将生物作用的物质结合至生物粒子面膜上的化合物，组合物和方法

专利名称：将生物作用的物质结合至生物粒子面膜上的化合物，组合物和方法
本申请为1988年5月2日申请的US189192，标题为“将生物作用的物质结合至生物粒子面膜上的化合物、组合物和方法”的申请的部分继续。
本发明是关于将生物作用的物质，如治疗剂，也可以是诊断剂结合至生物相容粒子上的化合物，组合物和方法;生物相容的粒子不仅包括能生存的细胞和病毒，而且还包括不能生存的载体粒子。本发明还涉及用于这类化合物制备的原材料和中间体。本发明还涉及这类化合物用于治疗剂，也可以是诊断剂，在体内部位选择性释放的应用。
用于疾病和其它病理情况治疗的治疗剂的释放可以通过各种手段来完成。这些手段包括口服给药、静脉内给药、皮下给药、经皮肤给药、肌肉内给药或局部施用。对于某些治疗剂来说，现有的一些释放方式，或者是在没有全身的副作用时就不能释放足够的剂量至疾病部位，或者是不能使治疗产品在疾病部位停留足够时间以产生预定治疗作用。
防止或减少病理细胞增生的药物主要是对包括不希望或无控细胞增生的各种疾病的治疗和控制。但所局限的是，这些抗增生剂对某些细胞类型肯定是有毒的。由于控制有病细胞所需的给药量对病人的正常细胞可能有毒或致死，因此不能经常全身地给这些药物。可通过将抗增生剂直接给药至不希望细胞增生部位来防止该困难的发生。这些抗增生剂还需在疾病部位保留一历程，以便它们可以有效地控制不希望细胞的增生，同时制止正常细胞的迁移和损坏。
对于抗增生剂在特定部位释放和留着特别有效的这些特定的疾病和情况简述如下。这些情况的每一种都涉及特定不希望细胞的增生，而且用于它们治疗的药物治疗的全身给药得不到最佳结果。
1.血管成形术后的再闭塞和再狭窄限制或阻塞冠状血液流动的动脉粥样硬化的损害，是有关冠心病死亡的主要原因。通过经皮透照的冠状血管成形术(PTCA)或冠状动脉旁路接枝，已使用了直接干预法。
使用PTCA法的主要困难是，不仅是在紧随PTCA法后(严重闭塞)，而且是在很长时期内(再狭窄)血管成形术后脉管的闭合问题。
血管成形术后的再狭窄是由血管成形操作引起的动脉内壁损伤的反应。尽管准确的机理仍在积极的探索之中，但通常认为，好象是涉及动脉中间层平滑肌细胞的增生，随后这些细胞迁移至内(内膜)层，在那里细胞继续增生。通常是在损伤后的7-14天内，在内膜内停止增生。
有再闭塞症状的病人需要进一步的PTCA或冠状动脉旁路接枝。由于如此大百分率(30～50%)的进行过PTCA的病人要经历再狭窄，因此，很清楚，作为冠状动脉病治疗方法的PTCA的成功将受到限制。
借助药理学手段防止再狭窄的试图通常包括各种制剂的系统给药，并且总的来说是不成功的。
几种用于防止再狭窄的正在积极研究的抗增生剂将更详细地描述如下。
a.肝素和肝素片断肝素是由彻底硫酸化的α-D-葡糖酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的二糖重复单元组成的强阴离子的不均匀葡糖氨基聚糖。肝素的主要治疗作用是用作抗凝血剂。然而，已知肝素还能抑制包括血管平滑肌细胞(SMC)在内的若干种不同类型细胞的生长。已经发现，只有很弱或没有任何抗凝血作用的如四糖那样小的肝素片断在玻璃试管内和在体内具有抗增生活性。见Castellot等人的J.Cell Biol.，1021979～1984(1986)。
肝素通过高亲合力的结合部位结合至SMC细胞表面，并被细胞内吸收。通过与三(十二烷基)甲基氯化铵结合的离子涂布，肝素还能结合至各种人造表面上，如聚硅氧烷，Mylar
，Dacron
，聚碳酸酯、聚乙烯和聚丙烯上。见Grode等人的Trans.Am.Soc.Artif.Int.Organs，151(1969)。
当肝素结合至这些材料上时，至于是否还保留肝素的抗增生活性，没得到任何数据。
b.秋水仙碱秋水仙碱是用于治疗控制严重痛风性关节炎的天然存在的生物碱。通过阻止有丝分裂的梭状纤维的形成，秋水仙碱能在玻璃试管和在体内阻止动植物细胞的分裂，因而，阻止了中期的细胞分裂。秋水仙碱的这个作用类似于长春花生物碱，长春新碱和长春花碱。最近，已有报道说，对有粥样硬化髂骨动脉的兔子每天喂秋水仙碱，在气胀损伤后第四周进行血管造影术观察，减少了再狭窄度。见Currier等人，Circulation，80，11-66(1989)。
然而，在最近的临床研究中发现，对于进行过气胀血管成形术的病人来说，每天1mg的秋水仙碱将不能减少血管再狭窄的发生率。见C.Grines等人，Circulation，84Ⅱ-365(1991)。由于毒性的限制，病人不能忍受多于1mg/天的剂量，估计人类所能忍受的剂量为在血液中秋水仙碱的量比在对兔子的研究中的量低10～20倍。
c其它制剂已在动物试验中使用并能使肌内膜厚度降低的其它制剂为血管紧张转换酶(ACE)抑制剂(J.Powell等人，Science，245186-188(1989);(2)Angiopeptin(C.Lundergan等人，Am.J.Cardiol，17(Suppl.B)132B-136B(1991);(3)Cyclosporin A(L.Jonasson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，852303-06(1988));(4)goat antirabbit血小板得到的生长素抗体(G.Ferns等人，Science，2531129-1132(1991);(5)Terbinafine(G.NemeceK等人，J.Pharmacol.Exp.Thera.，2481167-1174(1989));(6)Trapidil(M.Liu等人，Circulation，811089-1093(1990);和(7)干扰素-γ(G.Hansson等人，Circulation 841266-72(1991))。
使用全身的药物释放，如口服给药治疗血管成形术后的再狭窄包括以固定的间隙周期性的给药，随后在疾病部位周期性的改变治疗剂的浓度。而且，当病人必须接受全身给药时，通常须经20-30天，大于99%的摄入药物经肝和肾处理，这取决入药物。这表明有严重有害反应的机会。
2.风湿性关节炎风湿性关节炎是一种慢性病，其特征为慢性的关节滑膜炎。虽然目前没有任何风湿性关节炎的治愈方法，但有一种认可的疗法是滑膜切除术，该切除术包括除去受影响关节中发炎的软组织。N.Gschwend，Textbook of Rheumatology，(W.N.Kelly等人编)，W.B.Saunders pp.1934-1961(1989)。滑膜切除术可采用外科、化学或放射性药物来完成。已证明外科的滑膜切除术对疼痛有减轻作用。然而，在绝大多数情况下，在外科手术数年后，滑膜炎将再次复发。况且，在每个关节只能进行一次外科的滑膜切除术，并且在相对小的关节处难于进行手术。对于外科的滑膜切除术而言，已表明化学的滑膜切除术是一种有效的可供选择的方法，但是，它的应用被现今市售制剂对软骨和骨的毒性所限制。
对化学的滑膜切除术而言，作为另一种可供选择方法的放射性同位素滑膜切除术，可以认为抑制了滑膜的增生。然而，放射性同位素滑膜切除术受到限制，这是因为，就已知的情况来说，至今所使用的释放系统要求受影响的关节长期的固定，或要求使用寿命极短的，市场上难以实行的同位素，以降低至对淋巴结、脾或肝是可接受值的放射性同位素全身的释放。用于风湿性关节炎早期治疗的该方法的开发中，自滑膜切除部位上放射性同位素的漏泄是最主要的问题。
3.卵巢癌卵巢癌排妇女癌症死因的第四位。上皮癌将引起约80%～90%的卵巢恶性。上皮癌主要是通过表皮脱落或淋巴传播而传遍全身。卵巢外最常见的传播形式为从原发性瘤表面脱落的细胞经腹膜的散布。
用于卵巢癌的最主要疗法的外科手术极少能完全治愈，这是因为癌细胞通常在发病的早期就进入腹膜腔，并不能用外科手术除去。外部射线的放射照相术在外科手术前后也是经常使用的，然而，照射量被腹部器官(肝、肾、胃和肠)对辐射的限定量所限制。过去曾使用腹膜内注入放射活性的胶态金或磷，以辐射腹膜腔。然而，其使用已减少，这是由于辐照的不均匀分布以及小肠内的并发症。单克隆的抗体是当前正在试验用作在腹膜内将放射性同位素释放的载体。迄今为止，尚没有任何一种这些单克隆抗体得到认可能够用于卵巢癌的治疗。
化学疗法是对先期卵巢癌病人的最常用的治疗方式。现今对卵巢癌所使用的药物可使病人延长几年寿命。然而，在建议的全身用药量时，它们将出现很大的副作用。
4.牛皮癣牛皮癣是一种常见的慢性皮肤病，它会发展成皮肤Keratinocytes的无控生长，产生发炎和溃疡。至今还得不到用于牛皮癣的相应的治愈办法。
当前用于牛皮癣治疗的有全身的和局部的。尽管两种治疗方法都是有效的，但它们都将产生一系列有害的副作用。牛皮癣的全身治疗主要包括皮质甾类和对细胞有毒性的化合物如氨甲喋呤的给药。局部治疗包括抗细菌或抗真菌制剂、焦油、使用暴露于阳光或紫外光的光学疗法，或局部施用甾类。对于牛皮癣而言，局部使用皮质甾类多于任何其它治疗方式。然而，局部治疗有容易被擦掉或洗掉的缺点，因而损害了它们的长期效果。皮质甾类的局部施用还受下面情况的限制它们趋于渗入周围血管中，并随后进入正常的循环中，引起不希望的全身累积。
在疾病部位允许有更大浓度和留着率的治疗剂而没有一系列副作用的药物疗法的给药方式，可以证明在处理上述情况时是有用的。
在特定目标的治疗或诊断剂的开发上，近来的研究工作已集中在使用特定生物的相互作用上，例如，受体-配位体或抗原-抗体的相互作用。另一个有前途的研究领域包括含适量诊断或治疗剂的特定目标的细胞或囊(例如，微脂粒)。具体地说，单克隆的抗体已用来赋予这些细胞或囊以目标特征。由于这是一项相当新的技术，因此，有目标的药物治疗法这类方法还不是真正有用或可靠的。
在国际专利申请PCT/US89/00087中，描述了一系列化合物，组合物，它们的制备方法以及将结合生物作用的物质结合到生物粒子(如细胞或病毒)面膜上的应用，这一应用不会对细胞形态学或生理功能产生明显有害的作用。所说的化合物通式为R-B-R1，其中B表示生物作用物质，例如，治疗或诊断剂，并且至少R和R1之一为选择的烃取代基，以便赋予能稳定地与生物粒子面膜结合的化合物以亲脂性。包含刚描述过的化合物的组合物利用用于在化合物和生物粒子外表面膜间稳定结合的相容结合介质进行配制。为了在体内特定部位发挥预定的作用，利用这些组合物，它们是通过稳定地结合该化合物至具有固有或已获得的亲合力用于预定部位的选择性生物粒子上，并将该生物粒子引入体内，借此，该生物粒子将生物作用物质载至预定部位，以产生其预定的作用。
根据本发明的一个方面，提供了具有结合治疗活性物质至含生物粒子如细胞或病毒的脂类的能力的化合物。本发明的化合物包括生物作用部分，并包含通过连接部分稳定连接至至少一个选择的烃取代基上的治疗活性物质;以便使所述化合物具有足够的非极性，能在体内或在玻璃试管内稳定地结合至含脂质生物相容粒子的脂部分上。如要求传递治疗活性，所述化合物还可以包括间隔基部分，以在治疗物质和连接部分之间构成分离。
本发明化合物的进一步特征在于，含不定的但可预测的，与生物膜脂质部分相结合的稳定剂。相对于至少90%的表面膜留着率(MRC)及至少30%的膜结合稳定性而言，所述化合物是足够非极性的。本发明的化合物在使用过程中还必须是足以稳定的，也就是说，一旦通过直接给药或通过载体给药将治疗剂送到选择性部位以后，它能在那儿保留足以产生其预定作用的时间和量。测量膜留着率和膜结合稳定性的步骤详述如下。
根据本发明，上述化合物被用作选择性部位输送的治疗剂，并在选择部位留着。根据本发明的优选方面，该治疗剂有抗增生作用，并对涉及细胞增生的疾病或其它病理情况的治疗是有用的。该抗增生剂可以包含放射治疗物质或化学治疗物质。根据优选的具体例，本发明提供了这样一些化合物，其中，放射治疗物质含有螯合剂和放射性金属。在另一个优选具体例中，本发明的化合物含有化学治疗物质，如肝素、水蛭素和它们的衍生物，以及能影响选择的内细胞功能的制剂。
根据本发明的另一方面，化学治疗物质可以释放地共轭至本发明的化合物上。例如，可以从秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉醇和它们的衍生物中选择这类化学治疗物质，这些物质只在从化合物上释放时才显示出它们的生物作用。这些化合物影响微管蛋白的合成组合，分离或降解，和/或功能，这些在下面集中地被称之为“微管蛋白处理”。例如，提供一酸可分裂的秋水仙碱衍生物，其中，只要它保留共轭至连接部分，包括在其中的秋水仙碱类似物基本上是钝化的。该化合物被送至选择部位，并最终进入细胞。通过降低PH值而完成该化合物的吸收，这将使秋水仙碱部分从连接部分产生分裂。释放的秋水仙碱类似物能发挥其预定的生物作用，这可能影响微管蛋白的处理。
根据本发明的又一方面，提供了含在可相容生物介质中的本发明化合物的药物制剂。
根据本发明还有的另一方面，提供了在疾病或其它病理情况的治疗中，本发明各种化合物的使用方法，化合物包含治疗活性物质和不是必须的，包括诊断剂。
为了在疾病部位留着，本发明的化合物最好通过在体内直接输送来给药。另一方法是，可以将化合物结合至适于直接将该化合物送至疾病部位的载体颗粒上。对于各种病理情况，如血管成形术后的再狭窄，风湿性关节炎，卵巢癌和牛皮癣的治疗，特别优选的是体内直接输送，这将在下面更详细的描述。
与目前可得到的用于将治疗剂送至疾病部位的化合物和方法相比，本发明有许多明显的优点。最显著的是，借助在选择部位与细胞结构稳定的结合，本发明的化合物可以释放并保留在体内的选择部位。现有的一些释放方式，或是在没有全身的副作用时就不能释放足够的剂量至疾病部位，或者是不能使治疗产品在疾病部位留着足以产生希望的治疗作用时间和量。本发明的化合物将能在疾病部位达到治疗有效的剂量。例如，在放射治疗的情况下，极不希望放射同位素的全身分布，本发明的化合物能使放射治疗物质稳定的结合并留着在所需的部位，并且能限制同位素的全身分布，而不需要进行关节固定或使用寿命极短的同位素。
本发明的另一个显著的优点是，可以这样配制化合物，即它们一开始就稳定地与细胞外膜结合，并随后通过正常的膜开通处理，吸收入细胞内。该特点联同含能释放共轭治疗剂的本发明化合物的配制能力，使潜在毒性物质能送至选择的细胞内部，在那儿它们可变得活化并单独的对这些细胞发挥其治疗作用，而不对身体的其它细胞起作用。反意义RNA或DNA的输送也可以用该方法来完成。
本发明的又一优点是，在此所述的化合物结合至细胞和其它生物相容粒子上主要是通过脂质的亲和力而产生的。这就细胞而言是特别重要的，因为在脂质中的结合将减少对位于不连续蛋白质部分上而不在更广阔的脂质区域的细胞膜的重要作用区域结构的干扰机会。依靠结合至膜蛋白和细胞受体上以输送生物作用物质至细胞上的先前的方法常导致减弱的作用能力。
根据在细胞脂质区域中的结合，还可获得一些伴生的益处。这是由于脂质区域包含了绝大部分的细胞表面，因此就能将更多的脂质结合化合物，和如此更大浓度的治疗剂置入血浆膜中。而且，由于本发明化合物的亲脂特性，它们被稳定地掺入膜脂质中，所以在正常的生理盐中它们是相对不溶解的。因此，一旦这些化合结合至膜上以后，它们就被有效地集留在那里，而且不能轻易地分离。因此，从细胞中的渗出被减至最少，由此，使不希望的全身作用减至最小。
参照本文中的附图。


图1显示局部注射物质P与注射本发明物质P-亲脂花青共轭体的脉管响应曲线的比较试验结果。上部曲线图是关于物质P，下面的曲线图是关于共轭体。
图2显示在存在和不存在物质P的对抗剂，〔D-Pro2，D-Trp7.9〕-SP时，每种物质P和本发明的物质P-亲油花青共轭体的剂量-响应关系曲线。
图3为一系列荧光/频率矩形图，其中的点代表独立的细胞;当从X轴原点起增加各点的距离，表示增加红光亮度(LFL2信号)，反之，当从y轴原点起增加各点的距离，表示增加绿光亮度(LFL1信号)。
图4为以时间的函数测量的，代表在体内本发明的物质P-亲脂花青染料共轭体对红血细胞结合稳定性的曲线图。
图5为放射性碘(125I)标记的亲脂花青在四种不同类型的人造表面〔硅橡胶(SIL)，聚碳酸酯(PC)，聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)〕上留着度的柱状图表。条纹柱表示一开始被结合至每个表面上的放射性碘(125I)标记的亲脂花青量;密实柱表示在连续6小时血液灌注后保留的量。与成对的柱组合的数值是化合物结合的原始量的保留百分数。
图6显示由实验得到的数据，其中，对于抑制在体外由标准浓度的凝血酶产生的纤维蛋白的生殖能力，试验了用抗凝血剂亲脂花青共轭体标记的载体细胞。用于非共轭抗凝血剂的浓度特性曲线被提供用作比较。记录凝血酶响应的百分抑制率(y轴)作为被试验化合物摩尔浓度(下x轴，对数刻度)的函数和每个试样的载体细胞数(上x轴，对数刻度)的函数。
下述定义的词和词组用于本发明描述作为参考1.生物作用部分-术语生物作用部分和生物作用物质在此可互换地用来表示能用于人类或动物的治疗、诊断、预防或其它治疗的许许多多的不同的物质。这些物质包括能发挥生物作用的任何物质。
2.生物相容的粒子-在此使用的术语“生物相容的粒子”不仅包括在体内和玻璃试管内能生存的实体例如细胞，而且还包括不能生存的实体，如脂质体和脂蛋白，只要在体内给药时，它们不会引起严重的负作用。
措词“能起生理作用的能生存的生物相容粒子”在此用来表示任何能生存的细胞或含膜的病毒。而且，在此所用的术语“细胞”包括原核生物细胞，如细菌;以及真核生物细胞，如白血细胞，各种瘤细胞;和培养的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞，酵母菌;和无核细胞，如红血细胞，红血细胞空胞和血小板。本发明的详细说明将根据特定的生活体细胞，在下面进行描述。然而，应该明白的是，所描述的有关细胞，对含膜病毒也是通用的。还应该明白的是，根据本发明，在进行治疗剂选择部位输送中，不能生存的实体可以用能生存的实体适当地替代，只要它们对于预定的输送部位已固有或已获得亲合力。例如，脂质体可以用作要输送至肝或肾上的治疗活性物质的载体。
3.诊断剂-指的是在体内或在玻璃试管试验中，能便于生理情况或状态检测、测量或分析的化合物或物质。在使用过程中，本发明的化合物可以作为信息分子起双功能作用，即可在体外检测，或可在玻璃试管中分析得到的体液或活组织来检测。
4.色基-指的是通过吸收至少一个选择的光波长，用肉眼或者用仪器能检测到的物质。
5.治疗活性物质-指的是能防止、缓和、治疗或医治活体的异常或病理情况的物质。这些物质包括能保持、增加、减少、限制或破坏活体生理作用的物质，以及通过抑制、杀死、改性或保留微生物或其抗原保护活体的物质。治疗活性物质包括药剂或治疗用的药物。
6.化学治疗物质-指的是其治疗作用是由该物质的化学特性产生的治疗活性物质。化学治疗物质可包括例如无放射性的药剂。它们可以包括小分子;或如脂质的较大的配合物分子，碳水化合物;蛋白质;或核酸，如DNA或RNA。
7.放射性治疗物质-指的是其治疗作用由它的放射性而产生的治疗活性物质。适用的放射性治疗物质可以包含放射性同位素原子。该生物作用部分最好含有与各种治疗放射性核素，如186Re、90Y、67Cu、177Lu或153Sm螯合的螯合剂。
8.抗增生剂-指的是能抑制、减少或防止细胞增生的治疗活性物质。
本发明的化合物可用于各种药疗法，其中，所希望的是将治疗活性物质对选择部位进行输送。根据本发明的优选具体例，该治疗活性物质为抗增生剂，它可以是放射治疗或化学治疗物质。在可供选择的另一个具体例中，本发明的化合物可以包含诊断剂，如色基或放射性核素，它能对在玻璃试管或在体内的本发明的化合物进行示踪和/或检测。因此，本发明的化合物可以包含例如作为连接部分的可检测色基和作为生物作用部分的治疗活性物质。
构成本发明化合物的诊断剂可以选自借助现有技术中熟练技术人员已知的各种分析方法能检测的各类物质。可检测的荧光化合物最好是花青染料和它们的衍生物，例如包括氧代羰花青，吲哚羰花青，硫代羰花青或吖啶染料和它们的衍生物。其它有用的荧光化合物包括例如，苯乙烯基吡啶、呫吨、吩噁嗪、吩噻嗪或二苯己三烯染料和它们的衍生物。
有用的诊断剂还可以包括便于检测的配位体，如生物素或特定的抗体。其它有用的诊断剂为可直接或间接进行检测的，与金属络合的螯合剂。合适的螯合金属的络合物可以包含选自原子充数从21-49的过渡金属系列的同位素，例如铟-111或锝-99m。可以将这类化合物结合至载体细胞的细胞血浆膜上，给予它们以放射性，以便在送入体内后，使用γ-摄影机能够使之成象。螯合物质还可以与可间接检测的金属离子络合，检测例如可借助在感兴趣的部位产生的某些作用原因进行。顺磁元素的络合物，例如，能影响靠近核处的衰减时间，这可通过磁响应图象(MRI)来检测。含选自其原子序数为21-29的过渡金属系列或其原子序数为59-66的镧系元素的金属离子的螯合金属络合物可适用于此目的。
如果希望的话，在本发明的各种应用中，也可使用含放射同位素原子的化合物。为了在该化合物的生物作用部分、色基或烃尾部有更多的但是不放射性形式的天然存在的原子，放射性同位素如125I、131I、14C、3H、35S或75Se可以被取代。具有非零自旋状态的同位素(例如19F)也可以引入本发明的化合物中，以便使得它们的存在能用MRI工艺检测。
对于治疗应用而言，生物作用部分可以包含上述类型的、并与各种治疗放射性核素如186Re、90Y或67Cu络合的螯合剂。
相对于根据本发明的治疗应用而言，包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白或肽的蛋白物质也可以通过合适的连接部偶合至适当链长的烃尾部。有代表性的生物作用的蛋白物质是免疫原，毒素、激素、酶、抗原、抗体和抗体片断。这类治疗活性蛋白质最好共轭至上述类型的亲油色基上，并通过与各种含脂质生物粒子的不同的但可预测的结合稳定性，对最终的共轭体进行标记，举例将在下文进行。
