合成胸腺法新的方法

合成胸腺法新的方法
【专利摘要】本发明涉及医药合成领域，具体涉及合成胸腺法新的方法。本发明要解决的技术问题是现有方法分离纯化困难、总收率低、生产成本高。本发明解决上述技术问题的方案是提供一种合成胸腺法新的方法，包括以下步骤：a、合成在侧链上有保护基的多肽片段1和多肽片段2；b、将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，然后脱除N端保护基，得到多肽树脂Ⅰ；c、根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个偶联第11个至第1个氨基酸，然后脱除N端保护基，再乙酰化，得到胸腺法新树脂；d、胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，纯化后，获得胸腺法新。本发明所述方法能够大幅度提高产品收率，缩短合成周期。
【专利说明】合成胸腺法新的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及合成胸腺法新的方法。

【背景技术】
[0002] 胸腺法新是一种免疫调节因子，由28个氨基酸组成，它可以特异性地诱导T细胞 Lytl+、2+、3+表面标志的产生，促使T细胞及自然杀伤细胞（NK)的分化与成熟，促使致 敏的T细胞在各种抗原或有丝分裂原激活后产生各种淋巴因子，如白介素2 (IL2)、a干扰 素（IFNci)、γ干扰素（IFNY)等淋巴因子，促使对IL2高亲和力受体的表达增加，增强 Th细胞的功能，同时它还通过对T4细胞的激活作用来增强异体和自体的人类混合的淋巴 细胞反应。胸腺法新可能影响NK前体细胞的募集，这前体细胞暴露于干扰素后变得更有 细胞毒性，使机体能有效的发挥免疫防护功能。该品具有促进T细胞分化、成熟，提高NK细 胞活性，促进T细胞分泌各类淋巴因子，提高IL 一 2受体对IL 一 2的亲合力等作用。早期 临床应用主要集中于抗肿瘤、免疫功能低下方面，近年来药效学研究结果同时表明，本品更 具有保护肝脏、特异性地抑制受HBV感染的Η印G2-Nu2细胞的生长和抑制土拨鼠 WHV病毒 复制的作用。在用于治疗慢性肝炎的多中心试验结果表明单独使用该品的疗效与干扰素相 同，但副反应比干扰素少得多。在临床上，已成功地应用于治疗乙、丙型肝炎及其它免疫缺 陷的疾病。
[0003] 药代动力学研究文献显示，本品健康人单次皮下注射胸腺法新1. 6mg，血药峰浓度 约为37. 51ng/ml，达峰时间约为1. 67小时，AUC0-15约为152. 15ng/ml *h，半衰期约为1. 65 小时。一组有关Τα 1药代动力学方面的由日达仙、Timosina和Τα 1三种样品作对照的实 验中显示，Τ α 1释放快速（Tmax为l_2h)，代谢缓慢（16_18h)，尽管80%由泌尿系统排出体 夕卜，但Cmax为30_80ug/L，仍比正常Τ α 1血浓度〇. 5?0. 75ug/L高出几十倍。
[0004] 当前胸腺法新的制备方法主要为固相合成法，但由于胸腺法新分子结构中有大量 的β折叠结构，形成困难序列，如逐个氨基酸从C端到N端进行接肽，从第28氨基酸偶联 至第21氨基酸时，肽树脂体积就发生20%以上的收缩，同时继续接到第11氨基酸时才恢复 正常，这种收缩严重降低了后续氨基酸的偶联收率，增加了分离纯化的难度，同时严重降低 了产品的收率，从已报道的制备方法可知，对于98% HPLC纯度的胸腺法新，当前的制备总 收率一般都在20 %左右。
[0005] 胸腺法新的氨基酸顺序如下所示：
[0006] Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val 5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu 10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys 14 -Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys 19-Lys20-Glu21-Val22-Val 23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu 27-Asn28-0H


【发明内容】

[0007] 本发明要解决的技术问题是现有方法分离纯化困难、总收率低、生产成本高。
[0008] 本发明解决上述技术问题的方案是提供一种合成胸腺法新的方法，使得本发明所 述方法在保证产品质量的前提下，降低合成方法的复杂程度和提高产品的总收率。
[0009] 上述合成胸腺法新的方法，包括以下步骤：
[0010] a、合成在侧链上有保护基的多肽片段1 :
[0011] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-〇H ;
[0012] 合成在侧链上有保护基的多肽片段2 :
[0013] NH2_Val_Val_Glu (OtBu) _Glu (OtBu) _Ala_Glu (OtBu) _Asp ( a -OtBu)_ 氣基树脂；
[0014] b、将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，然后脱除多肽片段的N端Fmoc 保护基，得到多肽树脂I :
[0015] NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇tB u)-氨基树脂；
[0016] c、根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个偶联第11个至 第1个氨基酸，然后脱除N端保护基，再进行乙酰化反应，得到胸腺法新树脂 ：
[0017] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu (OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基树脂；
[0018] d、胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗 品纯化后，获得胸腺法新。
[0019] 在本发明所述方法中，首先按照胸腺法新肽序列分成3个部分，即分成2个片段的 合成以及其他氨基酸的逐个偶联，以胸腺法新主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式所 示：
[0020] Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val 5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu 10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys 14 -Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys 19-Lys20-Glu21-Val22-Val 23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu 27-Asn28-0H
[0021] 多肽片段1的氨基酸序列即为上式中编号12-21的多肽序列：
[0022] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-〇H。
