治疗脱发和其它疾病的药物的制作方法

专利名称：治疗脱发和其它疾病的药物的制作方法
专利说明治疗脱发的药物 本发明涉及对脱发、妇女多毛症或皮脂溢有优越治疗效果或对前列腺癌引起的骨转移有优越预防效果的新组合物。产生雄性征的激素，例如二氢睾酮(DHT)的过量刺激会引起雄激素-依赖性脱发(男性的典型脱发等)、普通粉刺、皮脂溢、妇女多毛症、良性前列腺肥大和前列腺癌。
已发现甾族抗-产生雄性征的激素(如雌性激素雌激素)为能够治疗这些由这种产生雄性征的激素过度刺激引起的症状的化合物。然而，由于这些化合物本身具有激素的活性，它们易于产生不良作用。例如女性化。
一方面，也正在开发非甾族抗-产生雄性征的激素。尽管这些化合物没有激素作用，但它们与天然雄激素竞争受体，因而具有不良作用，例如，子宫内男胎儿或男性的女性化，或启动反馈机制而过度刺激睾丸。
由于5α还原酶作用于睾酮而形成二氢睾酮(DHT)，假如抑制5α还原酶的活性，则可期望治疗因产生雄性征的激素过度刺激所致的症状而无所述副作用。
其次，病人(かかゐ人)5α还原酶包括两种同功酶。已阐明I型5α还原酶存在于面部和皮肤的皮脂腺内，II型5α还原酶分布于前列腺中。
由于I型5α还原酶存在于毛囊中，可以期望强烈抑制该酶将减轻男性的典型脱发。然而，用为雄性型脱发动物模型的猴评价I型5-α-还原酶的选择性抑制剂MK386的效果。结果，血液中的DHT水平显示有30-40％的降低，但MK386的效果尚未确定(J.Invest.Dermatol.，104，658(1995))。
给予动物模型剂量1mg/kg为II型5α-还原酶选择性抑制剂的非那甾胺可降低血液中60-70％的DHT浓度，然而意外地发现该药对治疗脱发有效(J.Clin.Endocrinol.Metabol.，79，991(1994))。
事实上，通过临床试验已认识到非那甾胺对人脱发的疗效。抑制参与减少毛囊体积的因子产生这种疗效，并推测这种作用取决于血液中的DHT水平。此外，由最近的临床结果发现，降低血液中的DHT水平的强度主要取决于对II型5α还原酶抑制活性的强度，但兼有对I型5α还原酶的抑制活性可能获得更好的结果(J.Clin.Endocrinol.Metabol.，81，2942-2947(1996))。
同样，在妇女多毛症或皮脂溢的治疗中，不只对II型5α-还原酶有抑制活性、而且兼有对I型5α-还原酶抑制活性的化合物，被认为是优越的药物。因此，为发现更有效的用于脱发、妇女多毛症或皮脂溢的药物，迫切需要比非那甾胺更有效地抑制II型5α-还原酶且同时强烈抑制I型5α-还原酶的化合物。
此外，II型5α-还原酶分布于前列腺中，所以对II型5α-还原酶具有强烈抑制活性的化合物有效用于前列腺癌的治疗，但最近发现，在前列腺癌发展和骨转移期间，I型5α-还原酶为活性形式[J公开特许平8-277220号公报]。因此，如上所述的对两种类型酶的抑制性化合物也期望用于预防和治疗前列腺疾病。
再者，已公开对前列腺酶具有很强抑制活性的本发明的化合物(1)[公开特许平5-32693号公报]。有理由期望对II型5α还原酶的抑制活性来自对前列腺酶的抑制活性。然而，不可能期待化合物(1)对I型5α-还原酶有抑制活性，因为I型5α-还原酶并不分布于前列腺中。多年来，本发明人对有睾酮5α-还原酶抑制活性的衍生物的合成和所述衍生物的药理活性进行了多年广泛的研究。结果发现有些具有特异结构的化合物强烈抑制II型5α-还原酶，而且还强烈抑制I型5α-还原酶，因而它们显示出很强的降低血中DHT水平的活性，而这种活性在目前已知的II型5α-还原酶选择性抑制剂中尚未获得，并且它们可对脱发、妇女多毛症或皮脂溢有优越治疗效果或对由前列腺癌引起的骨转移有优越预防效果，由此完成了本发明。
本发明的目的提供对脱发、妇女多毛症或皮脂溢有优越治疗效果或对由前列腺癌引起的骨转移有优越治疗效果的新组合物。本发明的另一目的在于提供所述化合物在制备用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢或用于预防由前列腺癌引起的骨转移的组合物中的用途。
此外，本发明的再一目的是提供治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢或预防由前列腺癌引起的骨转移的方法，该方法包括给予温血动物有效治疗量的所述化合物。