在另一治疗应用中，生物作用部分含有能改变结合至细胞体内的迁移和循环方式的碳水化合物。能用于该方法的一类碳水化合物包括唾液酸;另一类包括葡糖氨基聚糖。例如，含唾液酸的配方能用于红细胞的血浆膜上，以增加唾液酸在该膜上的数量。填充的基团的数量增加必将增加在从肝脏中排出前的循环过程中红细胞的寿命。
该生物作用部分还可以是配位体形态，它能结合至特定组织的受体上或结合至在标定器官内细胞上的受体上。含这类配位体的化合物，例如当被结合至载体细胞上时，将增强对特定器官部位的迁移作用。
可通过各种手段，将本发明的化合物直接送至体内选定的部位，这些手段包括注射、灌注、导管插入术和局部施用以及其它一些手段。本发明的化合物还可结合至例如自体细胞，同种异基团细胞或zenogenic细胞的载体生物相容粒子上，以便于生物作用物质的定标输送。除非另有说明，下面显示的讨论指的是，或者通过直接输送至疾病部位，或在载体赋形剂的制备中将本发明的化合物结合至能生存的细胞上。本发明的一个目的是提供治疗药物或放射性同位素可以连接至其上的化合物，而且所述化合物溶于构成细胞外膜的脂质双层。当直接输送至疾病部位时，通过本发明化合物的治疗物质的输送，与其它可实现的输送相比，将使这些物质能以更高的浓度和更长的时间在作用区的细胞上留着。而且，本发明化合物的使用能使在全身给药情况下可能是有毒性的治疗剂的使用成为可能。
本发明化合物对细胞的作用方式是不同的，并取决于(1)该化合物连接的细胞种类;(2)亲脂尾的性质，长度和数量，(3)被治疗的身体部位，(4)生物作用部分的性质和(5)通过将生物作用部分连接至该化合物上的历程产生的对细胞的作用。本发明的化合物沉积在细胞上，并一开始就直接至血浆膜的外脂质双层上。由于膜组份自然地向里传输，所以这些化合物也将被带入细胞内。在细胞处，这种情况发生的速率将取决于特定细胞的种类，其生长状态以及其活化或激发值。
某些类型的抗增生剂，如共轭至本发明化合物上的放射治疗物质，不管它们集中于外膜上还是在细胞内，都将是活性的。这些抗增生剂发出损害核的辐射，如果该辐射是足够穿透的话，那么，它还将抑制周围细胞的生长。必须实质上与细胞内的组份相互作用以抑制生长的药物，只有在本发明的化合物被吸收入细胞后，才将是有效的。也已设计了另一种作用方式，借此，可将相当毒的药物如秋水仙碱共轭至亲脂部分，并以钝化的形态结合至外膜上，这种钝化形态对细胞是无毒性的。然后，当该共轭体向内传输时，一个特别制备的连接部分(将在下面的例子中更详细的描述)使该药物从共轭体上脱落，并发挥其抗增生作用。
落入本发明范围的化合物为下面通式的那些化合物
其中B表示含有效治疗物质的生物作用部分，R和R1独立地表示选自氢、烷基、烯基、炔基、烷芳基或芳烷基的取代基，其烃链为直链或支链，并且它们是非取代的或由一个或多个非极性官能基取代的，至少R和R1之一包含烃取代基，其链长为对化合物能有效地赋予膜结合能力;R2表示一间隔基部分，n为0或1，当n＝0时，L表示在B和至少R和R1之一间构成稳定结合的连接部分，当n＝1时，L表示在R2和至少R和R1之一间构成稳定结合的连接部分，假定当n＝0时，L为非芳族的连接部分。
在此所使用的措词“非极性官能团”指的是如氧-烷基、硫-烷基、卤素、N(烷基)2、硒-烷基、NO2、CN、CO-烷基、Si(烷基)3、O-Si(烷基)3等的取代基。
连接部分(L)可以是饱和的或不饱和的脂族连接部分(linker)，或可以是包括脂环族和芳族的环状结构，这些环结构可以是单环的、多环的、碳环的、稠合的或不稠合的。
连接部分最好是一色基。在本发明化合物中引入色基将有助于在体内示踪该化合物。用于此目的的有用的色基包括花青、吖啶、吡啶、喹啉、呫吨、吩噁嗪、吩噻嗪和二苯基己三烯染料以及其衍生物。
落入本发明范围的优选类的化合物为下面结构式的化合物
其中B表示生物作用物质，R和R1独立地表示选自氢、烷基、烯基、炔基、烷芳基或芳烷基的取代基，其烃链具有1～约30个碳原子，并且为直链的或支链的，所说的取代基是非取代的，或由一个或多个非极性官能团取代，R2表示如下通式的间隔基部分-(R3)p-Q-(R4-Q′)q-(R5-Q″)r-(R6-Q
)s-(R7-Q
)t，其中R3表示脂族烃，R4、R5、R6和R7独立地选自脂族烃、脂环烃、或芳香烃、杂环化合物或CH2C(CO2H)＝CH，Q、Q′、Q″、Q
和Q
独立地选自由酰胺、硫脲、腙、酰腙、酮缩醇、醛缩醇、原酸酯、酯、酸酐、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、亚胺、胺、醚、碳酸酯、硫醚、氨磺酰、羰基、脒和三嗪连接键，此外，Q′、Q″、Q
、Q
、可独立地表示化合价键，具有C1-12线性碳原子的脂族或脂环族烃和C6-12的芳香烃;n、p、q、r、s、和t各自可为0或1。
X和X1可以相同或不同，并表示O、S、C(CH3)2或硒;
y表示选自＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-或＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-的连接基团，其中R8选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或CH(CH3)2;
Z表示选自H、烷基、OH、-O-烷基、COOH、CONH2、SO3H、SO2NH2、CONH-烷基、CON-(烷基)2、NH-酰基、NH-烷基、N(烷基)2、SH、S-烷基、NO2、卤素、Si(烷基)3或O-Si(烷基)3、锡(烷基)3或Hg-卤素，包含有C1-4的所说Z取代基的烷基基团的取代基，A表示生物相容的阴离子。相对于要求高稳定的生物膜结合的应用，结构式(Ⅱ)中R或R1之一至少必须有12个碳原子，在R和R1中线性碳原子总数总计至少必须23个。
按照熟知的合成路线，可以通过存在于或者在首基上，或者在生物作用部分上，或两者上都有的合适的官能团，便利地在花青首基和生物作用部间引入各种间隔基部分(R2)。大量不同类型的双官能(同型双官能和异型双官能)的间隔剂已在用于这样用途的专业文献中报道。见Meth.Enz.，91580-609(1983)。根据反应基团的种类，疏水性或亲水性，长度以及连接反应基团的结构是可裂解的，还是不可裂解的，这些间隔基部分将有所不同。
如上所述，间隔基的官能连接可以是酰胺(-NHCO-)、硫脲(-NHCSNH-)、腙(＝NHN-)、酰腙(＝NHNCO-)、酮缩醇(-O-C(烷基)2-O-)、醛缩醇(-O-CH(烷基)-O-)、原酸酯(-C(O-烷基)2-O-)、酯(-COO-)、酸酐(-COOCO-)、二硫化物(-S-S-)、脲(-NHCONH-)、氨基甲酸酯(-NHCO2-)、亚胺(＝N-)、胺(-NH-)、醚(-O-)、碳酸酯(-O-CO2-)、硫醚(-S-)、氨磺酰(-SO2-NH-)、羰基(-CO-)和脒(-NHC＝(NH
-))。
在放射疗法的优选具体例中，B表示与放射性金属如铼或钇等络合的螯合剂。在化学疗法的优选具体例中，B表示肝素、水蛭素、秋水仙碱、长春花碱或它们的类似物，所有这些都是抗增生剂。在化学疗法的另一个优选例中，B表示肽。与游离的即非共轭的肽相比较，已发现落入上述结构式Ⅱ的被称为物质P的肽衍生物能稳定地结合至红细胞上，并在循环中提供长时间的治疗作用。可以预料，当以非共轭的形式时，在循环中具有相对短寿命的其它治疗活性物同样能取得增强的生物利用率。
在本发明化合物的某些应用中，例如复合疗法和诊断，在通式Ⅰ中的B最好为生物素。
1.亲脂官能化的花青根据下面通式的亲脂花青前体，能方便地制备上述结构式(Ⅱ)的化合物
其中R、R1、X、X1、Y、Z和A参考结构式Ⅱ化合物中的上述定义;R2表示下面结构式的间隔基部分-(R3)p-(Q-R4)q-(Q′-R5)r-(Q″-R6)s-(Q
-R7)t-，其中R3、R4、R5、R6、R7、Q、Q′、Q″、Q
、p、q、r、s和t参考结构式Ⅱ化合物中的上述定义，W表示选自氨基(-NH2-)、α-卤代乙酰氨基(-NH-COCH2-hal)(hal＝卤素)、异硫氰酸盐(-NCS)、卤素、异氰酸盐(-NCO)、羧基(-COOH)、肼基(NHNH2)、酰肼(-CONH-NH2)、酮(-RCO)、例如二苯酮、二硫代吡啶基(-ss-C5H5N)、巯基(-SH)、醛(-HCO)、酸酐(-COOCO-烷基)、琥珀酰亚胺酯(-COOC4H4NO2)、羟基(-OH)、卤代磺酰基(-SO2-卤素)、亚氨酸酯(-C(＝NH)OCH3)、环氧乙烷基(-C2H3O)、马来酰亚胺基(-NCOCH＝CHCO)和叠氮基(-N3)。
用于制备本发明化合物的合适的前体可根据不同的合成路线进行制备，其中之一的合成路线阐明于反应方案1中，并将在下面的例子中进行详细讨论，所述的前体含有在上述结构式中作为取代基W的活性胺(NH2)基。
根据方案1，根据Gale和Wilshire，Aust.J.Chem.，30693(1977)的步骤，将2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚(市场上可得到的)与N-羟甲基邻苯二酰胺(市场上可得到的)反应，得到化合物(1)，再将该化合物与烷基4-氯苯磺酸酯反应，得中间体(2)，所说的磺酸酯是通过Sondermann，Liebigs Ann.Chem.，749183-197(1971)的步骤，根据相应的醇和4-氯苯磺酰氯而制得的。借助在浓盐酸中加热，除去中间体(2)中的苯二酰亚胺基保护基，随后进行碱性整理得化合物(3)，再将该化合物用甲酸甲酯进行处理，得(4)。化合物(5)是通过或者是2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚或者是2-甲基-苯并噁唑(市场上可得到的)与烷基4-氯苯磺酸酯的烷基化作用而制得。随后，通过类似于US2，647，054描述的方法，将化合物(5)与N，N-二苯基甲脒(市场上可得到的)反应，得(6)。中间体(4)和(6)随后可以在碱(乙酸钠或三乙胺)的存在下，在乙醇中通过搅拌偶合在一起，得(7)。借助Dhawan等人，Orgn.Prep.and Proc.Int.7(2)85-88(1975)的步骤，(7)的去保护作用将得到氨基衍生化的花青(8)。
该氨基花青(8)能直接连接至含合适官能团(例如，CO，COOH)的治疗剂上，以生产可用于特定部位药物输送的共轭体。此外，对能共轭至其它生物作用部分上的许多其它花青衍生物的制备而言，该氨基花青(8)是很通用的中间体。而且，就与许多同型或异型双官能间隔部分反应而言，化合物(8)是理想的分子，以在亲脂花青部分和连接至其上的生物作用物质间构成分离。
在生成的花青衍生物上的胺取代基可以用熟知的反应方案，以简易的方法转换成其它官能团。例如，根据de Costa等人，J.of Lab.Compds.and Radiopharm.，27(9)1015(1989)的步骤，通过用硫光气的处理，可以实现异硫氰酸盐官能团的转换。
胺基与1，4-对苯二酸二-N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应，形成了通过OOC-芳基-CONH-烷基间隔基部分连接至花青首基上的琥珀酰亚胺基官能团。生成的化合物能分离和提纯成为稳定的结晶固体。
取代的氨基和对硝基苯碘代乙酸酯(市场可得到的)在二甲基甲酰胺中的简单酰化作用，形成了通过烷基-CONH-烷基间隔基部分偶合至花青首基上的活性碘代取代基。
胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基-3(2-吡啶二硫基)丙酸盐(市场可得到的)的反应，形成了有吡啶二硫基官能团和烷基-CONH-烷基间隔基部分的化合物。
胺基和γ-硫代丁内酯的反应，形成了有硫氢基官能团和烷基-OCNH-烷基间隔基部分的化合物。类似地，胺基和γ-丁内酯的反应，形成了有羟基官能团和烷基-CONH-烷基间隔基部分的化合物。
2.蛋白质/肽亲脂花青共轭体通常为如上所述制备的亲脂花青前体可以通过许多不同的合成路线连接至蛋白质或肽上，以获得结构式Ⅱ的化合物。
蛋白质或肽至例如如上所述的那些亲脂连接键衍生物上的偶合，可以通过存在于蛋白质或肽(即赖氨酸的α-氨基或ε-氨基)上的胺基进行。另外，羧基或硫羟基(其中存在半胱氨酸残余物)可以用来将蛋白质或肽偶合至适当的花青前体上。用于进行这样的偶合反应的合适的条件对本领域熟练技术人员来说是已知的。
用于亲脂花青前体与多肽的α-氨基的共轭作用的一种方法是通过Wetzel等人，Bioconjugate Chem.，1，114(1990)的步骤的改进进行的。这包括在pH为6时多肽与碘代乙酸酐(市场可得到的)的酰化作用，以形成碘代乙酰胺衍生物，该衍生物随后与如上所述制备的硫氢基衍生的亲脂花青化合物反应，并通过具有良好稳定性的硫醚键形成共轭体。
通过赖氨酸的ε-脂族氨基的共轭作用最好在pH8.5以上进行，在此条件下，达到平衡时，仅有有限量的胺部分是非质子化的和活性的。对上述的若干胺活性的亲脂连接化合物而言，该氨基必须具有高的反应性。例如，异硫氢酸盐衍生的连接键化合物，在含水条件下显示出高的稳定性，并能与赖氨酸的侧链反应，形成通过硫脲链连接的共轭体。
就与赖氨酸反应而言，上述的N-羟基-琥珀酰亚胺基酯衍生的连接键化合物是特别好的反应剂，这是由于如此形成的酰胺共轭体很稳定。该反应最好是在无水条件下在如二甲基甲酰胺的有机溶剂中进行，这是由于这种特定的衍生物在含水条件下的水解是一个竞争的副反应。一种上述结构式Ⅲ的N-羟基-琥珀酰亚胺基酯衍生的连接键被共轭至十一肽(物质P)第3位置的赖氨酸残余的氨基上反应将在下面详细描述。
存在于谷氨酸和天冬氨酸残余的侧键上的以及存在于肽或蛋白质C-末端的氨基酸残余上的羧酸基，是使用上述胺衍生的亲脂花青化合物进行选择共轭的可能的位置。该反应可或者通过使用用作反应偶合剂水溶性的碳化二亚胺，如1-乙基-3-二甲基氨基-丙基碳化二亚胺(市场可得到的)，根据Hoare和Koshland，J.Biol.Chem.，2422447-2453(1967)的步骤的改进进行，或者通过使用2-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3-磺酸盐(Woodward的反应剂K，市场可得到的)作为活性偶合剂，根据在J.Biol.Chem.，2495452(1974)中描述的步骤的改进进行。生成的共轭体是通过稳定的酰胺键连接的。
必须避免官能化的衍生物连接至主要用于生物活性的肽或蛋白质的活性基团上，这是由于，这通常将产生钝化的共轭体。然而，如果肽或蛋白质能通过可裂解的间隔基部分，从亲脂花青衍生物上释放的话，这个问题就可被克服。
由于上述化合物的亲脂性，因此，其中一些将很难溶于常用的水缓冲体系中。因此，要求含水条件以保持药物溶解性或活性构象的共轭反应将不得不在有机溶剂改性的含水溶剂中进行。溶剂如二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙腈和醇类与水是可混溶的，而且可用来溶解亲脂花青衍生物，产生所希望的共轭作用。
利用所形成的特定化合物的大小，电荷或亲脂性，通过各种标准的提纯工艺，可将本发明的化合物提纯。对于含肽治疗剂特别有用的提纯方法是Bohlen等人，Int.J.Rept.Prot.Research，16306-10(1980)的方法。
3.生物素化(Biotinylated)的亲脂花青本发明的生物素化的亲脂花青化合物最好具有如下结构式
其中R，R1和R8如前面定义，m为0～6。这样的生物素化的衍生物可通过生物素或生物素衍生物与上述结构式Ⅲ官能化的亲脂花青化合物的反应制得。用于该反应的生物素衍生物最好具有如下结构式
其中E表示借助所说的活性官能团W能取代的具有易变态基团的化合物的残余，m＝0、1或2。
例如，根据反应方案1制得的氨基官能化的花青衍生物(8)，可根据Hofmann，Finn和Kiso，J.Am.Chem.Soc.，1003585(1987)的步骤，与市场可得到的胺活性的生物素衍生物，(+)-生物素4-硝基苯基酯，N-羟基琥珀酰亚胺基6-(生物素酰氨基)己酸酯和6((6((生物素酰)-氨基)己酰)氨基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯反应，以形成上述结构式Ⅳ的生物素-亲脂花青共轭体，其中m分别为0、1和2。就共轭体的生物素部分和脂质结合部分间间隔臂的长度而言，这些共轭体有所不同，取决于该生物素化化合物预定的用途，这一间隔臂的作用可以是很重要的。已证明较长的间隔臂对生物素共轭体在抗生物素蛋白中生物素的“深度”结合部位的结合能力具有有益的作用。
带活性官能团如马来酰亚胺基，α-碘代乙酰胺基，肼基和氨基的各种其它的生物素衍生物是市场可得到的(Molecular Probes，Eugene，OR，Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents，1989-91)，并可用来与各种上述的官能化的亲脂连接键化合物偶合。合适的反应方案对本领域熟练技术人员将是已知的。
此外，通过花青和生物素部分前体上的合适的官能团，能在它们之间引入各种不同类型的间隔基部分。引入这些间隔基的反应方案对本领域熟练技术人员是已知的。
4.放射性同位素取代的亲脂花青亲脂三丁基锡中间体的合成列于反应方案2中，并将在下面例子中详细描述;所说中间体可用于放射性卤素标记的花青衍生物的制备，该衍生物能有利地用于本发明的方法中。
根据反应方案2，将5-碘代-2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(9)和烷基-4-氯苯磺酸盐(如前述制备的)进行烷基化作用以形成(10);所说假吲哚是由碘代苯胺(市场可得到的)，使用Blaikie等人，J.Chem.Soc.，313，(1924)中所述的步骤和Moreau等人，Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.，9，(3)274-280(1974)中所述的步骤制得的。随后，在乙酸酐中(10)和N，N-二苯基甲脒的反应制得了乙烯基中间体(11)。然后，在乙酸钠存在下，借助在乙醇中搅拌将中间体(11)和(5)连接在一起。中间体(5)如前述制备。用乙酸银，随后用氯化钠对该混合物进行骤冷，得碘代花青(12)。
随后，可借助H.Azizian等人，J.Organomet.Chem.，21549-58(1981)的步骤用(12)制备化合物(13)。该步骤包括在催化剂、四-(三苯基膦)钯(O)的存在下，用双(三-正丁基锡)加热(12)。然后，能在温和的条件下，通过例如Wilbur等人，J.Nuc.Med.，30216-226(1989)的步骤的改进，容易地对三丁基甲锡烷基衍生物(13)进行放射性卤素标记。借助固相交换，使用Weiss等人，J.Labelled Cmpds.& Radiopharmaceuticals，XXVI109-10(1989)的步骤的变更，也能实现向(12)引入放射性卤素。
可以用来引入放射性卤素的另一种亲脂花青衍生物是(13)的类似物，其中用-Hgx替代了-Sn(Bu)3，X表示卤素。当然，通过原料的适当选择，可以改变化合物(12)中卤素取代基的环的位置。例如，根据Bassignana等人，SpectrochemicaActa.，19(11)，1885(1963)的步骤制得的6-碘代-2-甲基苯并噻唑可以用来形成相应的6-碘代衍生物。
5.可分裂的秋水仙碱-亲脂花青共轭体通过适当官能化的活性秋水仙碱衍生物(如Brossi，J.Med.Chem.，332311，2319(1990)中描述的)的选择，并通过如顺乌头基、乙缩醛、原酸酯、酯、酮缩醇、酸酐或腙键，连接至适当官能化的亲脂花青衍生物上，可制得带酸可分裂键的秋水仙碱-花青共轭体。
使用Shen等人，Biochem，Biophys.Res.Commun.，102，31048-1054(1981)中描述的步骤，可以获得通过顺乌头基键的偶合。该步骤包括药物的游离氨基衍生物(如去乙酰基秋水仙碱)和带顺鸟头基酸酐的氨基形式的亲脂花青(市场可得到的)的偶合。
可以使用用适当官能化秋水仙碱和花青衍生物的Srinivasachar等人，Biochemistry，28，2501-2509(1989)所述的步骤的改进，实现通过乙缩醛，原酸酯或酮缩醇键的偶合。
可以使用Laguzza等人，J.Med.Chem.，32548-555(1989)中所述步骤的改进，进行通过腙键的偶合。该步骤包括醛形式的药物和酰肼形式的亲脂花青的偶合。
根据本发明的可分裂的秋水仙碱-花青共轭体的合成显示于反应方案3中，并且，将在下面的例子中进行详细的描述。
根据反应方案3，氨基官能化的花青(8)与戊二酸的单甲酯(市场可得到的)偶合，以制成单甲酯衍生物(14)，当该衍生物(14)在甲醇中用肼处理时，将形成肼基衍生物(15)。
秋水仙碱部分是通过将去乙酰基的秋水仙碱(市场可得到的)与戊二酸酐反应以形成一酸中间体而制得的;随后，该中间体通过添加Carbonylidiimidazole就地被活化，以形成酰基咪唑;当该酰基咪唑用氢硼化四丁铵进行还原时，形成醇(17)。(17)和氯代铬酸吡啶鎓的氧化将产生7-N-(5-氧代戊酰基)去乙酰基秋水仙碱(18)，随后，(18)与肼基衍生物(15)偶合制成共轭体(19)，其中，秋水仙碱和花青部分是通过酸可分裂的酰基腙键进行偶合的。在方案3中生产的作为中间体的7-N-(5-氧代戊酰基)去乙酰基秋水仙碱是构成本发明一部分的新颖的化合物。如果希望的话，在秋水仙碱核的第10位置的甲氧基，可以用甲硫基或其它含硫属的基团取代。
