一种制霉菌素的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种制霉菌素的制备方法，包括使用水溶性有机溶剂从诺尔斯氏链霉菌发酵液提取制霉菌素以及将制霉菌素进一步纯化结晶的步骤。本发明所述制备方法采用特定的提取工艺及纯化结晶工艺，获得了高收率、高纯度的制霉菌素结晶的制备，适于大规模的工业化生产。
【专利说明】一种制霉菌素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物制备【技术领域】，尤其涉及一种制霉菌素原料药的制备方法。
【背景技术】
[0002]制霉菌素是由Hazen和Brown于1950年发现的由Streptomyces noursei发酵后分离得到的抗真菌类抗生素，在1956年开始临床应用，对念珠菌引起的胃肠炎、阴道感染，以及由于长期使用广谱抗生素所致的念珠菌病的预防和治疗有良好的效用。
[0003]由诺尔斯氏链霉菌属制备制霉菌素的方法在1951年I月12日提交的序号为208，978的Hazen和Brown的同时待审的申请中有描述。粗制的制霉菌素浓缩液可通过用几部分的甲醇提取菌丝垫，然后用乙酸乙酯分级沉淀，用0.85%NaCl溶液洗涤沉淀，将沉淀溶解在甲醇中并用乙醚分级沉淀来处理甲醇溶液。活性晶体材料可通过在丁醇和盐水之间分配和通过从甲醇中部分沉淀由所得粗制浓缩液中获得，。高纯度的晶体制霉菌素通过使部分纯化的制霉菌素浓缩液在通过混合正丁醇、甲醇、水和己烷制作的两相系统中分配，并允许该系统暴露于空气蒸发直到晶体在截面上聚集而得。
[0004]以上描述的方法可产生晶体制霉菌素，但是由于杂质的存在和低产量备受争议，并且难以控制和进行大规模的工业化生产。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出一种高收率、高纯度的制霉菌素制备方法。
[0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种制霉菌素的制备方`法，包括:
[0008]( I)将水溶性有机溶剂加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中；
[0009](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4-6，然后为6.5-7.5 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除所述有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0010](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至55-58 °C，然后冷却至6-8 °C，从浆液中回收制霉菌素。
[0011]上述制备方法中，作为优选，步骤(1)中，所述水溶性有机溶剂为异丙醇和/或正
丙醇；
[0012]优选地，所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比为55%_72%、优选为60%-70%、更优选为65%。
[0013]在具体的实施方式中，所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比可以为 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71% 或 72%。
[0014]作为优选，步骤(2)为:调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4.5-5.5、优选为5，然后为6.5-7.5、优选为7 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除所述有机溶剂，回收所得沉淀即为制霉囷素沉fe。
[0015]在具体的实施方式中，步骤(2)中，可调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，然后再调节至 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、
7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。
[0016]作为优选，步骤(3)中，所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中，六偏焦磷酸钠的按g/ml计的质量体积百分含量为0.8-3.0%，优选为1.0-3.0%，更优选为2.2%。
[0017]在具体的实施方式中，所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中，六偏焦磷酸钠的按g/ml计的质量体积百分含量可以为0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、
1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9% 或 3.0%。
[0018]优选地，所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中，异丙醇的体积百分含量为20-40v/v%、优选为 30%。
[0019]作为优选，上述制备方法还包括进一步纯化结晶制霉菌素的步骤，具体为:
[0020](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在甲醇-氯化钙溶液中，加入水，调节溶液的pH值为5.9-6.1，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的pH值为5.3-5.5，加热至50-55°C持续15-40分钟、优选20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
[0021]作为优选，步骤(4)中，所述甲醇-氯化钙溶液中，氯化钙的按g/ml计的质量体积百分比为1_4%、优选为2-3%、更优选为2%。
[0022]作为优选，步骤(4)中，第一次加入的水量为甲醇-氯化钙溶液体积的1/2。
[0023]更优选地，步骤(4)具体为:
[0024]将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9-6.1、优选为6.0，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3-5.5、优选为5.4，加热至50_55°C持续15-40分钟、优选20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的pH值为5.0-5.2、优选为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
[0025]本发明的一个特别优选的实施方案具体包括如下步骤:
[0026](I)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为65% ；
[0027](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为5，然后为7 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0028](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的2.2%六偏焦磷酸钠的30v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至55-58°C，然后冷却至6-8°C，从浆液中回收制
霉囷素；
[0029](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9-6.1、优选为6.0，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3-5.5、优选为5.4，加热至50_55°C持续20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.0-5.2、优选为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
[0030]本发明所述制备方法采用特定的提取工艺及纯化结晶工艺，获得了高收率、高纯度的制霉菌素结晶的制备，适于大规模的工业化生产。【具体实施方式】
[0031]下面结合【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0032]实施例1
[0033]具体步骤为:
[0034](I)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为65% ；
[0035](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4.5，然后为7.0 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0036](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的2.2%六偏焦磷酸钠的30v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至55°C，然后冷却至6°C，从浆液中回收制霉菌素；
