蓖麻蛋白是糖蛋白异二聚体，是由全毒素、毒类素、凝集素三种物质组成的蛋白 质，其分子式为_[C8H8N202]n-，分子量64000，蓖麻蛋白为白色粉末或结晶型固体，不溶于乙醇、乙醚、氯仿、甲苯等有机溶剂，溶于稀酸或盐类水溶液。蓖麻蛋白是蓖麻毒素中毒性最强的一种，对各种哺乳动物都有毒，但对昆虫无毒或毒性较低。脱除蓖麻蛋白的方法有基因脱毒采用导入与内源基因有较高同源性的基因可加强内源基因的沉默；采用甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇修饰蓖麻蛋白；加热降低毒性。ZL200810072473. 7公开了一种高效低毒的载蓖麻蛋白毒素A链超声微泡及制备方法，本方法是采用蓖麻毒素A链水溶液加入PLGA-PEG-PLGA溶液及聚乙烯醇水溶液高速搅拌制备成载蓖麻毒素A链超声微泡。200410018033. 5公开了一种利用蓖麻毒素杀伤特定肿瘤细胞的方法，本方法是利用基因重组技术在肿瘤细胞中特异性表达蓖麻毒素B链蛋白，同时注射毒素A链蛋白，从而在肿瘤组织中形成有活性的毒素，杀伤肿瘤细胞。201010552949. 4公开了蓖麻毒素A链密度体的构建及作为候选疫苗抗原，本发明提供的蛋白质是由点突变获得的突变体mRTA，是通过重组表达得到的蓖麻毒素A链突变体蛋白。中国蓖麻的研究处于世界领先地位，每年产量较大，但由于含有毒性物质，限制了蓖麻的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种蓖麻蛋白的生物改进工艺，用蓖麻籽为原料，经过蛋白提取、生物改性，降低了蓖麻蛋白的毒性，扩大了蓖麻蛋白的用途。本发明的目的是通过技术方案实现的1、蓖麻籽浸出油，2、蓖麻蛋白提取，3、诱导生成蓖麻蛋白蛆虫卵；4、蓖麻蛋白幼虫培殖；5、蓖麻蛆虫培育；6、蓖麻蛋白蛆虫分离、清洗与灭活；7、蓖麻蛋白蛆虫干燥与包装。具体步骤如下
(1)蓖麻籽浸出油蓖麻籽去壳、粉碎后浸出油，蓖麻籽柏备用；
(2)蓖麻蛋白提取以蓖麻籽柏为原料提取蓖麻蛋白，即蓖麻籽柏加入去离子水，用缓冲液调整pH=5. 0-7.0，控制温度为25-35°C，时间为l_4h，溶解均匀后加入乙醇或(NH4)2SO4生成沉淀，然后分离固液相，收集固体物，固体物烘干成蓖麻蛋白粉备用；
(3)诱导生成蓖麻蛋白蛆虫卵取IOOg谷糠、10-20g蓖麻蛋白粉、5-10g蛋白胨、5-8gKH2P04混合均匀，喷洒10-20ml纯净水，保持温度25_45°C、时间48_120h，生成虫卵；
(4)蓖麻蛋白幼虫培殖取200-300g蓖麻蛋白粉、10-20g酵母抽提粉、10-15g蛋白胨、10-20gKH2P04、2-5gNaCl、l-5mL氨水，加入I. 0-2. OL纯净水混匀成为蓖麻蛋白幼蛆培养液，分装于20-30个三角烧瓶中，每瓶分别装入O. 2-1. Og前面培殖的虫卵，摇床1-10次/min，培育12-48h，生成含蓖麻蛋白幼蛆培养液；
(5)蓖麻蛆虫培育取2000-5000g蓖麻蛋白粉、500-800g酵母抽提粉、12-15gNH4Cl、O. 1-0. 5gNaCl、50-100gNa2HP04、0. 2-1. 0gCaCl2、10_15L 去离子水搅拌均匀成为蛆虫培育液，用高斯磁感强度处理，加入I. 0-2. OL含蓖麻蛋白幼蛆培养液进行培育，培育出的蓖麻蛋白蛆虫由乳白色变成乳黄色；
(6)蓖麻蛋白蛆虫分离、清洗与灭活将蓖麻蛋白蛆虫放入分离机中分离虫液，用纯净水漂洗，然后用热水喷淋蓖麻蛋白蛆虫，蓖麻蛋白蛆虫被灭活；