用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢或用于预防由前列腺癌引起的骨转移的本发明的新组合物，包含作为活性成分的、由下述式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐或其它衍生物。优选含有N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺作为活性成分。
本发明的新使用方法是使用下述式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐或其它衍生物以制备用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢或用于预防由前列腺癌引起的骨转移的组合物，优选使用N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺制备所述组合物。
(其中R1和R2各自可以相同或不同且各自表示氢原子、羟基或低级烷氧基。)在上述式(I)中，术语“低级烷氧基”意指直链或支链C1-6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正-戊氧基、异戊氧基、2-甲基丁氧基、新戊氧基、正-己氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基，其中优选直链和支链C1-4烷氧基，且更优选甲氧基。
术语“脱发”意指男性的典型脱发和女性脱头发。
由于化合物(I)可以形成盐，术语“药学上可接受的盐”意指可以转化为其盐的本发明化合物(I)的盐，这样的盐的实例优选包括碱金属盐，如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐，及金属盐，如铝盐、铁盐和锌盐。
当本发明的化合物(I)处于大气中时，它可以从中吸收水分、吸收的水分附着于其上，形成水合物。这样的物质也包括在本发明中。
本发明的化合物(I)可以通过下面所示的方法制备。
(上式中R1和R2如上所述)。
在方法A中，通过羧酸衍生物与胺衍生物的缩合制备化合物(I)。
在步骤A1中，采用化合物(II)或其反应性的衍生物和化合物(III)制备化合物(I)。以用于肽合成的常规方法，例如，叠氮化物法，活化酯法，混合酸酐法或缩合法，进行该步骤。
在这些方法中，叠氮化物法包括用胺化合物(III)处理叠氮化物。所述叠氮化物通过亚硝酸与氨基酸的酰肼反应而制备，所述酰肼通过化合物(II)或其酯与肼于室温下，在惰性溶剂(如二甲基甲酰胺)中反应而制备。
可使用的亚硝酸化合物的实例可以包括碱金属亚硝酸盐(例如亚硝酸钠)和亚硝酸烷基酯(如亚硝酸异戊基酯)。
该反应优选在惰性溶剂中进行，可使用的溶剂的实例包括酰胺类，例如二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺；亚砜类，例如二甲基亚砜；以及吡咯烷酮，例如N-甲基吡咯烷酮。此外，该方法的两步反应通常在一种反应液中进行。该反应的温度范围在第一步为-50℃-0℃，而在第二步为-10-10℃。反应所需的时间范围在第一步为5分钟-1小时，而在第二步为10小时-5天。
所述活性酯法通过化合物(II)与活性酯化剂的反应形成化合物(II)的活性酯，然后使生成的化合物与胺化合物(III)反应来进行。
两个反应优选在惰性溶剂中进行，可使用的溶剂的实例可以包括卤代烃，例如二氯甲烷和氯仿；醚类，例如乙醚和四氢呋喃；酰胺类，如二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺以及腈类，例如乙腈。
可使用的活性酯化剂的实例包括N-羟基化合物，例如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺和二硫化物，例如，二吡啶基二硫化物。活性酯化反应适合在缩合剂，例如，二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑或三苯膦存在下进行。
该酯化反应温度范围为-10-100℃，活性酯化合物与胺(III)的反应在大约室温下进行。所述反应所需的时间范围对于两个反应均为30分钟-80小时。
在活性酯与胺的反应中，也可以加入4-二甲基氨基吡啶等。
所述混合酸酐法通过在制备化合物(II)的混合酸酐后与胺反应来进行。
制备混合酸酐的反应通过在惰性溶剂(例如前述卤代烃、胺、醚)中使化合物(II)与形成混合酸酐的物质反应而进行。这样的物质的实例包括低级(C1-C4)烷基碳酸酯，例如氯代碳酸乙酯、氯代碳酸异丁酯；低级链烷酰基卤化物，例如新戊酰氯；(低级烷基)-或二芳基-氰基磷酸，例如，二乙基氰基磷酸、二苯基氰基磷酸；或磺酰卤，例如，2，4，6-三异丙基苯磺酰氯，对甲苯磺酰氯或甲磺酰氯等。