[0037](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为6.0，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.4，加热至55°C持续16分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶收率80%、纯度88%。
[0038]实施例2
[0039]具体步 为:
[0040](I)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为55% ；
[0041](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为5.5，然后为7.2 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0042](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的2.0%六偏焦磷酸钠的20v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至58°C，然后冷却至8°C，从浆液中回收制霉菌素；
[0043](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为3%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为6.1，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.5，加热至55°C持续16分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.0，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶，收率78%、纯度85%。
[0044]实施例3
[0045]具体步骤为:
[0046](I)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为70% ；
[0047](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为6.0，然后为7.5 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0048](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的3.0%六偏焦磷酸钠的40v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至58°C，然后冷却至8°C，从浆液中回收制霉菌素；
[0049](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为3%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3，加热至55°C持续16分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶，收率77%、纯度86%。
[0050]实施例4
[0051]具体步骤为:
[0052](I)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为72% ；
[0053](2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4.0，然后为6.5 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀；
[0054](3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的0.8%六偏焦磷酸钠的40v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至56°C，然后冷却至8°C，从浆液中回收制霉菌素；
[0055](4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3，加热至55°C持续16分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.2，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶，收率75%、纯度85%。
[0056] 申请人:声明，本发明通过上述实施例`来说明本发明，但本发明并不局限于上述，SP不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种制霉菌素的制备方法，其特征在于，包括: (1)将水溶性有机溶剂加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中； (2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为4-6，然后为6.5-7.5 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除所述有机溶剂，得制霉菌素沉淀； (3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至55-58 °C，然后冷却至6-8 °C，从浆液中回收制霉菌素。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水溶性有机溶剂为异丙醇和/或正丙醇； 优选地，所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比为55%-72%、优选为60%-70%、更优选为65%。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤(2)为:调节步骤(1)所得混合溶液的PH值为4.5-5.5、优选为5，然后为6.5-7.5、优选为7 ;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除所述有机溶剂，回收所得沉淀即为制霉菌素沉淀。
4.根据权利要求1-3任一项所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中，六偏焦磷酸钠的按g/ml计的质量体积百分含量为0.8-3.0%、优选为1.0-3.0%、更优选为2.2% ； 优选地，所述含 六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中，异丙醇的体积百分含量为20-40v/v%、优选为30%。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，还包括步骤: (4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在甲醇-氯化钙溶液中，加入水，调节溶液的pH值为5.9-6.1，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的pH值为5.3-5.5，加热至50-55 °C持续15-40分钟、优选20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述甲醇-氯化钙溶液中，氯化钙的按g/ml计的质量体积百分比为1_4%、优选为2-3%、更优选为2%。
7.根据权利要求5或6所述制备方法，其特征在于，步骤(4)中，第一次加入的水量为甲醇-氯化钙溶液体积的1/2。
8.根据权利要求5-7任一项所述制备方法，其特征在于，步骤(4)具体为: 将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9-6.1、优选为6.0，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3-5.5、优选为5.4，加热至50_55°C持续15-40分钟、优选20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.0-5.2、优选为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
9.根据权利要求1-8任一项所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将正丙醇和/或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中，使得其在混合溶液中的体积百分比为65% ； (2)调节步骤(1)所得混合溶液的pH值为5，然后为7;过滤去除未溶解的物质，蒸发去除有机溶剂，得制霉菌素沉淀； (3)将步骤(2)所得制霉菌素沉淀在含以g/ml计的2.2%六偏焦磷酸钠的30v/v%的异丙醇水溶液中制浆，将所得浆液升温至55-58°C，然后冷却至6-8°C，从浆液中回收制霉菌素； (4)将步骤(3)回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液中，加入1/2体积的水，调节溶液的pH值为5.9-6.1、优选为6.0，过滤去除未溶解的物质，调节所得滤液的PH值为5.3-5.5、优选为5.4，加热至50_55°C持续20-30分钟，加入与缩减之前的水体积相当的水，调节并维持溶液的PH值为5.0-5.2、优选为5.1，然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。
【文档编号】C07H1/08GK103755758SQ201410028136
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】程雪翔 申请人:北京安汀医药生物科技有限公司