此外，更有效的7-N-(5-氧代戊酰基)去乙酰基硫代秋水仙碱类似物可采用方案3中用于制备醛18的相同反应程序，由去乙酰基硫代秋水仙碱(如Shian等人，J.Pharma.Sci.，64，646-648(1975)中所述制备)制成。该硫代秋水仙碱的衍生物也能用相同的偶合条件连接至肼基衍生物(15)上，形成酸可分裂共轭体。
秋水仙碱类似物从共轭体上释放的动力学也可借助对秋水仙碱和花青部分间腙键类型改性而改变。例如，通过磺酰基苯基腙和苯基腙偶合的抗体-药物共轭体已被Mueller等人，于Bioconjugate Chem.，1325-330(1990)中描述，以提供比相应酰基腙衍生物更慢的释放动力学。
6.肝素-亲脂花青共轭体通过稳定的氨基甲酸酯键偶合的，并可用于本发明的肝素-花青共轭体的合成路线显示于反应方案4中，并将在下面例子中作详细的描述。
根据方案4，根据Eckert等人，Angew Chem.Int.Ed.Engl.，26(9)894-95(1987)的步骤，用三光气进行处理时，氨基官能化的花青(8)将转化成高度活性的异氰酸酯衍生物(20)。不对该异氰酸酯衍生物(20)进行进一步的分离或提纯，随后，根据Dong，“Heparinized Segmented Polyurethane Urea Surfaces with Hydrophilic Spacer Groups”，Dissertation，University of Utah，1990的步骤的改进，在二甲基甲酰胺/甲酰胺的混合溶剂中，立即将它与肝素钠反应，以形成肝素-亲脂花青共轭体(21)，其中，通过其羟基，通过形成氨基甲酸酯键(或通过氨基，通过形成脲键)，肝素被共价地连接至花青上。使用市场可得到的反应剂，N-Boc-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，通过对本领域熟练技术人员已知的反应，也可以在肝素和花青部分之间引入碳间隔臂。
当然，在反应中通过对反应剂化学计算量的控制，能改变每个肝素分子中花青基团的数量，这是因为肝素有许多有效的游离羟基。如果需要的话，可以通过疏水的相互作用色谱法，从游离肝素中将肝素-亲脂花青共轭体提纯。
另外，可以用Kin等人，于Nonthrombogenic Bioactive Surface Annals，New York Academy of Sciences，p116-130中描述的步骤的改进，制备肝素-花青共轭体。该步骤包括使用碳二酰亚胺反应剂，将在肝素上的羧酸基与氨基官能化的花青偶合。Ebert等人于BiomaterialsInterfacial Phenomenon and Application，Adv.Chem.Ser.99，American Chem.Soc.，Washington，D.C.(1982)中已确定，在肝素上达20%的羧基能被衍生，而不损失生物活性。
7.放射性金属配合物-亲脂花青共轭体用于放射性金属配合物-亲脂花青共轭体的合成路线显示于反应方案5中，其中的金属选自铼、铟、铜或钯。根据方案5，将二官能螯合剂(22)与氨基官能化的花青(8)反应，以制成衍生物(23)，其中所述的螯合剂如Baidoo和Lever，于Tetrahedron Lett.，31，40，5701-5704(1990)中描述的进行制备。随后将化合物(23)与适当氧化态的金属溶液反应，以制成金属配合物(24)。当所用的金属为铼时，方案5表达所得中性金属配合物的结构。当然，该配合物的准确结构和电荷取决于所用的金属和所选择的双官能螯合剂的准确结构。
制备放射性金属配合物-亲脂花青共轭体的路线显示于反应方案6中，其中的金属选自稀土金属。
结构(25)的双官能化的聚氨基羧酸酯螯合剂可根据EP0353450A1中所述的步骤制备。根据方案6，螯合剂(25)在PH9～9.5与氨基官能化的花青(8)反应，以制成化合物(26)，其中，螯合剂和花青部分是通过稳定的硫脲键偶合的。随后，同样根据上述EP申请所述的步骤，将该化合物(26)与在适当缓冲体系中的放射性金属盐的溶液反应，以制成最终的放射性金属配合物-花青共轭体(27)。
用于阐明方案6的M(PA-DOTA)指的是放射性金属配合物。所述的配合物包含显示于方案6中间体(26)中的聚氨基-羧酸酯螯合剂(Chelator)和部分间隔部分(-(CH2)2-C6H4-NH-)。可以预料，化合物(27)的放射性金属配合物部分的三维结构将与Spinlet等人于Inorgn.Chem.，234278-4283(1984)中所描述的结构相似。
其它类型的双官能化的聚氨基羧酸酯螯合剂是已知的，并能通过本领域熟练技术人员已知的其它反应方式偶合至官能化的花青上。例如，可参看Sundberge等人，J.Med.Chem.，171304(1974)。
其它的含氮四配位基螯合剂和含硫四配位基螯合剂是已知的，并能通过本领域熟练技术人员已知的反应方式偶合至适当的官能化的花青上。例如，可参见Ras等人，J.Am.Chem.Soc.，1125798-5804(1980)。
Ⅳ.将本发明的化合物结合至生物相容的粒子上在本发明化合物上被取代的烃尾中的线性碳原子数是在化合物和生物粒子面膜间获得所希望程度的稳定结合的重要因素。为了获得具有单个烃尾化合物的稳定结合，例如吖啶衍生物，线性碳原子数必须为23或更大。根据本发明制备的花青衍生物的经验表明，在有两个或多个烃尾的化合物中，其中之一的烃尾必须有至少12个碳的线性长度，在所有烃尾中线性碳原子的总数至少为23。根据化合物的结构，通常不发生从一个细胞至另一细胞的泄漏或转移。通常，烃尾越长，亲脂性就越高。然而，含超过30个线性碳原子的烃尾可能提出一问题，这是因为，生物作用部分和用来提供烃尾的反应物可能不溶于同一溶剂中，这将使烃尾化学连接至生物作用部分变得十分困难。因此，根据要与烃尾结合的连接部分的化学性质，烃尾的长度可存在一实际的限定。
与烃尾连接的连接部分的结构变更也将对膜结合稳定性的程度有重大的影响。带正电的连接部分，例如花青、苯乙烯基吡啶、呫吨、吩恶嗪、吩噻嗪或二苯基己三烯染料和它们的衍生物可有助于化合物在带负电的膜中的引入和留着。中性或带负电的连接部分也可用于获得从生物膜上控制的释放。
根据具体情况，连接部分、烃尾和间隔部分或生物作用部分之间的稳定结合对于治疗活性物质获得选择部位的留着以达到本发明提供的治疗益处所必需的时间和量来说是必不可少的。
必须这样选择连接部分(L)，以便赋予本发明的化合物以所要求的稳定性，从而使这些化合物在选择的输送部位存在的时间和量足以获得所希望的治疗益处。为此，上述结构式Ⅰ化合物中的连接部分必须提供生物作用部分(B)与当n＝0时至少R和R1两者之一的稳定结合，以及间隔部分(R2)与当n＝1时至少R和R1两者之一的稳定结合。由连接基团赋予的具有所必需的结合稳定性的化合物，在治疗活性的、亲脂共轭体直接给药的情况下，可根据留着时间来确定;在通过载体将共轭体送至疾病部位的情况下，可根据循环时间来确定。也就是说，本发明的治疗活性的，亲脂共轭体的留着时间或循环时间必须比非共轭形式的治疗活性组份的留着时间或循环时间长。
虽然增加的留着时间或循环时间是获得本发明提供的治疗益处的重要因素，但是存在着同样是取决于本发明化合物结合稳定性的另一个同等重要的因素，也就是在疾病部位存在或积累的化合物的量足以提供所希望的治疗益处。
留着时间或循环时间的确定可用本领域熟练技术人员已知的各种方法进行，这将在下面的实施例9.10和12等中列举。对要求产生希望的作用的本发明的治疗活性、亲脂共轭体的量的确定(沉淀是利用治疗剂的情况)不受特定方法的限定。由于可用于本发明实践中的治疗活性物质的差异，能用治疗活性物质治疗的许多疾病状况以及接受治疗病人情况的易变性，这也必须如此。因此，对根据本发明接受治疗病人的反应，必须周期性地进行监测，以确定在疾病部位存在或积累的治疗活性物质量足以产生所希望的治疗益处。
可设计本发明的化合物，以结合至能生存细胞的外膜或其它生物相容粒子的外膜上，而对生存能力没有固有的有害作用。或者可以将它们设计成立即发挥或延迟发挥抑制细胞或细胞毒素的作用。为了测定由于细胞毒素的生物作用部分的细胞毒性含量，例如，可将细胞暴露至各种浓度，包括零浓度的化合物，以及没有共轭至细胞毒素剂上的化合物。随后，将这些细胞暴露至锥虫蓝或Propidiumiodide(F.Celada等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，57630(1967))。这些染料通常被有生命的细胞排斥，并只能渗透死亡细胞的膜。在适当的孵育时间后，用显微镜或借助血细胞流量计数器检查这些细胞，并测定染色细胞的百分数(百分死亡率)。
将本发明的化合物结合至载体细胞上也必须对细胞的功能不产生任何明显的有害作用，这对它们作为载体进行目标输送的能力是十分重要的。例如，载体细胞的有序分离对其在给定的应用中的使用是重要的。另一方面，在对预期应用的细胞的分离电位或细胞其它所要求的性能没有影响时，所用的化合物可以改变某些功能。因此，可以认为，这类化合物对用于本发明的细胞的功能没有明显的有害作用。用于由本发明化合物产生的，对实践本发明存在潜在重要性的细胞功能的作用的测定方法描述于US4859584，Slezak和Horan的Blood，742172-77(1989)以及J.Immunol.Meth.，117205-14(1989)中。
为了能重复地将本发明的化合物结合至目标或载体细胞的血浆膜上而对细胞所希望的功能不产生有害作用，在细胞结合介质的选择中，必须满足两个标准。ⅰ)该细胞结合介质对于本发明化合物要结合的生物相容粒子在等渗压浓度(哺乳动物细胞约260-340mos摩尔)下必须是等渗压的，以便对这些细胞不产生皱缩或溶胀以及可能的损害;ⅱ)使本发明的化合物以这样一种方式溶液化，即它们能以恒定的浓度引入细胞的血浆膜中。溶解时间过程的实验(US4783401和M.Melnicoff等人，J.Leuk.Biol.，43387-397(1988))显示，仅是部分水溶的和用以稳定地结合至血浆膜上的化合物，往往会形成微胶粒，或者形成集合物;当在阴离子溶液(例如磷酸盐的缓冲盐水，培养介质等)中溶液化时，所述的微胶粒或集合物能被沉淀出来，这将导致该化合物对血浆膜的引入减少，或产生不希望地不相容的引入。
对于放射性同位素化合物，可应用类似的实验步骤，而且该化合物的稳定性可通过β-或γ-计数器测定。在所有场合，在每一时间点，将在所说等渗透压溶液上层清液中的本发明化合物的量与用乙醇作为溶剂的这样的化合物试样进行比较;尽管乙醇溶剂并不适于对细胞做标记，但它足以使该化合物达到最大溶解度(总的)。
为了确定用于结合至细胞血浆膜上的本发明化合物的适当浓度，必须考虑若干个因素，这包括由化合物产生的预期的作用以及化合物连接的细胞的类型等。通常，主要目标是尽可能多的将治疗剂引入细胞膜。这可通过将治疗化合物直接输送至疾病部位或通过将治疗化合物结合至体外细胞上并再将该改性的细胞引入体内而实现。通过使引入细胞血浆膜的治疗剂达到最大值，可相对较低剂量进行给药，或可要求达到希望部位以发挥希望的作用的较少的载体细胞。在通过细胞输送治疗剂的情况下，对于迁移至希望部位的细胞的生存能力和容量而言，引入至细胞的化合物量只须增加至在载体细胞中观察不到负更替的这样一个值。
在不存在血清和其它含脂材料下，将本发明的化合物施加至载体细胞上或其它的生物相容粒子上。将细胞从身体上取出或取自培养物，并洗涤至无血清。将它们悬浮以形成一组合物，该组合物包括通常不溶于阴离子溶液的等渗压调整剂，和适当浓度的本发明的化合物(10-5-10-7M)。通常，在10分钟内完成化合物至细胞的结合，并且，可以添加自体固有的血清或异种血清来停止该结合反应。然后，在含血清介质(5-10%V/V)中洗涤所述的细胞，并根据应用，将它们置于培养物中或注射给受血者。
在此所述类型的化合物对细胞的结合步骤在上述US4783401中更进一步地详细被描述，其整个公开内容引入本发明的说明书作为参考，恰如在此完全写出来一样。
另一个细胞结合工艺包括，将本发明化合物悬浮于盐水中，以便于形成微胶粒。随后将所述细胞放入生成的悬浮液中，吞噬细胞的细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞和中性白细胞)将优先地成为标记的。这样，就能将本发明的化合物选择性地对准吞噬细胞的细胞。见M.Melnicoff等人的J.Leukocyte Biol.，43387-97(1988)。
现在，参考特定的药物治疗法，对本发明的化合物、组合物和方法的有代表性的应用进行描述。
V.本发明化合物的使用方法A.常用的治疗方法1.同位素治疗的应用由于本发明的化合物具有可引入至含脂质生物相容粒子的脂质组份中的能力和与放射性的、并发射高线性能转换(LET)辐射的离子螯合的能力，因此，它们能用来将辐射疗法传送至疾病部位。通过首先将本发明螯合化合物和适当放射性离子(例如67Cu、90Y、186Re，α-发射体)形成稳定配合物，然后分离配合物，并按照上述常用的细胞结合步骤用本发明的化合物将细胞作标记。
瘤浸润的淋巴细胞(TIL)可以从下疳中分离，在IL-2中膨胀，被结合至如上所述放射性治疗物质并在静脉内注射。标记的细胞示踪转移疾病的部位，并发射杀死转移的瘤细胞的辐射，由此将增加对TIL的治疗有效性，或许还能减少获得疾病消退所要求的细胞数。同样地，也可以使用迁移至转移部位的其它类细胞，用于局部辐射疗法的输送。
2.通过将特定的蛋白质结合至细胞膜的细胞的标记在另一个具体例中，本发明的化合物引入至包括作为生物作用部分的蛋白质、糖蛋白、脂蛋白或肽的蛋白质的物质中。如上所述，这些化合物被结合至细胞上，在其上，所说化合物的烃链将嵌入血浆膜中，由此，将蛋白质置于特定类型细胞的表面上。
上面所述的步骤可以用来将连接至人类纤维蛋白的单克隆抗体结合至载体细胞的表面，例如，用于输送至纤维蛋白凝块部位的红细胞的表面。
一种类似的方法可以用来将连接至人类纤维表面瘤抗原的单克隆抗体通过载体输送至瘤部位，载体例如单核细胞或淋巴细胞。借助对载体细胞(例如红细胞)表面的施加，同样地可以输送软组织纤维蛋白溶酶原活化剂。
如果希望的话，上述疗法可以组合使用。因此，结合至人类纤维蛋白的单克隆抗体可以结合至细胞(例如红细胞)的表面上，该细胞随后也与溶解纤维蛋白的化合物(例如tPA，链球菌激酶、尿激酶)结合。该单克隆抗体能使载体细胞结合至纤维蛋白上，并且，在结合后输送大量治疗的溶解纤维蛋白的化合物。
根据上述常用的制备步骤，这些治疗活性蛋白质可以共轭至亲脂色基上。
上述的工艺也可以用来将各种其它的治疗活性蛋白质或肽引入合适的生物相容粒子中，这些生物粒子如细胞、病毒、脂质体或低密度脂蛋白(LDLs)，由此，在循环过程中，将实质性地延长蛋白质物质的生物有效性。
如上所述，也可以用放射性成象化合物或磁响应成象化合物对蛋白质结合的生物相容粒子进行同位素标记。最终的生物粒子可以对病人注射，借此将细胞迁移至疾病部位，该疾病部位可利用标准的γ-闪烁扫描术或核子成象进行成象，以估价治疗剂的作用。
3.蛋白质偶合至用于菌苗的细胞在本发明的另一个应用中，将免疫原用作生物作用部分，并不是必须地包括用于结合至细胞(例如红细胞，单核细胞)表面的连接基。对免疫原而言，希望能产生保护性的抗体，它可以是蛋白质、糖蛋白、脂蛋白或肽。然后，在存在或不存在辅药的情况下，将如此改性的细胞进行注射。注射的时间间隔将取决于免疫原的性质，但在间隔不少于两周的情况下，通常每次可以注射106个细胞。
相对于抗原的抗体量用标准的Elisa方法进行监测，细胞内的免疫量可通过确定对免疫细胞的增生或对细胞毒性的反应而测量。
4.借助改性细胞表面而使迁移方式变更在该项技术的另一应用中，使用本发明的化合物，能将唾液酸或葡糖氨基聚糖结合至细胞的血浆膜上。如上所述，将特定的化合物置于等渗压介质中，例如，将红细胞置于该溶液中，结果是该化合物结合至血浆膜上。通过添加血清使该反应停止，然后，在含介质的盐水中洗涤这些细胞，准备好用于注射。
作为未成熟细胞的红细胞经过该循环，它们表面上有大量的唾液酸。随着该红细胞的老化，将减少每个细胞上唾液酸的量，这使得脾和肝的巨噬细胞能识别红细胞膜抗原，借此，将它们从循环中除去。借助适当增加唾液酸引入红细胞膜的量，可以增加红细胞在循环中的寿命。增加红细胞寿命的能力对于移植病人或贫血病人可能是有益的。当骨髓移植病人接受移植时，必须几周后，他们才能制造他们自己的红血细胞。借助使用这项延长他们自身红细胞寿命的技术，如果需要，病人能在没有贫血发作的情况下进行若干次骨髓的移植。
在贫血病人的情况下，贫血可由红细胞寿命的减短引起，或由产生红细胞速率的减小而引起。在这两种情况下，增加红细胞的寿命将减少贫血。
5.用于治疗作用的光动力化合物的输送用于癌症治疗的光动力疗法是一个认真探索的领域(Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering;Volume 847，“New Directions in Photodynamic Therapy”，Douglas C.Neckers编辑(1987.10))。大多数这些化合物为酞菁类或血卟啉(hematoporphrin)类。在处理过程中所有吸收光均为600-800nm范围，并产生受激状态的氧。
使用本发明的方法学，制取该化合物的亲脂衍生物，并溶于等渗压溶液中。用这些化合物对瘤选择细胞(例如，TIL)作标记，并将这些细胞给病人注射。随后，这些瘤选择细胞迁移至微转移部位。在48小时内，病人暴露至高强度光区域内，在此区域光动力分子进行吸收，产生的受激状态氧将杀死瘤细胞。而且，载体细胞也将被杀死，这将产生一炎症，由此更多的免疫细胞汇集，以除去死亡的细胞，增加对瘤的毒性。在光动力作用输送的该方法中，载体细胞负责在瘤部位选择性地积累更多的治疗剂。在某些情况下，将本发明化合物直接应用至体腔(如胸膜腔)内的瘤沉积物上，可有助于在该部位的留着，使得在外科手术时进行更有效的腔内放射治疗。
B.通过将治疗活性物质的直接输送而治疗特定的疾病或病理情况1.血管成形术后的再闭塞和再狭窄实验已表明，本发明的化合物能保留在局部的血管部位以及在人造表面上，甚至在连续血流的存在下(见下面实施例8和12)保留。另外，已显示，在玻璃试管和在体内，生物活性能保留在含治疗活性物质的本发明的化合物中(见下面实施例4、13和15)。
动物研究表明，细胞增生和迁移的主要作用是，在血管成形术后约7-21天内将导致血管成形术后的再狭窄的发生。因而，抗增生药必须在血管成形术后通过平滑肌细胞保留在修缮的动脉中多至7～10天，以防止这些作用的发生。含合适抗增生剂的本发明的化合物可以在血管成形术期间输送至损伤的管壁，并且，共轭至该化合物的抗增生剂可通过损伤的细胞被保留。因此，可直接对受影响的细胞给予较高剂量的抗增生药物，并且，该药物通过本发明化合物的应用能在受影响部位较之通过全身药物输送保留更长的时间。例如，在血管成形术中，通过药物输送管的抗增生剂的直接沉积能使该药物结合在血管成形术操作部位的细胞膜上，而在血管成形术操作中任何没结合的药物可从动脉清洗掉。取出药物输送管，已结合至休止细胞上的药物将保留在外膜中，或经过间隙到达更深的细胞层。如果那些细胞进入活性或生长状态的话，本发明的化合物将随膜组分向内传送而移入细胞内。一旦进入细胞内，它们就能发挥其抗增生作用。因此，包含合适抗增生剂的本发明的化合物主要地可以送至疾病部位，并且，在任一时间，由肝或肾处理的药物量被减至最少，这将减少产生严重负作用的机会。
在优选的具体例中，可用于治疗血管成形术后再狭窄的本发明的化合物包含抗增生剂，如，肝素、水蛭素、秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉醇和它们的衍生物。在动脉损伤后，将肝素应用至培养物中的平滑肌细胞，或借助动物给药，结果使细胞减少生长，减少肌内膜增厚以及细胞增生。含肝素的本发明化合物优选制成这样的结构，它们是通过与一种或多种细胞壁组份疏水的相互作用保留在动脉内壁细胞的外膜上，而不是被吸收入那些细胞的内部。相反，如秋水仙碱这样的抗增生剂必须被细胞吸收，以发挥它们的抗增生作用;秋水仙碱影响微管细胞突(tubulin processes)。在这种情况下，最好这样来合成本发明化合物，即使它们能更快速地到达内壁的动脉细胞。在优选的具体例中，秋水仙碱包含用作酸可分裂共轭体的本发明化合物的生物作用部分。该秋水仙碱在其共轭形式是钝化的。然而，当该化合物被吸收入细胞内酸囊时，该制剂将从化合物中释放出，由此使之活化。于是，活性秋水仙碱被送至细胞内其活性部位，并能在其中抑制微管细胞突，从而抑制细胞的分裂。
用于本发明特别优选的化合物是含秋水仙碱的酸可分裂的下面结构式的化合物
另一种有用的含秋水仙碱的化合物结构如下
在本发明实践中准备使用的其它抗增生剂包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，血管肽(angiope ptin)，环孢多肽A，钙通道阻断剂，由生长素抗体衍生的goat-antirabbit血小板，Terbinafine和Trapidil，用于阳离子生长素结合的干扰素-γ和聚阴离子。
2.风湿性关节炎本发明的治疗化合物特别适用于风湿性关节炎的治疗。它们提供了进行化学或放射滑膜切除这样一些手段，使关节能保留大量的治疗剂，而对淋巴结，脾或肝没有显著的全面释放。比所有存在的输送体系都好的一个主要优点是，本发明的化合物被均匀地输送至需治疗的那片组织，并被保留在那些细胞中。就本发明的放射治疗化合物而言，从该化合物发射的放射性产生了对滑膜细胞的治疗作用。如在下面实施例更详细的描述，发现几乎所有在体内的化合物都在被治疗的关节中，并且在6天后，关节中仍保留注射化合物的约70%。这种局部的和持续的留着将减少放射滑膜切除的每个步骤所需的放射性同位素量，并将减少使用传统疗法将全身暴露于由关节释放的放射性同位素而引起的副作用。