该反应适合在有机胺如三乙胺或N-甲基吗啉存在下，于-10℃-50℃进行。该反应所需的时间范围为30分钟-20小时。
混合酸酐和胺(III)的反应适合在上面例举的有机胺存在下，在惰性溶剂(例如上面例举的卤代烃、酰胺或醚)中进行。该反应温度范围为0℃-80℃，该反应所需的时间范围为1小时-48小时。
或者，该反应也可以在化合物(II)、化合物(III)和形成相应的混合酸酐(无需分离混合酸酐)的混合物中进行。
所述缩合法通过使化合物(II)与胺(III)在缩合剂(例如，二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑、1-甲基-2-氯代-碘化吡啶鎓-三乙胺)存在下直接反应来进行。该反应在类似于上述制备活化酯的反应中所用的条件下进行。
当R1和R2含有保护羟基时，该保护基团可以用常规方法除去。
此外，原料化合物(II)或其活性酯是已知的化合物或通过本领域技术人员熟知的方法制备[例如，J.Med.Chem.，27，1690(1984)；J.Med.Chem.，29，2298(1986)]。
化合物(III)是已知的化合物或通过本领域技术人员制备[例如，Synthesis，593(1976)；J.Org.Chem.，36，305(1971)；Angew.chem.，82(1970)；Synthesis，24(1978)；Synthetic Commun.，18，777(1988)；Synthetic Commun.，18，783(1988)；Organic Reactions，3，337(1946)；Org.Synthesis，51，48(1971)；Tetrahedron，30，2151(1974)；J.Org.Chem.，37，188(1972)；]。例如，式H2N-C(Me)(Me)-Ph(R1)(R2)的化合物为本发明的原料化合物，它可如下面反应流程所示，用Synthesis，第24页(1978)中所述的方法，通过Grignard反应、羟基的叠氮化物反应以及随后的还原反应来制备
(其中，R1和R2如上所述，Me表示甲基，Ph表示苯基)。
化合物(I)可以以片剂、胶囊、颗粒、粉末、糖浆等的形式口服给予，以乙醇溶液、清洁泡沫胶、清洁霜、皮肤用凝胶、皮肤洗剂、洗发凝较、洗发膏等局部给予。
口服药用制剂通过本领域技术人员熟悉的方法，采用下列添加剂制备赋形剂(实例包括有机赋形剂，如糖衍生物，例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇；淀粉衍生物，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物，如结晶纤维素、低-取代的羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和内交联羧甲基纤维素；阿拉伯胶；葡聚糖；pullulan；无机赋形剂，例如，硅酸盐衍生物如轻硅酸酐、合成的硅酸铝和硅酸铝镁；磷酸盐如磷酸钙；碳酸盐如碳酸钙和硫酸盐如硫酸钙)、润滑剂(实例包括硬脂酸，硬脂酸的金属盐，如硬脂酸钙和硬脂酸镁；滑石；胶态硅胶，蜡如蜂蜡(ビ-ガム)和鲸蜡；硼酸；己二酸；硫酸盐如硫酸钠；甘醇；富马酸；苯甲酸钠；DL亮氨酸；脂族酸的钠盐；十二烷基硫酸盐，如十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸镁；硅酸，如硅酸酐和硅酸水合物；以及上面例举的淀粉衍生物)、粘合剂(实例包括聚乙烯吡咯烷酮、Macrogol和与上例举的赋形剂类似的化合物)、崩解剂(实例包括与上例举的赋形剂同样的化合物和化学改性淀粉和纤维素如sodiumcross carmellose、羧甲基淀粉钠和交联聚乙烯吡咯烷酮)、稳定剂(实例包括对氧基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；醇如氯代丁醇、苄醇和苯乙醇；氯苄烷铵；酚衍生物如苯酚和甲酚；乙基汞硫代水杨酸钠；脱氢乙酸和山梨酸)、矫味剂(实例包括普通使用的甜味剂、酸化剂和香料)和/或稀释剂等。