(7)蓖麻蛋白蛆虫干燥灭活的蓖麻蛋白蛆虫干燥，得蓖麻蛋白蛆虫成品。蓖麻毒素是蓖麻中主要有毒成分，通过生物改性重组蛋白相对分子量由64KDa增 加到86KDa，并由植物蛋白特性转变成为动物蛋白特性，小鼠急性毒性实验结果表明，蓖麻毒素LD是2. 5-7. 5 μ g/kg,经生物改性的蓖麻素LD为25_28mg/kg,仍具有相似的细胞毒作用，由于重组蓖麻蛋白质既保留了原有的性能，又消除了特异性毒性，因此扩大了蓖麻蛋白的用途。本发明的蓖麻蛋白的生物改性工艺过程易于控制，生产效率高，节能，无环境污染，适合工业化生产。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述。实施例I :
(O晒干蓖麻籽，用蓖麻籽脱壳机脱去壳，然后碾压成饼状物，用粉碎机以400-6001·/min粉碎至O. 2-0. 5mm颗粒。(2) IOOOg蓖麻籽颗粒加入2-10L 6号轻汽油浸出，温度30-50 °C，压力O. 1-0. 5MPa，时间2-5小时。浸出蓖麻籽油并作油净化处理，剩余蓖麻籽柏作为蓖麻蛋白原料备用。(3)蓖麻籽柏在30_50°C烘干l_3h，去除溶剂残留。(4) IOOOg烘干蓖麻籽柏加入2-10L去离子水，用磷酸盐缓冲液调ρΗ=5· 8_7，温度25-35°C，时间2-4h，溶解均匀，加入100-200g(NH4)2SO4生成沉淀，放置l_2h，然后用离心分离机以750-1250r/min分离，收集固体物。(5)固体物用真空干燥机在35_55°C、真空度O. 5_2MPa，烘干至含水份5_8%成蓖麻蛋白备用。(6)取IOOg谷糠、10_20g蓖麻蛋白粉、5-10g蛋白胨、5_8gKH2P04混合均勻，喷洒10-20ml纯净水，保持温度25-45°C、时间48_120h，生成虫卵，用孔径O. 1-2. Omm筛子筛出虫
卵备用。(7)取 200-300g 蓖麻蛋白粉、10_20g 酵母抽提粉、10_15g 蛋白胨、10_20gKH2P04、2-5gNaCl、l-5mL氨水，加入I. 0-2. OL纯净水混匀成为蓖麻蛋白幼蛆培养液，分装于20-30个三角烧瓶中，每瓶分别装入O. 2-1. Og前面培殖的虫卵，摇床1-10次/min，培育12_48h，
生成含蓖麻蛋白幼蛆培养液。(8)取 2000-5000g 蓖麻蛋白粉、500_800g 酵母抽提粉、12_15gNH4Cl、O. l-o. 5gNaCl、50-100gNa2HP04、0· 2-1. 0gCaCl2、10_15L去离子水搅拌均匀。用 10000-15000高斯磁感强度处理3-5min，处理2次后加入I. 0-2. OL含蓖麻蛋白幼蛆培养液进行培育。培育参数温度25-35°C，pH=5. 5-8，搅拌速度 Ι-lOr/min，通气量 O. 5_2L/min，时间 72-120h。培育出的蓖麻蛋白蛆虫由乳白色变成乳黄色，培育过程完成。(9)将培育液及培育出的蓖麻蛋白蛆虫一起放入分离机以转速550_1250r/min分离虫液，用10-20L纯净水漂洗2-3次，用80-100°C热水喷淋蓖麻蛋白蛆虫l_5min，蓖麻蛋白蛆虫被灭活。(10)灭活的蓖麻蛋白蛆虫用真空冷冻 干燥机在温度-30-50°C、时间12_24h、真空度IO-IOOkPa干燥至蓖麻蛋白蛆虫含水分5-8%成为蓖麻蛋白蛆虫成品，其蓖麻蛋白蛆虫含量为95%。(11)蓖麻蛋白蛆虫用铝塑真空包装袋真空包装。实施例2