特别优选的用于放射滑膜切除的本发明的放射治疗化合物可以如下举例进行合成，以引入适当的放射性同位素。例如，可用或者是(1)含氮和硫的螯合剂，或者是(2)含氮和氧的螯合剂对放射性金属进行络合。放射性同位素可选自放射性卤素，铜、钇、铑、钯、铟、碘、钐、钆、钬、铒、镱、镥、铼、金或它们的组合。
用于本发明的优选的化合物为具有下面结构式的化合物
其中每个R′独立地为氢原子或烷基，最好是低级烷基，或者是取代的低级烷基，其中取代基可是任何酯，R″和R
独立地为氢原子或烷基、m和n各自可为零或1，M表示选自铼、铟、铜和钯的放射性金属。
在优选具体例中，上述结构式Ⅷ的化合物具有如下结构式
其中R和R1为具有C1-30的烃取代基;X和X1可以相同或不同，并表示O、S、C(CH3)2或Se;A表示药理上能接受的阴离子;Z表示氢或金属的配位部位;R′＝R″或
其中每个R′独立地为氢原子或烷基，最好是低级烷基或取代的低级烷基，其中，取代基可是任何酯，R″和R
独立地为氢原子或烷基，m和n各自可为零或1;M表示选自铼、铟、铜和钯的放射性金属。
另一个用于本发明的特别优选的化合物为如下结构的化合物
其中，M表示如铼、铟、铜或钯这样的放射性治疗物质。
另一个有用的化合物为如下结构的化合物
其中R和R1为C1-30的烃取代基，X和X1可以相同或不同，并表示O、S、C(CH3)2或Se;A表示药理上可接受的阴离子;M表示选自铜、锝、铑、钯、铟、钐、钆、钬、铒、镱、镥、铼、钇、金，或它们的组合物的放射性治疗物质;n为2、3或4;m为1或2;P为1～6。
3.卵巢癌含化学治疗剂或放射治疗剂的本发明的化合物将能使那些治疗剂以高浓度，直接输送至卵巢瘤细胞增生部位。而且，这些治疗剂将在腹膜腔内保留较长的一段时间，因此，阻止了瘤细胞的扩散作用。此外，这一方式可在没有通过全身输送高浓度的这种治疗剂所伴随的明显副作用下完成。
本发明的化合物可以在外科手术后，通过用作治疗的Tenckhoff导管在腹膜内输送，或在外科手术时作为辅助疗法，通过剖腹术的第二观察孔(second-look laparotomy)，在腹膜内输送。
如前所述，含秋水仙碱的酸可分裂的本发明的化合物将也能用于卵巢瘤细胞的抗增生治疗。如上所述，这样的分子将以无毒形态保留在细胞的外膜上。然而，当该化合物被吸收入细胞内时，化学治疗药物从化合物的残余部分分裂，该化学治疗物质能发挥其抗增生活性。
4.牛皮癣含皮质甾类的本发明的化合物可用来帮助牛皮癣的治疗。它们能在牛皮癣损害的部位提供较多的药物留着，因此，在减少角蛋白细胞和免疫细胞的增生方面，增强了药物的效力。此外，在损害部位本发明化合物的留着，将阻止可能有毒的化合物渗入循环系统。这将产生临床的益处，其中，在两周连续用药后，该疗法不需要由于抗增生药物的高血清浓度而中断。
根据本发明的其它应用，血小板或低密度脂蛋白(LDL)可以用于早期探测动脉粥样硬化的动脉粥样硬化斑沉着部位的示踪。血小板可以用标准的梯度技术从个人的血液中分离出，然后作为不是必须的诊断部分用铟或锝作标记，并向静脉内再注射。在上述US4762701中提供了将所述类型的化合物结合至血小板上的合适的方法。在注射后的48小时内，放射性标记的血小板将在动脉壁斑形成部位积累，使用γ摄影机能探测到斑形成部位的γ辐射。
同样地，LDL也可以用标准的超离心技术提纯，并凭借其高脂含量和相对于生物相容粒子脂区域的本发明化合物的结合力，用本发明的化合物作标记。这些放射性标记的LDL将在再注射后，在动脉粥样硬化斑形成处积累，使得通过该成象能探测。还知道，单核细胞也在动脉粥样硬化斑处积累，因而，还可用于单核细胞形成的探测。可以预料，对它们的限制只是用于放射性标记的适量提纯的单核细胞的有效性。
还知道，血小板也在血栓形成部位(例如，冠状形成血栓、深静脉形成血栓、血管内接枝)和器官移植后的严重障碍部位积累。因此，当与药物疗法结合时，通过标准方法分离的并利用本发明的化合物和方法放射性标记的自体固有血小板也将提供这种疾病过程的非侵入的诊断。
此外，使用螯合剂能结合至放射性金属离子上，同时也能制造上述结构式Ⅰ化合物的荧光或非荧光化合物，其中放射性同位素原子，如，放射性碘、碳、氮、硫、磷或硒原子是该分子的组成部分。对使用本发明放射同位素地标记的化合物能辐射足够γ-射线能的化合物，可用γ-闪烁照相法进行探测。如果同位素是低能非穿透的β-发射体的话，那么，使用标准的β-计数技术，该化合物能用于研究应用。
本发明的生物素化的亲脂化合物能起多用途反应剂的作用。例如，这样的化合物可用来使通常不粘着的细胞迅速地粘着至选择的表面上。这对于要求固定化细胞的分析，即用于单个细胞全部时间的监测是重要的。如果将细胞总体用本发明的生物素化的化合物作标记，并将最终标记的细胞与抗生蛋白链菌素结合的表面接触的话，这些细胞将迅速地粘着至该表面。该细胞的分析能立即开始。与生物素化的化合物结合的荧光在实验期间还提供用肉眼监测细胞的简便手段。
此外，前述已表明，通过荧光的稀释，荧光细胞标记的化合物能用来监测细胞的生长并测量生长率(US4859584)。在5-8个倍增时间(取决于细胞类型)后，当标记化合物的荧光减至自动荧光值时，该技术将失去灵敏性。通过将荧光染料共轭的抗生蛋白链菌素结合至在此所述的例如生物素化的花青上，可实现对荧光的放大。借助该方法，甚至在色基荧光已降至自动荧光值后，仍能辨别标记的细胞。如果还需要进一步的灵敏性，可将放射-标记的抗生蛋白链菌素结合至本发明的生物素化的化合物上，然后可进行放射自显影法，以辨别标记的细胞。
本发明生物素化的化合物的另一个应用是在蛋白质中的结合。对于某些大分子蛋白质，也许不能通过将该蛋白质共价键地结合至本发明的亲脂化合物(如上述结构式Ⅲ所表示的)上而将该蛋白质连接至细胞上。在这种情况下，另一种偶合机理为抗生物素蛋白-生物素结合对。为此目的，目标细胞可以用本发明生物素化的化合物作标记，该大分子蛋白质被共轭至抗生物素蛋白上或抗生物素蛋白的合适衍生物如抗生蛋白链菌素上。随后将生物素化的细胞暴露至抗生物素蛋白-蛋白质共轭体，结果是蛋白质稳定地结合至细胞上。
c.药物制剂相对于用生物相容介质如无盐的等渗压溶液或药理上可接受的液体赋形剂给药，含本发明化合物的药物制剂可方便地配制。赋形剂包括各种惰性油，例如，植物油如橄榄油或花生油，或高度精炼的矿物油。根据化合物的性质和要治疗的疾病或病理情况，在所选介质中活性配料的浓度将有所不同。
为了便于给药以及剂量均匀，以剂量单位的形式配制药物制剂是特别有益的。在此所用的剂量单位形式指的是适用于病人进行治疗的实际上分散的药物制剂单位。每剂量单位必须包含计算量的活性配料，与选择的药物载体相结合以产生希望的治疗作用。在给定类型的病人中，用于抑制细胞增生或用于其它病理情况治疗的合适剂量单位的测量方法对于本领域熟练技术人员来说是熟知的。例如，在辐射滑膜切除术中，以各种胶体形式给药的约5毫居里(mci)90Y(半衰期，2.7天，β能，2.2MeV)或300mci165Dy(半衰期，2.3小时，β能，1.3MeV)的剂量已表明临床是有效的。见P.Lee，J.Rheumatol.，9165-167(1982);C.Sledge等人，Clin.Orthop.，18237-40(1984)。利用标准的剂量测量计算，估计使用约10mci剂量的186Re(半衰期3.7天，β能0.98MeV)将获得同样的治疗作用，该剂量将通过注射以200mci/μmole的特定活性制备的约0.05微摩尔(μmoles)合适的化合物(例如反应方案5的化合物23)来提供。其它的放射性治疗同位素在现有技术中也是已知的。见W.Volkert等人，J.Nucl.Med.，32174-185(1991)。预期，本发明的其它化合物也可用于输送有效量的这类治疗剂。
在瘤的放射处理中，当通过单克隆抗体输送时，相对于固体瘤而言，已建议80Gy的剂量为放射疗法的灭菌剂量。见J.Humm，J.Nucl.Med，271490-1497(1986)。预期，结合至细胞面膜并使之内部化，将增强这种疗法的效力。见Humm J.L.，J.Nucl.Med.，3175-83(1990)。通过注射约0.8毫微摩尔(nmoles)的以200mci/μmole的特定活性制备的化合物23，将提供80Gy的剂量。还可预期，本发明的该化合物和其它化合物可用于输送现有技术中已知的其它放射治疗的同位素。见W.Volkert等人，Supra.。和其它类型的抗癌放射性药物一样，本发明的化合物可直接输送到瘤组织中，输送入含扩散的瘤的体腔中，或输送入供应该瘤的血管中等。见C.Hoefnagel，Anti-Cancer Drugs，2107-132(1991)。
在血管成形术后的再狭窄治疗中，为了表明能将足够量的本发明的化合物输送至病理生理部位，可注意按Grines等人，Circulation，84Ⅱ-365(1991)给药的每人1mg/天治疗剂量的秋水仙碱，这不能防止再狭窄，导致2毫微克(ng)/毫升(ml)或5纳米(秋水仙碱分子量＝399.4)的血浆峰值浓度。见Bochner等人，Handbook of Clinical Pharmacology，Little，Brown and Co.，Boston(1983)，pp.151-152。假定(ⅰ)在兔子中秋水仙碱的吸收和分布相同;(ⅱ)兔子平均体重为3kg;(ⅲ)人平均体重为70kg，按Currier等人，Circulation，80Ⅱ-66(1989)使用的0.2mg/kg·天的剂量，将成功地防止再狭窄，相应的兔子的血浆浓度为28mg/ml或70nM。因此，防止再狭窄所显示的在兔子中的秋水仙碱浓度为临床试验取得的浓度的14倍。本发明的化合物能在上述的相容结合介质中高至100μM即1400倍于动物研究中所显示的是有效的浓度中进行制备，并能在血管成形过程中，由导管直接输送至动脉壁上。
本发明的药物制剂优选借助注射，腹膜内灌注或导管插入进行给药。其它的给药方式也可能是有效的，如在某些情况下的口服给药，或烟雾化作用给药。
该药物制剂可以以适当的间隔进行给药。由于本发明化合物的性质，重复给药似乎是不需要的。确定药物制剂给药频率的方法对相应医学领域的熟练技术人员来说是熟知的。在任何情况下，在任何特定场合的适当间隙通常都将取决于要治疗的病人的状况以及药理情况的类型。
现提供下述实施例，以更详细的描述本发明。这些例子只是阐明本发明的某些方面，而不将以任何方式解释为对本发明的限制。
实施例1膜留着率的测定膜留着率(MRC)提供关于给定化合物在细胞血浆膜中保留多好的信息，它按如下所述测定。
借助将全部血液于300×g离心15分钟，除去血浆，并于0.83%(W/V)的氯化铵中再悬浮细胞丸，完成了用作模型膜的红血细胞空胞的生产。借助在10000×g离心10分钟，由氯化铵将这些空胞制成丸。最少重复该氯化铵的洗涤处理5次，以保证细胞中的血红蛋白已完全释放出。在能用仪器分析或荧光显微方法对标记的空胞进行探测的浓度和在用来标记上述特定应用的细胞的浓度相同的浓度下，用上述化合物对空胞作标记。考虑到下文的测定，在2×10-3摩尔浓度于乙醇中制备上述化合物的储备液，并在等渗压蔗糖(52g/500ml蒸馏水)中制备该化合物的操作稀释物。在空胞于化合物的操作稀释物中以约1×109空胞/ml的浓度孵育10分钟后，将试样于10000×g进行离心分离，以将空胞制成丸，并从试样中抽出染色液。将标记的空胞再悬浮于含10%胎牛血清(PBS-FBS)的磷酸盐缓冲的盐水液中。从每个试样中取出三份20μl的等分试样，用于测定存在化合物的总量。如上所述将试样进行离心作用，并从上层清液中取出三份20μl的等分试样，用于定量地测定存在的没结合的化合物的量。
取样后，抽出上层清液，并将红细胞空胞丸再悬浮于1.0ml的PBS-FBS中，如上所述再进行一次试验。重复该过程至少6次，以便于快速释放的化合物的探测，并在等于或大于24小时的时间后监测该过程以便于更慢释放的化合物的探测。为了对每个试样中存在的化合物量进行测定，借助摇动，将20μl等分试样萃取入3.0ml正丁醇中。以3000×g离心分离这些试样，以除去膜碎屑，并将丁醇馏份进行化合物浓度的分析。利用要被分析的特定化合物的峰值激发和辐射波长，以这种方式分析荧光化合物，以测定每个试样中的荧光单元。放射性标记的化合物不要求丁醇萃取，并且可以用β或γ计算仪直接进行分析。
如上所述的每个试样中存在的化合物量的测定便于每次洗涤或固定时间点的MRC的计算。借助下式获得MRC值(CT-CS)/C＊T100其中CT表示在整个试样中存在的化合物量(利用借助用于分析化合物的方法测定的单位)，CS表示特定时间点的上层清液试样中存在的化合物量。MRC值的对比确定了本发明化合物的判断标准，这些标准是1)每个洗涤步骤测定的MRC值至少必须具有约90的值，2)经过至少24小时的MRC值间的百分差值必须小于约10%。
下表Ⅰ中提供的数据是由一个实验得到的结果，并用作MRC测定的例子。在表Ⅰ中，如A-C来表示的化合物具有上述结构式Ⅻ，其中在每个化合物中X和X1表示C(CH3)2，Z和Z1表示H，R/R1表示C-5/C-5(化合物A)、C-10/C-10(化合物B)以及C-14/C-14(化合物C);如D-K表示的化合物还具有结构式ⅩⅢ，其中Z和Z1表示氢，R/R1表示C-14/C-3(化合物D)、C-18/C-3(化合物E)、C-20(3，7，11，15-四甲基十六烷基)/C-3(化合物F)、C-22/C-3(化合物G)、C-20/C-3(化合物H)、C-18/C-8(化合物I)、C-18/C-5(化合物J)以及C-22/C-3(化合物K);如L-N表示的化合物具有上述结构式ⅩⅣ，其中Z和Z1都表示N(CH3)2(在环的3和6位)，Z2表示H，R表示C-22(化合物L)、C-18(化合物M)以及C-26(化合物N)。在化合物K中，阴离子为氯化物，在所有剩余的化合物中，阴离子为碘化物。
上表Ⅰ中所列的MRC值与如前述国际申请PCT/US89/00087中所述的，由细胞内化合物转移分析得到的结果相比显示出优异的一致性。
实施例2膜结合稳定性的测定已知，从含水相(例如细胞外介质)至液态烃相(例如生物膜的烃内部)的烃链转移自由能取决于烃链的支化度，不饱和度和亚甲基数。亚甲基烃相互作用的自由能相对于最靠近水界面的亚甲基而言是最小的，并随依次的亚甲基而增大，最终约与在含非极性烃的溶剂中，烃基的4个或更多个碳进入膜脂质内部的烃发现的自由能相等。因此，有可能计算任何结构，如本发明的化合物，它含有由4个或更多个碳组成的极性首基和线性烃尾(单个或多个的，对称或不对称的)，当完全浸于烃溶剂中时，碳当量数将近似等于结合的自由能，如下所述碳当量＝0+0.25+0.5+0.75+n-4(+)0+0.25+0.5+0.75+m-4(+)……，其中n等于第一个烃尾中线性烃数，m等于第二烃尾中线性烃数，等等。
按上述实施例1所述的那样进行测定，已实验地测得，本发明化合物的碳当量和它们的膜留着率(MRC)之间存在着相关性。例如，具有碳当量大于18-19的本发明化合物具有90的MRC或更大，并且，用细胞内化合物转移分析(见上述)时，在标记的和未标记的细胞间显示出最小的转移。因此，可以预料，这些化合物也将显示出在体内与标记的细胞结合的良好的稳定性。令人惊奇的是，情况不总是这样。实际上，显示出MRC仅10%不同的本发明的若干化合物显示出在体内相差10倍的损失率。
利用在体内在化合物和生物膜之间的结合稳定性以及可预示性的某些测量，对于能评估本发明化合物和方法的各种实际应用是重要的。例如，相对于如治疗放射性核输送至瘤部位的应用而言，可能要求十分稳定地结合至膜上，因为化合物的损失将在非瘤部位导致放射性核产生的毒性作用。另一方面，相对于涉及控制治疗剂释放速率的应用而言，从生物膜上更快速地损失化合物可能是所希望的。因此，在下文中将描述在与体内近似的条件下测定MBS的试验。
在该试验进行过程中，使用近似生理浓度的血清白蛋白(5%)。另外，因为本发明的许多化合物在含5%白蛋白的盐水中是低溶解性的，所以，在含限定体积的“生理”液的密闭体系中，在24小时内在膜中的溶解性和在周围介质中的溶解性之间达到平衡。为了更近似于在体内标记的细胞暴露于其中的大液体体积的作用，借助在固定体积的含白蛋白盐水中悬浮减少量的标记的膜空胞而进行MBS的试验。在24小时时，借助对混合良好的悬浮液进行取样测定存在的标记总量，然后，借助离心作用将膜空胞制成丸，并测定释放入上层清液中的标记量，并以总标记的百分数来表示。依据每毫升悬浮液的空胞数对百分留着率作图，并测定MBS为5×107空胞/ml和4×108空胞/ml之间的曲线下的面积。在该试验中，显示出无限的膜结合稳定性的化合物将给出3.5×1010的MBS，该结果将被表达为这个最大MBS的百分数。
下表分别列出了根据本发明化合物有代表性的试样的如上面实施例1所述的MRC测定数据和本实施例MBS测定数据。用O-T表示的化合物具有结构式Ⅻ，其中X和X1表示C(CH3)2，Z和Z1表示H，R/R1表示C-12/C-10(化合物0)、C-22/C-12(化合物P)、C-14/C-3(化合物Q)、C-14/C-14(化合物R)、C-16/C-16(化合物S)和C-22/C-14(化合物T)。
表ⅡMRC#MBS(最在体内膜的化合物碳当量 (24小时时) 大值的%) 半衰期(天*)O 15 30±4.7 19±3.5 <1P 19 65±2.0 48±3.1 1.4Q 20.25 85±0.6 41±5.0 10±0.7R 23 87±0.6 55±1.7 36S 27 87±1.2 79±3.7 58T 31 97±0.1 85±1.7 130±17＊如在Slezak和Horan，Blood.742172-77，(1990)中所述测定的，在标记并在体内再注射确定后，由兔子红细胞染料损失的半衰期(±标准误差的中间值)。
由上表可看出，MBS试验使得MRC几乎相同但在体内与生物膜结合的稳定性有所不同的化合物的区分成为可能。
利用MBS试验选择用于本发明各种应用具有适当结合特性的化合物的附加益处是，它能识别首基结构变化对膜结合稳定性的影响，而MRC试验对此几乎无能为力。如下表Ⅲ可以看出，烃尾长度(表达为使对称和不对称结构能对比的碳当量)和首基结构都对膜结合稳定性有显著的影响，在低至碳当量中间值时，首基的影响更为显著。因此，对用于本发明实践的带各种官能团的其它类型的首基而言(例如，放射性金属螯合剂，蛋白质，肽，放射性核等)，可以测得有相同的影响，并可以估算在首基影响和需要达到希望的膜结合稳定性的碳当量之间的平衡。MBS至少约30%或更大的化合物预期可用于下述类型的本发明的应用中。还可观察到，即使碳当量数保持恒定，首基上的取代基对膜结合稳定性也有显著的影响。如下表Ⅲ可看出，化合物AC和AD仅在首基取代基上有所不同，然而它们各自的MBS值却大不相同。
在表Ⅲ中，用U、W和Y表示的化合物具有上述结构式ⅩⅢ，其中在每个化合物中X和X1表示O，Z和Z1表示H，R/R1表示C-22/C-3(化合物U)、C-14/C-14(化合物W)和C-18/C-18(化合物Y);用V、X和AA表示的化合物具有结构式Ⅻ，其中X和X1表示S，Z和Z1表示H，R/R1表示C-22/C-3(化合物V)、C-14/C-14(化合物X)和C-18/C-18(化合物AA)。
用AB、AC和AD表示的化合物具有上述结构式Ⅻ，其中X和X1表示(CH3)2，Z1表示H，R/R1表示C-14/C-22(化合物AB)和C-14/C-3(化合物AC、AD)。在化合物AB中，Z表示-CH2-NHOCH。在化合物AC中，Z表示H。在化合物AD中，Z表示如下所示的不可分裂的秋水仙碱衍生物。
在表Ⅰ-Ⅲ中鉴定的许多对称染料是从Molecular Probes Inc.，Eugene，OR得到的。
表Ⅲ化合物 首基类型 碳当量 MBSQ 吲哚羰花青(Indocarbocyanine) 20.25 42±5.7U 噁羰花青(Oxacarbocyanine) 20.25 47±3.1V 噻羰花青(Thiacarbocyanine) 20.25 64±3.4R 吲哚羰花青 23 55±1.6W 噁羰花青 23 77±1.1X 噻羰花青 23 91±1.3T 吲哚羰花青 31 85±1.7Y 噁羰花青 31 93±1.0AA 噻羰花青 31 94±1.5AB 吲哚羰花青 31 91±0.5AC 吲哚羰花青 12.25 10±2.1AD 吲哚羰花青 12.25 28±1.0例3化合物的制备a)5-氨基甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物的制备按照上述反应图1制备主题化合物。在下面叙述中，括号中给出的数字表示在反应图1中显示的对应数字的反应物。所得产物具有化合物8的化学式，其中X和X1表示C(CH3)2和R/R1表示C14H29/C22H45及A表示I。
通过Gale等人，Aust.J.Chem.，30693(1977)的改进方法制备5-(N-苯二酰亚氨基氨基甲基)-2，3，3，-(3H)-三甲基假吲哚(1)。将2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚(23.85g，0.15mol，Aldrich)溶解在150ml浓硫酸中。然后烧瓶置于冰浴中并在30分钟内分批加入N-羟基甲基邻苯二甲酰亚胺(26.55g，0.15mol，Fluka)。移出冰浴并将溶液在室温搅拌5天。然后反应混合物倒入200g碎冰中，在通过加冰(需要时)保持温度低于35℃的同时用50%NaOH溶液将PH值调至9.0。过滤收集生成的沉淀物，用蒸馏水洗并在高真空下干燥过夜。从二氯甲烷/己烷中再结晶出粗产物，生成5-(N-苯二酰亚氨基氨基甲基)-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚(1)(30g，63%)。