局部药用制剂通过将示例性化合物加入本领域技术人员熟知的基质中制备，这些基质有，例如，悬浮剂(实例包括阿拉伯胶，黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、藻酸钠和膨润土)、乳化剂(实例包括三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、脱水山梨醇倍半油酸酯、多乙氧基醚80和硬脂酸聚烃氧基酯40)、润湿剂(实例包括山梨醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇和甘油)、防腐剂(实例包括对氧基苯甲酸甲酯、对氧基苯甲酸乙酯、对氧基苯甲酸丙酯和对氧基苯甲酸丁酯)或溶剂(实例包括水；醇如乙醇、异丙醇、丙二醇、十六烷醇和异硬脂醇；烃如天然油脂、蜡和液体石蜡；脂族酸如硬脂酸、异硬脂酸、油酸和亚油酸；和酯如肉豆蔻酸异丙酯)或其混合物。
口服给予或局部给予化合物(I)的量将根据患者的病情、年龄等变化。最好平均给予0.001mg/kg体重(优选0.01mg/kg体重)为下限和10mg/kg体重(优选0.5mg/kg体重)为上限的一个剂量，根据症状，可以平均每日给予1至数个剂量。本发明此后将通过试验实施例、参考实施例和制备实施例更具体地说明本发明。对人I型和II型5α-还原酶的抑制活性的测定方法(1)重组人I型和II型5α-还原酶的制备a)克隆重组人I型和II型5α-还原酶的2cDNA为了通过聚合酶链式反应(PCR)克隆人I型和II型5α-还原酶的整个翻译区，采用Oligo 1000 DNA合成仪(BECKMAN Co.，Ltd.的产品)，根据发表的报告中所述的人I型和II型5α-还原酶的碱基序列(参见Stefan.A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3640-3644(1990)，Stefan.A等，Nature，354，159-161(1991))，合成Sequence ID.No.1、2、3和4所示的引物。I型有义引物5’-CCAGCCCTGGCGATGGCAAC-3’(序列ID 1号)I型反义引物5’-CAGAGCTTGAAATTCTGACCTGTTA-3’(序列ID2号)II型有义引物5’-ACGGCGCGATGCAGGTTCAGTG-3’(序列ID 3号)II型反义引物5’-AGCATTGTGGGAGCTCTGCTCCT-3’(序列ID 4号)作为PCR方法的模板，采用人肝QUICK-CloneTMcDNA和人前列腺QUICK-CloneTMcDNA(CLONTECH Laboratory.Inc.的产品)。
用1μl cDNA、5μl所附的PCR缓冲液、1μl 10mM dNTP混合溶液、浓度为20μM的上述有义引物和反义引物各1μl、1μl 5单位/mlTaKaRa Taq聚合酶和40μl蒸馏水进行PCR，反应体积为50μl。PCR的条件为于94℃为20秒，55℃为1分钟，并于72℃1分钟，进行25个循环，最后于4℃贮存。当将一份约5μl PCR反应混合物经0.8％琼脂糖凝胶电泳时，发现对应于上述文献中期望的还原酶的条带(I型1021bp，II型812bp)。因此，将PCR反应混合物的剩余部分经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化。用TA CloningTMKit(InvitrogenCorporation的产品)对纯化的cDNA片段进行亚克隆。通过染料终止子方法对亚克隆的I型和II型cDNA的每一个全碱基序列进行分析，已证实它们与所报道的序列相同。将已证实碱基序列的I型和II型cDNA插入表达载体中，以使其表达，然后提供使用。
b)人I型和II型表达质粒的制备通过TA CloneTMKit所附说明书的方法，用人I型或II型表达质粒pME18sH5R1或pME18sH5R2转化大肠杆菌株DH5(supE44、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、relA1)(购自东洋纺织株式会社)转化。将转化子的约10μl原代培养液接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的50ml 2×LB培养基(20g，细菌培养用胰蛋白胨(DIFCOLabs的产品)、10g细菌培养用酵母膏(DIFCO Labs的产品)、10g氯化钠和2g葡萄糖/1L)中，接着于37℃培养约40小时。离心分离(5000rpm，10分钟)该培养液，回收细胞。采用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen Inc.的产品)，由所得的细胞制备pME18sH5R1或pME18sH5R2。