(O晒干蓖麻籽，用蓖麻籽脱壳机脱去壳，然后用粉碎机以400-600r/min粉碎至O. 2-0. 5mm 颗粒。(2) IOOOg蓖麻籽颗粒用螺旋压榨机以10_60r/min榨出蓖麻籽油及蓖麻籽柏饼，蓖麻籽饼柏备用。(3)1000g蓖麻籽饼柏加入2-10L去离子水，用O. 2moVL磷酸氢二钠-O. lmol/L柠檬酸缓冲液调整pH=5. 0-6. 0，控制温度25-35°C，时间180_210min，搅拌速度10_30r/min，加入5-20L乙醇生成沉淀，放置l_2h，然后用离心分离机以750-1250r/min分离固液相，收集固体物。(4)固体物用真空干燥机在35_55°C、真空度O. 5_2MPa，烘干至含水份5_8%成蓖麻蛋白粉备用。(5)取IOOg谷糠、10_20g蓖麻蛋白粉、5-10g蛋白胨、5_8gKH2P04混合均勻，喷洒10-20ml纯净水，保持温度25-45°C、时间48_120h，生成虫卵，用孔径O. 1-2. Omm筛子筛出虫
卵备用。(6)取 200-300g 蓖麻蛋白粉、10_20g 酵母抽提粉、10_15g 蛋白胨、10_20gKH2P04、2-5gNaCl、l-5mL氨水，加入I. 0-2. OL纯净水混匀，分装于20-30个三角烧瓶中，每瓶分别装入O. 2-1. Og前面培殖的虫卵，摇床1-10次/min，培育12_48h，生成含蓖麻蛋白幼蛆培养液。(7)取 2000-5000g 蓖麻蛋白粉、500_800g 酵母抽提粉、12_15gNH4Cl、O. 1-0. 5gNaCl、50-100gNa2HP04、0· 2-1. 0gCaCl2、10_15L去离子水搅拌均匀。用 10000-15000高斯磁感强度处理3-5min，处理2次后加入I. 0-2. OL含蓖麻蛋白幼蛆培养液进行培育。培育参数温度25-35°C，pH=5. 5-8，搅拌速度 Ι-lOr/min，通气量 O. 5_2L/min，时间 72-120h。培育出的蓖麻蛋白蛆虫由乳白色变成乳黄色，培育过程完成。(8)将培育液及培育出的蓖麻蛋白蛆虫一起放入分离机以转速550-1250r/min分离虫液，用10-20L纯净水漂洗2-3次，用80-100°C热水喷淋蓖麻蛋白蛆虫l_5min，蓖麻蛋白蛆虫被灭活。
(9)灭活的蓖麻蛋白蛆虫用真空冷冻干燥机在温度-30-50°C、时间12_24h、真空 度IO-IOOkPa干燥至蓖麻蛋白蛆虫含水分5-8%成为蓖麻蛋白蛆虫成品，其蓖麻蛋白蛆虫含量为93%。(10)蓖麻蛋白蛆虫用铝塑真空包装袋真空包装。
权利要求
1.蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述生物改性工艺如下 (1)蓖麻籽浸出油蓖麻籽去壳、粉碎后浸出油，蓖麻籽柏备用； (2)蓖麻蛋白提取以蓖麻籽柏为原料提取蓖麻蛋白； (3)诱导生成蓖麻蛋白蛆虫卵取IOOg谷糠、10-20g蓖麻蛋白粉、5-10g蛋白胨、5-8gKH2P04混合均匀，喷洒10-20ml纯净水，保持温度25_45°C、时间48_120h，生成虫卵； (4)蓖麻蛋白幼虫培殖取200-300g蓖麻蛋白粉、10-20g酵母抽提粉、10-15g蛋白胨、10-20gKH2P04、2-5gNaCl、l-5mL氨水，加入I. 0-2. OL纯净水混匀成为蓖麻蛋白幼蛆培养液，分装于20-30个三角烧瓶中，每瓶分别装入O. 2-1. Og前面培殖的虫卵，摇床1-10次/min，培育12-48h，生成含蓖麻蛋白幼蛆培养液； (5)蓖麻蛆虫培育取2000-5000g蓖麻蛋白粉、500-800g酵母抽提粉、12-15gNH4Cl、O.1-0. 