[0023] 多肽片段2的氨基酸序列即为上式中编号22-28的多肽序列：
[0024] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基树脂。
[0025] 作为本发明的优选方案，步骤a所述合成多肽片段1具体为：在偶联试剂存在下， 将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu) -0H)与 载体树脂偶联，再脱Fmoc保护基得到H-Glu (OtBu)-载体树脂，然后采用活化试剂和缩合试 齐?，根据胸腺法新氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基 以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧 链偶联有Boc保护基的赖氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联 有tBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc 保护基的赖氨酸（Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸（Fmoc-Leu-〇H)、 N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的天门冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu)-0H)、 N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸（Fmoc-Lys (Boc) -OH)、N端偶 联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏冬氨酸（Fmoc-Thr (tBu) -OH)、N端偶联有 Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸（Fmoc-Thr (tBu) -OH)进行延伸偶联，偶联 后裂解液裂解，脱除载体树脂得到多肽片段1 :
[0026] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH。
[0027] 作为本发明的优选方案，步骤a所述合成多肽片段2具体为：在偶联试剂存在 下，将N端偶联有Fmoc保护基的天门冬氨酸（Fmoc-Asp(a-tBu)-OH)与脱保护后的氨基 树脂偶联，脱Fmoc保护基得到H-Asp ( a -tBu)-氨基树脂，然后采用活化试剂和缩合试 齐?，根据胸腺法新氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个将N端偶联有Fmoc保 护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨酸（Fm 〇c-Glu(0tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护 基的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨 酸（Fmoc-Glu (OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨酸 (Fmoc-Glu (OtBu) -〇H)、N端偶联有Fmoc保护基的纟颜氨酸（Fmoc-Val-〇H)、N端偶联有Fmoc 保护基的缬氨酸（Fmoc-Val-OH)进行延伸偶联，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段 2 ：
[0028] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基树脂。
[0029] 作为优选方案，步骤c具体为：
[0030] 采用活化试剂和缩合试剂，根据胸腺法新氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序先 将N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸（Fmoc-Ile-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后 脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂I，然后依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链 偶联有tBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu (OtBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联 有tBu保护基的丝氨酸（Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu 保护基的丝氨酸（Fmoc-Ser (tBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基 的苏氨酸（Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天 冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基的缴氨酸（Fmoc-Val-〇H)、N端偶联 有Fmoc保护基的丙氨酸（Fmoc-Aal-〇H)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸（Fmoc-Aal-〇H)、 N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸（Fmoc-Asp (OtBu) -0H)、N 端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸（Fmoc-Ser (tBu)-0H)进行延伸 偶联，偶联后脱除N端带有的Fmoc保护基，进行乙酰化反应后得到胸腺法新树脂：
[0031] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu (OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基树脂。
[0032] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，第一个保护氨基酸与载体树脂偶联所形成 的多肽树脂取代值为〇. 3?1. 2mmol/g多肽树脂；优选的取代值为0. 6?1. 0mm〇l/g多肽 树脂。
[0033] 上述方法步骤a的合成多肽片段2中，第一个保护氨基酸与氨基树脂偶联所形成 的多肽树脂取代值为〇. 2?0. 8mmol/g多肽树脂；优选的取代值为0. 4?0. 6mmol/g多肽 树脂。