c)人I型和II型蛋白的表达和制备通过电穿孔方法(Gene PulserTM；Bio-Rad Laboratories)，960μF，200Ω，300V)将10-20μg pME18sH5R1或pMEpME18sH5R2引入2×106/0.5ml COS-1细胞中。引入后，收集培养约48小的细胞。通过POLYTRON(KINEMATICA GmbH的产品)将细胞在置于冰浴上的缓冲液(20mM磷酸钾，pH7.4，10％甘油，0.33M蔗糖，50μM还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和0.001％苯甲基磺酰氯(PMSF))中匀浆，然后离心(10000×g，1小时)。将沉淀物再次悬浮于缓冲液中并于-80℃贮存。该悬浮液用作I型或II型5α-还原酶。
(2)蛋白含量的测定通过Bradford方法(Bio-Rad的蛋白测定，Biorad)，采用牛γ-球蛋白(牛cohn组分II，Sigma的产品)作为标准品测量蛋白含量。
(3)5α-还原酶活性的测定用14C睾酮(Amersham)转化为14C 5α-二氢睾酮的转化率作为指标测定5α-还原酶活性。将化合物溶解并稀释于二甲亚砜(DMSO)中。向每个试管中倾入5μl份所得的溶液，同时对照组倾入5μl单纯的DMSO。将含有10-25μl重组人I型或II型5α-还原酶的0.5ml酶反应缓冲液(I型，含有1μM14C睾酮、1mM二硫苏糖醇和0.5mM NADPH的40mM磷酸钙缓冲液(pH7.5)；II型，含有1μM14C睾酮、1mM二硫苏糖醇和1mM NADPH的100mM tris-柠檬酸缓冲液(pH5.5))加入各试管中，接着于37℃保温15分钟。保温后，加入2ml乙酸乙酯(含睾酮、5α-二氢睾酮和雄烯二酮，各10μg)并将所得的混合物充分搅拌，由此终止所述酶反应，将甾族化合物提取到乙酸乙酯相中。然后，通过离心(3000rpm 5分钟)使乙酸乙酯相与水相分开。将乙酸乙酯相转移到另一试管中，接着在氮气流下蒸发至干。用0.8ml乙醚洗涤试管壁，由此所述甾族化合物被洗脱至试管底部。再次蒸发至干后，将甾族化合物溶于40μl乙酸乙酯中并将所得溶液在薄层板(LK6DF硅胶板，Whatman的产品)上点样。将该薄层板用1∶1乙酸乙酯和环己烷的混合物展开两次，以分离含甾族化合物的各部分。含甾族化合物的各部分的放射性用生物显象分析仪(Fuji Film Co.，Ltd.)测定。对还原酶的抑制活性用50％抑制浓度(IC50)表示。
所述IC50)值如下进行计算以对照组的转化率为100％，计算还原酶活性的抑制率(100-(加入测试化合物的转化率÷对照组的转化率)×100)(％)。制备化合物的稀释系列并通过上述方法计算每种浓度的抑制率。采用抑制率降至约20％-约80％范围内的稀释浓度，设定测试化合物浓度的log值为X，抑制率为Y，通过最小二乘方方法计算回归直线。从获得的回归直线，计算产生50％抑制率所需的化合物浓度并将该浓度指定为IC50。
I型的IC50值示于表1中，同时型II的IC50值示于表2中。(I型)化合物 IC50化合物I 4.9×10-8M非那甾胺7.0×10-7M[表2](II型)化合物 IC50化合物I 3.2×10-9M非那甾胺1.5×10-8M[试验实施例2]降低人血中二氢甾酮水平的作用口服给予人体1-10mg/人的化合物I或5mg/人的非那甾胺并测定血中二氢睾酮(DHT)和睾酮(T)的浓度。计算它们在给药前(pre)和时间推移(10和18小时)后的比率(DHT/T)，从中计算(DHT/T)/(DHT/T)pre。结果列于表3(人数n＝4-6)。10小时后 18小时后化合物I(1mg) 0.5180.525化合物I(5mg) 0.4110.376化合物I(10mg)0.2790.284非那雄酮 0.5530.461用人毛乳头细胞进行试验毛乳头为少量存在于毛囊中的细胞团。目前，推测毛乳头为形成毛发生长基质的干细胞。发现该细胞含有5α-还原酶活性。因此，通过用这种细胞培养系统有可能进行5α-还原酶抑制剂的试验。通过Messenger，A.G.(人发毛囊皮肤毛乳头细胞的培养，Br.J.Dermatol.，110，685-989(1984))和Itami，S等，(“培养的人胡须真皮毛乳头细胞与网状真皮成纤维细胞相比的5α-还原酶活性”)J.Invest Dermatol.，94，150-152(1990)的方法，进行毛乳头细胞的分离和培养。使用胡须毛乳头细胞和两个受试者的头部枕区发根用于试验。