5gNaCl、50-100gNa2HP04、0. 2-1. 0gCaCl2、10_15L 去离子水搅拌均匀成为蛆虫培育液，用高斯磁感强度处理，加入I. 0-2. OL含蓖麻蛋白幼蛆培养液进行培育，培育出的蓖麻蛋白蛆虫由乳白色变成乳黄色； (6)蓖麻蛋白蛆虫分离、清洗与灭活将培育液和培育出的蓖麻蛋白蛆虫放入分离机中分离虫液，用纯净水漂洗，然后用热水喷淋蓖麻蛋白蛆虫，蓖麻蛋白蛆虫被灭活； (7)蓖麻蛋白蛆虫干燥灭活的蓖麻蛋白蛆虫干燥，得蓖麻蛋白蛆虫成品。
2.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(I)中，蓖麻籽粉碎至O. 2-0. 5mm颗粒。
3.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(2)中，蓖麻籽柏加入去离子水，用磷酸盐缓冲液调pH=5. 8-7，温度25-35°C，时间2_4h，溶解均匀，加入(NH4)2SO4生成沉淀，放置l_2h，然后用离心分离机以750-1250r/min分离，收集固体物，固体物烘干成蓖麻蛋白粉备用。
4.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(2)中，蓖麻籽饼柏加入去离子水，用O. 2mol/L磷酸氢二钠-O. lmol/L柠檬酸缓冲液调整pH=5. 0-6. 0，控制温度25-35°C，时间180-210min，加入乙醇生成沉淀，放置l_2h，然后用离心分离机以750-1250r/min分离固液相，收集固体物，固体物烘干成蓖麻蛋白粉备用。
5.根据权利要求3或4所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述固体物用真空干燥机在35-55°C、真空度O. 5-2MPa，烘干至含水份5_8%成蓖麻蛋白粉备用。
6.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(3)中，虫卵用孔径O. 1-2. Omm筛子过筛。
7.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(5)中，培育参数温度 25-35°C，ρΗ=5· 5-8，搅拌速度 Ι-lOr/min，通气量 O. 5_2L/min，时间 72_120h。
8.根据权利要求I所述的蓖麻蛋白的生物改性工艺，其特征在于所述步骤(7)中，用真空冷冻干燥机在温度-30-50°C、时间12-24h、真空度IO-IOOkPa干燥至蓖麻蛋白蛆虫含水分5-8%成为蓖麻蛋白蛆虫成品。
全文摘要
蓖麻蛋白的生物改性工艺，属于生物技术领域。本发明用蓖麻籽为原料，经过蛋白提取、生物改性，降低了蓖麻蛋白的毒性，扩大了蓖麻蛋白的用途。本发明的目的是通过如下技术方案实现的1、蓖麻籽浸出油，2、蓖麻蛋白提取，3、诱导生成蓖麻蛋白蛆虫卵；4、蓖麻蛋白幼虫培殖；5、蓖麻蛆虫培育；6、蓖麻蛋白蛆虫分离、清洗与灭活；7、蓖麻蛋白蛆虫干燥与包装。本发明的蓖麻蛋白的生物改性工艺过程易于控制，生产效率高，节能，无环境污染，适合工业化生产。
文档编号C07K14/435GK102816220SQ201210316220
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者徐华民, 赵荣华, 赵艳琨, 徐萌 申请人:哈尔滨工业大学