用PCT/US89/00087中所述方法制备二十二烷基-4-氯苯磺酸酯。
以类似的方法制备十四烷基-4-氯苯磺酸酯。将5-(N-苯二酰亚氨基氨基甲基)-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚(6.36g，2mmol)和十四烷基-4-氯苯磺酸酯(7.62g，2mmol)混合，并一同在130℃加热2小时。然后反应混合物冷却到室温，粗产物从乙酸乙酯中再结晶出，生成纯5-(N-苯二酰亚氨基氨基甲基)-1-十四烷基-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚鎓4-氯苯磺酸盐(2)(10.23g，72%)，m.p.＝141℃。
在搅拌的同时将2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(6.26g，0.04mol，Aldrich)和正二十二烷基-4-氯苯磺酸酯(20.02g，0.04mol)一同在140℃加热3小时。然后反应混合物冷却到室温，生成腊状固体。然后将固体溶解在乙醇(250ml)中，加入200ml饱和KI溶液，该溶液搅拌30分钟。加入1升冷水并继续搅拌15分钟。收集生成沉淀物，用蒸馏水洗两次，在高真空下干燥一夜。从二氯甲烷/已烷中再结晶出粗物料，生成纯1-二十二烷基-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚鎓碘化物(5)(14.5g，61%)，m.p.＝107-110℃。
将1-二十二烷基-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚鎓碘化物(8.94g，0.015mol)、N，N-二苯基甲脒(2.94g，0.015mol，Aldrich)和乙酐(60ml)置于装有冷凝器的圆底烧瓶中，烧瓶用氩气纯化，然后冷凝器装干燥管。将烧瓶放入预加热的油浴(160℃)中并回流60分钟。然后从油浴移去烧瓶并冷却到室温，再转移至1升锥瓶中并用乙醇(60ml)及接着60ml饱和KI溶液稀释，混合物搅拌30分钟。加入冷水(800ml)并再继续搅拌15分钟。过滤收集沉淀产生，用蒸馏水洗并在高真空下干燥一夜，生成2-(β-乙酰苯胺乙烯基)-1-二十二烷基-3，3-(3H)二甲基假吲哚鎓碘化物(6)(10.52g，95%)，m.p.＝98～100℃。使用未进一步纯化的粗产物。
将5-(N-苯二酰亚氨基氨基甲基)-1-十四烷基-2，3，3-(3H)-三甲基假吲哚鎓、4-氯苯磺酸盐(2)(14.1g，20mmol)溶解在300ml浓盐酸中。溶液缓慢加热到115℃(小心，可起泡沫)并回流22小时。此后混合物冷却到室温并置于冰浴中。在保持温度在15和20℃之间的同时，用氢氧化铵(30%)将pH值调至9.0。然后用蒸馏水将溶液稀释到其体积的两倍，并用二氯甲烷萃取(3×200ml)。混合二氯甲烷萃取液，经硫酸镁干燥，浓缩得到黄色油状5-氨基甲基-3，3-二甲基-2-亚甲基-1-十四烷基二氢吲哚(3)(6.9g，90%)。
将5-氨基甲基-3，3-二甲基-2-亚甲基-1-十四烷基二氢吲哚(14.88g，38.75mmol)溶解在甲酸甲酯(75ml)中，并于氩气下加热回流(55℃)24小时。然后溶液冷却到室温并蒸出甲酸甲酯。剩余物从己烷中再结晶出，生成5-(N-甲酰氨基甲基)-3，3-二甲基-2-亚甲基-1-十四烷基二氢吲哚(4)(10.85g，68%)。
将2-(β-乙酰苯胺基乙烯基)-1-二十二烷基-3，3-(3H)-二甲基假吲哚鎓碘化物(6)(740mg，1mmol)和5-(N-甲酰氨基甲基)-3，3-二甲基-2-亚甲基-1-十四烷基二氢吲哚(4)(330mg，0.8mmol)以及无水乙酸钠(150mg，1.8mmol)溶解在异丙醇中并在室温搅拌24小时。然后溶液送入250ml锥瓶，用乙醇(20ml)和KI饱和溶液(20ml)稀释，混合物搅拌30分钟。通过加100ml冷水沉淀出产物并搅拌生成液15分钟。过滤收集沉淀物，用蒸馏水洗并在高真空下干燥一夜。粗产物(870mg)分成两批，各由快速柱色谱法(硅胶，10%异丙醇在二氯甲烷中)纯化，生成纯1′-二十二烷基-5-(N-甲酰氨基甲基)-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物(7)(414mg，52%)。
将100ml的浓盐酸∶甲醇溶液(由混合11ml浓盐酸和120ml甲醇制备)加到1′-二十二烷基-5-(N-甲酰氨基甲基)-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物(7)(250mg)中，溶液在室温搅拌16-24小时。然后溶液用冰水(100ml)稀释，在冰浴中冷却并由缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液调PH值至7.5～8.0。然后液相用二氯甲烷萃取(2×100ml)，混合有机相经硫酸钠干燥、过滤、浓缩(Buchi浴温度＜30℃)，然后在高真空下干燥，生成产物(8)(240mg，98%)。
b)2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-氨基甲基-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基〕-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物也按照反应图1制备主题化合物。还是在此叙述中，括号中给定的数字表示在反应图1中显示的对应数字的反应物。所得产物具有化合物(8)的化学式，其中X代表C(CH3)2，X代表氧，R/R1代表C14H29/C22H45和A代表碘离子。
如上所述制备的2-甲基苯并噁唑(2.65g，19.9mmol，Aldrich)和二十二烷基-4-氯苯磺酸酯(10.0g，19.9mmol)的搅拌溶液在160-170℃(油浴温度)加热6小时。此后，反应混合物冷却到室温，从二氯甲烷中再结晶出生成的固体物，生成纯1-二十二烷基-2-甲基苯并噁唑鎓-4-氯苯磺酸盐(5)(7.3g，58%)，m.p.＝124～125℃。
1-二十二烷基-2-甲基-苯并噁唑鎓-4-氯苯磺酸盐(5)(1.5g，2.36mmol)、N，N′-二苯基甲脒(0.462g，2.36mmol，Aldrich)和乙酐(7ml)的搅拌溶液在油浴(预热到160℃)中回流30分钟。在冷却到室温时，混合物用纯乙醇(15ml)及接着饱和碘化钾溶液(10ml)稀释，并搅拌30分钟，然后加水(150ml)和过滤收集沉淀产物，用水洗并在高真空下干燥一夜。从乙酸乙酯中再结晶出干燥的粗产物，生成纯2-(β-乙酰苯胺-乙烯基)-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物(6)(1.51g，90%)，m.p.＝67-68℃。
2-(β-乙酰苯胺乙烯基)-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物(6)(1.10g，1.53mmol)、5-(N-甲酰氨基甲基)-1-十四烷基-3，3-二甲基-2-亚甲基二氢吲哚(4)(630mg，1.53mmol)(如上述3a中制备)、三乙胺(0.5ml)和乙醇(25ml)加热回流1小时。然后溶液冷却到室温，送入锥瓶并用乙醇(40ml)和饱和KI溶液(20ml)稀释。该混合物搅拌30分钟后加200ml冷水，用二氯甲烷萃取该溶液。混合二氯甲烷萃取液，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩，生成粗产物。该产物由快速柱色谱法(硅胶，5%甲醇在二氯甲烷中)纯化，生成2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(N-甲酰氨基甲基)-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基〕-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物(7)(305mg，20%)。
将如上述(a)中制备的25ml浓HCl∶甲醇溶液加到2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(N-甲酰氨基甲基)-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基〕-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物(7)(50mg)中，溶液在室温搅拌16-24小时。然后溶液用冰水(30ml)稀释，在冰浴中冷却，由缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液调PH值至7.5～8.0。然后用二氯甲烷萃取水相(2×50ml)，混合有机相经硫酸钠干燥，过滤浓缩(Buchi浴温度0-5℃)，然后在高真空下干燥，得到产物(8)(48mg，99%)。
(c)5-氨基甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物的对苯二酰N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物。
在室温和氩气气氛下经套管向在干燥四氢呋喃(30ml)中的对苯二甲酸的二-N-羟基琥珀酰亚胺酯(100mg，0.278mmol)(由对苯二酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺反应制备)的搅拌溶液添加在四氢呋喃(10ml)中的5-氨基甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物(如上面3a中制备)的溶液。生成的溶液搅拌2小时，然后在Buchi上浓缩。得到的粗产物由快速柱色谱法(硅胶，5%，甲醇在二氯甲烷中)纯化，制成主题化合物(101mg，34%)。
d)P-5-亲脂花青共轭物在氩气气氛下于0-2℃向在干燥二甲基甲酰胺(10ml)中的物质P(21mg，0.013mmol)和上述例3c的产物(30mg，0.024mmole)的搅拌溶液中加三乙胺(60μl)，生成的溶液在0-2℃搅拌4小时，通过加三氟乙酸(100μl)抑制反应，溶液送入250ml烧瓶，用水(80ml)稀释并冻干一夜。生成物经过十八烷基硅胶柱纯化，先用80∶20∶1(甲醇∶水∶三氟乙酸)洗脱以除去非共轭肽，然后用100∶2∶1(甲醇∶水∶三氟乙酸)洗脱需要的产物。混合含有肽-亲脂花青共轭物的成份在Buchi上浓缩，剩留物从水中(50ml)冰干，得到红紫色粉末状纯共轭物(14mg，40%)。高效液体色谱(hplc)纯度大于90%，同时游离物P低于0.02%。所得的共轭物具有下述结构式(其中用常用的三个字母符号表示物质P的氨基酸次序)
由于肽和花青信息基团均是由酰胺键连接到间隔基团部分，因此生成的共轭物在体内是相对稳定的。
e)2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(+)-生物素酰胺基甲基-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基)-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物在氩气气氛下，如上述例3b中制备的在二甲基甲酰胺中的2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-氨基甲基-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基〕-1-二十二烷基苯并噁唑鎓碘化物(53mg，0.055mmol)的搅拌溶液在冰浴中冷却。向该溶液中加(+)-生物素4-硝基苯酯(23mg，0.63mmol，Aldrich)，然后加咪唑(16mg，0.23mmol，Aldrich)，溶液在冰浴中搅拌1小时，然后在室温搅拌一夜。反应混合物于高真空下在Buchi上浓缩，剩余物快速色谱(硅胶，7.5%甲醇在二氯甲烷中，然后10%甲醇在二氯甲烷中)，生成主题化合物(22mg，36%)。
f)5-｛6-(6-(+)-生物素酰基酰氨基己酰氨基)-己酰氨基甲基｝-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物。
再使用如上述例3e所述的同样方法和下述量的反应物如上述制备的5-氨基甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物(90mg，0.09mmol)6-〔6-((生物素酰基)氨基)己酰氨基己酸N-羟基-琥珀酰亚胺酯(55mg，0.097mmol，Molecular Probes)，二甲基甲酰胺(20ml)和咪唑(20mg，0.24mmol)。快速色谱法(硅胶，10%甲醇在二氯甲烷中)，生成主题化合物(27.5mg，21%)。
分别由N-羟基琥珀酰亚胺基6-(生物素酰氨基)己酸酯和6-〔6-((生物素酰基)氨基)己酰氨基〕己酸N-羟基琥珀酰亚胺脂(购自Molecular Probes)类似制备化合物2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(6-｛(+)-生物素酰氨基)己酰氨基甲基)-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基-1-二十二烷基-苯并噁唑鎓和2-｛3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(6-(6(+)-生物素酰氨基己酰氨基)己酰氨基甲基)-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基)-1-丙烯基〕-1-二十二烷基苯并噁唑鎓盐。
g)N-正-二十二烷基-N′-正十四烷基-5-三丁基甲锡烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物按反应图2合成主题化合物，所得产物具有化合物(13)的化学式，其中X和X1代表C(CH3)2，R/R1代表C22H45/C14H29和A代表Cl。由Blaikie等人在J.Chem.Soc.313;296(1924)的方法制备4-碘苯基肼。将溶解在水(100ml)中的硝酸钠(16.56g，0.24mol，Aldrich)在45分钟内滴加到在冰水(600ml)和浓盐酸(200ml)中的4-碘苯胺(43.9g，0.20ml，Aldrich)的溶液(已冷却到0-2℃)中。反应混合物再于0-2℃搅拌30分钟，在保持反应混合物温度在0-2℃的同时，在90分钟内将在浓HCl(150ml)中的氯化锡(Ⅱ)(151.68g，10.8ml，Aldrich)滴入。添加完后，将反应混合物升到室温并搅拌3小时。然后过滤收集从溶液中分离出的黄色固体，置于冰水(800ml)中，用25%氢氧化钾水溶液调PH值至10。过滤收集生成的固体，用少量水洗涤，并在真空下干燥。然后产品置于甲苯(400ml)中并过滤除去不溶杂质。加入己烷(1200ml)，因在冰箱中冷却分离出了黄色针状晶体，将其过滤收集，用己烷(100ml)洗涤，并在高真空下干燥，生成纯4-碘苯基肼(23.36g，50%)，m.p.＝94℃。
用Moreau等人，在Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.，9(3);274-280(1974)中的改进方法制备5-碘-2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(9)。将在乙醇(100ml)中的4-碘苯基肼(23.36g，0.0998mol)和2-甲基丁酮(8.59g，0.0998mol)的溶液回流3小时。此后，用1小时时间滴加溶解在乙醇(100ml)中的浓硫酸(9.92g，0.0998mol)，生成的溶液再回流3小时。在冷却到室温的同时，过滤除去沉淀的固体，滤液浓缩到80ml，然后倒入冰水中。然后用二氯甲烷萃取水溶液，经硫酸镁干燥混合有机相，过滤并浓缩，生成粗产物(26.9g，95.0%)。真空蒸馏后得到纯产物5-碘-2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(9)(16.7g，59.0%)，b.p.81-88℃(在0.03mmHg下)。
在连续搅拌的同时，5-碘-2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(2.85g，0.01mol)和正二十二烷基-4-氯苯碘酸酯(5.55g，0.01mol)在130℃(油浴温度)加热4小时。接着冷却的反应混合物从乙酸乙酯中再结晶出，生成褐色晶体的N-正二十二烷基-5-碘-2，3，3-三甲基二氢吲哚鎓4-氯苯碘酸盐(10)(4.62g，59%)m.p.＝118℃。
在连续搅拌的同时，2，3，3-三甲基-(3H)-假吲哚(6.36g，0.04mol，Aldrich)和正十四烷基-4-氯苯碘酸酯(15.52g，0.04mol)一起在130-135℃(油浴温度)加热3小时。然后粗产物溶解在乙醇(200ml)中，并与饱和碘化钾溶液(50ml)搅拌30分钟。加冷水(500ml)，过滤收集沉淀物，用冷冰洗净。从乙酸乙酯中结晶出干燥的粗产物，用乙醚洗净收集的晶体并干燥，生成N-十四烷基-2，3，3-三甲基二氢吲哚鎓碘化物(5)(12.8g，66.8%)，m.p.＝97℃。
将N-二十二烷基-5-碘-2，3，3-三甲基二氢吲哚鎓4-氯苯磺酸盐(2.36g，3.0mmol)，N，N′-二苯基甲脒(0.59g，3.0mmol.Aldrich)和乙酐(20ml)放入50ml圆底烧瓶中，该烧瓶处于氩气气氛下并装有回流冷凝器和搅拌杆。然后该烧瓶置于油浴中，该油浴已预热到170℃的恒温，混合物回流60分钟。然后反应烧瓶冷却到室温，然后送入500ml锥瓶中。然后该瓶置于冰浴中并加饱和碘化钾溶液。搅拌15分钟后，加入冷水(250ml)，混合物再搅拌15分钟。过滤收集并干燥沉淀的产物，得到N-正二十二烷基-5-碘-2-(β-乙酰苯胺乙烯基)-3，3-二甲基二氢吲哚鎓碘化物(11)(2.37g，91%)，m.p.＝170℃(分解)。
在室温下将N-二十二烷基-5-碘-2-(β-乙酰苯胺乙烯基)-3，3-二甲基二氢吲哚鎓碘化物(511mg，0.59mmol)，N-十四烷基-2，3，3-三甲基二氢吲哚鎓碘化物(233mg，0.47mmol)和在无水乙醇(15ml)中的无水乙酸钠(48mg，0.59mmol，Aldrich)的混合物搅拌24小时。然后深红色反应混合物倒入锥瓶中并用乙醇(25ml)稀释。然后加入溶解在水(25ml)中的乙酸银(492mg，2.95mmol，Aldrich)，溶液搅拌15分钟。然后加入乙醇(25ml)和饱和氯化钠溶液，继续搅拌15分钟。然后溶液送入分液漏斗中，用水(200ml)稀释并用二氯甲烷(2×100ml)萃取。经无水硫酸镁干燥有机相，过滤并蒸发以生成粗产物。用快速色谱法(硅胶，先5%甲醇在二氯甲烷中后8%甲醇在二氯甲烷中)纯化粗产物，生成N-二十二烷基-N′-十四烷基-5-碘-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(12)(272mg，58%)。
将N-二十二烷基-N′-十四烷基-5-碘-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(12)(200mg，0.2mmol)溶解在干燥甲苯(15ml，从氢化钙中新蒸出的)中，生成的溶液通过将氩气鼓泡而脱气。然后经注射管加双-(正三丁基锡)(0.237ml，0.47mmol.Aldrich)接着加四(三苯基膦)钯(0)(2.34mg，2.0μmol，Aldrich)。生成的溶液在氩气下回流48小时。然后在真空中除去甲苯，剩余物快速色谱(硅胶，5%甲醇在二氯甲烷中)，生成主题化合物(13)(71mg，31%)，测得值M+，1122，C71H123N2Sn理论值1122。
化合物(13)是用由Wilbur等人在J.NuCl.Med，30216-226(1989)中叙述的方法引入放射性卤素原子的通用中间体。
h)186Re-螯合剂亲脂花青共轭物按照所示反应图5制备主题化合物，在反应中出现的附注数字对应于反应示意图5的那些。所得产物具有化合物24的化学式，其中X和X1代表C(CH3)2，R1/R2代表C14H29/C22H45和A代表I。
将溶解在400μl四氢呋喃(THF)中的双官能螯合剂化合物(22)(84.5mg，0.291mmol)加到含有(8)(66.8mg，0.066mmol)的梨形烧瓶中。在环境温度下搅拌该溶液。通过薄层色谱(TLC;硅石，90∶10 CH2Cl2∶MeOH)监测反应的进程。4小时后，反应混合物用己烷稀释生成75∶25 THF∶己烷的溶液并加到短程硅胶(20g)柱上。过量化合物(22)用50∶50己烷∶EtOAc洗脱直到洗脱液与溴甲酚绿产生负反应。溶剂组合物变成90∶10CH2Cl2∶MeOH并洗脱化合物22。在减压下蒸发溶剂，生成65.0mg化合物23。