在这些细胞经传代培养4-6代后，在汇合状态下进行所有的试验，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤成为汇合的细胞，经乳胶刮剥离，然后收集到离心管中。将所述细胞于4℃ 1500rpm离心10分钟。将获得的沉淀物悬浮于缓冲液(含250mM蔗糖，1mM氯化镁和2mM氯化钙的20mM tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中，用25G针将该悬浮液抽吸注射10次。然后用特氟隆-玻璃匀浆器匀浆该悬浮液得到破碎细胞液。为了确定5α-还原酶在细胞中的定位，将所得的破碎细胞液经800×g离心10分钟，由此得到粗核部分。将上清液于10,000g离心15分钟，由此得到线粒体部分。将该上清液进一步以100,000×g离心60分钟，由此得到微粒体部分和细胞溶胶部分。将每一部分的沉淀物洗涤两次，接着再悬浮。
在常规的保温条件下，将50μl破碎细胞液加入到含有50nM[3H]-睾酮和1mM NADPH的100mM柠檬酸钠(pH5.5)或100mM tris-盐酸(pH7.5)中得到100ml溶液。根据蛋白含量，将50-100mg量的该破裂细胞溶液加入各管中。该反应在37℃进行30分钟。在保温期间，该反应随时间的推移而进行。为找到适合于该反应的最适pH值，使用pH4.5-6.5的柠檬酸缓冲液，使用pH7.0-9.0的tris-盐酸缓冲液，通过Lowry等(“用福林酚试剂的蛋白质测定”，J.Biol.Chem.193，265-275(1951))的方法测定蛋白含量。
保温完成后，通过加入4倍量含110mg每种载体甾固醇的氯仿-甲醇(2/1v/v)使反应终止。根据Gomez等的方法(“人皮肤睾酮-4-14C和D-二氢睾酮-3，17-二酮-4-14C的体外新陈代谢”，Biochem.，7，24-32(1968))，经薄层层析分析提取的甾固醇。经重结晶提高每种甾固醇的纯度。用所形成的二氢睾酮的量指示5α-还原酶活性。该酶抑制作用表示为抑制百分率(100-(加入测试化合物的转化率÷对照组的转化率)×100)(％)，设定对照组的转化率为100％。
发现式(I)化合物显示出卓越的5α-还原酶抑制活性。在断尾猴(ベニガオザル)中预防脱毛发和生发(trichogenous)作用(1)使断尾猴罹患与男性典型脱发类似的脱发。断尾猴的脱发在青春期(约4岁)后即开始发生。几乎所有的雄性和雌性断尾猴都患有脱发症，而且这主要取决于雄激素的水平。由此，断尾猴为男性的典型脱发的有用的动物模型。
将雄性断尾猴(3-16岁)分组，每组含有3-6只动物。将断尾猴的头皮清楚地划分为额区和枕区，其中一区用，例如中国墨汁标记。剃去标记区的头发。制备各种剂量和各种组合形式的测试化合物的溶液或粉末，将这些测试化合物每日一次或二次均匀地涂抹于剃去头发的头皮区，或者口服给予。将同样量的溶剂(如二甲亚砜等)、霜(皮肤给予)或安慰剂(口服)给予对照动物。每4-6周剃去标记区的头发并对剃去的头发称重。给药期间为6周至两年。非那甾胺为5α-还原酶抑制剂并已知可预防上述动物的脱发。提供非那甾胺(口服给予)作为对照药物进行试验。
在治疗开始和结束时切取头皮(4mm穿孔)，作为活组织检查样品。通过样品的5α还原酶活性分析和组织检查，判断有无脱发。
发现式(I)化合物对脱发有效。在断尾猴中预防脱毛发和生发作用(2)将雄和雌性断尾猴(3-16岁)分组，每组含有3-6只动物。制备各种剂量和各种组合形式的测试化合物的溶液或粉末并每日一次将其均匀地涂抹于额区的头皮上，或者口服给予。给药期间为6周至两年。将同样量的溶剂(如二甲亚砜等)、霜(皮肤给予)或安慰剂(口服)给予对照动物。每个月观察额区头发的情况，并从头发的直径、密度、发原区和生发时间评价测试化合物的作用。同时拍照并从照片判断整体效果。在该试验开始前以及试验开始后3个月和6个月切取头部额区的皮肤部分(4mm圆径)，作为活组织检查样品，并通过组织学分析研究对发根发育阶段的作用。
发现式(I)化合物对脱发有效。采用有细毛的大鼠的试验有细毛的大鼠为显示发根皮脂腺细胞的增生和分泌异常活跃的雄激素-依赖性模型动物。它的发根在未成熟阶段(约4周龄)主要为生长阶段的发根。但性成熟(约8周龄)时，处于静止期的发根增加。因此，它在研究对毛发发育的影响方面用作模型动物。
将有细毛的大鼠(雄性，3-12周龄)分组，每组含有5-6只大鼠。制备各种剂量和各种组合形式的测试化合物的溶液或粉末，并每日一次将其均匀地涂抹于背部皮肤上，或者口服给予。给药期间为4-8周。将同样量的溶剂(如二甲亚砜)、霜(皮肤给予)或安慰剂(口服)给予对照动物。在完成给药后的第二天，对这些大鼠实施断头术。切取背部皮肤组织(直径为4mm的圆形)。通过组织学检查研究对皮脂腺和发根的毛发发育阶段的作用。