[0034] 本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基载体偶联后，剩余氨基酸按照各 自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进 行偶联。本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为多肽树脂摩尔数的1?6 倍；更优选为2. 5?3. 5倍。所述偶联的反应时间为60?300分钟；优选为100?140分 钟。
[0035] 在延伸偶联中，由于每个氨基酸的N端都有保护基，因此需要用去N端保护基试剂 先脱除N端保护基再偶联。本发明用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺）混合溶液作为 去N端保护基试剂脱除N端保护基；所述混合溶液中含哌啶为10?30% (V)，其余为DMF。 所述去N端保护基试剂的用量为每克多肽树脂5?15mL，优选的为每克多肽树脂8?12mL。 去N端保护基的时间为10?60分钟，优选的为15?25分钟。
[0036] 需要说明的是，本发明所述多肽树脂指任意个数保护氨基酸按照胸腺法新氨基酸 顺序和氨基载体相连接形成的多肽树脂，这其中也包括多肽树脂I、胸腺法新树脂。
[0037] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，所述的载体树脂为Trityl-Cl (三苯甲基 氯）类树脂。优选的，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲 基三苯甲基氯）树脂、4-Methoxytrityl-Cl (4-甲氧基三苯甲基氯）树脂或2-C1 Trity-Cl (2-氯三苯甲基氯）树脂中的任意一种。
[0038] 进一步优选的，当载体树脂为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸与载体树脂的偶 联方法为：保护氨基酸的羧基与树脂中的C1代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保 护氨基酸。
[0039] 上述方法步骤a的合成多肽片段2中，所述的氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、 Rink Amide树脂和Rink MBHA树脂中的任意一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。
[0040] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，所述裂解液为体积百分比25%的三氟乙醇 的二氯甲烷溶液。
[0041] 作为优选的方案，所述缩合试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺（Die)、N，N-二环己基 碳二亚胺（DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱（PyBOP/有机碱）、 2_ (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱（HATU/有机 碱）、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱（HBTU/有机碱）或0-苯并三 氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱（TBTU/有机碱）中的任意一种。所述缩 合试剂的摩尔用量为多肽树脂中氨基总摩尔数的1?6倍；优选为2. 5?3. 5倍。
[0042] 上述缩合试剂中所述的有机碱为Ν，Ν-二异丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺（TEA)或 N-甲基吗啡啉（NMM)中的任意一种；优选为DIPEA。
[0043] 需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱， 在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱 组合在一起成为一种缩合试剂使用。其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比 为1. 3?3. 0:1 ;更优选为1. 3?1. 5:1。
[0044] 作为优选的方案，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑（HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯 并三氮唑（HOAt)。所述活化试剂的用量为多肽树脂中氨基总摩尔数的1. 2?6倍；优选为 2. 5 ?3. 5 倍。
[0045] 作为优选的方案，所述的偶联试剂为N，N-二异丙基乙胺（DIPEA)、N，N-二异丙基 碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶（DIC/DMAP)两种之一。
[0046] 在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。
[0047] 除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法按照本发明片段合成策略 进行合成。
[0048] 作为优选方案，步骤d所述的酸解，是采用由体积百分比为80?95%的TFA、体积 百分比为1?10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液进行酸解。优选地，用由体积百分比 为90%的TFA、体积百分比为5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液进行酸解。所述混合 酸解液用量为每克胸腺法新树脂需要4?15mL ;优选为9?llmL。所述酸解的时间为室温 条件下1?6小时；优选为室温条件下3?4小时。
[0049] 作为优选的方案，步骤d所述的纯化具体为：
[0050] 胸腺法新粗品，加水搅拌，用氨水调pH7. 0至完全溶解，溶液用0. 45 μ m微孔滤膜 过滤，纯化备用；
[0051] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统 为0. 1% TFA/水溶液-0. 1% TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用 梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸 去乙腈后，得胸腺法新纯化中间体浓缩液；
[0052] 取胸腺法新纯化中间体浓缩液，用0. 45 μ m滤膜滤过备用；
[0053] 采用高效液相色谱法进行换盐,流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色 谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min,采用梯度洗脱，循环上 样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并 用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到胸腺法新醋酸水溶液，冷冻干燥， 得胸腺法新纯品。