高场1Hnmr(300MHz)显示苄基亚甲基质子的低场化学位移为从3.9ppm到4.5ppm，正如在前面甲酰防护的化合物8中所见。在4.5和8.4ppm处的信号的相对积分表明1∶1的偶合率。
通过加HCl气体/乙醇溶液使产物(化合物23)转变成HCl盐。加入草酸的乙醇溶液作为抗氧剂，蒸发溶液，在氮气下储存固体剩余物。
将在107μ10.1N NaOH(0.181mci/nmol)中的60nmol Na186ReO4加到150μl转移螯合溶液(200mg柠檬酸、40mg SnCl22H2O和20mg溶解在2ml H2O中的2，5-二羟基苯甲酸)中，接着加43μl0.1M NaOH。溶液涡流1分钟并在55℃加热10分钟。向反应混合物加乙醇(0.69ml)，接着加300μl化合物23(0.8mg，0.69μmol)的乙醇溶液。溶液涡流15秒并继续加热1小时。
反应混合物加到半制备HPLC柱(Waters Novapak，7.5×300mm)中，用30分钟以流率4.0ml/分以50∶50A∶B到100%B的梯度洗脱，其中溶剂A是含有0.1%三氟乙酸(TFA)和0.05%2，5-二羟基苯甲酸的75∶25H2O∶CH3CN，溶剂B是含有0.1%TFA和0.05%2，5-二羟基苯甲酸的20∶80CH3CN∶THF)。在洗脱大约20分钟的馏分中发现含主题化合物的馏分。
上述馏分以1∶1用溶剂1(0.05%2，5-二羟基苯甲酸在水中)稀释并加到Sep-Pak柱(C-18，Waters 36805)上，该柱已先用10ml溶剂2(0.05%2，5-二羟基苯甲酸在乙醇中)然后用10ml溶剂1洗涤。用10ml溶剂1，150μl溶剂2和300μl溶剂2洗提柱体。取该最后馏分作产物。用氮气流蒸发溶剂到约10μl体积，然后用乙醇稀释到约40μl。通过在555nm的吸收测定上述所得产物的浓度是252μM。与理论值181mci/μmol相比，特有活性是186±21mci/μmol。产品的回收是Re-186总量的-9%。一天后用HPLC测放射性纯度并发现是约94%。发现杂质(约5%)的主要部分在空隙处，并假定是游离的高铼酸盐。
(i).7-N(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素亲脂花青腙共轭物和酸-可裂性的测定(a)制备按照上述反应图3所示一般过程制备主题化合物。其中附注数字对应于反应示意图3中的那些。所得产物具有化合物19的化学式，其中X和X1＝C(CH3)2和R/R1＝C14H29/C22H45及A代表Cl。
用反应图1的一般过程制备5-氨基甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青碘化物(化合物8)，其中R是C14H29;R1是C22H45，X和X1＝C(CH3)2。
在室温下向在二甲基甲酰胺(15ml，从氢化锂铝中蒸出)中的单甲基戊二酸酯(0.14ml，1.1mmol，Aldrich)的搅拌溶液加N-羟基琥珀酰亚胺(126.5mg，1.1mmol，Aldrich)。该混合物在冰浴中冷却并加二环己基碳化二亚胺(226.6mg，1.1mmol)。反应混合物逐渐升温至室温并再搅拌3小时。其后，反应混合物送入含有新制备化合物8(700mg，0.7mmol)的烧瓶中，反应混合物在室温保持搅拌30小时。然后在高真空下除去二甲基甲酰胺，生成的粗产物溶解在无水乙醇(250ml)和水(250ml)中。然后加入乙酸银(434mg，2.6mmol)，搅拌30分钟后，加入饱和氯化钠溶液(100ml)，混合物再搅拌30分钟。用二氯甲烷萃取水层(4×100ml)，混合有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。剩余物进行快速色谱(硅胶，先用2.5%后用5%再后用10%甲醇在二氯甲烷中洗脱)，生成5-〔N-(单甲基戊二酰)-氨基甲基〕-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(14)(520mg，63%)。
在室温下将无水肼(5ml，Aldrich)缓慢加到反应物的搅拌溶液中，该溶液是由5-〔N-(单甲基戊二酰)-氨基甲基〕-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(520mg，0.44mmol)和无水乙醇(6ml)构成。反应混合物保持搅拌2小时，然后由旋转蒸发器浓缩，剩余物进行快速色谱(硅胶，先用10%后30%甲醇在二氯甲烷中洗脱)，生成5-〔N-(单肼基)戊二酰氨基甲基〕-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(15)(110mg，27%)。
在室温下向脱乙酰秋水仙素(16)(0.2902g，0.81mmol，Molecular Probes)在二氯甲烷(5ml)中的搅拌溶液中加戊二酐(111.2mg，0.975mmol，Aldrich)，反应混合物在室温保持搅拌2小时。然后旋转蒸发除去二氯甲烷，在高真空下干燥粗产物，生成固体7-(N-戊二酰基)脱乙酰秋水仙素(0.397g，100%)。
然后在室温下向7-(N-戊二酰基)脱乙酰秋水仙素(0.397g，0.83mmol)在二甲基甲酰胺(5ml，由氢化锂铝中新蒸出的)中的搅拌溶液中加羰基二咪唑(0.197g，1.22mmol，Aldrich)，反应混合物在室温下保持搅拌2小时，在这期间在溶液中形成沉淀。真空蒸发除去二甲基甲酰胺，剩余物溶解在二氯甲烷(5ml)中。向该溶液加四丁基铵硼化氢(250mg，0.972mmol，Aldrich)，生成的混合物搅拌3小时，然后倒入水(50ml)中，分离成有机层。水底层用二氯甲烷萃取(2×25ml)。混合有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产品进行快速色谱(硅胶，10%甲醇在二氯甲烷中)，生成7-N-(5-羟基戊酰基)脱乙酰秋水仙素(17)(72mg，25%)。
在室温下向7-N-(5-羟基戊酰基)脱乙酰秋水仙素(72mg，0.16mmol)的在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加吡啶鎓氯铬酸盐(41.3mg，0.19mmol，Aldrich)，混合物搅拌2小时，然后倒入水(50ml)中，分离出有机层，水底层用二氯甲烷萃取(2×25ml)。混合有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。生成的剩余物进行快速色谱(硅胶，10%甲醇在二氯甲烷中)，生成油状7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素(18)(35mg，49%)。
向含有7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素(40mg，0.088mmol)的烧瓶加5-〔N-戊二酰(单肼基)氨基甲基〕-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(110mg，0.12mmol)在乙醇(20ml)中的溶液，反应混合物搅拌20小时。然后由旋转蒸发除去乙醇，剩余物进行快速色谱(硅胶，10%甲醇在二氯甲烷中)，生成主题化合物(19)(26.5mg，27%)。该化合物的200MHz质子NMR的积分表示1∶1的偶合率，快原子轰击质量光谱测定法(甘油/硫甘油基体)表明M+＝1429对应于产物离子C90H135N6O8的预定M+。通过反相高压液相色谱法(HPLC)按下述条件进一步表征该产物，并具有保留时间55分钟。用UV在350nm探测发现纯度是98%，在该产物的探测中发现低于0.30%的游离的7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素(保留时间＝12分钟)。
所用的HPLC体系包括带W600E梯度控制器的Waters Model 600E溶剂分送系统，U6K注射器和Model 990光二极管阵列探测器。色谱条件如下柱体Waters Nova-Pak(苯基，4μm，3.9mmX 15cm);流动相∶溶剂A＝水∶甲醇∶乙腈∶PICA试剂(Waters)(395∶25∶250∶4);溶剂B＝水∶甲醇∶乙腈∶PICA试剂(225∶25∶250∶4);溶剂C＝甲醇∶水∶PICA试剂(490∶15∶4)。梯度条件100%(A)到60%∶40%(A∶B)用20分钟，然后到100%(c)用10分钟，接着100%(c)用40分钟。流率2ml/分。探测从240-575nm光二极管阵列。
(b).酸可裂性的测定通过HPLC在三个不同PH值研究腙共轭物(19)的酸水解生成7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素的比率。
按照Gomori“Methods in Enzymology”，16138(1955)所述的方法制备缓冲溶液。HPLC条件和保留时间与上述相同。测定7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素的检测范围是在350nm大约100ng。
通过加50μl腙共轭物溶液(1mg/ml甲醇)到含有预定PH值柠檬酸盐磷酸盐缓冲液200μl的螺帽管瓶(1ml)中来制备要研究的化合物溶液。管瓶保持封闭，由HPLC(350nm探测)分析溶液的共轭物(19)的保留和在24小时和48小时生成的7-N-(5-氧代戊酰基)脱乙酰秋水仙素。每个HPLC注射200μl。
在PH4.21、5.74和7.35的水解结果概括如下。
PH4.2124小时后78%的(19)分解生成(18)，48小时后100%分解。
PH5.7424小时后45%的(19)分解生成(18)，48小时后100%分解。
PH7.3524小时后36%的(19)分解生成(18)，48小时后77%分解。
通过HPLC探测，仅腙共轭物的游离秋水仙素水解产物是预期的醛，化合物18。
j)肝素亲脂花青共轭物按照上述反应图4所示的一般方法制备主题化合物。其中附注数字对应于在反应图4中所示的那些。所得产物具有由化合物21所代表类型的化学式，其中X和X1＝C(CH3)2，R/R1＝C14H29/C22H45和A＝Cl。
如上所述制备化合物8。
将新制的化合物8(18.0mg，18.0μmol)溶解在NMR管中的氘化氯仿(0.5ml，Aldrich)中。加入三乙胺(5μl，0.036mmol)，接着加三光气(1.95mg，6.7μmol，Aldrich)，该混合物摇动两分钟。进行质子NMR，呈现在苄基质子中从如化合物(8)中所见3.95到4.95的位移，证明产物5-异氰酸根合亚甲基-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青氯化物(20)的生成。通过旋转蒸发浓缩异氰酸酯(20)的氘化氯仿溶液，剩余物溶解在二甲基甲酰胺(4ml，干燥并蒸馏过的)中并迅速搅拌。向该迅速搅拌的溶液加肝素的甲酰胺溶液(9.4mg/ml，2ml，0.0016mmol)，烧瓶盖上帽并在室温下搅拌20小时。过滤除去不溶物，在高真空下于50℃由旋转蒸发浓缩滤液。剩余物加到水(20ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中。分离出水层并用二氯甲烷再次洗涤。然后水溶液置于渗析袋(spetra/Por membrane MWCO∶1000)中并对水渗析，然后冻干生成桃红色固体(24.3mg)。该物料不再进一步纯化并确信是化合物21和未反应肝素的混合物。原状用作生物评价(见例14)。
例4将医疗活性蛋白质共轭到亲脂分子上的生物效应以类似于U.Forstermann等人在J.Pharmacol.EXP.Ther，234，1055-61(1987)中所述的兔血后肢灌注试验，研究上述例3d所制化合物的体内受体药物学。血来自戊巴比妥麻醉的人工呼吸的兔子，并从插套管的颈动脉取出，在医疗级硅橡胶管中穿过恒速辊泵并直接导入插套管的股动脉。借助伸入到灌注管中而位置刚超出股导管尖端的微压变换器(Millar)测量股动脉床的远侧灌注压(以mmHg)。开始，调整泵速到使远侧灌注压接近系统平均动脉血压，其后在每个实验的剩余部分保持血液恒定。然后，类似于欧姆定律所述的方法，阻力的变化直接与远侧灌注压力成正比，这样血管阻力＝ (灌注压力)/(血流)因此，通过在每个实验期间保持血流恒定，在远侧灌注压力中的变化直接反映血管阻力，由此压力的减小表明血管舒张，而压力的增加表明血管收缩。这样可通过直接注射到灌注回路中，以评价确认物质在体内血管平滑肌弹性上产生作用的生物学和药物学。
图1表示在体内物质P和例3d共轭物的响应曲线在本质上的相似。物质P和共轭物当局部注射到灌注兔后肢时，在后肢灌注压力上均产生明显的与剂量相对的降低。这些扩张肌响应完全符合物质P的已知血管药物学，例如见J.Beny等人在J.Physiol，398277-89(1988)中的例子。
正如图2中可以看出那样，物质P和共轭物间的响应存在数量上的区别。要求产生灌注压降的物质P的平均限界剂量是大约0.003pmol，而最大压降的剂量范围为3-10pmol。要求引起灌注压降的共轭物的最小剂量是高于物质P的，为1-10pmol，而在1000pmol达到最大压降。通过物质P和共轭物的对数函数计算ED50值分别是0.13和34pmol，表明大于物质P能力250倍。然而，二物质显示的具有平行斜率的剂量响应曲线符合普通受体的相互作用。图2也表示了在物质P，〔D-Pro2，D-Trp7.9〕-物质P的已知对抗物的输注过程中，物质P和共轭物的剂量响应关系。所报导的这种在3位带D-氨基酸的合成的肽抵抗了内原物质P和外原给予的物质P的神经原、行为和血管的作用。当对抗存在时，〔D-Pro2，D-Trp7.9〕物质P阻止灌注压因物质P和共轭物而产生的降低，正如在二化合物剂量响应曲线中向右平行飘移所确定的。在对抗物存在时物质P和共轭物的剂量响应曲线向右飘移的量是相似的，进而可以假设这两种物质是在共同的受体位置上作用。图2中所列数据基于包括三个兔子的试验，并表示在无对抗存在下相应于物质P在灌注压力上的最大响应值的平均(±SEM)变化百分率。
除了上述外，已实验测定出以1和10nmol浓度服用相应的未共轭亲脂花青不具有血管松弛作用。β-肾上腺受体兴奋剂、异丙基肾上腺素以1、10、100pmol浓度服用也产生相对剂量的灌注压力降低，但它不受SP对抗物〔D-Pro2，D-Trp7.9〕-SP的对抗，表明〔D-Pro2，D-Trp7.9〕-SP对SP受体的特性。
当二者在体外共同培育时，例3d(100μM)的共轭物可容易地结合到悬浮在含1mM EDTA和0.5%兔血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水溶液中的洗涤兔红血细胞上。共轭物的荧光部分可使其在RBCs上通过流动细胞测量很快地探测。当在兔后肢中注射共轭物标记的兔RBCs时，灌注压力出现降低，其量与被注射的细胞数有关。而且实验表明，106-109的RBCs注射导致在兔后肢中灌注压力降低。当共轭物标记的样品分离成上清液部分和细胞部分时，它应被再悬浮于上述RBCs缓冲液中，然后再注射。上清液部分含有有机细胞悬浮液的生物活性有效部分，说明共轭物能从RBCs中渗出。反复洗涤具有血管舒张活性的由上清液部分产生的RBCs，消除来自RBCs的共轭物的延迟释放性能。
从上面的实验可以意识到，例3d的物质P亲脂花青共轭物具有血管舒张活性的能力，它的性质相似于自然物质P，并且该活性可通过物质P受体的对抗物中和。这些实验结果趋于表明，物质P与受体的相互作用受到保护而与亲脂信息分子的化学共轭受到排斥。
例5测量由亲脂花青衍生的物质P的在结构上的细胞结合作用和生物相互作用为测试是否例3d的共轭物的物质P组分在结构上未改变和辨认是否在球形血红细胞(RBCs)的表面上，用共轭物(10μm，红荧光)标记2ml人RBCs(106细胞/ml)，然后由流动细胞测量研究。该研究结果示于图3A-C中。尤其是，分析未处理RBCs和共轭物标记的RBCs，以测定是否1.在细胞表面上结合有共轭物(图3A比较)。
2.共轭了山羊抗兔抗体的荧光素异硫氰酸酯(FITC)非特异性键合到共轭物标记的或未标记的细胞上(表3B比较)，或3.兔抗物质P抗体+FITC抗兔抗体特异性键合到共轭物标记的RBCs上(表3C比较)。
在图3A中，未标记的RBCs的检测仅表示自生荧光素背景〔细胞种群位于在绿(LFL1)和红(LFL2)轴的靠近起始处〕，而共轭物标记的细胞物当与未标记细胞比较时显示了红荧光信号的增加。
在图3B中，标记细胞共轭物用荧光化山羊抗兔抗体处理的共轭物标记的细胞表明，该抗体仅有最少量非特异性键合到RBCs上，这可由与图3A中的结果比较时绿荧光信号(LFL1)的少量增加证明。
图3C表示未标记RBCs或用共轭物标记的RBCs(它是用兔抗物质P抗体作第一反应物然后用荧光化山羊抗兔抗体作第二反应物间接荧光标记的)的荧光矩形图。在共轭物标记的细胞中，在细胞上可探测到显著量的绿和红荧光(LFL1信号相对于图3B增加)，说明在与共轭物连接的细胞上的特异性结合。使用未用共轭物标记的RBCs则未注意到这种荧光增加。因此，该技术说明，通过抗物质P抗体可抗原地辨认在RBCs表面上的物质P，证明在红细胞上物质P结构的存在和保留。
例6在血红细胞上物质P亲脂花青共轭物的体内稳定性测定研究用上述例3d共轭物标记的血红细胞在体内的性质，0.5ml来自两个兔中每个的新鲜抗凝血的血液用共轭物标记(最后浓度为10μM)，然后注射回取血的同一兔。在共轭物标记后但在注射前通过流动细胞测量，测定标记细胞的等分量，以保证足够的标记。然后标记细胞施用于体内，在30分钟及第1、2、3、4、7天取血样，并通过流动细胞测量进行荧光细胞的测定。
该研究结果示于图4的图形中，从中可以看出，标记细胞的共轭物在体内的分解发生得相对缓慢。与自然物质p的分钟循环寿命相比，标记细胞的荧光(Log荧光强度)以5-6天的半衰期减少。
因此，由上述实验结果显示出，生物粒子用载有治疗剂的亲脂分子标记为肠胃外施用治疗剂提供了革新的输送媒介物。
例7在染色结合、细胞生存性和膜键合稳定性上的碘化作用的影响。
为检验碘原子加到本发明化合物上基本不影响其标记细胞的性能，对下述化合物进行化合物吸收、标记后细胞生存性和膜保留的体外测定
按上述反应图1和例3所述的一般方法制备化合物T、AA和AB。
以5、10和20μM的标记浓度和化合物AA和AB的5或10μM浓度测试回收和生存性(按Slezak和Horan在Blood，742172-2177，1989中所述的方法计算)。对20μM标记浓度的化合物AA和AB来说生存性和回收降低至70～80%。
对用10μM的化合物标记的细胞测定每个细胞结合的化合物的分子数。在最终再悬浮和计数之后，从洗涤细胞中取106细胞(10μl)的等分量，通过与250μl100%乙醇混合从细胞膜萃取出化合物，用FluoroskanⅡ荧光微盘读数器与过滤器的组合测量200μl萃取物的荧光强度。通过以已知化合物在100%乙醇中的浓度并在FluoroskanⅡ上测量得到的校准曲线来测定各萃取物中化合物的浓度。然后由已知萃取物的浓度总萃取物体积和萃取细胞的已知数量计算每个细胞的化合物分子数量。计算值为化合物T为(4.0±0.4)×106，化合物AA为(1.3±0.2)×106和化合物AB为(2.5±0.7)×106。
使用由NH4Cl溶解制备的红细胞膜空胞(Slezak和Horan，Blood，Supra)测定相对膜保留。使用上述方法在室温下以4×108/ml用10μM的化合物标记空胞5分钟。用含有1mMEDTA和5%BSA的PBS进行标记后的洗涤。最终洗涤后，以4×108/ml在PBS+EDTA+5%BSA中再悬浮空胞，并在37℃孵化24小时。在24小时后，从a)均匀混合的空胞悬浮液(以测量存在的总化合物量)中和b)在空胞以12，500×g成小球15分钟之后，保留的上清液中(以测量未结合化合物的量)取双份的50μl等分量，用含200μl100%乙醇的混合物萃取等分量，用FluoroskanⅡ荧光微板阅读器测量各萃取物的荧光强度。如下计算所保留化合物的百分含量(总化合物-无键合化合物)/(总化合物) ×100发现计算值是化合物T为(91.9±2.9)%，化合物AA为(97.7±0.2)%和化合物AB为(96.8±1.3)%。
基于上述的实验，可以计算本发明的碘化化合物呈现的膜保存性能等于或高于未碘化的化合物。尽管与等量浓度的未碘化的化合物相比它与红细胞膜的结合有点低，但根据其较大分子尺寸和重量可断言，不期望该差异足以改变它对上述类型细胞标记应用的使用。
例8人造物表面的保留为评价本发明化合物保留在人造物表面的能力，放射碘(125I)化亲脂花青(上述例3g中由反应图2所得的化合物12)在100%乙醇中的溶液与不同类型塑料管的短切段的腔表面接触，塑料包括医用硅橡胶(SIL)，聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)。让化合物与管保持10分钟接触然后移开并用PBS轻轻地冲洗管。在完成标记管的基线放射活性测量之后，管段与含有大约30ml新鲜防凝人血的长封闭管路接触。管路经过一辊泵并使血循环6小时。6小时结束时，断开管段，用PBS轻轻冲洗以清除粘附的血液并计算放射活性。该实验结果图示于图5中。记录管段长度、直径和本发明放射性碘化合物的特定活性，表示为放射性碘化物的皮克数/mm2管状腔表面(柱状图表的X轴)。图5表明PVC管初始结合的放射性碘化合物最多，而PE结合的最少。与血接触6小时之后在管上保留最多的是PVC(97.6±2.1%的初始放射活性被保留)，而PC的保留量最差(56.0±10.4%的初始放射活性被保留)。然而，所有管的平均保留量超过50%，而PVC接近100%，说明本发明的化合物尽管与生物液接触，但仍具有在人造物表面上保持一较长时间的能力。因此，本发明的化合物可用于在人造物表面上保留生物钝化物。