发现式(I)化合物对皮脂溢和脱发有效。
此外，在上述试验实施例中，可以根据文献(B de Brouwer等，Br.J.Dermatol.，137，699-702(1997))所述的方法，使用裸鼠，对毛发生长进行评价。N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺向30ml无水甲苯中，顺序加入1.0g 3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酸、1.6g三苯膦和1.4g 2，2-二吡啶基二硫化物。于室温下搅拌生成的混合物过夜。使该反应混合物经35g硅胶柱层析，用丙酮-二氯甲烷(1∶9至1∶1)洗脱，得到1.11g 2-吡啶基硫酯化合物。向30ml无水二氯甲烷中，顺序加入同样合成的5.0g 2-吡啶基硫酯化合物和5.0g 1-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙胺并于室温下搅拌生成的混合物3天。该反应混合物用100ml二氯甲烷稀释后，用1N盐酸、水、碳酸氢钠水溶液和饱和盐水顺序洗涤该混合物，经硫酸镁干燥并减压浓缩。残留物经15g硅胶柱层析，用丙酮-二氯甲烷(1∶9至1∶1)洗脱，得到5.2g标题化合物。NMR谱(CDCl3)δppm0.68(3H，s)，0.98(3H，s)，0.90-2.20(16H，m)，1.70(3H，s)，1.72(3H，s)，3.35(1H，t，J＝9Hz)，3.80(3H，s)，5.48(1H，br.)，5.76(1H，br.)，5.83(1H，d，J＝10Hz)，6.82(1H，d，J＝10Hz)，6.88(2H，d，J＝9Hz)，7.32(2H，d，J＝9Hz)。IR谱Vmaxcm-1(KBr)2969，2938，1672，1599，1514，1455，1248，1181，1035，825。[制剂实施例1]片剂(5-mg片剂)化合物 基本配方(mg/片)参考实施例1的化合物 5羟丙基甲基纤维素 15羧甲基淀粉钠 9.5结晶纤维素30.5sodium cross carmellose 20乳糖(过筛后) 38.75黄色三氧化二铁0.05硬脂酸镁(过筛后) 1.2片120.0[制剂实施例2]醇溶液参考实施例1的化合物 15.0(wt.％)水45乙醇 40[制剂实施例3]清洁泡沫参考实施例1的化合物 10.00(wt.％)水70.439春黄菊0.01Aloe vera胶 0.01尿囊素0.001三乙醇胺 0.02METHOCEL(METHOCELTM40-100(Dow)) 1.50甘油 3.00十二烷基硫酸钠15.00维生素A油 0.01维生素E油 0.01[制剂实施例4]清洁霜参考实施例1的化合物 5.0(wt.％)合成蜂蜡 14.0PPG2十四烷基丙酸酯 5.0羊毛脂醇 0.5矿物油36.0对羟基苯甲酸丙酯 0.15硼砂 1.0水38.35PPG聚乙二醇聚丙二醇[制剂实施例5]皮肤用凝胶参考实施例1的化合物 2.00(wt.％)PPG2十四烷基醚丙酸酯 45.00PPG2十六烷基醚 5.00C18-C36甘油三酯 4.00肉豆蔻酸酸十四烷基酯 3.00三(二十二烷酸)甘油酯 2.00环甲基硅酮34.00聚乙烯5.00[制剂实施例6]皮肤洗剂参考实施例1的化合物 1.0(wt.％)oleth-3磷酸二乙醇胺 1.0乳化蜡2.0C18-C36蜡脂族酸 1.0PPG2十四烷基丙酸酯 5.0甘油 3.0三乙醇胺 0.5水86.5[制剂实施例7]洗发用凝胶参考实施例1的化合物 2.0(wt.％)异丙醇胺十二烷基硫酸酯81.5椰子油脂族酸二乙醇酰胺8.0C18-C36钎焊酸甘油酯 4.5PPG5 ceteth-10磷酸酯 4.0[制剂实施例8]洗发膏参考实施例1的化合物 0.1(wt.％)十二烷基硫酸钠65.0三(二十二烷酸)甘油酯 2.0水解胶原 1.0
月桂酸二乙醇酰胺 5.0水26.9[工业适用性]非那甾胺为一种在欧洲市场作为治疗良性前列腺肥大的药物已有出售的化合物，它作为用于脱发的药物，目前正处于临床试验阶段。
本发明的式(I)化合物及其有关化合物对II型同功酶有比非那甾胺更强的抑制作用。它们对I型同功酶也有强的抑制作用。它们具有比非那甾胺更强的降低血中DHT的作用和低的毒性，因而作为用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物或用于预防前列腺癌引起的骨转移的组合物是有用的。[序列表ID.1号]合成序列的描述基于编码I型5α还原酶的cDNA序列设计的引物。合成序列的描述基于编码I型5α还原酶的cDNA序列设计的引物。合成序列的描述基于编码II型5α还原酶的cDNA序列设计的引物。合成序列的描述基于编码II型5α还原酶的cDNA序列设计的引物。