[0054] 由本发明提供的方法合成的胸腺法新，经HPLC检测纯度为99%以上，总收率为 30%以上，而且本发明所述方法中2个片段可以同时进行合成，与现有逐个合成氨基酸的 技术方案相比，缩短了合成周期，提高总收率。

【专利附图】

【附图说明】
[0055] 图 1 Rink Amide AM 树脂的结构。
[0056] 图2 Rink Amide树脂的结构。
[0057] 图3 Rink MBHA树脂的结构。

【具体实施方式】
[0058] 合成胸腺法新的方法，包括以下步骤：
[0059] a、在偶联试剂存在下，将Fmoc-Glu (OtBu) -0H与载体树脂偶联，再脱Fmoc保护基 得到H-Glu (OtBu)-载体树脂，然后采用活化试剂和缩合试剂，根据胸腺法新氨基酸序列， 按照从 C 端到 N端依次逐个将 Fmoc-Lys (Boc) -〇H、Fmoc_Lys (Boc) -〇H、Fmoc_Glu (OtBu) -0H、 Fmoc-Lys(Boc)-〇H> Fmoc-Leu-〇H> Fmoc-Asp(OtBu)-〇H> Fmoc-Lys(Boc)-〇H> Fmoc-Thr (tBu) -0H、Fm〇c-Thr (tBu) -OH进行延伸偶联，偶联后裂解液裂解，脱除载体树脂得 到多肽片段1 :
[0060] Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH ;
[0061] 在偶联试剂存在下，将Fmoc-Asp ( a -tBu) -OH与脱保护后的氨基树脂偶联，脱 Fmoc保护基得到H-Asp ( a -tBu)-氨基树脂，然后采用活化试剂和缩合试剂，根据按照胸 腺法新氨基酸序列，按照从C端到N端依次逐个将Fmoc-Glu(0tBu)_0H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Val-〇H 进行延伸偶联，脱除 N端带有的Fmoc保护基得到多肽片段2 :
[0062] NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基树脂；
[0063] b、将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端连接，然后脱除N端Fmoc保护基，得 到多肽树脂I:
[0064] NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -〇tB u)-氨基树脂；
[0065] c、根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个连接第11 个至第1个氨基酸，先将Fmoc-Ile-OH的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护 基得到 H-I le-多肽树脂 I，然后依次逐个将 Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ser (tBu) -0H、 Fmoc-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Aal-OH、 Fmoc-Aal-〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc_Ser (tBu) -〇H 进行延伸偶联，偶联后脱除 N 端带有 的Fmoc保护基，进行乙酰化反应后得到胸腺法新树脂：
[0066] Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys (Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -〇 tBu)-氨基树脂；
[0067] d、胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗 品纯化后，获得胸腺法新。
[0068] 胸腺法新结构有28个氨基酸残基，要获得总收率明显的提高，必须克服在合成过 程中肽树脂的收缩问题。为此， 申请人:根据长期的试验研究，提出了本发明所述方法来制备 胸腺法新，在提高产品质量的同时，提高制备总收率。
[0069] 本发明在步骤a中合成的多肽片段1所示氨基酸序列，在其N端、Thr侧链上、Lys 侧链上、Asp侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；合成的多肽片段2所示氨基酸序列， 在其N端、Asp侧链上以及、Glu侧链上分别偶联保护基；而剩余的其他氨基酸，则是在多肽 片段1与多肽片段2偶联形成多肽树脂I后，按照胸腺法新1?11多肽序列所示氨基酸序 列C端到N端的顺序，先将N端偶联有保护基的亮氨酸的C段与多肽树脂I的N端偶联，然 后依次逐个将其他对应的保护氨基酸进行延伸偶联，偶联后脱除N端保护基，经乙酰化反 应后得到整个胸腺法新树脂。
[0070] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，第一个保护氨基酸与载体树脂偶联所形成 的多肽树脂取代值优选为〇. 3?1. 2mmol/g多肽树脂；更优选的取代值为0. 6?1. Ommol/ g多肽树脂。
[0071] 上述方法步骤a的合成多肽片段2中，第一个保护氨基酸与氨基树脂偶联所形成 的多肽树脂取代值优选为0. 2?0. 8mmol/g多肽树脂；更优选的取代值为0. 4?0. 6mmol/ g多肽树脂。
[0072] 本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基载体偶联后，剩余氨基酸按照各 自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进 行偶联。本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为多肽树脂摩尔数的1?6 倍；更优选为2. 5?3. 5倍。所述偶联的反应时间优选为60?300分钟；更优选为100? 140分钟。
[0073] 在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要用去N端保护基试剂 先脱除N端保护基再偶联。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺）混合溶液 作为去N端保护基试剂脱除N端保护基；所述混合溶液中含哌啶为10?30% (V)，其余为 DMF。所述去N端保护基试剂的用量为每克多肽树脂5?15mL，优选的为每克多肽树脂8? 12mL。去N端保护基的时间为10?60分钟，优选的为15?25分钟。
[0074] 需要说明的是，本发明所述多肽树脂指任意个数保护氨基酸按照胸腺法新氨基酸 顺序和氨基载体相连接形成的多肽树脂，这其中也包括多肽树脂I、胸腺法新树脂。
[0075] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，所述的载体树脂为Trityl-Cl (三苯甲基 氯）类树脂。优选地，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl (4-甲 基三苯甲基氯）树脂、4-Methoxytrityl-Cl (4-甲氧基三苯甲基氯）树脂或2-C1 Trity-Cl (2-氯三苯甲基氯）树脂中的任意一种。