例9在肿瘤内注射后，186Re螯合剂亲脂花青共轭物在体内的保留与Na186ReO4的比较基本由例3h所述方法制备186Re螯合剂亲脂花青共轭物(反应图5的化合物24)，不同的是在用乙醇洗脱产物前，SepPak用大约10ml蒸馏水洗涤，以除去过量2，5-二羟基苯甲酸，并避免在体内施用前调节PH值的需要。真空蒸发后，使在乙醇中的浓缩原料溶液达约25μl的最终体积(化合物24的浓度为约500μM，特定活性约123mci/μmol)。如下所述制备化合物24和含有约5-6μci186Re用于体内注射的Na186ReO4。在无菌300mOSM Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中稀释Na186ReO4(NEZ301，在0.1N NaOH中)，调整PH值直到用PH试纸检验PH值是7.0，然后所得制剂通过0.22μm过滤器再消毒。在300mOSM无菌葡萄糖中稀释化合物24。使用无菌技术将5.0μl Na186ReO4或化合物24制剂装入无菌50μl哈密顿注射器中。分离等分量以给每个制样提供计算标准并用作整体成像和生物分布测量的衰减矫正的样品。
如下所述评价注射入肿瘤内后上述制样的保留。肿瘤内注射前5至6天，使用有约1×106活肿瘤细胞悬浮在无菌Hank缓冲盐溶液中的接种物，在雌C57B1/6鼠右后肢上真皮注射以便开始MC38腺癌瘤的生长。在0天时，动物再麻醉，用酒精拭子消毒右后肢并将5.0μl等分量的化合物24或Na186ReO4直接注入约5mm直径的肿瘤中。用大约10秒时间注射，注射完成后，针在原地再保持5至10秒以使在注射位置背压扩散和减小泄漏。注射后(10至15分钟)，用GE Starcam300系统立刻对动物和计算标准成像，此后用140±20KeV的能量窗逐日进行4天。在第2天和第4天完成成像后，杀死动物组并收集各种器官，称重，为评价186Re的生物分布而测量cpm/gm。
选择第4天的器官的186Re分布示于表ⅣA中，结果表示为衰减校正后回收特定器官中注射总量的百分率。由于器官和肿瘤在尺寸上明显不同，在各器官中观测到的186Re相对浓度的比较在表ⅣB中。结果表示为注射量的百分率，注射量可由在衰减校正后在细胞组织的1克体块中找出。通过建立对应于肿瘤或整体的研究区域(ROI)来分析整体闪光照相图像。各研究区域的数量被确定为注射后的时间函数。在肿瘤中标记的集中由肿瘤ROI的得数对整体ROI的得数(表Ⅴ中2和3栏)的比计算。体内标记的保留百分率由整体ROI得数对参考ROI得数(表2中4和5栏)的比率计算。
表Ⅳ和Ⅴ的数据说明，通过以化合物24的形式施用放射性核素可以大大减少186Re从内部肿瘤注射位置的泄漏程度。这些数据还说明，使用两种不同的方法(整体γ闪光照相法和直接切割)测量在肿瘤内的保留得到良好的一致性。
例10关节内注射后186Re螯合剂亲脂花青共轭物在体内的保留与Na186ReO4的比较除了其医疗学功能外，本发明的化合物的两个性能在实现选位施用和保留中是重要的a)当与未结合的治疗剂相比时施用位置的保留水平;
b)在一位置注射后其分布的范围(不均匀与均匀相比)。
使用荧光或放射性标记化合物，根据将含铼化合物输送到关节腔的滑液衬层中来检测这些性能。
如例3h所述制备186Re螯合剂亲脂花青共轭物(反应图5的化合物24)。使浓缩原料最终体积在乙醇中为大约40μl。用于体内注射的化合物24和Na186ReO4的制样如下进行制备。在无菌300mOSM Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐液中稀释Na186ReO4(NEZ301，在0.1N NaOH)，调整PH值用PH试纸检测PH值是7.0，然后将其通过0.22μm过滤器再消毒。在消毒的300moSM葡萄糖中稀释化合物24并加无菌0.1N NaOH调PH值到7.0(由于实际情况是在葡萄糖稀释剂中没有缓冲剂存在，并且2，5-二羟基苯甲酸存在于最后制样中，而导致未调节的PH值为1-2)。无菌1.0ml结核菌素注射器(带25G×5/8吋针头)称重，用无菌技术装入约0.1ml Na186ReO4或化合物24制样，再称重以测定预注射液重量。取出等分量以测定各制样的cpm/μl。如下评价关节内注射后上述制样的保留。用氯胺酮和甲苯噻嗪(xylazine)麻醉3-4kg重雌新西兰白兔，仔细刮毛并用碘溶液擦净膝部区。用无菌技术，将膝部弯曲大约120°，短暂侧向移动膝盖骨，穿过皮肤将针中间插入到关节间隙，注射大约0.1ml化合物24(3个动物)或Na186ReO4(2个动物)的制样，拔出针头，膝盖骨恢复到正常位置。注射的化合物24或Na186ReO4的准确体积及活性按如下确定通过再称重注射器，计算注射液重量的前后差别，(假设注射液的密度为1.0g/ml)并将单位为μl的测量体积乘以cpm/μl值，该值是由计算各制样已知体积的等分量获得的。关节内注射后5-10分钟之内从中心耳动脉取已知体积的血(大约1ml)。然后把动物放在笼内，该笼能分别收集尿和粪便并监视6天。每天取血并收集前24小时内排泄的尿，用Packard Cobra Model 5003γ计数器对已知体积的等分量血和尿测量cpm/ml。基于总体重5.5%的血体积和血的cpm/ml计算产生的总血球数;基于24小时的尿体积和尿的cpm/ml计算总尿数。在粪便中未探测到有效数。使用GE Starcam300系统用大约120-150kev能量窗在第0、1、4和6天进行γ闪光照相。在第6天，收集血和尿样后，杀死动物并收集各器官，称重，为评价186Re的生物分布测量cpm/gm。
在注射后的6天期间化合物24和Na186ReO4在血中的循环值和在尿中的排泄量示于表Ⅵ中。在第6天的选定器官中186ReO的分布示于表Ⅶ中。在表Ⅵ和Ⅶ中的所有结果表示为在衰减校正后的注射量的百分率。表Ⅵ和Ⅶ中的数据表明，通过以化合物24的形式使用放射性核素大大减少了186Re从关节内间隙中泄漏的程度(如通过血值、排泄尿和在其它器官中累积测量)。如表Ⅷ中所示，由γ闪光照相成像测量在特定研究区(膝部和/或整体)的量可以进一步计算在膝部的保留。这些结果也表明，当放射核素是以化合物24的形式施用时，大大地改善了保留。
表 Ⅵ 关节内注射后186Re在血和尿中的值注射量的百分率<
>1.如上述例3h中所制备，2.HA＝不适用表Ⅶ关节内注射后186Re在6天的生物分布器官 注射量的百分率Na186ReO4186Re-Cpd.24肝 .0005±.0007 0.16±.073肌肉 0±0 .023±.025肾 0±0 .070±.010血 .0015±.0021 .190±.070骨髓 0±0 .027±.012其它器官10±0 .023±.0121.肺、心、脾、胆囊、甲状腺和淋巴节的总和表Ⅷ关节内注射后186Re在膝部的保留注射后时间存在于膝中的整体部分量1第0天保留在膝中的量1Na186ReO4186Re-Cpd.24 Na186ReO4186Re-Cpd.2430分钟 11% 96±2% 100% 100±0%1天 &lt;5% 103±3% &lt;5% 98±1%4天 &lt;5% 108±2% &lt;5% 83±11%6天 &lt;5% 114±4% &lt;5% 68±2%1.衰减校正值，＜5%的不统计的不同于0的差例11关节注射后亲脂花青共轭物的滑液分布关节内注射后由滑液细胞统计混合的均匀性和不均匀性，将在300mosM PH7.0的葡萄糖中的0.1ml化合物T(见上例2)的碘盐的10μM溶液注射到例10中所述的膝中，1小时后，杀死动物，解剖注射和未注射的膝关节。整个关节横切面的制样是不可用的，因为脱矿化要求切成薄切片及脱矿化溶剂从细胞组织中除去了本发明化合物。因此，仔细除去髕下脂肪垫(在膝盖下并形成一个滑液腔边界)，在干冰中冷冻一小块，并在-80℃储存直到能制备冷冻切片。制备厚的(10μ)低温恒温器切片，粘附到玻璃片上，并由光和荧光显微镜评价。
脂肪垫横截面(注射或未注射的膝)的光显微图显示，(当在放大100倍观察时)滑液细胞以沿截面内边的细黑线勾划出脂肪垫的表面面对关节间隙。(在一般关节中滑液层仅是1-2个细胞厚，但由于在关节炎的关节中过高的增生而变厚)。组织的剩余部分主要由大量脂肪细胞构成。用蓝激发光由注射膝部的横截面的照射说明，明亮和相对均匀的标记主要存在于滑液细胞层，而脂肪细胞区域未注射膝部的横截面仅呈现许多深绿自生荧光。
例12在血管内位置亲脂花青共轭物的保留进行一次应用实验，其中如上述例2所述制备的125I取代的亲脂花青(反应图2的化合物12)施用到麻醉兔股动脉的腔表面上，以测量是否本发明的化合物保留在血管内的位置上。手术分离股动脉，并且其邻近的侧支用短的PE10管插套，环绕侧支的1cm动脉部分被闭塞将20-25μl含125I取代化合物12的溶液通过套管施用到阻塞部分并让其保留5-10分钟。顺套管取出125I取代的化合物，持久地绑住侧支，除去股动脉的阻塞让血恢复流动，封合股切口。然后用带最佳探测125I窗的Ludium Model 2200Scaler Ratemeter和Model 44-17 2吋晶体在其后三周以选定的时间监视125I放射活性。
结果数据的图解分析给出一种两段排除法，在头24小时后保留于动脉内的施用物为34.0±10.9%(平均值±标准平均误差，n＝4)并且有0.77±0.29天的初始排除半衰期。然而，头24小时后，保留物质的排除很慢，排除半衰期为15.24±2.89天。因此，由于从血管内施用位置排除缓慢，施用后至少3周可探测到明显量的125I取代的化合物。
例13在体外A10细胞上秋水仙素亲脂花青共轭物的抗增生活性为测定本发明化合物的抗增生活性，使用A10细胞、原始衍生于胚胎鼠的胸主动脉的无性系细胞系完成体外研究，这两种细胞作为成肌细胞增生并发展成表型相似的平滑肌细胞(B.Kimes和B.Brandt，Exptl.Cell Res 98349(1976))。典型地，用在Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)中的2500-10000A10细胞/cm2和10%胎腓肠血清(FCS)接种十二穴板，让其粘附并在37℃稳定24小时。然后在适当的结合细胞介质中以所要求的浓度制备试验物质，抽吸涂布介质后，在37℃仅10分钟期间内加到各穴中。然后抽吸处理物，用含未处理介质洗穴4次，然后在研究期间将其置于具有10%FCS的含DMEM的未处理介质中。在应用处理后的各次中，将其吸至一组三个穴中，保存吸出物，用0.25ml0.25%胰蛋白酶处理穴以释放粘附的细胞。通过加过量的蛋白质(1.75ml DMEM±10%FCS)停止胰蛋白酶在细胞上的酶作用，吸出物返回到穴中，以Coulter Counter(Model ZM with Sampling stand Ⅱ)计量生成的细胞悬浮液的等分量。将细胞数规范化成每平方厘米生长面积(穴底的表面积)的细胞数。
如下表Ⅸ中所示，7天后，在用本发明化合物(例3i，反应图3的化合物19，这里称作为“秋水仙素共轭物”)处理的细胞培养的增生说明，只有5.2%媒介物处理长成最大。存在有效联接荧光的细胞(由流动血细胞计数测量)，说明秋水仙素共轭物结合到A10细胞上的持久性。相反，用相同初浓度的非共轭秋水仙素处理的细胞仅以用媒介物处理的细胞的细胞密度的一半存在，在细胞数量上用本发明的化合物所得的细胞增长为大约10倍。因此，尽管曝露只有10分钟，但本发明的化合物允许在A10细胞的母体化合物上有效地保留抗增生活性，这表明与以同样方法使用非共轭秋水仙素相比具有大得多的抗增生作用。
例14抗凝剂亲脂花青共轭物与生物膜的结合为评定本发明的抗凝化合物是否能稳定地结合到生物膜上，以前面例1描述的兔红血细胞空胞(ghosts)进行在玻璃试管内的研究。使用(1)衍生的不含抗凝剂的亲脂花青(化合物7，反应图解1，例3a)或者(2)抗凝剂亲脂花青共轭物(化合物21，反应图解4，例3j)或者(3)荧光素异硫氰酸酯标记的肝素(FITC-肝素)分别以10μM.20μM和20μM的浓度标记2×108个空胞/ml。然后彻底洗涤空胞，并在带有1mM EDTA和5%BSA的磷酸盐缓冲盐水中于37℃放置24小时。搅拌试样，从每个试样中取出50μl的等份试样放入在微滴定板穴中的200μl Triton X-100
中(代表所有悬浮液的荧光)，离心原始试样10分钟，50μl试样的空胞上清液除去，并放在200μlTriton X-100
中(表示仅在水相中无荧光)。在荧光测定微滴定板读数器上测定所有试样的荧光。在修正了未标记空胞的背景荧光后，通过从总的中减去无荧光的，确定结合的荧光。无荧光和结合荧光的百分数，通过以结合荧光及无荧光分别除以总荧光乘以100确定。
下面表X显示的结果说明本发明的抗凝共轭物显示很好的膜滞留率，24小时后90.94%的荧光与空胞膜连接。相比之下，不含抗凝剂的本发明化合物具有94.96%的滞留率。FITC-肝素仅显示很差的滞留率，仅为24小时后37.63%的荧光滞留率。这个值很可能是FITC-肝素真实滞留率的过高估价，因为，FITC-肝素在空胞上的荧光信号仅仅稍高于背景荧光水平，而结合百分率的计算及没有这些值在精度上是不可靠的。但下面的数据清楚地显示了本发明化合物很好地保留在生物膜上，而荧光肝素却不能。
表Ⅹ荧光强度悬浮液 上清液 %无 %结合1439.00 73.69 5.04 94.96化合物7±33.55 ±2.53 ±0.06 ±0.06未标记的 1.68 1.24191.40 18.36 9.06 90.94肝素共轭物±6.07 ±0.53 ±0.04 ±0.04未标记的 1.64 1.1660.599 0.517 62.37 37.63FITC-肝素±0.005 ±0.011 ±1.29 ±1.29未标记的 0.463 0.465＊荧光化合物的值以平均值±标准平均误差给出，n＝3重复测定。
例15当结合到生物膜表面时抗凝剂-亲脂花青共轭物的抗凝性能的保持为测定本发明的化合物当覆盖在生物膜表面上时抗凝性能是否还保持，在玻璃试管中进行研究，以评定本发明化合物抑制凝血酶、血栓的能力。兔子的红血细胞空胞首先用10μM的抗凝剂-亲脂花青共轭物(化合物21，反应图解4，例3j)标记，然后用含有0.1%BSA的PBS洗涤4次，然后稀释到各种数量的空胞/ml。通过将已知数量的空胞放在微滴定板穴中，并将观察到的荧光与由已知标准浓度化合物产生的荧光比较，评价在空胞上的化合物21的浓度。然后以由Krstenansky和Mao在FEBS Let.211∶10(1987)上报告的类似方式进行活性分析，其中100μl在磷酸酯缓冲盐水(PBS)缓冲剂中的1∶10人血浆稀释液、50μl含各种浓度标记空胞或标准血栓抑制剂的PBS和50μl含定量(0.5nM)血栓的PBS被加入到微滴定板穴中，以60分钟的周期在分光光度板读数器(Bio-Tek)上记录在405nm处的吸收变化。试样分成三份，然后平均。相对于时间数据的吸收变化被绘图，并由计算机进行在曲线下面积的测量。由抑制剂处理的穴得到的数据被表示作在抑制剂不存在下得到的吸收面积的抑制百分比。由典型实验得到数据显示在图6中。分别由肝素(·)和本发明抗凝剂共轭物(⊙)的3参数非线性数理回归得到的1.03nM和21.23nM(
1.43×107空胞/200μl)的EC50值表明，当施加到生物膜上时，本发明的化合物作为血栓抑制剂比母体化合物的效力低于20倍。但是由于一系列稀释的无空胞的上清液(◇)的同时分析试样没有血栓抑制活性，这种抑制活性是所有连接的膜的。这样，本发明的化合物仍保留有效的抗血栓作用，甚至当结合到生物膜上时。
以上已经描述并根据一些优选实施例举例说明了本发明的各个方面，即化学治疗和放射性治疗抗增生化合物的合成和使用。但是，一些其它实施例对本领域的那些熟练人员是明显的。例如，其他化学治疗和放射性治疗共轭物可合成并用于治疗或评价各种病态或病理调理。另外，本发明的化合物和方法还可用于开发其它类的药物的选定点输送和滞留，例如抗细菌剂、抗霉菌剂、抗炎症剂。因此，本发明不限于特别描述及举例说明的实施例，而能够在不脱离本发明权利要求范围的情况下改变或改进。
权利要求
1.一种用于将有医疗作用的物质结合到含在生物粒子中的类质物上的化合物，所述的化合物的通式为
其中B表示一种生物作用部份，该部份包含一种有医疗作用的物质；R和R1分别表示选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基的取代基，其中的烃链是线性的或支链的，所述的取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能团取代的，至少R和R1之一包含一个烃取代基，所述烃取代基的链长可有效地把类脂物结合的能力赋予所述化合物；R2表示一个间隔部分，n是0或1；L表示一个联接部分，当n=0时，在B与至少R1和R之一间提供稳定的联接，当n=1时，在R2与至少R和R1之一间提供稳定的联接，条件是当n=0时，L是一个非芳族的联接部分。
2.如权利要求1的化合物，包含一个间隔部分，该部分适于将所述的生物作用部分共价联接到所述的联接部分。
3.如权利要求2的化合物，其中R和R1之一是具有至少12个线性碳原子的烃基，R和R1中的线性碳原子总数至少为23。
4.如权利要求2的化合物，其中R和R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子总数足以把至少90%的膜滞留率赋予所述的化合物。
5.如权利要求2的化合物，其中R和R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子总数足以把至少30%的膜结合稳定性赋予所述的化合物。
6.如权利要求2的化合物，其中所述的联接部分选自花青、吖啶、吡啶、喹啉、呫吨、吩噁嗪、吩噻嗪和二苯基己三烯染料和它们的衍生物。
7.如权利要求2的化合物，其中R2包含一个可断裂键，并且所述的生物作用部分可释放地键合到所述化合物上，在预定的引起所述可断裂键断裂的条件下从所述化合物上释放。
8.如权利要求7的化合物，其中所述的生物作用部分从所述的化合物释放时能够发挥它的预定生物作用。
9.如权利要求7的化合物，其中所述的生物作用部份当共轭到并脱离所述化合物时能够发挥它的预定生物作用。
10.如权利要求1的化合物，其中所述的生物作用部份包含一个化学治疗物质。
11.如权利要求10的化合物，其中所述的化学治疗剂包括有一种抗增生剂。
12.如权利要求11的化合物，其中所述的抗增生剂能够与微管蛋白方法相干扰。
13.如权利要求11的化合物，其中所述的抗增生剂选自秋水仙素、长春节生物碱、紫杉醇及它们的衍生物。
14.如权利要求11的化合物，其中所述的化学治疗物质包括有抗凝血剂。
15.如权利要求14的化合物，其中所述的抗凝血剂选自肝素及其衍生物。
16.如权利要求14的化合物，其中所述的抗凝剂选自水蛭素及其衍生物。
17.如权利要求1的化合物，其中所述的生物作用部分实质上在生理条件下共轭到所述的化合物上。
18.如权利要求1的化合物，通式为
其中B表示化学治疗物质，R和R1是具有从1至约30个碳原子的烃取代基;R2表示通式如下的间隔部分其中R3表示脂族烃，R4、R5、R6和R7分别选自脂族、脂环族或芳族烃、杂环或CH2C(CO2H)＝CH，Q和Q′、Q″、Q
和Q
分别选自这样组成的官能键组酰胺、硫脲、腙、酰腙、酮缩醇、醛缩醇、原酸酯、酯、酐、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、亚胺、胺、醚、碳酸酯、硫醚、氨磺酰、碳酰和脒键，Q′、Q″、Q
、Q
还可分别代表一个价键;所说的脂肪族烃具有从1至12个线性碳原子;所说的芳香族烃具有从6至12个碳原子;n、p、q、r、s和t每个可是0或1;X和X1可是相同的或不同的，并表示O、S、C(CH3)2或Se;Y表示一个连接基团，选自＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-，＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-，或＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-，其中R8选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或CH(CH3)2;Z表示一个取代基，选自H、烷基、OH、-O-烷基、COOH、CONH2、SO3H、SO2NH2、SH、S-烷基、CONH-烷基、CON-(烷基)2、NH-酰基、NH-烷基、N(烷基)2、NO2卤素、Si(烷基)3、O-Si(烷基)3、Sn(烷基)3或-Hg-卤素，在所述Z取代基中的烷基具有从1至4个碳原子;A表示药物学可接受的阴离子。
19.如权利要求18的化合物，包含一个放射性同位素，选自放射性氢、碳、氮、卤素、硫、硒或它们的混合物。
20.如权利要求18的化合物，其中所述的化学治疗物质选自免疫原、毒素、激素、酶、抗原、抗体和抗体片段。
21.如权利要求18的化合物，通式为
22.如权利要求18的化合物，通式为
23.如权利要求18的化合物，通式为