序列表<110>Sankyo company，Limited<120>用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物<130>FP-9820<140><141><150>JP平9-203136<151>1997-07-29<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于编码1型5α-还原酶的cDNA序列设计的引物<400>1ccagccctgg cgatggcaac 20<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于编码1型5α-还原酶的cDNA序列设计的引物<400>2cagagcttga aattctgacc tgtta 25<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于编码2型5α-还原酶的cDNA序列设计的引物<400>3acggcgcgat gcaggttcag tg22<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述基于编码2型5α-还原酶的cDNA序列设计的引物<400>4agcattgtgg gagctctgct cct 2权利要求
1.用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物或用于预防前列腺癌引起的骨转移的组合物，它包括作为活性成分的由下式(I)表示的化合物
(其中R1和R2彼此可以相同或不同且各自表示氢原子、羟基或低级烷氧基)或其药学上可接受的盐或其它衍生物。
2.用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物或用于预防前列腺癌引起的骨转移的组合物，它包括作为活性成分的N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺。
3.根据权利要求1或权利要求2的用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物。
4.根据权利要求1或权利要求2的用于治疗脱发的组合物。
5.根据权利要求1或权利要求2的用于治疗妇女多毛症的组合物。
6.根据权利要求1或权利要求2的用于治疗皮脂溢的组合物。
7.根据权利要求1或权利要求2的用于预防前列腺癌引起的骨转移的组合物。
8.由下式(I)表示的化合物、其药学上可接受的盐或其它衍生物
(其中R1和R2彼此可以相同或不同且各自表示氢原子、羟基或低级烷氧基)在治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物或预防前列腺癌引起的骨转移的组合物制备中的用途。
9.N-[1-甲基-1-(4-甲氧基苯基)乙基]-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺在治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物或预防前列腺癌引起的骨转移的组合物制备中的用途。
10.根据权利要求8或权利要求9的在制备用于治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的组合物中的用途。
11.根据权利要求8或权利要求9的在制备用于治疗脱发的组合物中的用途。
12.根据权利要求8或权利要求9的在制备用于治疗妇女多毛症的组合物中的用途。
13.根据权利要求8或权利要求9的在制备用于皮脂溢的组合物中的用途。
14.根据权利要求8或权利要求9的在制备用于预防前列腺癌引起的骨转移的组合物中的用途。
全文摘要
具有下述式(Ⅰ)的化合物:为有效治疗脱发、妇女多毛症或皮脂溢的新组合物或具有预防前列腺癌引起的骨转移作用的新组合物,其中R
文档编号C07J73/00GK1271285SQ98809366
公开日2000年10月25日 申请日期1998年7月27日 优先权日1997年7月29日
发明者小岛孝一, 浜田孝和, 吉冈史朗 申请人:三共株式会社