[0076] 其中，进一步优选地，当载体树脂为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸与载体树脂 的偶联方法为：保护氨基酸的羧基与树脂中的C1代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接 入保护氨基酸。
[0077] 上述方法步骤a的合成多肽片段2中，所述的氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、 Rink Amide树脂和Rink MBHA树脂中的任意一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。
[0078] 上述方法步骤a的合成多肽片段1中，所述裂解液为体积百分比25%的三氟乙醇 的二氯甲烷溶液。
[0079] 作为本发明优选的方案，所述缩合试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC)、N，N-二 环己基碳二亚胺（DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱（PyBOP/ 有机碱）、2-(7_氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱 (HATU/有机碱）、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱（HBTU/有机碱） 或0-苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱（TBTU/有机碱）中的任意一 种。所述缩合试剂的摩尔用量为多肽树脂中氨基总摩尔数的1?6倍；优选为2. 5?3. 5 倍。
[0080] 上述缩合试剂中所述的有机碱为Ν，Ν-二异丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺（TEA)或 N-甲基吗啡啉（NMM)中的任意一种；优选为DIPEA。
[0081] 需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱， 在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱 组合在一起成为一种缩合试剂使用。其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比 为1. 3?3. 0:1 ;更优选为1. 3?1. 5:1。
[0082] 作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑（HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮 唑（HOAt)。所述活化试剂的用量为多肽树脂中氨基总摩尔数的1. 2?6倍；优选为2. 5? 3. 5 倍。
[0083] 作为优选，本发明所述偶联试剂为N，N-二异丙基乙胺（DIPEA)、N，N-二异丙基碳 二亚胺/4-二甲氨基吡啶（DIC/DMAP)两种之一。
[0084] 在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。
[0085] 除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法按照本发明片段合成策略 进行合成。
[0086] 作为优选方案，步骤d所述的酸解，是采用由体积百分比为80?95%的TFA、体积 百分比为1?10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液进行酸解。优选地，用由体积百分比 为90%的TFA、体积百分比为5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液进行酸解。所述混合 酸解液用量为每克胸腺法新树脂需要4?15mL ;优选为9?llmL。所述酸解的时间为室温 条件下1?6小时；优选为室温条件下3?4小时。
[0087] 作为优选，步骤d所述纯化具体为：
[0088] 胸腺法新粗品，加水搅拌，用氨水调pH7. 0至完全溶解，溶液用0. 45 μ m微孔滤膜 过滤，纯化备用；
[0089] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统 为0. 1% TFA/水溶液-0. 1% TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用 梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸 去乙腈后，得胸腺法新纯化中间体浓缩液；
[0090] 取胸腺法新纯化中间体浓缩液，用0. 45 μ m滤膜滤过备用；
[0091] 采用高效液相色谱法进行换盐,流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色 谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min,采用梯度洗脱，循环上 样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并 用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到胸腺法新醋酸水溶液，冷冻干燥， 得胸腺法新纯品。
[0092] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、 羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生 成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及 知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过OtBu 保护基保护谷氨酸、天冬氨酸的侧链；通过tBu保护基保护苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸的侧链； 通过Boc保护基保护赖氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，氨基酸N端 均优选通过Fmoc保护基进行保护。而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。
[0093] 本发明公开了一种合成胸腺法新的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方 法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0094] 在本发明【具体实施方式】中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发 明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限 公司，其中本发明所述多肽片段1也可以通过市售获得，申请文件中所用英文缩写对应的 中文含义见表1。