24.如权利要求18的化合物，通式为
25.如权利要求2的化合物，通式为
其中B表示放射治疗物质;R和R1是具有从1至约30个碳原子的烃取代基;R2表示通式如下的间隔部分其中R3表示脂族烃，R4、R5、R6和R7分别选自脂族、脂环族或芳族烃、杂环;Q和Q′、Q″、Q
和Q
分别选自这样组成的官能键组酰酰胺、硫脲、醛缩醇、酯、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、胺、醚、硫醚、氨磺酰、碳酰和脒和键;Q′、Q″、Q
、Q
还可分别代表一个价键;所述脂族烃具有从1至12个线性碳原子;所述芳族烃具有从6至12个碳原子;n、p、q、r、s和t，每个可是0或1;X和X1可以是相同的或不同的，并代表O、S、C(CH3)2或Se;Y表示一个连接基团，选自＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-或＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-、其中R8选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或CH(CH3)2;Z表示一个取代基，选自H、烷基、OH、-O-烷基、COOH、CONH2、SO3H、SO2NH2、SH、S-烷基、CONH-烷基、CON-(烷基)2、NH-酰基、NH-烷基、N(烷基)2、NO2、卤素、Si(烷基)3、O-Si(烷基)3、Sn(烷基)3或-Hg-卤素，包含在所述Z取代基中的烷基具有1至4个碳原子;A表示药物可接受的阴离子。
26.如权利要求25的化合物，包含一放射性同位素，选自放射性氢、碳、氮、卤素、硫、硒或它们的混合物。
27.如权利要求25的化合物，其中所述放射性治疗物质包含与治疗放射性核素配合的螯合剂。
28.如权利要求25的化合物，通式为
其中R和R1是具有从1至30个碳原子的烃取代基，X和X1可是相同的或不同的，并表示O、S、C(CH3)2或Se;A代表药物可接受的阴离子，M表示放射性治疗物质，选自铜、锝、铑、钯、铟、钐、镓、钬、铒、镱、镥、铼、钇、金、铒、钬或它们的混合物，n是2、3或4;m是1或2，p是1至6。
29.如权利要求1的化合物，其中所说的生物作用化合物包含以螯合剂和放射性金属为形式的放射性治疗物质。
30.如权利要求29的化合物，包含一与含氮、含硫螯合剂配合的放射性金属。
31.如权利要求29的化合物，包含一与含氮、含氧螯合剂配合的放射性金属。
32.如权利要求29的化合物，其中所述放射性治疗物质包含抗增生剂。
33.如权利要求29的化合物，包含一放射性同位素，选自放射性卤素、铜、钇、锝、铑、钯、铟、钐、钬、铒、镱、镥、铼、金或它们的混合物。
34.如权利要求29的化合物，通式为
其中L、R、R1和R2如权利要求1定义，Z表示H或一个金属配位位置;
其中每个R′分别是H原子或烷基，优选是低级烷基，或取代的低级烷基，其中取代基可是酯，R″和R
分别是氢原子或烷基，m和n每个可是0或1;M表示放射性金属，选自铼、铟、铜和钯。
35.如权利要求34的化合物，通式为
其中R和R1是具有从1至约30碳原子的烃取代基，X和X1可是相同或不同的，并代表O、S、C(CH3)2或Se;A表示药物可接受的阴离子;Z表示H或金属配位位置;
其中每个R′分别是H原子或烷基，优选是低级 低级烷基，其中取代基可以是酯，R″和R
分别是H原子或烷基，m和n每个可以是0或1;M代表放射性金属，选自铼、铟、铜、钯。
36.如权利要求35的化合物，通式为
其中M是放射性治疗物质，选自铼、铟、铜、钯。
37.如权利要求1的化合物，它更进一步包含能在体内检测的诊断剂。
38.一种药物制剂包含一种如权利要求1的化合物和相容的生物介质。
39.如权利要求38的药物制剂，其中所述的相容的生物介质选自无盐等渗溶液和药物可接受的液体赋形剂。
40.如权利要求39的组合物，其中所述介质在260mos和340mos之间具有等渗性，并且对于该化合物要结合的生物粒子是等渗的。
41.一种化合物，通式为
其中R和R1可是相同的或不同的，并分别代表选自H、烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基的取代基，其烃链具有从1至30个C原子，并且是线性或支链的，所述取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能团取代的;R2表示通式如下的间隔部分其中R3代表一个脂族烃，R4、R5、R6和R7分别选自脂族、脂环或芳香烃或杂环或CH2C(CO2H)＝CH，Q、Q′、Q″和Q
分别选自如下组成的功能键组酰胺、硫脲、腙、酰基腙、酮缩醇、醛缩醇、原酸酯、酯、酐、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、亚胺、胺、醚、碳酸酯、硫醚、氨磺酰、碳酰、和脒键;Q′、Q″和Q
还可分别表示一个价键，所述的脂族烃具有从1至12个线性碳原子，所述芳族烃具有从6至12个C原子;p、q、r、s和t每个可以是0或1;X和X1可以是相同的或不同的，并代表O、S、C(CH3)2或Se;Y表示一个连接基团，选自＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-，＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-或＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-，其中R8选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或CH(CH3)2;Z表示一个取代基，选自H、烷基、OH、O-烷基、COOH、CONH2、SO3H、SO2NH2、SH、S-烷基、CONH-烷基、CON-(烷基)2、NH-酰基、NH-烷基、N(烷基)2、NO2、卤素、Si(烷基)3、O-Si(烷基)3、Sn(烷基)3或-Hg-卤素，包含于所述Z取代基中的烷基具有从1-4的碳原子;W表示一个反应性官能基，选自氨基、α-卤代乙酰胺、异硫氰酸盐、异氰酸盐、羧基、肼基、二硫吡啶基、巯基、醛、酐、琥珀酰亚胺基酯、酮、卤素、羟基、磺酰卤化物、亚氨酸酯、环氧化物、马来酰亚胺、酰肼基(acylhydrazido)和叠氮基;A代表阴离子。
42.如权利要求41的化合物，包含一放射性同位素，选自放射性氢、碳、氮、卤素、硫、硒或它们的混合物。
43.如权利要求41的化合物，其中W-R2表示反应性官能基团-间隔基团的组合，选自NH2-CH2、SCN-CH2、SCN-芳基-HNSCHN-CH2、4，6-二氯三嗪基-NH-CH2、OCN-CH2、琥珀酰亚胺基-OOC-芳基-CONH-CH2、ICH2CONH-CH2、(2-吡啶基)-S-S-(CH2)2-CONH-CH2、HO(CH2)3CONHCH2、HS(CH2)3C(NH)NHCH2、HS(CH2)3CONHCH2或马来酰亚胺基-CH2。
44.如权利要求41的化合物，通式为
45.如权利要求41的化合物，通过所述的反应性官能基团W偶合到生物素或生物素的衍生物上。
46.如权利要求45的化合物，其中所述的生物素的衍生物由如下通式表示
其中E表示一种化合物的残部，该化合物具有能由所述的反应性官能基团，W，取代的反应性官能基团，并且m＝0、1或2。
47.如权利要求45的生物素化化合物通过抗生物素蛋白-生物素的相互作用偶合到承载有抗生物素蛋白或其衍生物的蛋白质物质上。
48.如权利要求45的化合物，其中所述的反应性官能基团W是NH2，R2是烷基。
49.一种生物素衍生物，通式为
其中R和R1表示取代基，分别选自H、烷基、烷芳基、芳烷基、其烃链具有从1至30个C原子，并是线性的或支链的，所述的取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能基团取代的;X和X1可以是相同的或不同的，并代表O、S、C(CH3)2或Se;R3代表H、甲基、乙基、丙基或异丙基;m是从0至6的数;A是阴离子。
50.如权利要求49的化合物，其中R和R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子的总数为至少23。
51.根据权利要求49的2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(+)-生物素酰胺基甲基-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基(indol-2-yliden)-1-丙基〕-1-二十二烷基-苯并噁唑鎓卤化物。
52.根据权利要求49的2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(6-｛(+)-生物素酰胺基｝-己酰胺基甲基)-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基(indol-2-yliden))-1-丙基〕-1-二十二烷基-苯并噁唑鎓卤化物。
53.根据权利要求49的2-〔3-(2，3-二氢-3，3-二甲基-5-(6-｛(6(+)-生物素酰酰胺基-己酰胺基)己酰胺基甲基｝-1-十四烷基-(2H)-二氢亚吲哚-2-基(indol-2-yliden))-1-丙基〕-1-二十二烷基-苯并噁唑鎓卤化物。
54.根据权利要求49的5-｛6-(6-(+)生物素酰酰胺基己酰胺基已酰胺基甲基｝-1′-二十二烷基-1-十四烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青卤化物。
55.一种化合物，通式为
其中R和R1表示取代基，分别选自H、烷基、链烯基、炔基、烷芳基或芳烷基，其烃链具有从1至30个C原子，并是线性或支链的，所述的取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能团取代的;X和X1可是相同的或不同的，代表O、S、C(CH3)2或Se;Y表示一个连接基团，选自＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-、＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-或＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-CR8＝CR8-，其中R8选自H、CH3、CH2CH3CH2CH2CH3或CH(CH3)2。Z和Z1可是相同的或不同的，代表取代基，选自H、OH、-O-烷基、NH2、COOH、CONH2、SO3H、SO2NH2、SH、S-烷基、CONH-烷基、CON-(烷基)2、NH-酰基、NH-烷基、N(烷基)2、Si(烷基)3、O-Si(烷基)3、Sn(烷基)3或Hg-卤素，包含在所述Z和Z1取代基中的烷基具有从1至4个碳原子，条件是Z和Z1不可全是H;A代表阴离子。
56.如权利要求55的化合物，其中R或R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子总数至少为23。
57.如权利要求55的化合物，包含一个放射性同位素，选自放射性H、C、N、卤素、S、Se或它们的混合物。
58.根据权利要求53的化合物，通式为
59.用于医疗活性物质的输送媒介物，包含具有类脂物成份的生物相容粒子，通式如下的化合物偶合到类脂物成份上
其中B表示包含医疗活性物质的生物作用部分;R和R1代表取代基，分别选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷芳基或芳烷基，其烃链是线性或支链的，所述取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能团取代的，至少R和R1之一包含一个烃取代基，所述烃取代基的链长足以把结合类脂物的能力赋予所述化合物，R2表示一个间隔部分，n是0或1，L代表连接部份，当n＝0时，在B与至少R和R1之一间提供稳定的连接，当n＝1时，在R2与至少R和R1之一间提供稳定的连接，条件是当n＝0时，L是非芳族连接部分，所述的化合物能够稳定的结合到所述类脂物成份上。
60.如权利要求59的医疗活性物质用输送媒介物，其中R或R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子的总数为至少23。
61.如权利要求59的医疗活性物质用输送媒介物，其中所述生物相容粒子是活的，有生理功能的含膜的组织。
62.如权利要求60的医疗活性物质用输送媒介物，其中所述的生物相容粒子选自红血球、白血球、血小板。
63.如权利要求59的医疗活性物质用输送媒介物，其中所述的生物相容粒子是脂蛋白。
64.将医疗活性物质给药予病人以便产生延长的系统治疗效果的方法，所述方法包含(ⅰ)偶合到生物相容粒子上一种通式如下的化合物
其中B代表一个生物作用部分，该部分包含医疗活性物质，R和R1表示取代基，分别选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷芳基或芳烷基，其烃链是线性或支链的，所述的取代基是未被取代的或是用一个或多个非极性官能基取代的，至少R和R1之一包含一烃取代基，所述烃取代基的链长有效地把结合类脂物的能力赋予所述化合物。R2表示一间隔部分，n是0或1，L代表连接部分，当n＝0时，在B与至少R和R1之一间提供稳定的连接，当n＝1时，在R2与至少R和R1之一间提供稳定的连接，条件是当n＝0时，L是非芳族连接部分，所述化合物是能够稳定结合到所述生物相容粒子上的，由此形成了医疗活性输送媒介物，(ⅱ)将所述的医疗活性输送媒介物引入到所述病人的循环系统中。
65.如权利要求64的方法，其中R和R1之一具有至少12个线性碳原子，R和R1中的线性碳原子总数共至少23。
66.如权利要求65的方法，其中所述的生物相容粒子选自红血球、白血球、血小板。
67.如权利要求66的方法，其中将所述化合物偶合到其上的生物相容粒子得自所述的病人。
68.如权利要求64的方法，其中所述的生物相容粒子是脂蛋白。
69.如权利要求64的方法，其中偶合到所述生物相容粒子上的所述化合物的通式为
70.选点施用医疗活性物质的方法，将通式如下的化合物输送到病人的体内的选定点，所述的选定位置包含含类脂物的生物相容粒子
其中B表示包含医疗活性物质的生物作用部分，R和R1表示取代基，分别选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷芳基或芳烷基，其烃链是线性或支链的，所述的取代基是未被取代或是用一个或多个非极性官能团取代的，至少R和R1之一包含一烃链，所述烃链的长度有效地把结合类脂物的能力赋予所述化合物，R2表示一个间隔部分，n是0或1，并且L代表一个连接部分，当n＝0时在B和至少R及R1之一间提供稳定的连接，当n＝1时在R2和至少R及R1之一间提供稳定联接。
71.如权利要求70的方法，其中所述的化合物以包含所述化合物在一相容生物介质中的药物制剂服用。
72.如权利要求70的方法，其中所述的医疗活性物质可释放地共轭到所述化合物上，并且所述的化合物在造成所述的医疗活性物质从所述化合物上在所述位置释放的条件下输送。
73.如权利要求72的方法，其中所述的医疗活性物质仅仅在从所述化合物释放出来时才是活性的。
74.在血管中减少血管成形术后再狭窄的方法，包含将如权利要求11的化合物输送到经受所述血管成形术的血管处，条件是由此所述的化合物稳定地与所述血管的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
75.如权利要求74的方法，其中所述的化合物从所用的导管处输送以完成所述的血管成形术。
76.在血管中减少血管成形术后再狭窄的方法，包含将如权利要求32的化合物输送至经受所述血管成形术的血管处，条件是由此所述的化合物稳定地与所述血管的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
77.如权利要求76的方法，其中所述的化合物从所用的导管处输送以完成所述血管成形术。
78.治疗风湿性关节炎的方法，包含将如权利要求11的化合物输送至关节的滑液的膜处，条件是由此所述的化合物稳定地与所述滑液膜的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
79.如权利要求78的方法，其中所述的化合物通过注射输送。
80.治疗风湿性关节炎的方法，包括将权利要求32的化合物输送至关节的滑液的膜处，条件是由此所述的化合物稳定地与所述滑液的膜的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
81.如权利要求80的方法，其中所述的化合物通过注射输送。
82.减少肿瘤细胞增生的方法，包含将如权利要求11的化合物输送给有所述肿瘤的病人，条件是由此所述的化合物稳定地与在所述肿瘤处的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
83.如权利要求82的方法，其中所述的化合物以选自如下的方法输送，(ⅰ)注射到所述病人的存在所述肿瘤的体腔内，(ⅱ)注射到将血供应到所述肿瘤细胞上的血管中和(ⅲ)直接注射到包含所述肿瘤细胞的实体上。
84.减少肿瘤细胞增生的方法，包含将权利要求32的化合物输送给具有所述肿瘤的病人，条件是由此所述的化合物稳定地与在所述肿瘤处的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
85.如权利要求84的方法，其中所述化合物以选自如下的方法输送，(ⅰ)注射到所述病人的存在所述肿瘤的体腔内，(ⅱ)注射到将血供应给所述肿瘤细胞上的血管中和(ⅲ)直接注射到包含所述肿瘤细胞的实体上。
86.减少卵巢肿瘤细胞增生的方法，包含将权利要求11的化合物输送到病人的存在所述肿瘤的体腔中，条件是由此所述的化合物稳定地与在所述肿瘤细胞增生处的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
87.如权利要求86的方法，其中所述的化合物通过注射输送。
88.减少卵巢肿瘤细胞增生的方法，包含输送如权利要求32的化合物到病人的存在所述肿瘤的体腔中，条件是由此所述的化合物稳定地与在所述肿瘤细胞增生处的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
89.如权利要求88的方法，其中所述的化合物通过注射输送。
90.治疗牛皮癣的方法，包含将如权利要求11的化合物输送到所述牛皮癣患处的细胞上，条件是由此所述的化合物稳定地与所述的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
91.如权利要求90的方法，其中所述化合物通过局部施用输送。
92.治疗牛皮癣的方法，包含将如权利要求32的化合物输送到所述牛皮癣患处的细胞上，条件是由此所述的化合物稳定地与所述的细胞连接，并以一个在所述细胞上有效地发挥抗增生效果的量存在。
93.如权利要求92的方法，其中所述的化合物通过局部施用输送。
94.选定点施用抗增生剂的方法，包含将如权利要求7中的化合物输送到病人体内的选定点上，条件是由此抗增生剂从所说的化合物上释放，该释放能使所述的剂在所述的点发挥它的抗增生作用。
95.选定点施用抗增生剂的方法，包含将如权利要求9中的化合物输送到病人体内的选定点上，条件是由此抗增生剂当共轭到所述化合物上时，能在所述的点发挥它的抗增生作用。
96.一种化合物，通式为
其中每个R′分别是氢原子或烷基，优选是低级烷基，或取代的低级烷基，其中取代基可以是酯，R″和R
分别是氢原子或烷基，配位体的盐包含单盐，例如氢卤酸、草酸和酒石酸，各m和n可各为0或1。
97.如权利要求96的化合物，通式如下
其中R和R1具有从1至约30个碳原子的烃取代基，X和X1可是相同或不同的，并表示O、S、C(CH3)2或Se;A代表药物可接受的阴离子;Z代表H或不稳定的硫羟保护基;
其中每个R′分别是氢原子或烷基，优选是低级烷基或取代的低级烷基，其中取代基可以是酯，R″和R
分别是氢原子或烷基，配位体的盐包含单盐例如氢卤酸、草酸和酒石酸。并且m和n可各为0或1。
98.如权利要求97的化合物，通式为
99.一种化合物，通式为
其中X代表氧或硫。
全文摘要
本发明提供了具有将医疗活性物质结合至类脂物上的能力的化合物，这些类脂物包含在生物相容粒子中。这些化合物包含一个生物作用部分，该部分包含有医疗活性物质，并通过一个联接部分与至少一个所选定的烃取代基联接，以致该化合物具有足够的非极性以把结合类脂物的能力赋予化合物。这样，本发明的化合物能用于选点输送医疗制剂，并在此选定点滞留。还提供了使用本发明的各种化合物进行疾病治疗或其它病理调理的方法，例如提供了用于治疗(1)血管成型术后的再狭窄；(2)风湿性关节炎；(3)肿瘤细胞增生；(4)牛皮癣的方法。
文档编号C07D495/04GK1074911SQ9211517
公开日1993年8月4日 申请日期1992年11月26日 优先权日1991年11月27日
发明者C·A·科皮亚, P·K·霍兰, B·D·格雷, D·E·特劳纳, K·A·米尔黑德, K·A·雪夫, C·-E·林, Z·余, S·Z·莱弗, K·E·拜杜, B·D·扬森, S·E·施列扎克 申请人:蔡纳齐斯技术有限公司