[0095] 表1英文缩写释义
[0096]

【权利要求】
1. 合成胸腺法新的方法，其特征在于，包括以下步骤： a、 合成在侧链上有保护基的多肽片段1 : Fmoc-Thr(tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc) -Lys (Boc)-Glu(OtBu)-OH ； 合成在侧链上有保护基的多肽片段2 : NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基树脂； b、 将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，然后脱除多肽片段的N端Fmoc保护 基，得到多肽树脂I : NH2-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys (Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -OtBu)-氨 基树脂； c、 根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个偶联第11个至第1 个氨基酸，然后脱除N端保护基，再进行乙酰化反应，得到胸腺法新树脂： Ac-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-G lu(OtBu)-Ile-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys ( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asp ( a -OtBu )_氨基树脂； d、 胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗品纯 化后，获得胸腺法新。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a所述合成多肽片段1的步骤为： 在偶联试剂存在下，将Fmoc-Glu(0tBu)_0H与载体树脂偶联，再脱Fmoc保护基得到 H-Glu (OtBu)-载体树脂，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照从C端到N端的顺序依次逐 个偶联 Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc_Asp(OtBu)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Thr(tBu)-〇H、 Fmoc-Thr (tBu)-0H，偶联后用裂解液裂解，脱除载体树脂得到多肽片段1 : Fmoc-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc) -Lys (Boc)-Glu(OtBu)-OH。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a所述合成多肽片段2的步骤为： 在偶联试剂存在下，将Fmoc-Asp ( a -tBu) -0H与脱保护后的氨基树脂偶联，脱Fmoc 保护基得到H-Asp(cx-tBu)-氨基树脂，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照从C端 到 N 端的顺序依次逐个偶联 Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H、 Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Val-〇H，脱除 N 端的 Fmoc 保护基得到多肤片段 2 : NH2-Val-Val-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asp ( a -OtBu)-氨基树脂。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c的步骤为： 采用活化试剂和缩合试剂，先将Fmoc-11 e-OH的C端与多肽树脂I的N端偶联 后，脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂I，然后按照从C端到N端的顺序依次逐个偶 联 Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-0H、 Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、 Fmoc-Ser (tBu)-OH，偶联后脱除N端的Fmoc保护基，进行乙酰化反应后得到胸腺法新树 脂： Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-G lu (OtBu)-Ile-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Lys( Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp ( a -OtBu )_氨基树脂。
5. 根据权利要求1、3或4任意一项所述的方法，其特征在于：所述的氨基树脂选自 Rink MBHA树脂、Rink Amide AM树脂和Rink Amide树脂中的任意一种；优选为Rink Amide MBHA树脂。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的载体树脂选自Trityl-Cl类树脂； 优选为2-C1 Trity-Cl树脂。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述裂解液为体积百分比25%的三氟乙 醇的二氯甲烷溶液。
8. 根据权利要求1?4任意一项所述的方法，其特征在于：所述的缩合试剂为N，N-二 异丙基碳二亚胺、N, N-二环己基碳二亚胺，六氟憐酸苯并二唑-1-基-氧基二批咯烧基憐/ N，N-二异丙基乙胺、2- (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/ N，N-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐/N，N-二异丙基乙胺或 〇-苯并三氮唑-Ν, Ν, Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯/Ν, Ν-二异丙基乙胺中的任意一种。
9. 根据权利要求1?4任意一项所述的方法，其特征在于：所述活化试剂为1-羟基苯 并三唑或Ν-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d所述的酸解，是采用由体积百分 比为80?95%的TFA、体积百分比为1-10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液进行酸解。
【文档编号】C07K14/575GK104098688SQ201410333844
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】文永均, 郭德文, 董华建, 曾德志 申请人:成都圣诺生物科技股份有限公司